Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microengineering 3D kollagenhydrogeler med langdistanse fiberjustering

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

Denne protokollen demonstrerer bruken av en mikrofluidisk kanal med endring av geometri langs væskestrømningsretningen for å generere ekstensjonsbelastning (strekking) for å justere fibre i en 3D-kollagenhydrogel (<250 μm i tykkelse). Den resulterende justeringen strekker seg over flere millimeter og påvirkes av ekstensjonsbelastningshastigheten.

Abstract

Justert kollagen I (COL1) fibre veileder tumorcellemotilitet, påvirker endotelcellemorfologi, kontrollstamcelledifferensiering, og er et kjennetegn på hjerte- og muskelskjelettvev. For å studere cellerespons på justerte mikromiljøer in vitro har flere protokoller blitt utviklet for å generere COL1-matriser med definert fiberjustering, inkludert magnetiske, mekaniske, cellebaserte og mikrofluidiske metoder. Av disse tilbyr mikrofluidiske tilnærminger avanserte evner som nøyaktig kontroll over væskestrømmer og det cellulære mikromiljøet. Imidlertid har de mikrofluidiske tilnærmingene for å generere justerte COL1-matriser for avanserte in vitro-kulturplattformer vært begrenset til tynne "matter" (<40 μm i tykkelse) av COL1-fibre som strekker seg over avstander mindre enn 500 μm og ikke bidrar til 3D-cellekulturapplikasjoner. Her presenterer vi en protokoll for å fremstille 3D COL1-matriser (130-250 μm i tykkelse) med millimeterskalaregioner med definert fiberjustering i en mikrofluidisk enhet. Denne plattformen gir avanserte cellekulturfunksjoner for å modellere strukturerte vevsmikromiljøer ved å gi direkte tilgang til den mikrokonstruerte matrisen for cellekultur.

Introduction

Celler bor i et komplekst 3D-fibrøst nettverk kalt den ekstracellulære matrisen (ECM), hvorav hoveddelen består av det strukturelle proteinkollagen type I (COL1) 1,2. De biofysiske egenskapene til ECM gir veiledende signaler til celler, og som svar omdanner celler ECM-mikroarkitekturen 3,4,5. Disse gjensidige cellematriseinteraksjonene kan gi opphav til justerte COL1-fiberdomener6 som fremmer angiogenese og celleinvasjon i tumormiljøet 7,8,9 og påvirker cellemorfologi 10,11,12, polarisering 13 og differensiering 14. Justerte kollagenfibre fremmer også sårheling 15, spiller en nøkkelrolle i vevsutvikling16 og bidrar til langdistanse cellekommunikasjon17,18. Derfor er replikering av den opprinnelige COL1-fibermikroarkitekturen in vitro et viktig skritt mot å utvikle strukturerte modeller for å studere celleresponser på justerte mikromiljøer.

Mikrofluidiske cellekultursystemer er etablert som en foretrukket teknologi for å utvikle mikrofysiologiske systemer (MPS)19,20,21,22,23. Ved å utnytte gunstige skaleringseffekter i mikroskala, gir disse systemene presis kontroll over væskestrømmer, støtter kontrollert innføring av mekaniske krefter og definerer det biokjemiske mikromiljøet i en mikrokanal 21,24,25,26,27. MPS-plattformer har blitt brukt til å modellere vevsspesifikke mikromiljøer og studere multiorganinteraksjoner28. Samtidig har hydrogeler blitt mye utforsket for å rekapitulere 3D-mekanikken og biologisk påvirkning av ECM som observeres in vivo29,30. Med en økende vekt på å integrere 3D-kultur med mikrofluidiske plattformer, kan mange tilnærminger kombinere COL1-hydrogeler i mikrofluidiske enheter31,32,33. Imidlertid har metodene for å justere COL1-hydrogeler i mikrofluidiske kanaler vært begrenset til tynne 2D "matter" (<40 μm i tykkelse) i kanaler <1 mm brede, noe som gir begrenset potensial for å modellere celleresponser i justerte 3D-mikromiljøer31,34,35,36.

For å oppnå justerte 3D COL1-hydrogeler i et mikrofluidisk system, har det vist seg at når en selvmonterende COL1-løsning blir utsatt for lokale ekstensjonelle strømmer (hastighetsendring langs strømretningen), viser de resulterende COL1-hydrogelene en grad av fiberjustering som er direkte proporsjonal med størrelsen på ekstensjonsbelastningshastigheten de opplever37, 38. Mikrokanaldesignet i denne protokollen er unikt på to måter; For det første introduserer den segmenterte designen lokal forlengelsesbelastning til COL1-løsningen, og for det andre tillater den "todelte" konstruksjonen brukeren å justere COL1-fibre og deretter demontere kanalen for direkte tilgang til de justerte fibrene i et åpent format. Denne tilnærmingen kan videre tas i bruk for å utvikle modulære mikrofluidiske plattformer som utvikler mikrofysiologiske systemer med bestilte COL1-matriser. Følgende protokoll beskriver prosessen med å fremstille segmenterte mikrokanaler og beskriver bruken av kanalene for å justere storfe atelo COL1. Denne protokollen gir også instruksjoner for dyrking av celler på COL1 i et åpent brønnformat og diskuterer å legge til funksjonalitet til plattformen ved hjelp av et modulært, magnetisk baselag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabrikasjon av den todelte kanalen og modulære plattformbasen

MERK: Den mikrofluidiske kanalen er konstruert ved hjelp av to deler - den mikrofluidiske kanalen "cutout", som er barberhøvel kuttet fra et polydimetylsiloksan (PDMS) ark med definert tykkelse, og kanaldekselet, som reversibelt binder seg til utskjæringen og danner kanalen. Kanalen er omgitt av en poly (metylmetakrylat) (PMMA) ramme som vil fungere som et mediereservoar (figur 1). PMMA-rammen kan også brukes til å feste spesialiserte moduler magnetisk for ekstra funksjonalitet.

  1. Barberhøvelskjærekanaler fra PDMS-ark:
    MERK: Den mikrofluidiske kanalutformingen for dette trinnet er gitt i tilleggsfigur 1. Kanalen består av fem segmenter med lengde 5 mm hver og bredder på 10 mm, 5 mm, 2,5 mm, 1,25 mm og 0,75 mm. Kollagenoppløsningens hastighet, injisert med konstant strømningshastighet (50-400 μL·min−1), øker lokalt langs kanalen etter hvert som kanalbredden reduseres for å generere ekstensjonsstrøm.
    1. Monter et 250 μm tykt PDMS-ark på et plastbæreark og kutt den mikrofluidiske designen med en håndverkskutter med en bladdybde på 0,5 mm, 1 cm·s−1 hastighet og høy kraft.
    2. Bruk et ultralydbad, rengjør de mikrofluidiske kanalutskjæringene i 5 minutter. Skyll sonikerte kanaler i avionisert (DI) vann og tørk dem på en ren kokeplate ved 100 ° C i 5 minutter.
    3. Oppbevar kanalene i en ren, dekket petriskål til bruk.
  2. Fremstilling av PDMS-dekselet og overflatepassivering:
    MERK: Kanalutskjæringen fra seksjon 1.1 krever et deksel som kan plasseres på toppen av det for å lage en lukket kanal som en COL1-løsning kan injiseres i (tilleggsfigur 1). Dekselet kan fjernes etter at COL1 har selvmontert. For å minimere sjansene for at COL1 i kanalen binder seg til dekselet, passiveres dekselet ved bruk av bovint serumalbumin (BSA). Formdesignet for PDMS-dekselet følger med. Formen må være minst 2 mm tykk og skal ha et fotavtrykk som er lik fotavtrykket til den mikrofluidiske kanalutskjæringen. I denne protokollen var formavtrykket 35 mm x 15 mm.
    1. For å forberede formen, fest et ark med trykkfølsomt lim (PSA) til et 2,5 mm tykt ark med PMMA og laserkutt ønsket formform.
    2. Rengjør den laserkuttede PMMA-formen med en fuktig, lofri klut og fjern baksiden fra PSA-filmen. Fest formen til en 100 mm diameter silisiumskive bt som trykker godt ned.
    3. Forbered PDMS i forholdet 10: 1 (base: crosslinker). Bland kraftig i 1 min for å sikre riktig blanding og degas blandingen i et vakuumkammer for å fjerne luftbobler.
    4. Hell den avgassede PDMS-løsningen i PMMA/silisiumformen og herd på en kokeplate ved 100 °C i 20 minutter. La formen avkjøles, fjern herdet PDMS og trim overflødig med et barberblad.
      MERK: Forsikre deg om at silikonskiven vender mot sidene (flate sider) av PDMS-dekslene vender opp gjennom alle de følgende trinnene.
    5. Bruk en biopsistans med diameter på 1 mm for å lage innløps- og utløpshull som tilsvarer endene av den mikrofluidiske kanalen. Kanalutskjæringen fra trinn 1.1 kan brukes som en mal for å veilede posisjonen til hullene.
    6. Sonikere dekselet i isopropanol (IPA) i 5 minutter, skyll med DI-vann, tørk med en trykkluftkilde, og oppbevar deretter i en ren, dekket petriskål. Plasser petriskålen i et UV-steriliseringskammer (avdekket) i 1 min for å sterilisere.
    7. Dekk til og overfør til et biosikkerhetsskap (BSC).
    8. Pipette 300 μL 40 mg•ml-1 bovint serumalbumin (BSA) i 1x fosfatbufret saltvann (PBS) på PDMS-dekslene og fordel oppløsningen jevnt ved hjelp av en pipettespiss. Oppbevares i kjøleskap ved 4 °C i minst 4 timer før bruk.
    9. Flytt dekslene fra kjøleskapet til en BSC, vask 5x med 1x PBS, og la dem tørke i luft i 10 minutter.
      NOTAT: PDMS-dekslene kan oppbevares i kjøleskapet i opptil 1 uke etter at de er belagt med BSA.
  3. Glutaraldehydbehandling av dekkslips
    MERK: Funksjonalisering av dekslene med glutaraldehyd kovalent binder COL1 til dekselet og forhindrer hydrogelen i å løsne.
    1. Forbered en 2% (v / v) aminopropyltrietoksysilan (APTES) løsning i et glassbeger ved å tilsette 1 ml APTES til 49 ml aceton.
    2. Fortynn en 25% glutaraldehydoppløsning til 5% i DI-vann. Lag 2 ml oppløsning for hver 24 mm x 50 mm deksel. For 24 mm x 24 mm eller 22 mm x 22 mm deksler, lag 1 ml løsning for hver.
    3. Rengjør dekslene i en badet sonicator i 5 min ved hjelp av IPA. Skyll av IPA fra dekslene med DI-vann. IPA skylles helt når en glatt film av vann kan sees på dekselet.
    4. Tørk lokkene på en kokeplate i 5 min ved 100 °C. Legg de tørkede dekslene i rene petriskåler, slik at de ikke overlapper hverandre.
    5. Bruk en koronautløpsstav, og utsett dekslene for en koronautladning i 1 min hver.
      MERK: Dette trinnet skal utføres i et godt ventilert område eller en kjemisk hette.
    6. Fjern dekselene fra petriskålen og senk deretter ned i APTES-løsningen i 10 s innen 5 minutter etter koronaeksponering, og sørg for at dekselet er nedsenket.
      MERK: Sørg for å holde styr på hvilken side som ble behandlet med plasma og hold den vendt oppover.
    7. Deretter senker du dekselet i aceton i 10 s og tørker med trykkluft. Legg det tørre dekselet tilbake i petriskålen, behandlet side vendt opp.
      MERK: Gjenta trinn 1.3.5-1.3.7 for alle deksler.
    8. Pipett 1 ml glutaraldehydoppløsning på overflaten av hver dekkslip. Dekk til så mye overflate som mulig uten å la løsningen søle over kanten av dekslen. Mer glutaraldehydoppløsning kan tilsettes om nødvendig. Pass på at du ikke riper opp overflaten med pipettespissen.
    9. La dekkene stå i kontakt med løsningen i 30 minutter og skyll deretter med DI-vann i 20 s. Tørk dekslene med trykkluft og legg dem tilbake i petriskålene, med plasmabehandlet side opp.
      MERK: Dekselene kan oppbevares i opptil 1 uke ved romtemperatur (RT).
  4. Laserskjæring av den modulære magnetiske basen
    MERK: Utformingen av den modulære magnetiske basen er gitt i tilleggsfigur 1. Den modulære basen fungerer som en brønn for å holde mediet og kan også brukes til magnetisk å feste spesialiserte moduler, som beskrevet i tidligere publiserte arbeider 22,37,38,39.
    1. Klipp ut designene fra PMMA-laget ved hjelp av passende laserinnstillinger, for eksempel antall passeringer og effekt.
      MERK: Laserinnstillingene skal justeres slik at magnetene kan trykkes i PMMA-laget. Hver laser er forskjellig, og kuttparametrene må optimaliseres eksperimentelt. For en 45 W laser anbefales 100 % hastighet, 100 % effekt og 3 passeringer for å kutte 2 mm til 2 mm tykk PMMA.
    2. Vask den laserkuttede delen med såpe og vann for å fjerne rusk fra laserskjæringsprosessen.
      MERK: Ikke bruk løsemidler til å rengjøre laserkuttede deler. Løsemidler kan føre til forplantning av mikrosprekker i laserkuttede kanter.
  5. Montering av plattformen
    1. Skyv magneter (3/16 i diameter, 1/16 i tykk) for hånd inn i den laserkuttede basen. En myk hammer eller skrutrekker enden kan brukes til å skyve i magneten. Tykkelsen på magnetene må være mindre enn tykkelsen på PMMA-basen for å sikre at magnetene er flush med overflaten av basen.
      MERK: Magnetene tillater brukeren å legge til funksjonalitet til plattformen ved å feste tilleggsmoduler.
    2. Fjern underlaget fra PSA-arket og fest basen til et glutaraldehydbehandlet deksel med den funksjonaliserte siden vendt oppover.
    3. Plasser forsiktig PDMS-kanalutskjæringen i hulrommet som er definert av rammen. Trykk ned med pinsett med bred spiss for å fjerne luftbobler og sikre konform kontakt.
    4. Plasser det BSA-behandlede kanaldekselet på toppen av kanalutskjæringen, med BSA-siden vendt nedover. Forsikre deg om at væskeinntaks- og utløpsportene er justert med kanalen.
    5. Enheten er klar for COL1-injeksjon.

2. Injisere COL1-løsningen i mikrokanalen og fjerne dekselet for cellekulturapplikasjoner

  1. Klargjøring av COL1-løsningen
    1. Legg alle nødvendige reagenser (COL1 stamoppløsning [6 mg·ml−1], ultrarent vann, 10x PBS, 0,1 M NaOH) på is i biosikkerhetsskapet.
    2. Beregn volumet av reagenser som følger
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      Equation 4
      MERK: For å lage 1 ml 2,5 mg·ml−1 nøytralisert kollagen fra en 6 mg·ml−1-stam, tilsett 416,67 μL kollagen, 429,16 μL DI-vann, 100 μL 10x PBS og 54,16 μL 0,1 M NaOH for en endelig pH på 7. Tilsett 20 μL på 0,1 M NaOH for å oppnå en pH på 9,0.
    3. Tilsett reagensene i et tomt 5 ml hetteglass i følgende rekkefølge: i) COL1-lager, ii) DI-vann, iii) 10x PBS, iv) 0,1 M NaOH.
      MERK: Bruk en fortrengningspipette til å håndtere COL1-løsningen. Betydelig prøvetap kan oppstå hvis en vanlig pipette brukes, noe som fører til svingninger i den endelige oppløsningskonsentrasjonen.
    4. Øk pH i løsningen til ønsket pH (vanligvis mellom 7-9).
  2. Injisering av COL1-oppløsningen
    1. Plasser en sprøytepumpe, en avkjølt steril sprøyte, avkjølt nøytralisert COL1-oppløsning og en steril 20 G 90° vinkelspiss Luer låsekanyle inn i et biosikkerhetsskap. Legg COL1-oppløsningen i sprøyten, pass på at boblene ikke kommer inn.
    2. Fest 90° 20 G nålespissen til sprøyten, stikk sprøyten inn i sprøytepumpen, kanylen vendt ned, og klargjør nålen med COL1 oppløsningen.
    3. Sett sprøytepumpen på ønsket strømningshastighet, mellom 50-2000 μL/min.
    4. Plasser forberedte PDMS-kanaler (seksjon 1) på en laboratoriekontakt og nivå med nålen.
    5. Stikk kanylen inn i innløpsporten på PDMS-kanalen (bred side). Injiser kanalen til en ~30 μL dråpe COL1 samler seg på utløpssiden.
    6. Senk laboratoriekontakten og skill kanylen forsiktig fra den nylig fylte kanalen.
    7. Gjenta trinn 2.2.5-2.2.9 til alle kanalene er fylt med COL1-løsning.
    8. Legg de fylte kanalene i petriskålene sammen med en ren, lofri klut mettet med DI-vann for å forhindre dehydrering av den nydannede COL1-gelen.
    9. Dekk petriskålen og legg de lastede kanalene i inkubatoren (37 °C, 95 % fuktighet) i 2 timer før avskallingstrinnet.
  3. Avskalling og medielikevekt
    1. Eksponer den polymeriserte COL1-gelen ved å løfte av PDMS-dekselet med pinsett. BSA-behandlingen hindrer COL1 i å feste seg til dekselet.
    2. Tilsett 650 μL EGM til brønnen.
    3. La utstyret ligge i inkubatoren (37 °C, 95 % fuktighet) i minst 4 timer for å balansere gelen og mediet. Bytt ut mediet før såing med celler
  4. Sådd celler
    1. Plasser varme 0,25% trypsin- og kulturmedier sammen med ønsket antall 5 ml og 10 ml pipetter i biosikkerhetsskapet.
    2. Dyrkning av endotelceller i humane navleårer (HUVEC) til 80 % konfluens i endotelvekstmedier (EGM) ved 37 °C, i 95 % fuktighet. Plasser vevskulturkolben som inneholder HUVEC i BSC etter å ha kontrollert konfluens under et mikroskop.
    3. Kast mediet i T25-kolben og vask cellene 2x med 1x PBS. Tilsett 1 ml Trypsin i kolben og legg den i inkubatoren (37 °C, 95 % fuktighet) i 3 minutter.
    4. Kontroller kolben under mikroskopet etter 3 minutter for å sikre at cellene er helt løsrevet fra overflaten.
    5. Tilsett 3 ml EGM (med serum) til kolben for å nøytralisere trypsinet. Deretter overføres celleoppløsningen ved hjelp av en 5 ml pipette til et 15 ml konisk rør. Sentrifuger det koniske røret som inneholder celler ved 150 x g i 5 minutter.
    6. Plasser det koniske røret i biosikkerhetskabinettet og kast supernatanten uten å forstyrre cellepelleten. Resuspender cellene i 1 ml ferske kulturmedier.
    7. Tilsett og bland 15 mikroliter trypanblått og 15 mikrol av den resuspenderte celleoppløsningen i et konisk rør på 1 ml.
    8. Injiser trypan blå og celleløsning på begge sider av et celletellingslysbilde og sett lysbildet inn i en celletellingsenhet.
    9. Fortynn celleoppløsningen i endotelvekstmedier til den nødvendige konsentrasjonen basert på cellekonsentrasjonen oppnådd fra celletellingsenheten.
      MERK: En T25-kolbe med HUVEC ved 80 % konfluens vil gi ~ 750 000 celler · ml-1 hvis fortynnet i 1 ml media. Volumet av cellesuspensjonen som skal sås beregnes som areal av kulturoverflaten × celletetthet/konsentrasjon av cellesuspensjon. Eksempel: For å så 20 000 celler·cm−2 i 35 mm x 15 mm brønnen, trenger man ~140 μL av cellesuspensjonen.
    10. Aspirer mediet på den konstruerte COL1-matrisen.
    11. Tilsett det nødvendige volumet av celleløsningen på COL1-substratet og la cellene slå seg ned i minst 4 timer før avbildning.
  5. Merking av cellekjernen og cytoskjelettet
    1. Aspirer mediet fra cellene og vask 3x med 1x PBS, 500 μL i hver vask. Dekk cellelaget med 4% paraformaldehyd i 15 min ved RT.
    2. Aspirer paraformaldehydet og vask med 1x PBS Tween-20 i 5 min.
    3. Permeabiliser cellemembranen med 500 μL 0,1% Triton-X-løsning i PBS i 15 minutter. Vask med 1x PBS Tween-20 i 5 min.
    4. Blokker de ikke-spesifikke bindingsstedene med 500 μL 4% BSA i PBS i 30 minutter ved RT.
    5. Fortynn den falloidin-aktinfluorescerende etikettløsningen i 4% BSA (1 μL av lager i 400 μL BSA).
    6. Aspirer BSA-løsningen, tilsett falloidinoppløsningen til cellene, og vent i 30 minutter ved RT.
    7. Fortynn atomflekken i 4% BSA (1 μL i 500 μL), aspirer falloidinet, tilsett den fungerende kjernefysiske flekkløsningen og vent i 15 minutter ved RT.
    8. Aspirer den kjernefysiske flekkarbeidsløsningen, vask med PBS Tween-20 3x i 5 minutter hver, og erstatt med 1x PBS før avbildning.
    9. Bilde ved hjelp av et epifluorescerende mikroskop ved hjelp av FITC-kanalen (f.eks. 491 nm/em 516 nm) og DAPI-kanalen (f.eks. 360 nm/em 460 nm) med et 40x-objektiv. Avbilde kollagenet ved hjelp av en laserskanning konfokal i refleksjonsmodus ved hjelp av 488 nm laserlinje (15% effekt) og 40x vann-nedsenking mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når en selvmonterende COL1-løsning strømmer gjennom en kanal med avtagende tverrsnittsareal, øker strømhastigheten (v x) til COL1-løsningen lokalt med en størrelse, ∂v x, langs lengden av innsnevringen mellom de to segmentene (∂x), noe som resulterer i en ekstensjonsbelastningshastighet (ε̇) hvor ε̇ = ∂v x/∂x. Den ekstensjonelle belastningshastigheten kan beregnes ut fra væskehastigheten, som måles ved hjelp av partikkelbildehastighet (PIV), som vist i figur 2.

Tidligere er det vist at lokal ekstensjonsstamme fremmer langtrekkende COL1-fiberjustering37,38,40 (figur 3). Justeringen av COl1 påvirkes direkte av størrelsen på den ekstensjonelle belastningshastigheten i innsnevringen og kan observeres å strekke seg jevnt gjennom hele segmentets 5 mm lengde. For å måle fiberjusteringen ble konfokal refleksjonsmikroskopi (CRM) bilder av fibre brukt til å lage et histogram for fiberjustering. Justeringskoeffisienten (CoA) er brøkdelen av fibre justert innenfor ±15° av modusverdien i histogrammet 38,42,43,44. CoA-intervaller fra 0-1 med verdier >0,5 ble ansett som justert.

Injisering av en 3D-hydrogel i tradisjonelle, forseglede mikrokanalgrenser der medier og celler kan introduseres til matrisen. Den todelte kanalen i denne protokollen overvinner begrensningen av å få tilgang til en hydrogel i en kanal ved å la brukeren løfte av kanaldekselet og få direkte tilgang til hele COL1-matrisen. Kanalløft aktiveres ved å funksjonalisere glassdekselet med glutaraldehyd for å fremme COL1-vedlegg ved hjelp av amin-aldehyd-amin-interaksjoner og funksjonalisere PDMS-dekselet med BSA for å forhindre COL1-adsorpsjon på dekselet. COL1-fiberjusteringen forblir upåvirket etter løfting av dekselet, som vist visuelt i figur 4.

Justerte COL1-substrater er kjent for å påvirke cellejustering ved å rette fremspring 9,12,45,46 og i sin tur organisering av spenningsfilamenter. Endotelceller i de ujusterte og justerte COL1-segmentene ble avbildet for å undersøke den cellulære responsen på COL1-matrisene utviklet ved hjelp av denne protokollen. Cellene ble festet og farget 4 timer etter såing. Representative bilder av HUVECene dyrket på det justerte segmentet av matrisen viste økt aktinfiberjustering sammenlignet med HUVECene på segmentet med tilfeldige fibre (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk visning av sammenstillingen av lagene. Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Ahmed et al.38. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Trappede kanal- og ekstensjonsbelastningshastigheter . (A) Skjematisk av den trinnvise kanalen med dimensjoner. Outset viser beregningen av ekstensjonsbelastningshastigheten. Den ekstensjonelle belastningshastigheten i hver innsnevring beregnes ut fra hastigheten målt ved hjelp av partikkelbildehastighet (PIV). (B) De ekstensjonelle belastningshastighetene i hver innsnevring. Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Ahmed et al.38. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Konfokale refleksjonsbilder av COL1-fibre i hvert mikrokanalsegment etter COL1-polymerisasjon. Økningen i graden av fiberjustering fra segment (a) til segment (e) kan observeres visuelt. Skala bar = 25 μm. Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Ahmed et al.38. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Konfokale refleksjonsbilder av COL1-fibre som viser at fiberjusteringen forblir upåvirket ved å fjerne kanaldekselet. Skala bar = 25 μm. Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Ahmed et al.38. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative bilder av celler og COL1-fibre. Representative bilder av celler og COL1-fibre i segment (e) i COL1-matrisen og segmentet (a) i COL1-matrisen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Figur som viser laserkuttede komponenter med dimensjoner. (A) Kanal, (B) magnetisk base og (C) kanaldekselform. Alle dimensjoner i millimeter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokoller for å generere COL1-matriser med justerte fibre har blitt beskrevet ved hjelp av magnetiske metoder, direkte anvendelse av mekanisk belastning og mikrofluidiske teknikker47. Mikrofluidiske tilnærminger brukes ofte til å skape mikrofysiologiske systemer på grunn av deres veldefinerte strømnings- og transportegenskaper, noe som muliggjør presis kontroll over det biokjemiske mikromiljøet. Siden justerte COL1-fibre gir viktige instruktive signaler under patofysiologiske prosesser som sårheling, tumorcelleinvasjon og vevsutvikling, er generering av justerte COL1-matriser i mikrofluidiske systemer et skritt mot å utvikle biologisk relevante mikrofysiologiske systemer.

Denne protokollen gir muligheten til å fremstille millimeterskala, justerte COL1-matriser med regioner med definert fiberjustering. For å indusere justering brukes en mikrofluidisk kanal med trinnvise reduksjoner i bredden. Når en selvmonterende COL1-løsning strømmer gjennom kanalen med konstant strømningshastighet, øker løsningsstrømningshastigheten ved innsnevringene, noe som resulterer i lokal ekstensjonsbelastning og langdistansejustering av de selvmonterende COL1-fibrene. Sammenlignet med skjærstrømningsindusert fiberjustering, observerte vi fiberjustering i kanaler opp til 250 μm i tykkelse, slik at vi kunne lage 3D-hydrogeler i en mikrofluidisk kanal. Siden COL1-fiberjustering er avhengig av ekstensjonsbelastningshastigheten, kan brukerne endre den medfølgende kanalen eller utvikle tilpassede kanaldesign for å generere ekstensjonsflyt og lage COL1-matriser av ønsket størrelse og form. Ytterligere fleksibilitet er gitt gjennom myk litografifri fabrikasjon av kanalene, noe som muliggjør rask prototyping av kanaldesign.

Den todelte kanaltilnærmingen som presenteres i denne protokollen, overvinner begrensningene ved tilgang til en 3D-hydrogel i mikrokanaler. En todelt kanal gir direkte tilgang til COL1-hydrogelen, hvor kanaldekselet kan løftes av for å avsløre COL1-matrisen i kanalen. Direkte tilgang til COL1 etter polymerisering eliminerer behovet for at celler blandes inn i COL1-forløperløsningen, slik at en bruker kan manipulere COL1-forløperløsningen i lengre perioder ved ikke-fysiologisk pH og lave temperaturer. Videre kan en modulær tilnærming brukes til å plassere cellene og gi lag-for-lag biofabrication evner, som vist i vårt tidligere arbeid. Moduler kan brukes til å introdusere membraner for samkultur, introdusere kontinuerlig perfusjon, og også lage flerlags ECM-konstruksjoner 22,38,39. Tilpassede moduler kan også fremstilles avhengig av eksperimentelle behov. Sammen med magnetisk låsing er den modulære tilnærmingen også godt egnet til eksperimenter som krever å legge til funksjonalitet med tiden.

Det er noen kritiske trinn som må vurderes i denne protokollen. Alle komponenter, inkludert kanalutskjæringen, dekselet, dekselene og modulbasen, skal rengjøres på riktig måte for å sikre riktig liming og kjemisk funksjonalisering. Kollagenet skal tilberedes på is, og alle komponentene må holdes kalde for å sikre konsistens. Etter tilberedning skal kollagenoppløsningen brukes innen 10 minutter etter tilberedning. Den endelige pH-verdien i kollagenoppløsningen må måles med en pH-sonde for å sikre konsistens. En ren, fuktig klut må plasseres i petriskålen med kollagenet for å sikre at kollagenet ikke tørker ut i den varme inkubatoren.

Noen modifikasjoner og feilsøking av protokollen inkluderer følgende. (i) Hvis media lekker under cellekultur, bør man sørge for at PMMA-rammen og dekslene er festet uten hull i limlaget. (ii) Hvis magnetene ikke er satt i flukt i underlaget, vil de forhindre at dekselet fester seg til basen, noe som resulterer i hull. (iii) Glutaraldehydbelegget på dekselet kan også ha en lavere konsentrasjon om nødvendig (ned til 0,1%). Den optimale konsentrasjonen av glutaraldehyd for å forhindre toksisitet bør bestemmes eksperimentelt for hver cellelinje som skal brukes i forsøket, siden glutaraldehyd kan presentere toksisitet for celler. (iv) Man kan inkludere ekstra materialer som hyaluronsyre, fibronektin eller fluorescerende perler sammen med kollagen for å tilpasse matrisen ytterligere. (v) Om nødvendig kan kanaldesignet endres for å ha lengre eller kortere segmenter for å unngå grense- og kanteffekter48.

Denne protokollen har følgende begrensninger. Atelo bovint kollagen er et mykt materiale (G '<100 Pa) ved 2,5 mg · ml -1. For å øke gelstivheten kan forskere bruke høyere konsentrasjoner av kollagen eller introdusere tverrbindingsmidler. Selv om denne protokollen bare er validert for justering av kollagenmatriser opp til 250 μm i tykkelse, kan tykkere matriser utvikles ved å øke kanaltykkelsen og optimalisere strømningshastighetene for å introdusere tilstrekkelige ekstensjonsbelastningshastigheter.

Det forventes at denne protokollen vil være til nytte for forskere som ønsker å utvikle vevsspesifikke bestilte mikromiljøer. Det kan også brukes som en veiledning for å lage modulære fluidiske plattformer for å etablere mikrofysiologiske systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere oppgir ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institute of Health under tildelingsnummer R21GM143658 og av National Science Foundation under tilskuddsnummer 2150798. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til finansieringsorganene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) Sigma Aldrich 440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip Jensen Global JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet KJ Magnetics D31
3M (TC) 12X12-6-467MP DigiKey 3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% Signa Aldrich 179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER Electro-Technic Products 12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar VWR AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet McMaster-Carr 8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested VWR 45000-666
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CT-FIRE software LOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL Lonza CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL VWR VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50 Graphtec CE LITE-50
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer McMaster-Carr 87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells Thermo Fisher Scientific C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
Isopropanol Fisher Scientific A4154
Laser cutter Full Spectrum 20x12 H-series
Microfluidics Syringe pump New Era Syringe Pumps NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E Gilson FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen Advanced BioMatrix 5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4 VWR 70011044.00
PBS pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 Alfa Aesar J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 USCUTTER GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip Restek 22766.00
Silicon wafer University wafer 452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g VWR BDH9292-500G
Sylgard 184 VWR 102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 Thermo Fisher Scientific 28352.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
  3. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  4. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  5. Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058 (2011).
  6. Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
  7. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  8. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11 (2008).
  9. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  10. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  11. Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
  12. Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107 (2018).
  13. Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
  14. Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
  15. Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780 (2019).
  16. Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323 (2018).
  17. Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
  18. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  19. Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506 (2018).
  20. Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016 (2017).
  21. Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
  22. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341 (2016).
  23. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
  24. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769 (2022).
  25. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
  26. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
  28. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
  29. Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848 (2021).
  30. Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911 (2018).
  31. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
  32. Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
  33. Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276 (2021).
  34. Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
  35. Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
  36. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  37. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
  38. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
  39. Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
  40. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  41. Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931 (2020).
  42. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  43. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  44. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
  45. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  46. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
  47. Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).

Tags

Tilbaketrekking utgave 187
Microengineering 3D kollagenhydrogeler med langdistanse fiberjustering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M.… More

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M. R., Vidas, J. A., Byerley, A. M., Mansouri, M., Day, S. W., Abhyankar, V. V. Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment. J. Vis. Exp. (187), e64457, doi:10.3791/64457 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter