Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microengineering 3D kollagenhydrogeler med langtrækkende fiberjustering

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

Denne protokol demonstrerer brugen af en mikrofluidisk kanal med skiftende geometri langs væskestrømningsretningen for at generere ekstensionel belastning (strækning) for at justere fibre i en 3D-kollagenhydrogel (<250 μm i tykkelse). Den resulterende justering strækker sig over flere millimeter og påvirkes af den ekstensionelle belastningshastighed.

Abstract

Justerede kollagen I (COL1) fibre styrer tumorcellemotilitet, påvirker endotelcellemorfologi, styrer stamcelledifferentiering og er et kendetegn for hjerte- og muskuloskeletale væv. For at studere cellerespons på justerede mikromiljøer in vitro er der udviklet flere protokoller til at generere COL1-matricer med defineret fiberjustering, herunder magnetiske, mekaniske, cellebaserede og mikrofluidiske metoder. Af disse tilbyder mikrofluidiske tilgange avancerede muligheder såsom nøjagtig kontrol over væskestrømme og det cellulære mikromiljø. Imidlertid har de mikrofluidiske tilgange til generering af justerede COL1-matricer til avancerede in vitro-kulturplatforme været begrænset til tynde "måtter" (<40 μm i tykkelse) af COL1-fibre, der strækker sig over afstande mindre end 500 μm og ikke er befordrende for 3D-cellekulturapplikationer. Her præsenterer vi en protokol til fremstilling af 3D COL1-matricer (130-250 μm i tykkelse) med millimeterskalaområder med defineret fiberjustering i en mikrofluidisk enhed. Denne platform giver avancerede cellekulturfunktioner til modellering af strukturerede vævsmikromiljøer ved at give direkte adgang til den mikrokonstruerede matrix til cellekultur.

Introduction

Celler befinder sig i et komplekst 3D-fibrøst netværk kaldet den ekstracellulære matrix (ECM), hvoraf hovedparten består af det strukturelle protein kollagen type I (COL1)1,2. ECM's biofysiske egenskaber giver vejledende signaler til celler, og som svar ombygger celler ECM-mikroarkitekturen 3,4,5. Disse gensidige celle-matrix-interaktioner kan give anledning til justerede COL1-fiberdomæner6, der fremmer angiogenese og celleinvasion i tumormiljøet 7,8,9 og påvirker cellemorfologi 10,11,12, polarisering 13 og differentiering 14. Justerede kollagenfibre fremmer også sårheling15, spiller en nøglerolle i vævsudvikling 16 og bidrager til langtrækkende cellekommunikation17,18. Derfor er replikering af den oprindelige COL1-fibermikroarkitektur in vitro et vigtigt skridt i retning af at udvikle strukturerede modeller til at studere celleresponser på justerede mikromiljøer.

Mikrofluidiske cellekultursystemer er blevet etableret som en foretrukken teknologi til udvikling af mikrofysiologiske systemer (MPS)19,20,21,22,23. Ved at udnytte gunstige mikroskalaskaleringseffekter giver disse systemer præcis kontrol over væskestrømme, understøtter kontrolleret introduktion af mekaniske kræfter og definerer det biokemiske mikromiljø inden for en mikrokanal 21,24,25,26,27. MPS-platforme er blevet brugt til at modellere vævsspecifikke mikromiljøer og studere multiorganinteraktioner28. Samtidig er hydrogeler blevet bredt udforsket for at rekapitulere 3D-mekanikken og den biologiske indflydelse af ECM, der observeres in vivo29,30. Med en stigende vægt på at integrere 3D-kultur med mikrofluidiske platforme kan mange tilgange kombinere COL1-hydrogeler i mikrofluidiske enheder31,32,33. Imidlertid har metoderne til justering af COL1-hydrogeler i mikrofluidiske kanaler været begrænset til tynde 2D "måtter" (<40 μm i tykkelse) i kanaler <1 mm brede, hvilket giver begrænset potentiale til at modellere celleresponser i justerede3D-mikromiljøer 31,34,35,36.

For at opnå justerede 3D COL1-hydrogeler i et mikrofluidisk system har det vist sig, at når en selvsamlende COL1-opløsning udsættes for lokale udvidelsesstrømme (hastighedsændring langs strømretningen), viser de resulterende COL1-hydrogeler en grad af fiberjustering, der er direkte proportional med størrelsen af den ekstensionelle belastningshastighed, de oplever37, 38. Mikrokanaldesignet i denne protokol er unikt på to måder; For det første introducerer det segmenterede design lokal udvidelsesbelastning til COL1-løsningen, og for det andet giver dens "todelte" konstruktion brugeren mulighed for at justere COL1-fibre og derefter adskille kanalen for direkte adgang til de justerede fibre i et åbent format. Denne tilgang kan yderligere vedtages for at udvikle modulære mikrofluidiske platforme, der udvikler mikrofysiologiske systemer med ordnede COL1-matricer. Følgende protokol beskriver processen med fremstilling af segmenterede mikrokanaler og beskriver brugen af kanalerne til justering af bovin atelo COL1. Denne protokol indeholder også instruktioner til dyrkning af celler på COL1 i et åbent brøndformat og diskuterer tilføjelse af funktionalitet til platformen ved hjælp af et modulært, magnetisk basislag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af den todelte kanal og modulære platformbase

BEMÆRK: Den mikrofluidiske kanal er konstrueret ved hjælp af to dele - den mikrofluidiske kanal "udskæring", som er barberbladsskåret fra et polydimethylsiloxan (PDMS) ark med defineret tykkelse, og kanaldækslet, som reversibelt binder til udskæringen og danner kanalen. Kanalen er omgivet af en poly (methylmethacrylat) (PMMA) ramme, der fungerer som et mediereservoir (figur 1). PMMA-rammen kan også bruges til magnetisk at låse specialiserede moduler for ekstra funktionalitet.

  1. Barbermaskine skærekanaler fra PDMS ark:
    BEMÆRK: Det mikrofluidiske kanaldesign for dette trin er vist i supplerende figur 1. Kanalen består af fem segmenter af længde 5 mm hver og bredder på 10 mm, 5 mm, 2,5 mm, 1,25 mm og 0,75 mm. Kollagenopløsningens hastighed, injiceret med en konstant strømningshastighed (50-400 μL·min−1), øges lokalt langs kanalen, da kanalbredden reduceres for at generere ekstensionel strømning.
    1. Monter et 250 μm tykt PDMS-ark på en plastbæreplade, og skær det mikrofluidiske design med kniv ved hjælp af en håndværksskærer i en klingedybde på 0,5 mm, 1 cm·s-1 hastighed og høj kraft.
    2. Brug et ultralydbad til at rengøre de mikrofluidiske kanaludskæringer i 5 minutter. Skyl de sonikerede kanaler i deioniseret (DI) vand og tør dem på en ren kogeplade ved 100 ° C i 5 min.
    3. Opbevar kanalerne i en ren, overdækket petriskål indtil brug.
  2. Fremstilling af PDMS-dækslet og overfladepassivering:
    BEMÆRK: Kanaludskæringen fra afsnit 1.1 kræver et dæksel, der kan placeres oven på det for at skabe en lukket kanal, som en COL1-opløsning kan injiceres i (supplerende figur 1). Dækslet kan fjernes, når COL1 er samlet selv. For at minimere chancerne for COL1 i kanalbindingen til dækslet passiveres dækslet ved hjælp af bovint serumalbumin (BSA). Formdesignet til PDMS-dækslet leveres. Formen skal være mindst 2 mm tyk og skal have et fodaftryk, der svarer til fodaftrykket af den mikrofluidiske kanaludskæring. I denne protokol var formfodaftrykket 35 mm x 15 mm.
    1. For at forberede formen skal du fastgøre et ark trykfølsomt klæbemiddel (PSA) på et 2,5 mm tykt ark PMMA og laserskære den ønskede formform.
    2. Rengør den laserskårne PMMA-form med en fugtig, fnugfri serviet, og fjern bagsiden af PSA-filmen. Fastgør formen til en siliciumskive med en diameter på 100 mm, der presses fast ned.
    3. Forbered PDMS i forholdet 10:1 (base: crosslinker). Bland kraftigt i 1 min for at sikre korrekt blanding og afgas blandingen i et vakuumkammer for at fjerne luftbobler.
    4. Hæld den afgassede PDMS-opløsning i PMMA/siliciumformen og hærd på en kogeplade ved 100 °C i 20 minutter. Lad formen køle af, fjern det hærdede PDMS, og trim eventuelt overskud med et barberblad.
      BEMÆRK: Sørg for, at siderne af PDMS-dækslerne mod siliciumskiven vender opad i alle følgende trin.
    5. Brug en biopsitang med en diameter på 1 mm til at skabe indløbs- og udløbshuller, der svarer til enderne af den mikrofluidiske kanal. Kanaludskæringen fra trin 1.1 kan bruges som skabelon til at styre hullernes placering.
    6. Soniker dækslet i isopropanol (IPA) i 5 minutter, skyl med DI-vand, tør med en trykluftkilde, og opbevar derefter i en ren, overdækket petriskål. Anbring petriskålen i et UV-steriliseringskammer (uden låg) i 1 min for at sterilisere.
    7. Dæk og overfør til et biosikkerhedsskab (BSC).
    8. Der pipetteres 300 μl 40 mg•ml-1 bovin serumalbumin (BSA) i 1x fosfatbufret saltvand (PBS) på PDMS-dækslerne, og opløsningen fordeles jævnt ved hjælp af en pipettespids. Anbring i køleskab ved 4 °C i mindst 4 timer før brug.
    9. Flyt dækslerne fra køleskabet til en BSC, vask 5x med 1x PBS, og lad dem tørre i luft i 10 min.
      BEMÆRK: PDMS-dækslerne kan opbevares i køleskabet i op til 1 uge efter belægning med BSA.
  3. Glutaraldehydbehandling af dæksedler
    BEMÆRK: Funktionalisering af dæksedlerne med glutaraldehyd binder kovalent COL1 til dækselen og forhindrer hydrogelen i at løsne sig.
    1. Der fremstilles en 2% (v/v) aminopropyltriethoxysilanopløsning (APTES) i et glasbægerglas ved at tilsætte 1 ml APTES til 49 ml acetone.
    2. Fortynd en 25% glutaraldehydopløsning til 5% i DI-vand. Lav 2 ml opløsning for hver 24 mm x 50 mm dæksel. For 24 mm x 24 mm eller 22 mm x 22 mm dæksler skal du lave 1 ml opløsning til hver.
    3. Rengør dækslerne i en bad sonikator i 5 minutter ved hjælp af IPA. Skyl IPA'en af dækslerne med DI-vand. IPA'en skylles helt, når en glat film af vand kan ses på dæksedlen.
    4. Tør dækslerne på en kogeplade i 5 minutter ved 100 °C. Læg de tørrede dæksler i rene petriskåle, og sørg for, at de ikke overlapper hinanden.
    5. Brug en koronaudladningsstav til at udsætte dæksedlerne for en koronaudladning i 1 min hver.
      BEMÆRK: Dette trin skal udføres i et godt ventileret område eller en kemisk hætte.
    6. Fjern dæksedlerne fra petriskålen, og nedsænk derefter i APTES-opløsningen i 10 s inden for 5 minutter efter koronaeksponering, hvilket sikrer, at dækslet er nedsænket.
      BEMÆRK: Sørg for at holde styr på, hvilken side der blev behandlet med plasma, og hold den opad.
    7. Nedsænk derefter dækslet i acetone i 10 s og tør med trykluft. Læg det tørre dæksel tilbage i petriskålen med den behandlede side opad.
      BEMÆRK: Gentag trin 1.3.5-1.3.7 for alle dæksedlerne.
    8. Der pipetteres 1 ml glutaraldehydopløsning på overfladen af hvert dæksel. Dæk så meget overflade som muligt uden at lade opløsningen spildes ud over kanten af dæksedlen. Mere glutaraldehydopløsning kan tilsættes om nødvendigt. Sørg for ikke at ridse overfladen med pipettespidsen.
    9. Lad dækslerne sidde i kontakt med opløsningen i 30 min og skyl derefter med DI-vand i 20 s. Tør dækslerne med trykluft og læg dem tilbage i petriskålene med plasmabehandlet side opad.
      BEMÆRK: Dæksedlerne kan opbevares i op til 1 uge ved stuetemperatur (RT).
  4. Laserskæring af den modulære magnetiske base
    BEMÆRK: Udformningen af den modulære magnetiske base er vist i supplerende figur 1. Den modulære base fungerer som en brønd til at holde medierne og kan også bruges til magnetisk at fastgøre specialiserede moduler, som beskrevet i tidligere offentliggjorte værker 22,37,38,39.
    1. Klip designene ud af PMMA-laget ved hjælp af passende laserindstillinger såsom antallet af gennemløb og effekt.
      BEMÆRK: Laserindstillingerne skal justeres, så magneterne kan trykkes monteret i PMMA-laget. Hver laser er forskellig, og skæreparametrene skal optimeres eksperimentelt. Til en 45 W laser anbefales 100 % hastighed, 100 % effekt og 3 gennemløb til skæring af PMMA fra 2 mm til 2 mm tykkelse.
    2. Vask den laserskårne del med sæbe og vand for at fjerne snavs fra laserskæreprocessen.
      BEMÆRK: Brug ikke opløsningsmidler til at rengøre de laserskårne dele. Opløsningsmidler kan resultere i spredning af mikrokrakker i de laserskårne kanter.
  5. Montering af platformen
    1. Skub magneter (3/16 i diameter, 1/16 i tyk) med hånden ind i den laserskårne base. En blød hammer eller skruetrækker ende kan bruges til at hjælpe med at skubbe magneten ind. Magneternes tykkelse skal være mindre end tykkelsen af PMMA-basen for at sikre, at magneterne flugter med basens overflade.
      BEMÆRK: Magneterne giver brugeren mulighed for at tilføje funktionalitet til platformen ved at vedhæfte yderligere moduler.
    2. Fjern bagsiden fra PSA-arket, og fastgør basen til et glutaraldehydbehandlet dæksel med den funktionaliserede side opad.
    3. Placer forsigtigt PDMS-kanaludskæringen i hulrummet, der er defineret af rammen. Tryk ned med en pincet med bred spids for at fjerne luftbobler og sikre konform kontakt.
    4. Placer det BSA-behandlede kanaldæksel oven på kanaludskæringen med BSA-siden nedad. Sørg for, at væskeindløbs- og udløbsportene er justeret med kanalen.
    5. Enheden er klar til COL1-injektion.

2. Injektion af COL1-opløsningen i mikrokanalen og fjernelse af dækslet til cellekulturapplikationer

  1. Klargøring af COL1-opløsningen
    1. Anbring alle de nødvendige reagenser (COL1-stamopløsning [6 mg·ml−1], ultrarent vand, 10x PBS, 0,1 M NaOH) på is i biosikkerhedsskabet.
    2. Beregn mængden af reagenser som følger:
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      Equation 4
      BEMÆRK: For at fremstille 1 ml 2,5 mg · ml - 1 neutraliseret kollagen fra en 6 mg · ml - 1 lager tilsættes 416,67 μL kollagen, 429,16 μL DI vand, 100 μL 10x PBS og 54,16 μL 0,1 M NaOH for en endelig pH på 7. Der tilsættes 20 μL 0,1 M NaOH for at opnå en pH-værdi på 9,0.
    3. Tilsæt reagenserne i et tomt 5 ml hætteglas i følgende rækkefølge: i) COL1-lager, ii) DI-vand, iii) 10x PBS, iv) 0,1 M NaOH.
      BEMÆRK: Brug en fortrængningspipette til at håndtere COL1-opløsningen. Der kan forekomme betydeligt prøvetab, hvis der anvendes en almindelig pipette, hvilket fører til udsving i koncentrationen af den endelige opløsning.
    4. Løft opløsningens pH til den ønskede pH (typisk mellem 7-9).
  2. Injektion af COL1-opløsningen
    1. Anbring en sprøjtepumpe, en afkølet steril sprøjte, afkølet neutraliseret COL1-opløsning og en steril 20 G 90° vinkelspids Luer lock kanyle i et biosikkerhedsskab. Læg COL1-opløsningen i sprøjten, og pas på at undgå at indføre bobler.
    2. Sæt kanylespidsen på 90° 20 G på sprøjten, læg sprøjten i sprøjtepumpen med nålen nedad, og prim kanylen med COL1-opløsningen.
    3. Indstil sprøjtepumpen til den ønskede gennemstrømningshastighed, mellem 50-2.000 μL/min.
    4. Placer forberedte PDMS-kanaler (sektion 1) på en laboratoriestik, og nivellere med nålen.
    5. Indsæt nålen i PDMS-kanalens indløbsport (bredsiden). Injicer kanalen, indtil en ~30 μL dråbe COL1 samler sig på udløbssiden.
    6. Sænk laboratoriestikket, og adskil forsigtigt nålen fra den nyligt fyldte kanal.
    7. Gentag trin 2.2.5-2.2.9, indtil alle kanaler er fyldt med COL1-opløsning.
    8. Læg de fyldte kanaler i petriskålene sammen med en ren, fnugfri serviet mættet med DI-vand for at forhindre dehydrering af den nydannede COL1-gel.
    9. Dæk petriskålen og læg de fyldte kanaler i inkubatoren (37 °C, 95% fugtighed) i 2 timer før afskalningstrinnet.
  3. Skræl af og medieligevægt
    1. Udsæt den polymeriserede COL1-gel ved at løfte PDMS-dækslet af med pincet. BSA-behandlingen forhindrer COL1 i at sætte sig fast på dækslet.
    2. Tilsæt 650 μL EGM til brønden.
    3. Lad apparaterne blive i inkubatoren (37 °C, 95 % fugtighed) i mindst 4 timer for at bringe gelen og mediet i ligevægt. Udskift mediet inden såning med celler
  4. Såning af celler
    1. Anbring varme 0,25% trypsin og kulturmedier sammen med det nødvendige antal 5 ml og 10 ml pipetter i biosikkerhedsskabet.
    2. Kultur humane navlestrengendototelceller (HUVEC'er) til 80% sammenløb i endotelvækstmedier (EGM) ved 37 ° C, i 95% fugtighed. Vævskulturkolben indeholdende HUVEC'er anbringes i BSC efter kontrol af sammenløbet under et mikroskop.
    3. Mediet i T25-kolben kasseres, og cellerne vaskes 2x med 1x PBS. Tilsæt 1 ml trypsin til kolben og læg den i inkubatoren (37 °C, 95% fugtighed) i 3 minutter.
    4. Kontroller kolben under mikroskopet efter 3 min for at sikre, at cellerne er helt løsrevet fra overfladen.
    5. Tilsæt 3 ml EGM (med serum) til kolben for at neutralisere trypsinet. Overfør derefter celleopløsningen ved hjælp af en 5 ml pipette til et 15 ml konisk rør. Det koniske rør indeholdende celler centrifugeres ved 150 x g i 5 min.
    6. Det koniske rør anbringes i biosikkerhedsskabet, og supernatanten kasseres, uden at cellepillen forstyrres. Resuspender cellerne i 1 ml friske dyrkningsmedier.
    7. Der tilsættes og blandes 15 μL trypanblåt og 15 μL af den opslæmmede celleopløsning i et 1 ml konisk rør.
    8. Injicer trypanblå og celleopløsning på begge sider af et celletællingsdias, og indsæt diaset i en celletælleenhed.
    9. Celleopløsningen fortyndes i endotelvækstmedier til den krævede koncentration baseret på cellekoncentrationen opnået fra celletælleanordningen.
      BEMÆRK: En T25-kolbe HUVEC'er ved 80% sammenløb giver ~ 750.000 celler · ml-1 , hvis den fortyndes i 1 ml medie. Volumenet af den cellesuspension, der skal podes, beregnes som arealet af dyrkningsoverfladen × celletætheden/koncentrationen af cellesuspensionen. Eksempel: For at frø 20.000 celler · cm-2 i 35 mm x 15 mm brønden skal man bruge ~ 140 μL af cellesuspensionen.
    10. Opsug mediet på den konstruerede COL1-matrix.
    11. Tilsæt det nødvendige volumen af celleopløsningen på COL1-substratet, og lad cellerne sætte sig i mindst 4 timer før billeddannelse.
  5. Mærkning af cellekernen og cytoskelettet
    1. Opsug mediet fra cellerne og vask 3x med 1x PBS, 500 μL i hver vask. Dæk cellelaget med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved RT.
    2. Opsug paraformaldehydet og vask med 1x PBS Tween-20 i 5 min.
    3. Permeabiliser cellemembranen med 500 μL 0,1% Triton-X-opløsning i PBS i 15 min. Vask med 1x PBS Tween-20 i 5 min.
    4. Bloker de ikke-specifikke bindingssteder med 500 μL 4% BSA i PBS i 30 minutter ved RT.
    5. Phalloidin-actin-fluorescerende etiketopløsning fortyndes i 4% BSA (1 μL lager i 400 μL BSA).
    6. Opsug BSA-opløsningen, tilsæt phalloidinopløsningen til cellerne, og vent i 30 minutter ved RT.
    7. Fortynd den nukleare plet i 4% BSA (1 μL i 500 μL), aspirer phalloidin, tilsæt den fungerende nukleare pletopløsning, og vent i 15 minutter ved RT.
    8. Opsug den nukleare pletarbejdsløsning, vask med PBS Tween-20 3x i 5 minutter hver, og udskift med 1x PBS før billeddannelse.
    9. Billede ved hjælp af et epifluorescerende mikroskop ved hjælp af FITC-kanalen (ex 491 nm/em 516 nm) og DAPI-kanalen (ex 360 nm/em 460 nm) med et 40x objektiv. Billede kollagen ved hjælp af en laserscanningskonfokal i reflektionstilstand ved hjælp af 488 nm laserlinjen (15% effekt) og 40x vandnedsænkningsmålet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når en selvsamlende COL1-opløsning strømmer gennem en kanal med faldende tværsnitsareal, øges COL1-opløsningens strømvise hastighed (v x) lokalt med en størrelsesorden ∂v x langs længden af indsnævringen mellem de to segmenter (∂x), hvilket resulterer i en ekstensionel belastningshastighed (ε̇), hvor ε̇ = ∂v x/∂x. Den ekstensive belastningshastighed kan beregnes ud fra væskehastigheden, som måles ved hjælp af partikelbilledhastighed (PIV), som vist i figur 2.

Tidligere har det vist sig, at lokal ekstensionel belastning fremmer langtrækkende COL1-fiberjustering37,38,40 (figur 3). Justeringen af COl1 påvirkes direkte af størrelsen af den forlængede belastningshastighed i indsnævringen og kan observeres at strække sig ensartet i hele segmentets 5 mm længde. For at måle fiberjusteringen blev konfokal reflektansmikroskopi (CRM) billeder af fibre brugt til at skabe et histogram af fiberjustering. Justeringskoefficienten (CoA) er den brøkdel af fibre, der er justeret inden for ±15° af tilstandsværdien i histogrammet 38,42,43,44. CoA spænder fra 0-1 med værdier >0,5 blev betragtet som justeret.

Injektion af en 3D-hydrogel i traditionelle, forseglede mikrokanaler begrænser, hvor medier og celler kan introduceres til matrixen. Den todelte kanal i denne protokol overvinder begrænsningen for adgang til en hydrogel i en kanal ved at give brugeren mulighed for at løfte kanaldækslet af og få direkte adgang til hele COL1-matrixen. Kanalløftning aktiveres ved at funktionalisere glasdækslet med glutaraldehyd for at fremme COL1-fastgørelse ved hjælp af amin-aldehyd-amin-interaktioner og funktionalisere PDMS-dækslet med BSA for at forhindre COL1-adsorption på dækslet. COL1-fiberjusteringen forbliver upåvirket efter løft af dækslet, som det ses visuelt i figur 4.

Justerede COL1-substrater er kendt for at påvirke cellejustering ved at rette fremspring 9,12,45,46 og igen organiseringen af stressfilamenter. Endotelceller i de ujusterede og justerede COL1-segmenter blev afbildet for at undersøge det cellulære respons på COL1-matricerne udviklet ved hjælp af denne protokol. Cellerne blev fastgjort og farvet 4 timer efter såning. Repræsentative billeder af HUVEC'erne dyrket på det justerede segment af matrixen viste øget aktinfiberjustering sammenlignet med HUVEC'erne på segmentet med tilfældige fibre (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Skematisk visning af samlingen af lagene. Denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Ahmed et al.38. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Trinvis kanal og forlængede belastningshastigheder . (A) Skematisk oversigt over den trinvise kanal med dimensioner. Start viser beregningen af den forlængede belastningshastighed. Den ekstensive belastningshastighed i hver indsnævring beregnes ud fra hastigheden målt ved hjælp af partikelbilledhastighed (PIV). (B) De ekstensive belastningshastigheder i hver indsnævring. Denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Ahmed et al.38. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Konfokale reflektionsbilleder af COL1-fibre i hvert mikrokanalsegment efter COL1-polymerisation. Stigningen i graden af fiberjustering fra segment (a) til segment (e) kan observeres visuelt. Skalabjælke = 25 μm. Denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Ahmed et al.38. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Konfokale reflektionsbilleder af COL1-fibre, der viser, at fiberjusteringen forbliver upåvirket ved at fjerne kanaldækslet. Skalabjælke = 25 μm. Denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Ahmed et al.38. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative billeder af celler og COL1-fibre. Repræsentative billeder af celler og COL1-fibre i segment (e) i COL1-matrixen og segment (a) i COL1-matrixen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Figur, der viser laserskårne komponenter med dimensioner. (A) Kanal, (B) magnetisk base og (C) kanaldæksform. Alle dimensioner i millimeter. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokoller til generering af COL1-matricer med justerede fibre er blevet beskrevet ved hjælp af magnetiske metoder, direkte anvendelse af mekanisk stamme og mikrofluidiske teknikker47. Mikrofluidiske tilgange bruges almindeligvis til at skabe mikrofysiologiske systemer på grund af deres veldefinerede strømnings- og transportegenskaber, som muliggør præcis kontrol over det biokemiske mikromiljø. Da justerede COL1-fibre giver vigtige lærerige signaler under patofysiologiske processer såsom sårheling, tumorcelleinvasion og vævsudvikling, er generering af justerede COL1-matricer i mikrofluidiske systemer et skridt i retning af at udvikle biologisk relevante mikrofysiologiske systemer.

Denne protokol giver mulighed for at fremstille millimeterskala, justerede COL1-matricer med regioner med defineret fiberjustering. For at inducere justering anvendes en mikrofluidisk kanal med trinvise reduktioner i bredden. Når en selvsamlende COL1-opløsning strømmer gennem kanalen med en konstant strømningshastighed, øges opløsningens strømningshastighed ved indsnævringerne, hvilket resulterer i lokal forlængelsesbelastning og langtrækkende justering af de selvsamlende COL1-fibre. Sammenlignet med forskydningsinduceret fiberjustering observerede vi fiberjustering i kanaler op til 250 μm i tykkelse, hvilket gjorde det muligt for os at skabe 3D-hydrogeler i en mikrofluidisk kanal. Da COL1-fiberjustering er afhængig af den ekstensive belastningshastighed, kan brugerne ændre den medfølgende kanal eller udvikle brugerdefinerede kanaldesign for at generere udvidelsesflow og oprette COL1-matricer med den ønskede størrelse og form. Yderligere fleksibilitet tilvejebringes gennem den bløde litografifri fremstilling af kanalerne, hvilket giver mulighed for hurtig prototyping af kanaldesign.

Den todelte kanaltilgang, der præsenteres i denne protokol, overvinder begrænsningerne ved adgang til en 3D-hydrogel i mikrokanaler. En todelt kanal giver direkte adgang til COL1-hydrogelen, hvor kanaldækslet kan løftes af for at afsløre COL1-matrixen i kanalen. Direkte adgang til COL1 efter polymerisering eliminerer behovet for, at celler blandes i COL1-forløberopløsningen, hvilket gør det muligt for en bruger at manipulere COL1-forløberopløsningen i længere perioder ved ikke-fysiologisk pH og lave temperaturer. Desuden kan en modulær tilgang bruges til at placere cellerne og give lag-for-lag biofabrikationsfunktioner, som vist i vores tidligere arbejde. Moduler kan bruges til at introducere membraner til co-kultur, introducere kontinuerlig perfusion og også skabe flerlags ECM-konstruktioner 22,38,39. Brugerdefinerede moduler kan også fremstilles afhængigt af eksperimentelle behov. Sammen med magnetisk låsning er den modulære tilgang også velegnet til eksperimenter, der kræver tilføjelse af funktionalitet med tiden.

Der er nogle kritiske trin, der skal overvejes i denne protokol. Alle komponenter, inklusive kanaludskæring, dæksel, dæksler og modulær base, skal rengøres korrekt for at sikre korrekt binding og kemisk funktionalisering. Kollagen skal tilberedes på is, og alle komponenter skal holdes kolde for at sikre konsistens. Når kollagenopløsningen er tilberedt, skal den anvendes inden for 10 minutter efter tilberedningen. Den endelige pH-værdi i kollagenopløsningen skal måles ved hjælp af en pH-sonde for at sikre konsistens. En ren, fugtig serviet skal placeres i petriskålen med kollagen for at sikre, at kollagen ikke tørrer ud i den varme inkubator.

Nogle ændringer og fejlfinding af protokollen omfatter følgende. (i) Hvis medie lækker under cellekultur, skal man sikre sig, at PMMA-rammen og dækslerne er fastgjort uden huller i klæbelaget. (ii) Hvis magneterne ikke er indstillet i flugt med basislaget, forhindrer de dækslet i at klæbe til basen, hvilket resulterer i huller. (iii) Glutaraldehydbelægningen på dæksedlen kan også have en lavere koncentration, hvis det er nødvendigt (ned til 0,1%). Den optimale koncentration af glutaraldehyd til forebyggelse af toksicitet bør bestemmes eksperimentelt for hver cellelinje, der skal anvendes i forsøget, da glutaraldehyd kan frembyde toksicitet for celler. (iv) Man kan inkludere yderligere materialer såsom hyaluronsyre, fibronectin eller fluorescerende perler sammen med kollagen for at tilpasse matrixen yderligere. v) Hvis det er nødvendigt, kan kanaldesignet ændres, så det har længere eller kortere segmenter for at undgå grænse- og kanteffekter48.

Denne protokol har følgende begrænsninger. Atelo bovin kollagen er et blødt materiale (G' <100 Pa) ved 2,5 mg·ml-1. For at øge gelstivheden kan forskere bruge højere koncentrationer af kollagen eller indføre tværbindingsmidler. Selvom denne protokol kun er valideret til justering af kollagenmatricer op til 250 μm i tykkelse, kan tykkere matricer udvikles ved at øge kanaltykkelsen og optimere strømningshastighederne for at indføre tilstrækkelige forlængelsesbelastningshastigheder.

Det forventes, at denne protokol vil være til nytte for forskere, der søger at udvikle vævsspecifikke ordnede mikromiljøer. Det kan også bruges som vejledning til oprettelse af modulære fluidiske platforme til etablering af mikrofysiologiske systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af National Institute of Health under tildelingsnummer R21GM143658 og af National Science Foundation under bevillingsnummer 2150798. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis finansieringsorganernes officielle synspunkter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) Sigma Aldrich 440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip Jensen Global JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet KJ Magnetics D31
3M (TC) 12X12-6-467MP DigiKey 3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% Signa Aldrich 179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER Electro-Technic Products 12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar VWR AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet McMaster-Carr 8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested VWR 45000-666
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CT-FIRE software LOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL Lonza CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL VWR VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50 Graphtec CE LITE-50
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer McMaster-Carr 87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells Thermo Fisher Scientific C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
Isopropanol Fisher Scientific A4154
Laser cutter Full Spectrum 20x12 H-series
Microfluidics Syringe pump New Era Syringe Pumps NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E Gilson FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen Advanced BioMatrix 5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4 VWR 70011044.00
PBS pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 Alfa Aesar J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 USCUTTER GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip Restek 22766.00
Silicon wafer University wafer 452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g VWR BDH9292-500G
Sylgard 184 VWR 102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 Thermo Fisher Scientific 28352.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
  3. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  4. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  5. Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058 (2011).
  6. Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
  7. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  8. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11 (2008).
  9. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  10. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  11. Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
  12. Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107 (2018).
  13. Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
  14. Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
  15. Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780 (2019).
  16. Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323 (2018).
  17. Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
  18. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  19. Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506 (2018).
  20. Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016 (2017).
  21. Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
  22. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341 (2016).
  23. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
  24. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769 (2022).
  25. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
  26. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
  28. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
  29. Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848 (2021).
  30. Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911 (2018).
  31. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
  32. Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
  33. Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276 (2021).
  34. Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
  35. Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
  36. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  37. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
  38. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
  39. Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
  40. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  41. Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931 (2020).
  42. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  43. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  44. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
  45. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  46. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
  47. Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).

Tags

Tilbagetrækning nr. 187
Microengineering 3D kollagenhydrogeler med langtrækkende fiberjustering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M.… More

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M. R., Vidas, J. A., Byerley, A. M., Mansouri, M., Day, S. W., Abhyankar, V. V. Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment. J. Vis. Exp. (187), e64457, doi:10.3791/64457 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter