Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microingeniería de hidrogeles de colágeno 3D con alineación de fibras de largo alcance

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64457
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

Este protocolo demuestra el uso de un canal microfluídico con geometría cambiante a lo largo de la dirección del flujo de fluido para generar tensión extensional (estiramiento) para alinear fibras en un hidrogel de colágeno 3D (<250 μm de espesor). La alineación resultante se extiende a lo largo de varios milímetros y está influenciada por la velocidad de deformación extensional.

Abstract

Las fibras alineadas de colágeno I (COL1) guían la motilidad de las células tumorales, influyen en la morfología de las células endoteliales, controlan la diferenciación de las células madre y son un sello distintivo de los tejidos cardíacos y musculoesqueléticos. Para estudiar la respuesta celular a microambientes alineados in vitro, se han desarrollado varios protocolos para generar matrices COL1 con alineación de fibra definida, incluidos métodos magnéticos, mecánicos, basados en células y microfluídicos. De estos, los enfoques microfluídicos ofrecen capacidades avanzadas, como un control preciso sobre los flujos de fluidos y el microambiente celular. Sin embargo, los enfoques microfluídicos para generar matrices COL1 alineadas para plataformas avanzadas de cultivo in vitro se han limitado a "esteras" delgadas (<40 μm de espesor) de fibras COL1 que se extienden a distancias inferiores a 500 μm y no son propicias para aplicaciones de cultivo celular 3D. Aquí, presentamos un protocolo para fabricar matrices 3D COL1 (130-250 μm de espesor) con regiones de escala milimétrica de alineación de fibra definida en un dispositivo microfluídico. Esta plataforma proporciona capacidades avanzadas de cultivo celular para modelar microambientes de tejidos estructurados al proporcionar acceso directo a la matriz de microingeniería para el cultivo celular.

Introduction

Las células residen en una compleja red fibrosa 3D llamada matriz extracelular (MEC), la mayor parte de la cual está compuesta por la proteína estructural colágeno tipo I (COL1)1,2. Las propiedades biofísicas de la ECM proporcionan señales de orientación a las células y, en respuesta, las células remodelan la microarquitectura de la ECM 3,4,5. Estas interacciones recíprocas célula-matriz pueden dar lugar a dominios de fibra COL1 alineados6 que promueven la angiogénesis y la invasión celular en el ambiente tumoral 7,8,9 e influyen en la morfología celular 10,11,12, polarización13 y diferenciación 14. Las fibras de colágeno alineadas también promueven la cicatrización de heridas 15, desempeñan un papel clave en el desarrollo de los tejidos16 y contribuyen a la comunicación celular de largo alcance17,18. Por lo tanto, replicar la microarquitectura de fibra COL1 nativa in vitro es un paso importante hacia el desarrollo de modelos estructurados para estudiar las respuestas celulares a microambientes alineados.

Los sistemas de cultivo celular microfluídico se han establecido como una tecnología preferida para desarrollar sistemas microfisiológicos (MPS)19,20,21,22,23. Aprovechando los efectos favorables de escala a microescala, estos sistemas proporcionan un control preciso sobre los flujos de fluidos, admiten la introducción controlada de fuerzas mecánicas y definen el microambiente bioquímico dentro de un microcanal 21,24,25,26,27. Las plataformas MPS se han utilizado para modelar microambientes específicos de tejidos y estudiar interacciones multiorgánicas28. Simultáneamente, los hidrogeles han sido ampliamente explorados para recapitular la mecánica 3D y la influencia biológica de la ECM que se observan in vivo29,30. Con un énfasis creciente en la integración del cultivo 3D con plataformas microfluídicas, numerosos enfoques pueden combinar hidrogeles COL1 en dispositivos microfluídicos31,32,33. Sin embargo, los métodos para alinear hidrogeles COL1 en canales microfluídicos se han limitado a "esteras" delgadas 2D (<40 μm de espesor) en canales de <1 mm de ancho, ofreciendo un potencial limitado para modelar respuestas celulares en microambientes 3D alineados31,34,35,36.

Para lograr hidrogeles COL1 3D alineados en un sistema microfluídico, se ha demostrado que, cuando una solución de COL1 autoensamblable se expone a flujos extensionales locales (cambio de velocidad a lo largo de la dirección de la corriente), los hidrogeles COL1 resultantes muestran un grado de alineación de la fibra que es directamente proporcional a la magnitud de la velocidad de deformación extensional que experimentan37, 38. El diseño de microcanales en este protocolo es único en dos sentidos; primero, el diseño segmentado introduce tensión extensional local a la solución COL1, y segundo, su construcción de "dos piezas" permite al usuario alinear las fibras COL1 y luego desmontar el canal para acceder directamente a las fibras alineadas en un formato abierto. Este enfoque se puede adoptar para desarrollar plataformas microfluídicas modulares que desarrollen sistemas microfisiológicos con matrices COL1 ordenadas. El siguiente protocolo describe el proceso de fabricación de microcanales segmentados y detalla el uso de los canales para alinear el atelo bovino COL1. Este protocolo también proporciona instrucciones para cultivar células en COL1 en un formato de pozo abierto y discute la adición de funcionalidad a la plataforma utilizando una capa base magnética modular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabricación del canal de dos piezas y la base de la plataforma modular

NOTA: El canal microfluídico se construye utilizando dos partes: el "recorte" del canal microfluídico, que es una cuchilla cortada de una lámina de polidimetilsiloxano (PDMS) de espesor definido, y la cubierta del canal, que se une reversiblemente al corte y forma el canal. El canal está rodeado por un marco de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) que actuará como un depósito de medios (Figura 1). El marco de PMMA también se puede utilizar para enganchar magnéticamente módulos especializados para mayor funcionalidad.

  1. Canales de corte de navajas de hojas PDMS:
    NOTA: El diseño del canal microfluídico para este paso se proporciona en la Figura suplementaria 1. El canal consta de cinco segmentos de longitud de 5 mm cada uno y anchos de 10 mm, 5 mm, 2,5 mm, 1,25 mm y 0,75 mm. La velocidad de la solución de colágeno, inyectada a un caudal constante (50-400 μL·min−1), aumenta localmente a lo largo del canal a medida que disminuye el ancho del canal para generar flujo extensional.
    1. Monte una lámina PDMS de 250 μm de espesor en una lámina portadora de plástico y corte con navaja el diseño microfluídico utilizando un cortador artesanal a una profundidad de cuchilla de 0,5 mm, velocidad de 1 cm·s−1 y alta fuerza.
    2. Usando un baño ultrasónico, limpie los recortes del canal microfluídico durante 5 minutos. Enjuague los canales sonicados en agua desionizada (DI) y séquelos en una placa calefactora limpia a 100 °C durante 5 min.
    3. Guarde los canales en una placa de Petri limpia y cubierta hasta que los use.
  2. Fabricación de la cubierta PDMS y pasivación superficial:
    NOTA: El corte de canal de la sección 1.1 requiere una cubierta que se puede colocar encima de ella para crear un canal cerrado en el que se pueda inyectar una solución de COL1 (Figura complementaria 1). La cubierta se puede quitar después de que el COL1 se haya autoensamblado. Para minimizar las posibilidades de que el COL1 en el canal se una a la cubierta, la cubierta se pasiva utilizando albúmina sérica bovina (BSA). Se proporciona el diseño del molde para la cubierta PDMS. El molde debe tener al menos 2 mm de espesor y debe tener una huella que sea igual a la huella del recorte del canal microfluídico. En este protocolo, la huella del molde era de 35 mm x 15 mm.
    1. Para preparar el molde, fije una lámina de adhesivo sensible a la presión (PSA) en una lámina de PMMA de 2,5 mm de espesor y corte con láser la forma de molde deseada.
    2. Limpie el molde de PMMA cortado con láser con una toallita húmeda y sin pelusa y retire el respaldo de la película de PSA. Fije el molde a una oblea de silicio de 100 mm de diámetro bt presionando firmemente.
    3. Prepare PDMS en una proporción de 10:1 (base:reticulante). Mezcle vigorosamente durante 1 minuto para asegurar una mezcla adecuada y desgasifique la mezcla en una cámara de vacío para eliminar las burbujas de aire.
    4. Verter la solución de PDMS desgasificada en el molde de PMMA/silicio y curar en una placa calefactora a 100 °C durante 20 min. Deje que el molde se enfríe, retire el PDMS curado y recorte cualquier exceso con una cuchilla de afeitar.
      NOTA: Asegúrese de que los lados orientados hacia la oblea de silicio (lados planos) de las cubiertas del PDMS estén orientados hacia arriba en todos los pasos siguientes.
    5. Utilice un punzón de biopsia de 1 mm de diámetro para crear orificios de entrada y salida que correspondan a los extremos del canal microfluídico. El recorte de canal del paso 1.1 se puede utilizar como plantilla para guiar la posición de los orificios.
    6. Sonicar la cubierta en isopropanol (IPA) durante 5 minutos, enjuagar con agua DI, secar con una fuente de aire comprimido y luego almacenar en una placa de Petri limpia y cubierta. Coloque la placa de Petri en una cámara de esterilización UV (descubierta) durante 1 minuto para esterilizar.
    7. Cubrir y transferir a un armario de bioseguridad (BSC).
    8. Pipetear 300 μL de 40 mg•mL-1 de albúmina sérica bovina (BSA) en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre las cubiertas del PDMS y extender la solución uniformemente con una punta de pipeta. Colocar en nevera a 4 °C durante al menos 4 h antes de usar.
    9. Mueva las tapas del refrigerador a un BSC, lave 5 veces con 1 PBS y déjelas secar al aire durante 10 minutos.
      NOTA: Las cubiertas PDMS se pueden almacenar en el refrigerador hasta 1 semana después de recubrirlas con BSA.
  3. Tratamiento con glutaraldehído de cubreobjetos
    NOTA: La funcionalización de los cubreobjetos con glutaraldehído une covalentemente COL1 al cubreobjetos y evita que el hidrogel se desprenda.
    1. Prepare una solución de trietoxisilano de aminopropilo (APTES) al 2% (v/v) en un vaso de precipitados de vidrio agregando 1 ml de APTES a 49 ml de acetona.
    2. Diluir una solución de glutaraldehído al 25% al 5% en agua DI. Hacer 2 ml de solución por cada cubreobjetos de 24 mm x 50 mm. Para cubreobjetos de 24 mm x 24 mm o 22 mm x 22 mm, haga 1 ml de solución para cada uno.
    3. Limpie los cubreobjetos en un sonicador de baño durante 5 minutos usando IPA. Enjuague el IPA de los cubreobjetos con agua DI. El IPA se enjuaga completamente cuando se puede ver una película suave de agua en el cubreobjetos.
    4. Secar los cubreobjetos en una placa caliente durante 5 min a 100 °C. Coloque los cubreobjetos secos en placas de Petri limpias, asegurándose de que no se superpongan.
    5. Usando una varita de descarga de corona, exponga los cubreobjetos a una descarga de corona durante 1 minuto cada uno.
      NOTA: Este paso debe realizarse en un área bien ventilada o en una campana química.
    6. Retire los cubreobjetos de la placa de Petri y luego sumérjalos en la solución APTES durante 10 s dentro de los 5 minutos posteriores a la exposición a la corona, asegurándose de que el cubreobjetos esté sumergido.
      NOTA: Asegúrese de llevar un registro de qué lado fue tratado con plasma y manténgalo mirando hacia arriba.
    7. A continuación, sumergir el cubreobjetos en acetona durante 10 s y secar con aire comprimido. Coloque el cubreobjetos seco de nuevo en la placa de Petri, con el lado tratado hacia arriba.
      NOTA: Repita los pasos 1.3.5-1.3.7 para todos los cubreobjetos.
    8. Pipetear 1 ml de solución de glutaraldehído sobre la superficie de cada cubreobjetos. Cubra la mayor superficie posible sin permitir que la solución se derrame sobre el borde del cubreobjetos. Se puede agregar más solución de glutaraldehído si es necesario. Asegúrese de no rayar la superficie con la punta de la pipeta.
    9. Deje que los cubreobjetos reposen en contacto con la solución durante 30 minutos y luego enjuague con agua DI durante 20 s. Seque los cubreobjetos con aire comprimido y vuelva a colocarlos en las placas de Petri, con el plasma tratado con el lado hacia arriba.
      NOTA: Los cubreobjetos se pueden almacenar hasta por 1 semana a temperatura ambiente (RT).
  4. Corte por láser de la base magnética modular
    NOTA: El diseño de la base magnética modular se proporciona en la Figura Suplementaria 1. La base modular sirve como un pozo para sostener los medios y también se puede utilizar para unir magnéticamente módulos especializados, como se describe en trabajos publicados anteriormente 22,37,38,39.
    1. Recorte los diseños de la capa de PMMA utilizando la configuración láser adecuada, como el número de pasadas y la potencia.
      NOTA: La configuración del láser debe ajustarse de tal manera que los imanes se puedan colocar en la capa de PMMA. Cada láser es diferente, y los parámetros de corte deben optimizarse experimentalmente. Para un láser de 45 W, se recomienda una velocidad del 100%, una potencia del 100% y 3 pasadas para cortar PMMA de 2 mm a 2 mm de espesor.
    2. Lave la pieza cortada con láser con agua y jabón para eliminar los residuos del proceso de corte por láser.
      NOTA: No utilice disolventes para limpiar las piezas cortadas con láser. Los disolventes pueden provocar la propagación de microfisuras en los bordes cortados con láser.
  5. Montaje de la plataforma
    1. Empuje los imanes (3/16 de diámetro, 1/16 de grosor) a mano en la base cortada con láser. Se puede usar un martillo suave o un extremo de destornillador para ayudar a empujar el imán. El grosor de los imanes debe ser menor que el grosor de la base de PMMA para garantizar que los imanes estén al ras de la superficie de la base.
      NOTA: Los imanes permiten al usuario agregar funcionalidad a la plataforma mediante la conexión de módulos adicionales.
    2. Despegue el respaldo de la hoja de PSA y fije la base a un cubreobjetos tratados con glutaraldehído con el lado funcionalizado hacia arriba.
    3. Coloque suavemente el recorte del canal PDMS en la cavidad definida por el marco. Presione hacia abajo con pinzas de punta ancha para eliminar las burbujas de aire y garantizar el contacto conformado.
    4. Coloque la cubierta del canal tratado con BSA en la parte superior del recorte del canal, con el lado de BSA hacia abajo. Asegúrese de que los puertos de entrada y salida del fluido estén alineados con el canal.
    5. El dispositivo está listo para la inyección de COL1.

2. Inyectar la solución de COL1 en el microcanal y retirar la cubierta para aplicaciones de cultivo celular

  1. Preparación de la solución COL1
    1. Coloque todos los reactivos necesarios (solución madre de COL1 [6 mg·mL−1], agua ultrapura, 10x PBS, 0,1 M NaOH) en hielo en el gabinete de bioseguridad.
    2. Calcule el volumen de reactivos de la siguiente manera
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
      Equation 4
      NOTA: Por lo tanto, para hacer 1 ml de colágeno neutralizado de 2.5 mg·mL−1 a partir de un stock de 6 mg·mL−1, agregue 416.67 μL de colágeno, 429.16 μL de agua DI, 100 μL de 10x PBS y 54.16 μL de NaOH 0.1 M para un pH final de 7. Añadir 20 μL de NaOH 0,1 M para alcanzar un pH de 9,0.
    3. Añadir los reactivos en un vial vacío de 5 ml en el siguiente orden: i) COL1 stock, ii) DI agua, iii) 10x PBS, iv) 0,1 M NaOH.
      NOTA: Utilice una pipeta de desplazamiento para manipular la solución COL1. Puede producirse una pérdida significativa de la muestra si se utiliza una pipeta normal, lo que provoca fluctuaciones en la concentración de la solución final.
    4. Eleve el pH de la solución al pH deseado (típicamente entre 7-9).
  2. Inyección de la solución COL1
    1. Coloque una bomba de jeringa, una jeringa estéril refrigerada, una solución de COL1 neutralizada refrigerada y una aguja de bloqueo Luer de punta angular estéril de 20 G 90° en un gabinete de bioseguridad. Cargue la solución de COL1 en la jeringa, teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas.
    2. Acople la punta de la aguja de 90° 20 G a la jeringa, cargue la jeringa en la bomba de la jeringa, con la aguja hacia abajo y prepare la aguja con la solución COL1.
    3. Ajuste la bomba de jeringa al caudal requerido, entre 50-2.000 μL/min.
    4. Coloque los canales PDMS preparados (sección 1) en un conector de laboratorio y nivele con la aguja.
    5. Inserte la aguja en el puerto de entrada del canal PDMS (lado ancho). Inyecte el canal hasta que se acumule una gota de ~30 μL de COL1 en el lado de salida.
    6. Baje el gato de laboratorio y separe suavemente la aguja del canal recién llenado.
    7. Repita los pasos 2.2.5-2.2.9 hasta que todos los canales se hayan llenado con la solución COL1.
    8. Cargue los canales llenos en las placas de Petri junto con una toallita limpia y sin pelusa saturada con agua DI para evitar la deshidratación del gel COL1 recién formado.
    9. Cubra la placa de Petri y coloque los canales cargados en la incubadora (37 °C, 95% de humedad) durante 2 h antes del paso de despegado.
  3. Despegado y equilibrio de los medios
    1. Exponga el gel COL1 polimerizado levantando la cubierta del PDMS con pinzas. El tratamiento BSA evita que COL1 se adhiera a la cubierta.
    2. Agregue 650 μL de EGM al pozo.
    3. Deje los dispositivos en la incubadora (37 °C, 95% de humedad) durante un mínimo de 4 h para equilibrar el gel y el medio. Reemplace el medio antes de sembrar con celdas
  4. Células de siembra
    1. Coloque la tripsina tibia al 0,25% y los medios de cultivo junto con el número requerido de pipetas de 5 ml y 10 ml en el gabinete de bioseguridad.
    2. Cultivo de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVECs) al 80% de confluencia en medios de crecimiento endotelial (EGM) a 37 °C, en 95% de humedad. Colocar el matraz de cultivo tisular que contiene HUVEC en el BSC después de comprobar la confluencia bajo un microscopio.
    3. Desechar el medio en el matraz T25 y lavar las celdas 2 veces con 1x PBS. Añadir 1 ml de tripsina al matraz y colocarlo en la incubadora (37 °C, 95% de humedad) durante 3 min.
    4. Compruebe el matraz bajo el microscopio después de 3 minutos para asegurarse de que las células estén completamente separadas de la superficie.
    5. Añadir 3 ml de EGM (con suero) al matraz para neutralizar la tripsina. A continuación, transfiera la solución celular con una pipeta de 5 ml a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el tubo cónico que contiene células a 150 x g durante 5 min.
    6. Coloque el tubo cónico en el gabinete de bioseguridad y deseche el sobrenadante sin alterar el pellet celular. Resuspender las células en 1 ml de medios de cultivo frescos.
    7. Añadir y mezclar 15 μL de azul de tripano y 15 μL de la solución celular resuspendida en un tubo cónico de 1 ml.
    8. Inyecte azul de tripano y solución celular en ambos lados de un portaobjetos de conteo de células e inserte el portaobjetos en un dispositivo de conteo de células.
    9. Diluir la solución celular en medios de crecimiento endotelial a la concentración requerida en función de la concentración celular obtenida del dispositivo de recuento celular.
      NOTA: Un matraz T25 de HUVEC al 80% de confluencia producirá ~750.000 células·ml−1 si se diluye en 1 ml de medio. El volumen de la suspensión celular a sembrar se calcula como área de la superficie de cultivo × densidad/concentración celular de la suspensión celular. Ejemplo: Para sembrar 20,000 células·cm−2 en el pozo de 35 mm x 15 mm, se necesitarán ~140 μL de la suspensión celular.
    10. Aspire el medio en la matriz COL1 diseñada.
    11. Agregue el volumen requerido de la solución celular sobre el sustrato de COL1 y deje que las células se asienten durante un mínimo de 4 h antes de la imagen.
  5. Etiquetado del núcleo celular y el citoesqueleto
    1. Aspirar el medio de las células y lavar 3 veces con 1x PBS, 500 μL en cada lavado. Cubrir la capa celular con paraformaldehído al 4% durante 15 min en RT.
    2. Aspirar el paraformaldehído y lavar con 1x PBS Tween-20 durante 5 min.
    3. Permeabilizar la membrana celular utilizando 500 μL de solución Triton-X al 0,1% en PBS durante 15 min. Lavar con 1x PBS Tween-20 durante 5 min.
    4. Bloquear los sitios de unión no específicos con 500 μL de BSA al 4% en PBS durante 30 min a RT.
    5. Diluir la solución de etiqueta fluorescente de faloidina-actina en BSA al 4% (1 μL de material en 400 μL de BSA).
    6. Aspire la solución de BSA, agregue la solución de faloidina a las células y espere 30 minutos en RT.
    7. Diluir la tinción nuclear en BSA al 4% (1 μL en 500 μL), aspirar la faloidina, añadir la solución de tinción nuclear de trabajo, y esperar 15 min en RT.
    8. Aspire la solución de trabajo de manchas nucleares, lave con PBS Tween-20 3x durante 5 minutos cada uno, y reemplácelo con 1x PBS antes de la imagen.
    9. Imagen con un microscopio epifluorescente utilizando el canal FITC (ex 491 nm/em 516 nm) y el canal DAPI (ex 360 nm/em 460 nm) con una lente 40x. Imagen del colágeno utilizando un escaneo láser confocal en el modo de reflectancia utilizando la línea láser de 488 nm (15% de potencia) y el objetivo de inmersión en agua 40x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cuando una solución COL1 autoensamblable fluye a través de un canal con área de sección transversal decreciente, la velocidad de flujo (v x) de la solución COL1 aumenta localmente en una magnitud, ∂v x, a lo largo de la longitud de la constricción entre los dos segmentos (∂x), lo que resulta en una velocidad de deformación extensional (ε̇) donde ε̇ = ∂v x / ∂x. La velocidad de deformación extensional se puede calcular a partir de la velocidad del fluido, que se mide utilizando velocimetría de imagen de partículas (PIV), como se ve en la Figura 2.

Anteriormente, se ha demostrado que la tensión extensional local promueve la alineación de la fibra COL1 de largo alcance37,38,40 (Figura 3). La alineación de COl1 está directamente influenciada por la magnitud de la velocidad de deformación extensional en la constricción y se puede observar que se extiende uniformemente a lo largo de los 5 mm de longitud del segmento. Para medir la alineación de la fibra, se utilizaron imágenes de microscopía de reflectancia confocal (CRM) de las fibras para crear un histograma de alineación de la fibra. El coeficiente de alineación (CoA) es la fracción de fibras alineadas dentro de ±15° del valor de modo en el histograma 38,42,43,44. Los rangos de CoA de 0-1 con valores >0,5 se consideraron alineados.

Inyectar un hidrogel 3D en los límites tradicionales de microcanales sellados donde se pueden introducir medios y células en la matriz. El canal de dos piezas en este protocolo supera la limitación de acceder a un hidrogel en un canal al permitir al usuario levantar la cubierta del canal y acceder directamente a toda la matriz COL1. El despegue del canal se habilita funcionalizando el cubreobjetos de vidrio con glutaraldehído para promover la unión de COL1 utilizando interacciones amina-aldehído-amina y funcionalizando la cubierta PDMS con BSA para evitar la adsorción de COL1 en la cubierta. La alineación de la fibra COL1 no se ve afectada después de levantar la cubierta, como se ve visualmente en la Figura 4.

Se sabe que los sustratos COL1 alineados influyen en la alineación celular dirigiendo protuberancias 9,12,45,46 y, a su vez, en la organización de los filamentos de estrés. Se obtuvieron imágenes de células endoteliales en los segmentos COL1 no alineados y alineados para investigar la respuesta celular a las matrices COL1 desarrolladas utilizando este protocolo. Las células se fijaron y se tiñeron 4 h después de la siembra. Las imágenes representativas de los HUVECs cultivados en el segmento alineado de la matriz mostraron una mayor alineación de la fibra de actina en comparación con los HUVECs en el segmento con fibras aleatorias (Figura 5).

Figure 1
Figura 1: Esquema que muestra el ensamblaje de las capas. Esta figura fue adaptada con permiso de Ahmed et al.38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Canal escalonado y velocidades de deformación extensional. (A) Esquema del canal escalonado con dimensiones. Outset muestra el cálculo de la tasa de deformación extensional. La velocidad de deformación extensional en cada constricción se calcula a partir de la velocidad medida mediante velocimetría de imagen de partículas (PIV). (B) Las tasas de deformación extensional en cada constricción. Esta figura fue adaptada con permiso de Ahmed et al.38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imágenes de reflectancia confocal de fibras COL1 en cada segmento de microcanal después de la polimerización de COL1. El aumento en el grado de alineación de la fibra del segmento (a) al segmento (e) se puede observar visualmente. Barra de escala = 25 μm. Esta figura fue adaptada con permiso de Ahmed et al.38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes de reflectancia confocal de fibras COL1 que muestran que la alineación de la fibra no se ve afectada por la eliminación de la cubierta del canal. Barra de escala = 25 μm. Esta figura fue adaptada con permiso de Ahmed et al.38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes representativas de células y fibras COL1. Imágenes representativas de células y fibras COL1 en el segmento (e) de la matriz COL1 y el segmento (a) de la matriz COL1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Figura que muestra componentes cortados con láser con dimensiones. (A) Canal, (B) base magnética y (C) molde de cubierta del canal. Todas las dimensiones en milímetros. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Los protocolos para generar matrices COL1 con fibras alineadas han sido descritos utilizando métodos magnéticos, la aplicación directa de deformación mecánica y técnicas microfluídicas47. Los enfoques microfluídicos se utilizan comúnmente para crear sistemas microfisiológicos debido a sus características de flujo y transporte bien definidas, que permiten un control preciso sobre el microambiente bioquímico. Dado que las fibras COL1 alineadas proporcionan señales instructivas clave durante los procesos fisiopatológicos como la cicatrización de heridas, la invasión de células tumorales y el desarrollo de tejidos, la generación de matrices COL1 alineadas en sistemas microfluídicos es un paso hacia el desarrollo de sistemas microfisiológicos biológicamente relevantes.

Este protocolo proporciona la capacidad de fabricar matrices COL1 alineadas a escala milimétrica con regiones de alineación de fibra definida. Para inducir la alineación, se utiliza un canal microfluídico con reducciones escalonadas en el ancho. A medida que una solución COL1 autoensamblable fluye a través del canal a un caudal constante, la velocidad de flujo de la solución aumenta en las constricciones, lo que resulta en una tensión extensional local y una alineación de largo alcance de las fibras COL1 autoensamblables. En comparación con la alineación de fibra inducida por flujo cortante, observamos alineación de fibra en canales de hasta 250 μm de espesor, lo que nos permite crear hidrogeles 3D en un canal microfluídico. Dado que la alineación de la fibra COL1 depende de la velocidad de deformación extensional, los usuarios pueden modificar el canal proporcionado o desarrollar diseños de canales personalizados para generar flujo extensional y crear matrices COL1 del tamaño y la forma deseados. Se proporciona flexibilidad adicional a través de la fabricación de los canales sin litografía suave, lo que permite la creación rápida de prototipos de diseños de canales.

El enfoque de canal de dos piezas presentado en este protocolo supera las limitaciones de acceder a un hidrogel 3D en microcanales. Un canal de dos piezas proporciona acceso directo al hidrogel COL1, en el que la cubierta del canal se puede levantar para revelar la matriz COL1 en el canal. El acceso directo al COL1 después de la polimerización elimina la necesidad de mezclar células en la solución precursora de COL1, lo que permite al usuario manipular la solución precursora de COL1 durante períodos prolongados a pH no fisiológico y bajas temperaturas. Además, se puede utilizar un enfoque modular para posicionar las células y proporcionar capacidades de biofabricación capa por capa, como se muestra en nuestro trabajo anterior. Los módulos se pueden utilizar para introducir membranas para el cocultivo, introducir perfusión continua y también crear construcciones ECM multicapa 22,38,39. Los módulos personalizados también se pueden fabricar dependiendo de las necesidades experimentales. Junto con el enganche magnético, el enfoque modular también es adecuado para experimentos que requieren agregar funcionalidad con el tiempo.

Hay algunos pasos críticos que deben considerarse en este protocolo. Todos los componentes, incluido el corte del canal, la cubierta, los cubreobjetos y la base modular, deben limpiarse adecuadamente para garantizar una unión adecuada y una funcionalización química. El colágeno debe prepararse en hielo y todos los componentes deben mantenerse fríos para garantizar la consistencia. Una vez preparada, la solución de colágeno debe usarse dentro de los 10 minutos posteriores a la preparación. El pH final de la solución de colágeno debe medirse utilizando una sonda de pH para garantizar la consistencia. Se debe colocar una toallita limpia y húmeda en la placa de Petri con el colágeno para garantizar que el colágeno no se seque en la incubadora caliente.

Algunas modificaciones y solución de problemas del protocolo incluyen lo siguiente. (i) Si el medio se filtra durante el cultivo celular, se debe asegurarse de que el marco de PMMA y los cubreobjetos estén unidos sin espacios en la capa adhesiva. (ii) Si los imanes no se colocan al ras en la capa base, evitarán que el cubreobjetos se adhiera a la base, lo que dará lugar a huecos. iii) El recubrimiento de glutaraldehído en el cubreobjetos también puede tener una concentración más baja si es necesario (hasta el 0,1%). La concentración óptima de glutaraldehído para prevenir la toxicidad debe determinarse experimentalmente para cada línea celular que se utilizará en el experimento, ya que el glutaraldehído puede presentar toxicidad para las células. (iv) Uno puede incluir materiales adicionales como ácido hialurónico, fibronectina o perlas fluorescentes junto con colágeno para personalizar aún más la matriz. v) Si es necesario, el diseño del canal puede modificarse para que tenga segmentos más largos o más cortos para evitar efectos de límite y borde48.

Este protocolo tiene las siguientes limitaciones. El colágeno bovino Atelo es un material blando (G' <100 Pa) a 2,5 mg·mL−1. Para aumentar la rigidez del gel, los investigadores pueden usar concentraciones más altas de colágeno o introducir agentes de reticulación. Aunque este protocolo solo ha sido validado para alinear matrices de colágeno de hasta 250 μm de espesor, se pueden desarrollar matrices más gruesas aumentando el espesor del canal y optimizando los caudales para introducir tasas de deformación extensionales adecuadas.

Se anticipa que este protocolo será de utilidad para los investigadores que buscan desarrollar microambientes ordenados específicos para tejidos. También se puede utilizar como guía para crear plataformas fluídicas modulares para establecer sistemas microfisiológicos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Todos los autores declaran no tener intereses en conflicto.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Salud bajo el número de concesión R21GM143658 y por la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención 2150798. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de las agencias de financiación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) Sigma Aldrich 440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip Jensen Global JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet KJ Magnetics D31
3M (TC) 12X12-6-467MP DigiKey 3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% Signa Aldrich 179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER Electro-Technic Products 12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar VWR AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet McMaster-Carr 8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested VWR 45000-666
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CT-FIRE software LOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL Lonza CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL VWR VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50 Graphtec CE LITE-50
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer McMaster-Carr 87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells Thermo Fisher Scientific C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
Isopropanol Fisher Scientific A4154
Laser cutter Full Spectrum 20x12 H-series
Microfluidics Syringe pump New Era Syringe Pumps NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E Gilson FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen Advanced BioMatrix 5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4 VWR 70011044.00
PBS pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 Alfa Aesar J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 USCUTTER GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip Restek 22766.00
Silicon wafer University wafer 452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g VWR BDH9292-500G
Sylgard 184 VWR 102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 Thermo Fisher Scientific 28352.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
  3. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  4. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  5. Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058 (2011).
  6. Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
  7. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  8. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11 (2008).
  9. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  10. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  11. Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
  12. Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107 (2018).
  13. Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
  14. Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
  15. Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780 (2019).
  16. Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323 (2018).
  17. Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
  18. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  19. Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506 (2018).
  20. Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016 (2017).
  21. Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
  22. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341 (2016).
  23. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
  24. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769 (2022).
  25. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
  26. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
  28. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
  29. Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848 (2021).
  30. Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911 (2018).
  31. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
  32. Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
  33. Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276 (2021).
  34. Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
  35. Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
  36. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  37. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
  38. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
  39. Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
  40. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  41. Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931 (2020).
  42. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  43. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  44. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
  45. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  46. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
  47. Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).

Tags

Retractación Número 187
Microingeniería de hidrogeles de colágeno 3D con alineación de fibras de largo alcance
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M.… More

Ahmed, A., Joshi, I. M., Goulet, M. R., Vidas, J. A., Byerley, A. M., Mansouri, M., Day, S. W., Abhyankar, V. V. Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment. J. Vis. Exp. (187), e64457, doi:10.3791/64457 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter