Summary
Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung eines mikrofluidischen Kanals mit sich ändernder Geometrie entlang der Strömungsrichtung des Fluids, um eine Dehndehnung (Dehnung) zu erzeugen, um Fasern in einem 3D-Kollagenhydrogel (<250 μm Dicke) auszurichten. Die resultierende Ausrichtung erstreckt sich über mehrere Millimeter und wird durch die Dehndehnungsrate beeinflusst.
Abstract
Ausgerichtete Kollagen-I-Fasern (COL1) steuern die Beweglichkeit von Tumorzellen, beeinflussen die Morphologie von Endothelzellen, kontrollieren die Differenzierung von Stammzellen und sind ein Markenzeichen von Herz- und Muskel-Skelett-Geweben. Um die Zellantwort auf ausgerichtete Mikroumgebungen in vitro zu untersuchen, wurden mehrere Protokolle entwickelt, um COL1-Matrizen mit definierter Faserausrichtung zu erzeugen, einschließlich magnetischer, mechanischer, zellbasierter und mikrofluidischer Methoden. Von diesen bieten mikrofluidische Ansätze fortschrittliche Fähigkeiten wie die genaue Kontrolle von Flüssigkeitsflüssen und der zellulären Mikroumgebung. Die mikrofluidischen Ansätze zur Erzeugung ausgerichteter COL1-Matrizen für fortschrittliche In-vitro-Kulturplattformen waren jedoch auf dünne "Matten" (<40 μm Dicke) von COL1-Fasern beschränkt, die sich über Entfernungen von weniger als 500 μm erstrecken und für 3D-Zellkulturanwendungen nicht geeignet sind. Hier stellen wir ein Protokoll zur Herstellung von 3D-COL1-Matrizen (130-250 μm Dicke) mit millimetergroßen Bereichen definierter Faserausrichtung in einem mikrofluidischen Gerät vor. Diese Plattform bietet fortschrittliche Zellkulturfunktionen zur Modellierung strukturierter Gewebemikroumgebungen, indem sie direkten Zugriff auf die mikrotechnische Matrix für die Zellkultur bietet.
Introduction
Die Zellen befinden sich in einem komplexen 3D-Fasernetzwerk, der als extrazelluläre Matrix (ECM) bezeichnet wird und deren Großteil aus dem Strukturprotein Kollagen Typ I (COL1) besteht1,2. Die biophysikalischen Eigenschaften der EZM geben den Zellen Orientierungshilfen, und als Reaktion darauf modellieren die Zellen die EZM-Mikroarchitektur 3,4,5. Diese reziproken Zell-Matrix-Wechselwirkungen können zu ausgerichteten COL1-Faserdomänen6 führen, die die Angiogenese und Zellinvasion in der Tumorumgebung 7,8,9 fördern und die Zellmorphologie 10,11,12, die Polarisation 13 und die Differenzierung 14 beeinflussen. Ausgerichtete Kollagenfasern fördern auch die Wundheilung15, spielen eine Schlüsselrolle bei der Gewebeentwicklung 16 und tragen zur langfristigen Zellkommunikationbei 17,18. Daher ist die Replikation der nativen COL1-Fasermikroarchitektur in vitro ein wichtiger Schritt zur Entwicklung strukturierter Modelle zur Untersuchung von Zellreaktionen auf ausgerichtete Mikroumgebungen.
Mikrofluidische Zellkultursysteme haben sich als bevorzugte Technologie zur Entwicklung mikrophysiologischer Systeme (MPS) etabliert19,20,21,22,23. Diese Systeme nutzen günstige mikroskalige Skalierungseffekte, bieten eine präzise Kontrolle der Flüssigkeitsströme, unterstützen die kontrollierte Einführung mechanischer Kräfte und definieren die biochemische Mikroumgebung innerhalb eines Mikrokanals 21,24,25,26,27. MPS-Plattformen wurden verwendet, um gewebespezifische Mikroumgebungen zu modellieren und Multiorganinteraktionen zu untersuchen28. Gleichzeitig wurden Hydrogele umfassend erforscht, um die 3D-Mechanik und den biologischen Einfluss der ECM, die in vivo beobachtet werden, zu rekapitulieren 29,30. Mit zunehmender Betonung der Integration von 3D-Kulturen mit mikrofluidischen Plattformen können zahlreiche Ansätze COL1-Hydrogele in mikrofluidischen Geräten kombinieren31,32,33. Die Methoden zur Ausrichtung von COL1-Hydrogelen in mikrofluidischen Kanälen waren jedoch auf dünne 2D-"Matten" (<40 μm Dicke) in Kanälen <1 mm Breite) beschränkt, was ein begrenztes Potenzial zur Modellierung von Zellantworten in ausgerichteten 3D-Mikroumgebungen bietet31,34,35,36.
Um ausgerichtete 3D-COL1-Hydrogele in einem mikrofluidischen System zu erreichen, wurde gezeigt, dass, wenn eine selbstorganisierende COL1-Lösung lokalen Dehnströmungen (Geschwindigkeitsänderung entlang der stromweisen Richtung) ausgesetzt wird, die resultierenden COL1-Hydrogele einen Grad der Faserausrichtung aufweisen, der direkt proportional zur Größe der Dehndehnungsrate ist, die sie erfahren37, 38. Widerrufsrecht Das Microchannel-Design in diesem Protokoll ist in zweierlei Hinsicht einzigartig. Erstens führt das segmentierte Design eine lokale Dehnungsdehnung in die COL1-Lösung ein, und zweitens ermöglicht seine "zweiteilige" Konstruktion dem Benutzer, COL1-Fasern auszurichten und dann den Kanal zu zerlegen, um direkt auf die ausgerichteten Fasern in einem offenen Format zuzugreifen. Dieser Ansatz kann weiter verfolgt werden, um modulare mikrofluidische Plattformen zu entwickeln, die mikrophysiologische Systeme mit geordneten COL1-Matrizen entwickeln. Das folgende Protokoll beschreibt den Prozess der Herstellung segmentierter Mikrokanäle und beschreibt die Verwendung der Kanäle zum Ausrichten von Rinderatelo COL1. Dieses Protokoll enthält auch Anweisungen für die Kultivierung von Zellen auf COL1 in einem Open-Well-Format und erörtert das Hinzufügen von Funktionen zur Plattform unter Verwendung einer modularen, magnetischen Basisschicht.
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Protocol
1. Herstellung des zweiteiligen Kanals und der modularen Plattformbasis
HINWEIS: Der mikrofluidische Kanal besteht aus zwei Teilen - dem mikrofluidischen Kanal-"Ausschnitt", der aus einer Polydimethylsiloxan-Folie (PDMS) definierter Dicke geschnitten wird, und der Kanalabdeckung, die sich reversibel mit dem Ausschnitt verbindet und den Kanal bildet. Der Kanal ist von einem Rahmen aus Polymethylmethacrylat (PMMA) umgeben, der als Medienreservoir fungiert (Abbildung 1). Der PMMA-Rahmen kann auch verwendet werden, um spezielle Module magnetisch zu verriegeln, um zusätzliche Funktionalität zu erhalten.
- Rasiermesser-Schneidkanäle aus PDMS-Platten:
HINWEIS: Das mikrofluidische Kanaldesign für diesen Schritt ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Der Kanal besteht aus fünf Segmenten mit einer Länge von jeweils 5 mm und einer Breite von 10 mm, 5 mm, 2,5 mm, 1,25 mm und 0,75 mm. Die Geschwindigkeit der Kollagenlösung, die mit einer konstanten Flussrate (50-400 μL·min−1) injiziert wird, nimmt lokal entlang des Kanals zu, wenn die Kanalbreite verringert wird, um einen Dehnfluss zu erzeugen.- Montieren Sie eine 250 μm dicke PDMS-Folie auf einer Kunststoffträgerfolie und schneiden Sie das mikrofluidische Design mit einem Bastelschneider bei einer Klingentiefe von 0,5 mm, einer Geschwindigkeit von 1 cm·s−1 und einer hohen Kraft.
- Reinigen Sie die mikrofluidischen Kanalausschnitte mit einem Ultraschallbad 5 Minuten lang. Spülen Sie die beschallten Kanäle in deionisiertem (DI) Wasser ab und trocknen Sie sie auf einer sauberen Kochplatte bei 100 °C für 5 min.
- Bewahren Sie die Kanäle bis zum Gebrauch in einer sauberen, abgedeckten Petrischale auf.
- Herstellung der PDMS-Abdeckung und Oberflächenpassivierung:
HINWEIS: Der Kanalausschnitt aus Abschnitt 1.1 erfordert eine Abdeckung, die darauf gelegt werden kann, um einen geschlossenen Kanal zu erzeugen, in den eine COL1-Lösung injiziert werden kann (Ergänzende Abbildung 1). Die Abdeckung kann nach der Selbstmontage des COL1 entfernt werden. Um die Wahrscheinlichkeit zu minimieren, dass das COL1 im Kanal an die Abdeckung bindet, wird die Abdeckung mit Rinderserumalbumin (BSA) passiviert. Das Formdesign für die PDMS-Abdeckung wird mitgeliefert. Die Form muss mindestens 2 mm dick sein und eine Grundfläche haben, die der Grundfläche des mikrofluidischen Kanalausschnitts entspricht. In diesem Protokoll betrug die Formfläche 35 mm x 15 mm.- Um die Form vorzubereiten, kleben Sie eine Folie aus Haftklebstoff (PSA) auf eine 2,5 mm dicke PMMA-Folie und schneiden Sie die gewünschte Formform per Laser.
- Reinigen Sie die lasergeschnittene PMMA-Form mit einem feuchten, fusselfreien Tuch und entfernen Sie den Träger von der PSA-Folie. Befestigen Sie die Form an einem Siliziumwafer mit einem Durchmesser von 100 mm und drücken Sie sie fest nach unten.
- Bereiten Sie PDMS im Verhältnis 10:1 vor (Basis:Vernetzer). Mischen Sie kräftig für 1 Minute, um eine ordnungsgemäße Durchmischung zu gewährleisten, und entgasen Sie die Mischung in einer Vakuumkammer, um Luftblasen zu entfernen.
- Die entgaste PDMS-Lösung wird in die PMMA/Silizium-Form gegossen und auf einer Kochplatte bei 100 °C für 20 min ausgehärtet. Lassen Sie die Form abkühlen, entfernen Sie das ausgehärtete PDMS und schneiden Sie überschüssiges Material mit einer Rasierklinge ab.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Siliziumwafer-Seiten (flache Seiten) der PDMS-Abdeckungen bei allen folgenden Schritten nach oben zeigen. - Verwenden Sie einen Biopsienstanzer mit einem Durchmesser von 1 mm, um Einlass- und Auslasslöcher zu erzeugen, die den Enden des mikrofluidischen Kanals entsprechen. Der Kanalausschnitt aus Schritt 1.1 kann als Schablone verwendet werden, um die Position der Bohrungen zu führen.
- Die Abdeckung 5 Minuten lang mit Isopropanol (IPA) beschallen, mit DI-Wasser abspülen, mit einer Druckluftquelle trocknen und dann in einer sauberen, abgedeckten Petrischale aufbewahren. Stellen Sie die Petrischale zum Sterilisieren für 1 Minute in eine UV-Sterilisationskammer (unbedeckt).
- Abdecken und in eine Biosicherheitswerkbank (BSC) überführen.
- Pipettieren Sie 300 μl 40 mg•mL-1 Rinderserumalbumin (BSA) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf die PDMS-Abdeckungen und verteilen Sie die Lösung gleichmäßig mit einer Pipettenspitze. Vor Gebrauch mindestens 4 h bei 4 °C in den Kühlschrank stellen.
- Legen Sie die Abdeckungen aus dem Kühlschrank in eine BSC, waschen Sie sie 5x mit 1x PBS und lassen Sie sie 10 Minuten an der Luft trocknen.
HINWEIS: Die PDMS-Abdeckungen können nach dem Beschichten mit BSA bis zu 1 Woche im Kühlschrank aufbewahrt werden.
- Glutaraldehyd-Behandlung von Deckgläsern
HINWEIS: Durch die Funktionalisierung der Deckgläser mit Glutaraldehyd wird COL1 kovalent an das Deckglas gebunden und verhindert, dass sich das Hydrogel löst.- Bereiten Sie eine 2%ige (v/v) Aminopropyltriethoxysilan (APTES)-Lösung in einem Becherglas vor, indem Sie 1 ml APTES zu 49 ml Aceton hinzufügen.
- Eine 25%ige Glutaraldehydlösung wird in DI-Wasser auf 5% verdünnt. Machen Sie 2 ml Lösung für jedes 24 mm x 50 mm Deckglas. Stellen Sie für Deckgläser mit den Maßen 24 mm x 24 mm oder 22 mm x 22 mm jeweils 1 ml Lösung her.
- Reinigen Sie die Deckgläser in einem Bad-Ultraschallgerät für 5 Minuten mit IPA. Spülen Sie das IPA mit DI-Wasser von den Deckgläsern ab. Das IPA ist vollständig gespült, wenn auf dem Deckglas ein glatter Wasserfilm zu sehen ist.
- Trocknen Sie die Deckgläser auf einer heißen Platte für 5 min bei 100 °C. Legen Sie die getrockneten Deckgläser in saubere Petrischalen und achten Sie darauf, dass sie sich nicht überlappen.
- Setzen Sie die Deckgläser mit einem Koronaentladungsstab jeweils 1 Minute lang einer Koronaentladung aus.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte in einem gut belüfteten Bereich oder einer chemischen Haube durchgeführt werden. - Entfernen Sie die Deckgläser aus der Petrischale und tauchen Sie sie dann innerhalb von 5 Minuten nach der Korona-Exposition 10 s lang in die APTES-Lösung ein, um sicherzustellen, dass das Deckglas untergetaucht ist.
HINWEIS: Achten Sie darauf, zu verfolgen, welche Seite mit Plasma behandelt wurde, und halten Sie es nach oben gerichtet. - Tauchen Sie dann das Deckglas für 10 s in Aceton und trocknen Sie es mit Druckluft ab. Legen Sie das trockene Deckglas mit der behandelten Seite nach oben wieder in die Petrischale.
HINWEIS: Wiederholen Sie die Schritte 1.3.5-1.3.7 für alle Deckgläser. - Pipettieren Sie 1 ml Glutaraldehydlösung auf die Oberfläche jedes Deckglases. Decken Sie so viel Oberfläche wie möglich ab, ohne dass die Lösung über den Rand des Deckglases verschüttet wird. Bei Bedarf kann mehr Glutaraldehydlösung hinzugefügt werden. Achten Sie darauf, die Oberfläche nicht mit der Pipettenspitze zu zerkratzen.
- Lassen Sie die Deckgläser 30 Minuten mit der Lösung in Kontakt und spülen Sie sie dann 20 s lang mit DI-Wasser ab. Trocknen Sie die Deckgläser mit Druckluft und legen Sie sie mit der plasmabehandelten Seite nach oben wieder in die Petrischale.
HINWEIS: Die Deckgläser können bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.
- Laserschneiden des modularen Magnetfußes
HINWEIS: Das Design des modularen Magnetfußes ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Der modulare Sockel dient als Vertiefung zur Aufnahme der Medien und kann auch zur magnetischen Befestigung von Spezialmodulen verwendet werden, wie in den zuvor veröffentlichten Arbeiten 22,37,38,39 beschrieben.- Schneiden Sie die Designs aus der PMMA-Schicht heraus, indem Sie geeignete Lasereinstellungen wie die Anzahl der Durchgänge und die Leistung verwenden.
HINWEIS: Die Lasereinstellungen sollten so eingestellt werden, dass die Magnete in die PMMA-Schicht gepresst werden können. Jeder Laser ist anders und die Schnittparameter müssen experimentell optimiert werden. Für einen 45-W-Laser werden 100 % Geschwindigkeit, 100 % Leistung und 3 Durchgänge zum Schneiden von 2 mm bis 2 mm dickem PMMA empfohlen. - Waschen Sie das lasergeschnittene Teil mit Wasser und Seife, um Schmutz aus dem Laserschneidprozess zu entfernen.
HINWEIS: Verwenden Sie keine Lösungsmittel, um die lasergeschnittenen Teile zu reinigen. Lösungsmittel können zur Ausbreitung von Mikrorissen in den lasergeschnittenen Kanten führen.
- Schneiden Sie die Designs aus der PMMA-Schicht heraus, indem Sie geeignete Lasereinstellungen wie die Anzahl der Durchgänge und die Leistung verwenden.
- Zusammenbau der Plattform
- Magnete (3/16 im Durchmesser, 1/16 Zoll dick) von Hand in den lasergeschnittenen Sockel schieben. Ein weicher Hammer oder ein Schraubendreherende kann verwendet werden, um den Magneten einzudrücken. Die Dicke der Magnete muss geringer sein als die Dicke des PMMA-Sockels, um sicherzustellen, dass die Magnete bündig mit der Oberfläche des Sockels abschließen.
HINWEIS: Die Magnete ermöglichen es dem Benutzer, der Plattform Funktionen hinzuzufügen, indem zusätzliche Module angebracht werden. - Ziehen Sie die Rückseite von der PSA-Folie ab und befestigen Sie die Basis mit der funktionalisierten Seite nach oben an einem mit Glutaraldehyd behandelten Deckglas.
- Platzieren Sie den PDMS-Kanalausschnitt vorsichtig in dem durch den Rahmen definierten Hohlraum. Drücken Sie mit einer Pinzette mit breiter Spitze nach unten, um Luftblasen zu entfernen und einen konformen Kontakt zu gewährleisten.
- Legen Sie die BSA-behandelte Kanalabdeckung mit der BSA-Seite nach unten auf den Kanalausschnitt. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeitseinlass- und -auslassöffnungen mit dem Kanal ausgerichtet sind.
- Das Gerät ist bereit für die COL1-Injektion.
- Magnete (3/16 im Durchmesser, 1/16 Zoll dick) von Hand in den lasergeschnittenen Sockel schieben. Ein weicher Hammer oder ein Schraubendreherende kann verwendet werden, um den Magneten einzudrücken. Die Dicke der Magnete muss geringer sein als die Dicke des PMMA-Sockels, um sicherzustellen, dass die Magnete bündig mit der Oberfläche des Sockels abschließen.
2. Injektion der COL1-Lösung in den Mikrokanal und Entfernen der Abdeckung für Zellkulturanwendungen
- Vorbereiten der COL1-Lösung
- Legen Sie alle erforderlichen Reagenzien (COL1-Stammlösung [6 mg·mL−1], Reinstwasser, 10x PBS, 0,1 M NaOH) auf Eis in die Biosicherheitswerkbank.
- Berechnen Sie das Volumen der Reagenzien wie folgt
ANMERKUNG: Um 1 ml neutralisiertes Kollagen von 2,5 mg·ml−1 aus einem Vorrat von 6 mg·ml−1 herzustellen, fügen Sie 416,67 μl Kollagen, 429,16 μl DI-Wasser, 100 μl 10x PBS und 54,16 μl 0,1 M NaOH hinzu, um einen endgültigen pH-Wert von 7 zu erhalten. Fügen Sie 20 μl 0,1 M NaOH hinzu, um einen pH-Wert von 9,0 zu erreichen. - Geben Sie die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge in eine leere 5-ml-Durchstechflasche: i) COL1-Vorrat, ii) DI-Wasser, iii) 10x PBS, iv) 0,1 M NaOH.
HINWEIS: Verwenden Sie eine Verdrängungspipette, um die COL1-Lösung zu handhaben. Bei Verwendung einer normalen Pipette kann es zu einem signifikanten Probenverlust kommen, der zu Schwankungen der Endlösungskonzentration führt. - Erhöhen Sie den pH-Wert der Lösung auf den gewünschten pH-Wert (typischerweise zwischen 7-9).
- Injektion der COL1-Lösung
- Setzen Sie eine Spritzenpumpe, eine gekühlte sterile Spritze, eine gekühlte neutralisierte COL1-Lösung und eine sterile 20-G-Luer-Lock-Nadel mit 90°-Winkelspitze in eine Biosicherheitswerkbank ein. Füllen Sie die COL1-Lösung in die Spritze und achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen.
- Befestigen Sie die 90° 20 G Nadelspitze an der Spritze, laden Sie die Spritze mit der Nadel nach unten in die Spritzenpumpe und grundieren Sie die Nadel mit der COL1-Lösung.
- Stellen Sie die Spritzenpumpe auf die erforderliche Durchflussrate zwischen 50 und 2.000 μl/min ein.
- Legen Sie vorbereitete PDMS-Kanäle (Abschnitt 1) auf eine Laborbuchse und richten Sie sie mit der Nadel aus.
- Führen Sie die Nadel in die Einlassöffnung des PDMS-Kanals (breite Seite) ein. Injizieren Sie den Kanal, bis sich ein ~30 μl Tropfen COL1 auf der Auslassseite ansammelt.
- Senken Sie die Laborbuchse ab und trennen Sie die Nadel vorsichtig vom neu gefüllten Kanal.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.5-2.2.9, bis alle Kanäle mit COL1-Lösung gefüllt sind.
- Füllen Sie die gefüllten Kanäle zusammen mit einem sauberen, fusselfreien Tuch, das mit DI-Wasser gesättigt ist, in die Petrischale, um ein Austrocknen des neu gebildeten COL1-Gels zu verhindern.
- Decken Sie die Petrischale ab und legen Sie die beladenen Kanäle für 2 h in den Inkubator (37 °C, 95% Luftfeuchtigkeit) vor dem Peel-Off-Schritt.
- Abziehen und Medienäquilibrierung
- Legen Sie das polymerisierte COL1-Gel frei, indem Sie die PDMS-Abdeckung mit einer Pinzette abheben. Die BSA-Behandlung verhindert, dass sich COL1 an der Abdeckung festsetzt.
- Geben Sie 650 μl EGM in die Vertiefung.
- Lassen Sie die Geräte mindestens 4 Stunden im Inkubator (37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit), um Gel und Medien auszugleichen. Ersetzen Sie das Medium vor der Aussaat durch Zellen
- Aussaat von Zellen
- Legen Sie warme 0,25% Trypsin und Nährmedien zusammen mit der erforderlichen Anzahl von 5 ml und 10 ml Pipetten in die Biosicherheitswerkbank.
- Kultivieren Sie menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) bis zu 80 % Konfluenz in Endothel-Wachstumsmedien (EGM) bei 37 °C und 95 % Luftfeuchtigkeit. Platzieren Sie den Gewebekulturkolben mit HUVECs in der BSC, nachdem Sie die Konfluenz unter einem Mikroskop überprüft haben.
- Entsorgen Sie das Medium im T25-Kolben und waschen Sie die Zellen 2x mit 1x PBS. 1 ml Trypsin in den Kolben geben und für 3 min in den Inkubator (37 °C, 95% Luftfeuchtigkeit) geben.
- Überprüfen Sie den Kolben nach 3 Minuten unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich die Zellen vollständig von der Oberfläche gelöst haben.
- Geben Sie 3 ml EGM (mit Serum) in den Kolben, um das Trypsin zu neutralisieren. Anschließend wird die Zelllösung mit einer 5-ml-Pipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen mit den Zellen bei 150 x g für 5 min.
- Legen Sie das konische Röhrchen in die Biosicherheitswerkbank und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml frischem Nährmedium.
- 15 μl Trypanblau und 15 μl der resuspendierten Zelllösung werden in einem konischen 1-ml-Röhrchen hinzugefügt und gemischt.
- Injizieren Sie Trypanblau und Zelllösung auf beiden Seiten eines Objektträgers und führen Sie den Objektträger in ein Zellzählgerät ein.
- Verdünnen Sie die Zelllösung in endothelialen Wachstumsmedien auf die erforderliche Konzentration, basierend auf der Zellkonzentration, die aus der Zellzählvorrichtung erhalten wird.
HINWEIS: Ein T25-Kolben mit HUVECs bei 80% Konfluenz ergibt ~750.000 Zellen·ml−1 , wenn er in 1 ml Medium verdünnt wird. Das Volumen der zu säenden Zellsuspension wird als Fläche der Kulturoberfläche × Zelldichte/Konzentration der Zellsuspension berechnet. Beispiel: Um 20.000 Zellen·cm−2 in die 35 mm x 15 mm große Vertiefung zu säen, benötigt man ~140 μl der Zellsuspension. - Aspirieren Sie die Medien auf der konstruierten COL1-Matrix.
- Geben Sie das erforderliche Volumen der Zelllösung auf das COL1-Substrat und lassen Sie die Zellen vor der Bildgebung mindestens 4 Stunden ruhen.
- Markierung des Zellkerns und des Zytoskeletts
- Saugen Sie das Medium aus den Zellen ab und waschen Sie es 3x mit 1x PBS, 500 μL in jeder Wäsche. Decken Sie die Zellschicht mit 4% Paraformaldehyd für 15 min bei RT ab.
- Paraformaldehyd absaugen und mit 1x PBS Tween-20 5 min waschen.
- Permeabilisieren Sie die Zellmembran mit 500 μl 0,1% Triton-X-Lösung in PBS für 15 min. Mit 1x PBS Tween-20 5 Min. waschen.
- Blockieren Sie die unspezifischen Bindungsstellen mit 500 μl 4% BSA in PBS für 30 min bei RT.
- Die Phalloidin-Aktin-Fluoreszenz-Markierungslösung wird in 4 % BSA (1 μl Vorrat in 400 μl BSA) verdünnt.
- Aspirieren Sie die BSA-Lösung, geben Sie die Phalloidinlösung in die Zellen und warten Sie 30 Minuten bei RT.
- Verdünnen Sie den Kernfleck in 4% BSA (1 μl in 500 μl), saugen Sie das Phalloidin ab, fügen Sie die arbeitende Kernfärbelösung hinzu und warten Sie 15 Minuten bei RT.
- Saugen Sie die Kernfleckenarbeitslösung ab, waschen Sie sie mit PBS Tween-20 3x für jeweils 5 Minuten und ersetzen Sie sie vor der Bildgebung durch 1x PBS.
- Aufnahme mit einem Epifluoreszenzmikroskop unter Verwendung des FITC-Kanals (ex 491 nm/em 516 nm) und des DAPI-Kanals (ex 360 nm/em 460 nm) mit einem 40-fachen Objektiv. Bilden Sie das Kollagen mit einem konfokalen Laserscanning im Reflexionsmodus mit der 488-nm-Laserlinie (15% Leistung) und dem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv ab.
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Representative Results
Wenn eine selbstorganisierende COL1-Lösung durch einen Kanal mit abnehmender Querschnittsfläche fließt, steigt die stromweise Geschwindigkeit (v x) der COL1-Lösung lokal um eine Größe ∂v x entlang der Länge der Einschnürung zwischen den beiden Segmenten (∂x), was zu einer Dehndehnungsrate (ε̇) führt, bei der ε̇ = ∂v x/∂x ist. Die Dehndehnungsrate kann aus der Fluidgeschwindigkeit berechnet werden, die mit Hilfe der Partikelbildgeschwindigkeit (PIV) gemessen wird, wie in Abbildung 2 zu sehen ist.
Zuvor wurde gezeigt, dass die lokale Dehndehnung die Ausrichtung der COL1-Faser über große Entfernungen fördert 37,38,40 (Abbildung 3). Die Ausrichtung von COl1 wird direkt von der Größe der Dehndehnungsrate in der Einschnürung beeinflusst und kann beobachtet werden, dass sie sich gleichmäßig über die 5 mm Länge des Segments erstreckt. Um die Faserausrichtung zu messen, wurden konfokale Reflexionsmikroskopie-Bilder (CRM) von Fasern verwendet, um ein Histogramm der Faserausrichtung zu erstellen. Der Ausrichtungskoeffizient (CoA) ist der Anteil der Fasern, die innerhalb von ±15° des Modenwerts im Histogramm 38,42,43,44 ausgerichtet sind. CoA-Bereiche von 0-1 mit Werten >0,5 wurden als ausgerichtet angesehen.
Die Injektion eines 3D-Hydrogels in herkömmliche, versiegelte Mikrokanäle schränkt die Möglichkeiten ein, Medien und Zellen in die Matrix einzubringen. Der zweiteilige Kanal in diesem Protokoll überwindet die Beschränkung des Zugangs zu einem Hydrogel in einem Kanal, indem er es dem Benutzer ermöglicht, die Kanalabdeckung abzuheben und direkt auf die gesamte COL1-Matrix zuzugreifen. Die Kanalabhebung wird durch die Funktionalisierung des Glasdeckglases mit Glutaraldehyd ermöglicht, um die COL1-Bindung unter Verwendung von Amin-Aldehyd-Amin-Wechselwirkungen zu fördern, und durch die Funktionalisierung der PDMS-Abdeckung mit BSA, um die COL1-Adsorption auf der Abdeckung zu verhindern. Die Ausrichtung der COL1-Faser bleibt nach dem Abheben der Abdeckung unbeeinflusst, wie in Abbildung 4 zu sehen ist.
Es ist bekannt, dass ausgerichtete COL1-Substrate die Zellausrichtung beeinflussen, indem sie die Vorsprünge 9,12,45,46 und damit die Organisation von Stressfilamenten lenken. Endothelzellen in den nicht ausgerichteten und ausgerichteten COL1-Segmenten wurden abgebildet, um die zelluläre Reaktion auf die mit diesem Protokoll entwickelten COL1-Matrizen zu untersuchen. Die Zellen wurden 4 h nach der Aussaat fixiert und gefärbt. Repräsentative Bilder der HUVECs, die auf dem ausgerichteten Segment der Matrix kultiviert wurden, zeigten eine erhöhte Ausrichtung der Aktinfasern im Vergleich zu den HUVECs auf dem Segment mit zufälligen Fasern (Abbildung 5).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Aufbaus der Schichten. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Ahmed et al.38 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Stufenkanal- und Dehndehnungsraten . (A) Schematische Darstellung des abgestuften Kanals mit Abmessungen. Der Beginn zeigt die Berechnung der Dehndehnungsrate. Die Dehndehnungsrate in jeder Einschnürung wird aus der Geschwindigkeit berechnet, die mit der Partikelbild-Velocimetrie (PIV) gemessen wird. (B) Die Dehndehnungsraten in jeder Einschnürung. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Ahmed et al.38 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Konfokale Reflexionsbilder von COL1-Fasern in jedem Mikrokanalsegment nach COL1-Polymerisation. Die Zunahme des Grades der Faserausrichtung von Segment (a) zu Segment (e) kann visuell beobachtet werden. Maßstabsbalken = 25 μm. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Ahmed et al.38 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Konfokale Reflexionsbilder von COL1-Fasern, die zeigen, dass die Faserausrichtung durch Entfernen der Kanalabdeckung unbeeinflusst bleibt. Maßstabsbalken = 25 μm. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Ahmed et al.38 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Repräsentative Bilder von Zellen und COL1-Fasern. Repräsentative Bilder von Zellen und COL1-Fasern in Segment (e) der COL1-Matrix und Segment (a) der COL1-Matrix. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Abbildung zeigt lasergeschnittene Bauteile mit Abmessungen. (A) Kanal, (B) Magnetfuß und (C) Kanalabdeckungsform. Alle Abmessungen in Millimetern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Protokolle zur Erzeugung von COL1-Matrizen mit ausgerichteten Fasern wurden unter Verwendung magnetischer Methoden, der direkten Anwendung mechanischer Dehnung und mikrofluidischer Techniken beschrieben47. Mikrofluidische Ansätze werden häufig verwendet, um mikrophysiologische Systeme zu schaffen, da sie genau definierte Strömungs- und Transporteigenschaften aufweisen, die eine präzise Kontrolle der biochemischen Mikroumgebung ermöglichen. Da ausgerichtete COL1-Fasern wichtige instruktive Hinweise bei pathophysiologischen Prozessen wie Wundheilung, Tumorzellinvasion und Gewebeentwicklung liefern, ist die Erzeugung ausgerichteter COL1-Matrizen in mikrofluidischen Systemen ein Schritt zur Entwicklung biologisch relevanter mikrophysiologischer Systeme.
Dieses Protokoll bietet die Möglichkeit, millimetergroße, ausgerichtete COL1-Matrizen mit Regionen mit definierter Faserausrichtung herzustellen. Um die Ausrichtung zu induzieren, wird ein mikrofluidischer Kanal mit schrittweiser Breitenreduzierung verwendet. Da eine selbstorganisierende COL1-Lösung mit einer konstanten Fließgeschwindigkeit durch den Kanal fließt, nimmt die Strömungsgeschwindigkeit der Lösung an den Verengungen zu, was zu einer lokalen Dehndehnung und einer weiträumigen Ausrichtung der selbstorganisierenden COL1-Fasern führt. Im Vergleich zur scherströmungsinduzierten Faserausrichtung beobachteten wir eine Faserausrichtung in Kanälen mit einer Dicke von bis zu 250 μm, was es uns ermöglichte, 3D-Hydrogele in einem mikrofluidischen Kanal zu erzeugen. Da die Ausrichtung der COL1-Faser auf der Dehndehnungsrate beruht, können Benutzer den bereitgestellten Kanal modifizieren oder benutzerdefinierte Kanaldesigns entwickeln, um einen Dehnfluss zu erzeugen und COL1-Matrizen der gewünschten Größe und Form zu erstellen. Zusätzliche Flexibilität wird durch die weiche lithographiefreie Herstellung der Kanäle geboten, die ein schnelles Prototyping von Kanaldesigns ermöglicht.
Der in diesem Protokoll vorgestellte zweiteilige Kanalansatz überwindet die Einschränkungen beim Zugriff auf ein 3D-Hydrogel in Mikrokanälen. Ein zweiteiliger Kanal bietet direkten Zugang zum COL1-Hydrogel, wobei die Kanalabdeckung abgehoben werden kann, um die COL1-Matrix im Kanal freizulegen. Durch den direkten Zugriff auf das COL1 nach der Polymerisation entfällt die Notwendigkeit, Zellen in die COL1-Vorläuferlösung einzumischen, sodass ein Benutzer die COL1-Vorläuferlösung über längere Zeiträume bei unphysiologischem pH-Wert und niedrigen Temperaturen manipulieren kann. Darüber hinaus kann ein modularer Ansatz verwendet werden, um die Zellen zu positionieren und Schicht-für-Schicht-Biofabrikationsfähigkeiten bereitzustellen, wie in unserer früheren Arbeit gezeigt. Module können verwendet werden, um Membranen für die Co-Kultur einzuführen, eine kontinuierliche Perfusion einzuführen und auch mehrschichtige ECM-Konstruktezu erstellen 22,38,39. Je nach experimentellen Anforderungen können auch kundenspezifische Module hergestellt werden. In Verbindung mit der magnetischen Verriegelung eignet sich der modulare Ansatz auch gut für Experimente, bei denen mit der Zeit Funktionen hinzugefügt werden müssen.
Es gibt einige kritische Schritte, die in diesem Protokoll berücksichtigt werden müssen. Alle Komponenten, einschließlich des Kanalausschnitts, der Abdeckung, der Deckgläser und des modularen Bodens, sollten entsprechend gereinigt werden, um eine ordnungsgemäße Verklebung und chemische Funktionalisierung zu gewährleisten. Das Kollagen sollte auf Eis zubereitet werden, und alle Komponenten müssen kalt gehalten werden, um die Konsistenz zu gewährleisten. Nach der Zubereitung sollte die Kollagenlösung innerhalb von 10 Minuten nach der Zubereitung verwendet werden. Der endgültige pH-Wert der Kollagenlösung muss mit einer pH-Sonde gemessen werden, um die Konsistenz zu gewährleisten. Ein sauberes, feuchtes Tuch muss mit dem Kollagen in die Petrischale gegeben werden, um sicherzustellen, dass das Kollagen im warmen Inkubator nicht austrocknet.
Einige Änderungen und Fehlerbehebungen des Protokolls umfassen Folgendes. (i) Wenn während der Zellkultur Medien austreten, sollte darauf geachtet werden, dass der PMMA-Rahmen und die Deckgläser lückenlos in der Klebeschicht angebracht sind. (ii) Wenn die Magnete nicht bündig in der Basisschicht angebracht sind, verhindern sie, dass das Deckglas an der Basis haftet, was zu Lücken führt. (iii) Die Glutaraldehydbeschichtung auf dem Deckglas kann bei Bedarf auch eine niedrigere Konzentration aufweisen (bis zu 0,1%). Die optimale Konzentration von Glutaraldehyd zur Verhinderung von Toxizität sollte für jede Zelllinie, die im Experiment verwendet werden soll, experimentell bestimmt werden, da Glutaraldehyd eine Toxizität für Zellen darstellen kann. (iv) Man kann zusätzliche Materialien wie Hyaluronsäure, Fibronektin oder fluoreszierende Kügelchen zusammen mit Kollagen hinzufügen, um die Matrix weiter anzupassen. (v) Falls erforderlich, kann das Kanaldesign so geändert werden, dass es längere oder kürzere Segmente aufweist, um Grenz- und Kanteneffekte48 zu vermeiden.
Dieses Protokoll weist die folgenden Einschränkungen auf. Atelo-Rinderkollagen ist ein weiches Material (G' <100 Pa) mit 2,5 mg·ml−1. Um die Gelsteifigkeit zu erhöhen, können Forscher höhere Konzentrationen von Kollagen verwenden oder Vernetzer einführen. Obwohl dieses Protokoll nur für die Ausrichtung von Kollagenmatrizen mit einer Dicke von bis zu 250 μm validiert wurde, können dickere Matrizen entwickelt werden, indem die Kanaldicke erhöht und die Flussraten optimiert werden, um angemessene Dehndehnungsraten einzuführen.
Es wird erwartet, dass dieses Protokoll für Forscher von Nutzen sein wird, die gewebespezifisch geordnete Mikroumgebungen entwickeln möchten. Es kann auch als Leitfaden für die Erstellung modularer fluidischer Plattformen zur Etablierung mikrophysiologischer Systeme verwendet werden.
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Disclosures
Alle Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise vom National Institute of Health unter der Fördernummer R21GM143658 und von der National Science Foundation unter der Fördernummer 2150798 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der Fördergeber dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
| 20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
| 3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
| 3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
| ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
| BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
| Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CT-FIRE software | LOCI - University of Wisconsin | ||
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
| Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
| Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
| Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
| Laser cutter | Full Spectrum | 20x12 H-series | |
| Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
| Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
| Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
| Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
| PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
| Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
| Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
| Silicon wafer | University wafer | 452 | |
| Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
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