Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تقييم سلامة نقطة تفتيش تجميع المغزل في بويضات الفأر

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64459
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

Summary

الخطأ في فصل الكروموسومات هو سمة شائعة في البويضات. لذلك ، فإن دراسة نقطة تفتيش تجميع المغزل تعطي أدلة مهمة حول الآليات اللازمة لإنتاج بيض صحي. يصف البروتوكول الحالي ثلاثة مقايسات تكميلية لتقييم سلامة نقطة تفتيش تجميع المغزل في بويضات الفئران.

Abstract

اختلال الصيغة الصبغية هو الشذوذ الوراثي الرئيسي الذي يسبب الإجهاض المبكر وفشل الحمل لدى البشر. تحدث معظم الأخطاء في فصل الكروموسومات التي تؤدي إلى اختلال الصيغة الصبغية أثناء الانقسام الميوزي في البويضات ، ولكن لماذا يكون الانقسام الاختزالي للخلايا البيضية عرضة للخطأ لا يزال غير مفهوم تماما. أثناء انقسام الخلايا ، تمنع الخلايا الأخطاء في فصل الكروموسومات عن طريق تنشيط نقطة فحص تجميع المغزل (SAC). تعتمد آلية التحكم هذه على اكتشاف مرفقات كينيتوخور (KT) - الأنابيب الدقيقة (MT) واستشعار التوتر الناتج عن ألياف المغزل. عندما تكون KTs غير متصلة ، يتم تنشيط SAC ويمنع تقدم دورة الخلية. يتم تنشيط SAC أولا بواسطة كيناز MPS1 ، والذي يؤدي إلى تجنيد وتشكيل مجمع نقطة التفتيش الانقسامية (MCC) ، المكون من MAD1 و MAD2 و BUB3 و BUBR1. بعد ذلك ، ينتشر MCC في السيتوبلازم ويعزل CDC20 ، وهو منشط مركب / سيكلوسوم معزز للطور (APC / C). بمجرد أن تصبح KTs متصلة بالأنابيب الدقيقة ويتم محاذاة الكروموسومات في لوحة الطور ، يتم إسكات SAC ، ويتم إطلاق CDC20 ، ويتم تنشيط APC / C ، مما يؤدي إلى تدهور Cyclin B و Securin ، مما يسمح ببداية الطور. بالمقارنة مع الخلايا الجسدية ، فإن SAC في البويضات ليست فعالة لأن الخلايا يمكن أن تخضع للطور الانفصالي على الرغم من وجود KTs غير مرتبطة. إن فهم سبب كون SAC أكثر تساهلا وما إذا كان هذا التساهل هو أحد أسباب أخطاء فصل الكروموسومات في البويضات لا يزال بحاجة إلى مزيد من التحقيق. يصف البروتوكول الحالي التقنيات الثلاث لتقييم سلامة SAC بشكل شامل في بويضات الفئران. تتضمن هذه التقنيات استخدام نوكودازول لإزالة بلمرة MTs لتقييم استجابة SAC ، وتتبع إسكات SAC باتباع حركية تدمير Securin ، وتقييم توظيف MAD2 إلى KTs عن طريق التألق المناعي. تعمل هذه التقنيات معا على فحص الآليات اللازمة لإنتاج بويضات صحية من خلال توفير تقييم كامل لسلامة SAC.

Introduction

اختلال الصيغة الصبغية ، الذي ينشأ عن أخطاء في فصل الكروموسومات ، هو السبب الرئيسي للإجهاض المبكر ويرتبط ارتباطا وثيقا بالأخطاء في الانقسام الاختزالي1. يختلف الانقسام الميوزي عن الانقسام الميتوزي؛ لأنه يتكون من جولتين من الانقسام الخلوي دون تدخل خطوة تضاعف الحمض النووي (DNA). في الانقسام الميوزي الأول، تنفصل الكروموسومات المتماثلة بينما تظل الكروماتيدات الشقيقة معا. في البويضات ، تكون هذه الخطوة عرضة للخطأ ، مما يؤدي إلى إنتاج بيض اختلال الصيغة الصبغية2.

لمنع أخطاء فصل الكروموسومات ، تقوم معظم أنواع الخلايا بتنشيط آلية مراقبة توقف دورة الخلية مؤقتا ، تسمى نقطة تفتيش تجميع المغزل (SAC). تستشعر هذه الآلية مرفقات الكينيتوخور (KT) - الأنابيب الدقيقة (MT) ويتم توليد التوتر عندما يتم توجيه الكروموسومات بطريقة ثنائية القطب3. تؤدي الحركية غير المرتبطة إلى استجابة SAC التي تبدأ بتوظيف MPS1 ، المنظم الرئيسي ل SAC ، إلى kinetochores 3,4. يبدأ MPS1 في توظيف مكونات SAC الأخرى ، حيث يعمل كمنصة لتشكيل مجمع نقاط التفتيش الانقسامية (MCC). ينتشر MCC ، المكون من MAD1 و MAD2 و BUB3 و BUBR1 ، في السيتوبلازم ويمنع تنشيط APC / C عن طريق عزل المنشط CDC20. بمجرد ربط جميع الحركية بثبات ب MTs ومحاذاة الكروموسومات في لوحة الطور ، يتم إسكات SAC ، ويتم تفكيك MCC وإطلاق CDC20 ، مما يسمح بتنشيط APC / C. يؤدي APC / C النشط إلى تدهور Securin و Cyclin B ، وهما خطوتان رئيسيتان في تحفيز بداية الطور 5,6. في الخلايا الجسدية ، يكون SAC صارما لأنه يتم تنشيطه بواسطة حركية واحدة غير متصلة وهو كاف للحث على إيقاف دورة الخلية6. ومع ذلك ، أثناء الانقسام الاختزالي للخلايا البيضية ، يكون SAC أكثر تساهلا ، ويمكن أن تدخل البويضات في الطور الانفصالي الأول مع واحد أو أكثر من الحركية غير المرتبطة6،7،8،9،10. إن فهم سبب كون SAC أكثر تساهلا في البويضات هو مجال تركيز مستمر في هذا المجال. يمكن أن تؤدي الآليات التي تسبب عيوبا في تنشيط SAC أو إسكات SAC إلى أخطاء في فصل الكروموسومات أو توقف دورة الخلية لفترات طويلة وموت الخلايا. لذلك ، فإن تقييم الآليات التي تحافظ على سلامة SAC في البويضات مهم لفهم عملية تكوين بويضات صحية ومتعددة الصبغيات.

يصف هذا البروتوكول تقنيات التقييم الشامل لسلامة SAC في الانقسام الاختزالي لبويضة الفأر من خلال فحص الخطوات الحرجة المختلفة لنقطة التفتيش. أولا ، يتم وصف تقييم استجابة SAC بعد تحفيز تنشيط SAC. يتم تحقيق هذا التنشيط عن طريق توليد حركية غير مرتبطة باستخدام نوكودازول ، وهو دواء يزيل بلمرة MTs11. ثانيا ، يتم وصف طريقة لمراقبة إسكات SAC من خلال تتبع ديناميكيات تدهور Securin أثناء نضوج البويضة. أخيرا ، يتم استخدام مقايسة قائمة على التألق المناعي لقياس تجنيد MAD2 ، أحد مكونات MCC ، إلى الحركية. معا ، تقوم هذه المقايسات بتقييم شامل لسلامة SAC أثناء النضج الاختزالي للبويضة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إيواء جميع الفئران المستخدمة في هذه البروتوكولات وتربيتها وفقا للجنة جامعة روتجرز المؤسسية لاستخدام الحيوانات ورعايتها (البروتوكول 201702497) وإرشادات المعاهد الوطنية للصحة. وافقت هذه الهيئات التنظيمية على جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على دراسات على الحيوانات. كانت جميع الفئران المستخدمة في الدراسة الحالية من الإناث CF-1 البالغة من العمر 6-8 أسابيع.

1. التحضير التجريبي

  1. قبل البدء في تقييمات SAC ، اجمع بويضات الفئران باتباع التقرير المنشور مسبقا12. قسم البويضات المجمعة إلى ثلاث مجموعات متساوية الحجم واحتفظ بها في وسائط استزراع Chatot و Ziomek و Bavister (CZB) تحتوي على 2.5 ميكرومتر ميلرينون (انظر جدول المواد) لتجنب الاستئناف الاختزالي13.
    ملاحظة: تكوين CZB: 81.6 mM كلوريد الصوديوم ؛ 4.8 مللي متر KCl ؛ 1.2 مللي متر KH2PO4 ؛ 1.2 مللي متر MgSO4-7H 2O ؛ 0.27 مليمتر بيروفات. 1.7 مللي متر CaCl2 ؛ 30.8 mM DL-حمض اللبنيك. 7 مليمتر توراين. 0.1 مللي متر EDTA ؛ 25 مللي متر NaHCO3 ؛ الجنتاميسين; و 0.3٪ BSA.
  2. تحضير cRNA للحقن المجهري كما هو موضح سابقا12،14. تضخيم جين Securin للفأر من cDNA المستنسخ من بويضات الحويصلة الجرثومية للفأر ، متبوعا بالاستنساخ الفرعي في ناقل pMDL2 الذي يحتوي على تسلسل Gfp15,16.
    1. لتحضير Securin-Gfp cRNA ، قم بخطي البلازميد باستخدام Nde I الهضم. إجراء النسخ في المختبر باستخدام بوليميراز T3 RNA وتنقية cRNA16.
      ملاحظة: قم بتخزين cRNA في حصص 2-3 ميكرولتر عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. علاج نوكودازول والتصوير الحي

  1. تحضير 1 مل من وسائط الاستزراع (CZB) التي تحتوي على 5 ميكرومتر نوكودازول (NOC) ، و 1 مل من وسائط الاستزراع مع 5 ميكرومتر من NOC بالإضافة إلى 0.5 ميكرومتر من الانعكاس (NOC + REV) ، و 1 مل من وسائط الاستزراع مع ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) (1: 2000) كعنصر تحكم (انظر جدول المواد).
  2. لنضوج البويضات والتصوير الحي ، استخدم صفيحة 96 بئرا تم تسخينها مسبقا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO2 ، ورطوبة 80٪. في البئر الأول ، قم بتحميل 150 ميكرولتر من معالجة DMSO للتحكم ؛ في البئر الثاني ، تحميل 150 ميكرولتر من معالجة شهادة عدم الممانعة ؛ وفي البئر الثالث ، قم بتحميل 150 ميكرولتر من معالجة NOC + REV. احتفظ باللوحة في الحاضنة في نفس الظروف المذكورة أعلاه حتى الحاجة.
    ملاحظة: في اللوحة المكونة من 96 بئرا، تجنب استخدام الصف الأول والعمود الأول لأن ظل الحد يتداخل مع جودة الصور.
  3. لبدء النضج الاختزالي ، قم بإزالة الميلرينون. أثناء عرض البويضات تحت مجهر مجسم باستخدام التكبير بين 30x-64x ، اغسل milrinone من الوسائط عن طريق نقل البويضات بالتتابع من خلال ست قطرات من 100 ميكرولتر من وسائط الثقافة الخالية من milrinone التي تحتوي على DMSO ووضعها في البئر المقابلة للوحة 96 بئر باستخدام ماصة تعمل باليد أو الفم.
    1. عد البويضات عن طريق التقاطها باستخدام ماصة تعمل باليد أو الفم وتوصيلها إلى القطرة التالية لتجنب فقدان أي منها. البويضات مفردة وكبيرة (~ 80 ميكرومتر في القطر) وخلايا مستديرة. ستظهر النواة كزر في وسط الخلية ، ويحيط الغشاء والمنطقة الشفافة بالبويضة.
      ملاحظة: انقل البويضات بين القطرات مع تحريك أقل كمية ممكنة من السائل. هذا يسمح بالإزالة المثلى للميلرينون من وسائط الثقافة. إذا فشلت البويضات في استئناف الانقسام الاختزالي ، فمن المحتمل أن الميلرينون لم تتم إزالته بشكل فعال.
  4. كرر نفس العملية (الخطوة 2.3) لعلاج NOC و NOC + REV.
  5. صور البويضات باستخدام مجهر برايت فيلد مجهز بغرفة حاضنة مع بيئة خاضعة للرقابة في ظل هذه الظروف: 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، و 80٪ رطوبة. التقط الصور في المستوى الأوسط للبويضات على فترات 20 دقيقة لمدة 24 ساعة.
  6. حدد عدد البويضات التي تقذف الجسم القطبي (PB) عن طريق تحديد الخلايا التي تمر عبر التحريك الخلوي غير المتماثل. ستكون النتيجة خلية صغيرة (PB) بجوار البويضة وداخل المنطقة الشفافة المشتركة. عرض الصور باستخدام برنامج التصوير (ImageJ، انظر جدول المواد).
  7. قم باستيراد تسلسل الصور إلى برنامج تحليل الصور وقم بتطوير الإطارات حتى تمر خلية واحدة أو أكثر من خلال التحريك الخلوي غير المتماثل. احسب النسبة المئوية للبويضات التي تقذف PB من إجمالي البويضات17.

3. مراقبة نمط تدهور Securin-gfp أثناء النضج الاختزالي

  1. جهاز طرد مركزي 3 ميكرولتر من Securin-Gfp cRNA (الخطوة 1.2) عند 19,283 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية18.
    ملاحظة: استخدم المادة الطافية لتجنب تحميل الشوائب التي قد تسبب انسداد الإبرة أثناء الحقن المجهري.
  2. اتبع الحقن المجهري للبويضات خطوة بخطوة ، الموصوف على نطاق واسع في المرجع12. حقن ميكرو طور بويضات محجوزة I مع 100 نانوغرام / ميكرولتر من Securin-gfp cRNA المحضرة في الخطوة 1.2.
  3. بعد الحقن المجهري ، اسمح للبويضات باستعادة وترجمة الحمض النووي الريبي في حاضنة CO2 لمدة 3 ساعات على الأقل. تحقق من التعبير من خلال مراقبة البويضات في نظام تصوير مضان آلي متعدد القنوات (انظر جدول المواد) لعرض إشارة GFP.
  4. كما هو موضح في الخطوة 2.2 ، قم بتحميل 150 ميكرولتر من وسائط الاستزراع مع أو بدون 5 ميكرومتر من نوكودازول و 150 ميكرولتر من وسائط الاستزراع مع 0.5 ميكرومتر من الانعكاس في ثلاثة آبار مختلفة من صفيحة 96 بئر.
  5. اغسل البويضات المحقونة الدقيقة من خلال ست قطرات من وسائط المزرعة الخالية من الميلرينون وانقل 1/3 من البويضات إلى كل علاج.
  6. احتفظ باللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ CO2 و 80٪ رطوبة حتى تستأنف البويضات الانقسام الاختزالي ، حوالي 3 ساعات بعد غسل ميلرينون.
    ملاحظة: استخدم مجهرا مجسما مع تكبير بين 30x-64x لتقييم انهيار الغلاف النووي كسمة مميزة للاستئناف الاختزالي.
  7. سجل صورا لنضوج البويضة باستخدام مجهر مضان مجهز بغرفة حاضنة كما هو موضح في الخطوة 2.6. استخدم إعدادات برايتفيلد للعثور على البويضات في البئر. استخدم مرشح 488 للكشف عن إشارة Securin-gfp وضبط شدة التألق لتجنب الإفراط في تعريض الخلايا.
    1. إذا كان نظام التصوير آليا ، فاحفظ مواضع البويضات في كل بئر. نظرا لأن Securin-gfp موزع بالتساوي في السيتوبلازم ، التقط الصور في المستوى الأوسط للبويضات على فترات 20 دقيقة لمدة 24 ساعة. لالتقاط مجموعات من البويضات في صورة واحدة ، استخدم عدسة موضوعية تكبير أقل مثل 10x.
  8. استخدم برنامج تحليل الصور لتحديد تدمير Securin-gfp. افتح صور قناة GFP. ابدأ من النقطة الزمنية 1. في برنامج التحليل المفضل ، استخدم أداة تحديد أو شكل لتمييز كل خلية بويضة وإنشاء منطقة اهتمام (ROI) لكل خلية.
    1. استخدم نفس عائد الاستثمار لتحديد منطقة خلفية ليتم طرحها لاحقا. قم بقياس كثافة بكسل GFP في كل عائد استثمار.
  9. باستخدام عائد الاستثمار لكل خلية بويضة تم إنشاؤها في الخطوة 3.8 ، قم بقياس شدة GFP في جميع النقاط الزمنية.
    ملاحظة: في بعض البرامج، تسمح علامة التبويب "تحليل" بتحديد وظيفة القياس.
    1. بعد ذلك ، تقدم إلى الإطار الزمني التالي وكرر هذه العملية لقياس شدة GFP في كل إطار زمني. أخيرا ، لكل قيمة GFP ، اطرح قياس عائد الاستثمار في الخلفية المحددة في الخطوة 3.8. سيعطي هذا التحليل قيمة لشدة Securin-gfp لكل بويضة في كل نقطة زمنية.
  10. استخراج بارامترات مختلفة من نمط تدمير Securin: (أ) الوقت الذي بدأ فيه تدهور Securin-gfp. هذا يخبرنا متى بدأ إسكات SAC ؛ (ب) وقت الإشارة الدنيا Securin-gfp. هذا يخبرنا عندما ينخفض إسكات SAC إلى ما دون مستوى العتبة للسماح بتنشيط APC / C العالي والتدهور الكامل ل Securin-GFP ؛ (ج) معدل تدمير سيكورين - هيئة أجيال السلام19. يوضح هذا مدى سرعة انخفاض نشاط SAC إلى ما دون مستوى عتبة تنشيط APC / C وتدهور Securin-GFP.

4. تجنيد MAD2 في الحركية عن طريق التألق المناعي أثناء النضج الاختزالي

ملاحظة: لجمع البويضات ونضجها ، راجع التقريرالمنشور مسبقا 12.

  1. تقسيم البويضات إلى ثلاث مجموعات. نقل كل مجموعة من البويضات إلى قطرات 100 ميكرولتر من وسائط الثقافة الخالية من الملرينون. قم بتغطية القطرات بالزيت المعدني وضعها في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، و 80٪ رطوبة) لمدة 3 ساعات و 5 ساعات و 7 ساعات للوصول إلى المرحلة الأولى المبكرة ، والمرحلة الأولى المتأخرة ، والمرحلة الأولى ، على التوالي.
    ملاحظة: ضع كل نقطة زمنية في طبق مختلف لتجنب إخراج نفس الطبق من الحاضنة عدة مرات ، مما يؤثر على التوقيت المنتظم للنضج الاختزالي.
  2. في النقاط الزمنية المحددة ، قم بإصلاح البويضات عن طريق نقلها إلى قطرات 500 ميكرولتر من 2٪ PFA في 1x PHEM عازلة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، باستخدام طبق زجاجي من 9 آبار كما هو موضح سابقا20. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى بئر نظيف يحتوي على قطرة 500 ميكرولتر من محلول الحجب (PBS + 0.3٪ BSA + 0.01٪ Tween-20 + 0.02٪ NaN3).
    ملاحظة: تكوين PHEM: أنابيب 60 مللي متر. 25 ملي متر هيبس ؛ 10 مللي متر EGTA ؛ و 2 mM MgCl2.
    ملاحظة: يمكن للمرء التوقف عند هذه النقطة وتخزين البويضات في محلول مانع في لوحة 9 آبار عند 4 درجات مئوية حتى الوقت المناسب لإكمال التألق المناعي.
  3. لمواصلة الكشف عن MAD2 ، انقل البويضات إلى بئر نظيف يحتوي على قطرة 500 ميكرولتر من محلول النفاذية (PBS + 0.3٪ BSA + 0.1٪ TritonX-100 + 0.02٪ NaN3). احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم نقل الخلايا إلى بئر جديد من محلول الحجب واحتضانها لمدة 10 دقائق.
  4. بالنسبة لبقية خطوات التألق المناعي ، استخدم غطاء طبق 96 بئرا مع مسافات بادئة كما هو موضح سابقا20. استخدم غرفة مظلمة مرطبة لتجنب التعرض للضوء والتبخر. انقل البويضات إلى قطرة 30 ميكرولتر من محلول الحجب مع الجسم المضاد ل MAD2 (1: 1000 ، أرنب) والجسم المضاد المضاد للسنتروميريك (ACA) (1:30 ، الإنسان) (انظر جدول المواد) واحتضانها لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يوفر غطاء الطبق المكون من 96 بئرا مساحة لمعالجة العديد من البروتينات والمجموعات في نفس الوقت.
  5. لغسل الأجسام المضادة الأولية الزائدة ، انقل الخلايا إلى قطرة 30 ميكرولتر من 1x PHEM عازلة مكملة بنسبة 0.5٪ Triton واحتضانها لمدة 10 دقائق في الغرفة المرطبة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
  6. قم بإجراء الغسيل الرابع ، ونقل الخلايا إلى قطرة 30 ميكرولتر من 1x PHEM عازلة بدون 0.5٪ 1x Triton ، واحتضانها لمدة 10 دقائق.
  7. انقل الخلايا إلى قطرة 30 ميكرولتر من محلول الحجب الذي يحتوي على أجسام مضادة ثانوية مثل anti-human-633 (1: 200) و anti-rabbit-568 (1: 200) (انظر جدول المواد) واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: اختر مجموعة من الفلوروفورات بناء على ليزر المجهر أو المرشحات.
  8. لغسل الأجسام المضادة الثانوية الزائدة ، كرر الخطوات 4.5-4.6.
  9. لتركيب الخلايا على شريحة المجهر ، انقل الخلايا إلى قطرة 10 ميكرولتر من وسائط التركيب التي تحتوي على DAPI (0.1 مجم / مل) (انظر جدول المواد). أضف نقاطا صغيرة من الفازلين إلى كل ركن من أركان الغطاء ، وضعها بعناية فوق قطرة الوسائط المتصاعدة ، واضغط ببطء للتوزيع. استخدمي طلاء أظافر شفاف لإغلاق الغطاء على الشريحة. للحصول على وصف أكثر تفصيلا لعملية التركيب ، انظر المرجع20.
  10. حركية الصورة باستخدام مجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد) مجهز بهدف 40x أو 63x. باستخدام إشارة ACA ، حدد النطاق z الذي يسمح بتصوير منطقة الكروموسوم بأكملها.
    ملاحظة: يمكن استخدام تكبير/تصغير بصري 4.0 وحجم z-step 0.5 ميكرومتر في بعض أنظمة التصوير. قد تختلف هذه المعلمات من نظام إلى آخر ، وسيكون التحسين ضروريا.
  11. تحليل شدة MAD2 في الحركية باستخدام برنامج تحليل الصور. قم بعمل عرض أقصى ل z-stack ثم قم بتقسيم القنوات.
  12. أولا ، قم بإنشاء قناع باستخدام قناة ACA عن طريق تحديد قناة ACA لإنشاء عتبة تحدد جميع إشارات الحركية. انتقل إلى علامة التبويب تحرير وأنشئ تحديدا. بعد ذلك ، قم بإنشاء عائد استثمار باستخدام هذا التحديد.
  13. حدد قناة MAD2 وقم بإحضار التحديد الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.12. حدد طريقة عتبة تتكيف بشكل أفضل مع إشارة MAD2. قياس شدة.
    ملاحظة: حدد طريقة العتبة في علاج التحكم واحتفظ بها ثابتة عند تحليل العلاجات المختلفة.
  14. لإجراء حسابات كثافة البكسل النسبية ، قسم شدة كل خلية على متوسط شدة بويضات WT في التجربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقييم استجابة SAC عن طريق علاج نوكودازول
الغرض من هذه التجربة هو تقييم تنشيط SAC وقوته. باستخدام نوكودازول لإزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة المغزل ، سيتم فك جميع الحركية ، مما سيؤدي إلى توقف دورة الخلية بوساطة SAC. في نظام التصوير الحالي ، قامت بويضات التحكم المعالجة ب DMSO ببثق جسم قطبي بعد حوالي 14 ساعة من إطلاقه من ميلرينون (الشكل 1 ، الألواح العلوية). تمشيا مع تنشيط SAC ، تم القبض على البويضات المعالجة بالنوكودازول في الطور الاستوائي الأول ولم تقذف جسما قطبيا (الشكل 1 ، الألواح الوسطى). لإثبات أن هذا الفحص هو مؤشر موثوق لنشاط SAC ، تم استخدام Reversine ، وهو مثبط MPS1 ، لمنع تنشيط SAC21. عندما يتعذر تنشيط SAC ، تقوم البويضات ببثق جسم قطبي على الرغم من عدم وجود ملحقات KT-MT (الشكل 1 ، الألواح السفلية). سيكون للبويضات ذات SAC الضعيف مزيج من النتائج - بعض البويضات توقف وبعض الأجسام القطبية المبثوقة17. يمكن استخدام هذه الطريقة لنضج بويضات الفأر مع وبدون نوكودازول كخطوة أولى وسهلة لتحدي تنشيط SAC.

نمط تدهور Securin-gfp أثناء النضج الاختزالي
أحد الأحداث النهائية بعد رضا SAC وإسكاته هو تنشيط APC / C ، مما يؤدي إلى تدهور Securin22. لذلك ، فإن تقييم نمط تحلل السيكورين هو قراءة مباشرة لوظيفة SAC ويجب إجراؤه لتحديد ما إذا كانت نتيجة نوكودازول اضطرابا يعتمد على SAC. يتضمن هذا الفحص التعبير خارج الرحم عن Securin-gfp في البويضات وتصوير الخلايا الحية اللاحق. وبعد وضع منحنى يتبع تدهور السيكورين، يمكن تحديد ثلاثة بارامترات: (أ) وقت بدء التدهور (إسكات الصوت)؛ (ب) وقت بدء التدهور (الإسكات)؛ (ب) وقت بدء التدهور (الإسكات)؛ (ج) وقت بدء التدهور (الإسكات)؛ (ج) وقت بدء التدهور (الإسكات)؛ (ج) وقت بدء التدهور (الإسكات). (ب) الوقت الذي يستغرقه الوصول إلى الحد الأدنى من مستوى Securin؛ (ج) معدل التدهور (الشكل 2 ألف). في المجموعة الضابطة ، البويضات المعالجة ب DMSO ، تبدأ شدة Securin-gfp في الانخفاض عند ~ 10 ساعات بعد غسل الميلرينون (الشكل 2B ، C). عندما نضجت البويضات في وجود عامل تنشيط SAC نوكودازول ، كانت مستويات Securin-gfp مستقرة خلال فترة النضج الاختزالي بأكملها. في المقابل ، عند منع تنشيط SAC مع العلاج العكسي ، تسارع نمط Securin-gfp. بدأ التدهور في ~ 4 ساعات بعد غسل ميلرينون ، بما يتفق مع تثبيط SAC (الشكل 2B ، C).

تجنيد MAD2 إلى الحركية عن طريق التألق المناعي أثناء النضج الاختزالي
إذا كانت البيانات تدعم وجود خلل في وظيفة SAC ، فإن الخطوة التالية هي تقييم توظيف وسطاء SAC الرئيسيين. يتم تنشيط SAC استجابة للحركات الحركية غير المرفقة. غالبا ما تكون حركية غير متصلة في الطور الأولي المبكر أثناء بناء المغزل ، ويتم زعزعة استقرار المرفقات غير الصحيحة للتصحيح. بمجرد أن يتم ربط kinetochores بثبات بالأنابيب الدقيقة ، يتم إسكات SAC للسماح بظهور الطور22. تتمثل الخطوة المبكرة في استجابة SAC في تجنيد سلسلة من البروتينات إلى الحركية التي تعمل كمنصة لتشكيل MCC22,23. يعد تقييم توطين مكونات SAC هذه إلى kinetochores استراتيجية أخرى لتقييم استجابة SAC. على سبيل المثال ، يعد تقييم MAD2 ، وهو مكون من مكونات MCC ، نهجا شائعا. يمكن استخدام صور المجهر متحد البؤر التي تكتشف السنتروميرات (ACA) و MAD2 للبويضات التي نضجت إلى الطور الأولي الأول المبكر ، والطور الأولي المتأخر الأول ، والطور الاستوائي الأول (الشكل 3 أ). لتقييم قوة إشارة SAC ، حدد كثافة بكسل MAD2 المترجمة KT (الشكل 3B). تحدث مستويات كبيرة من توظيف MAD2 في KTs في المرحلة الأولى المبكرة عندما لا تكون معظم KTs مرتبطة ب MTs. انخفضت مستويات MAD2 في الطور التمهيدي اللاحق وكانت غائبة تقريبا في الطور الاستوائي الأول عندما تم ربط جميع KTs بثبات ب MTs (الشكل 3A ، B). لذلك ، يمكن لهذه الطريقة تقييم استجابة SAC عند دمجها مع المقايستين الأخريين.

Figure 1
الشكل 1: تقييم تنشيط SAC مع نوكودازول. صور تمثيلية من تصوير الفاصل الزمني للبويضات الناضجة في وجود DMSO (التحكم) ، 5 ميكرومتر نوكودازول (NOC) ، أو 5 ميكرومتر نوكودازول + 0.5 ميكرومتر ريفيرسين (NOC + REV). يشير المربع الأحمر إلى الإطار الزمني لقذف الجسم القطبي. تم تحليل تجربتين مستقلتين. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: نمط تدهور Securin-gfp. (أ) رسم تخطيطي لمنحنى تدهور Securin-gfp مع ثلاثة بارامترات يمكن فحصها. (ب) صور تمثيلية من الفاصل الزمني للخلايا البويضية المحقونة بالحمض النووي الريبي Securin-gfp ونضجت في وجود DMSO (السيطرة) ، 5 ميكرومتر نوكودازول ، أو 0.5 ميكرومتر ريفيرسين. يشير المربع الأحمر إلى الإطار الزمني لقذف الجسم القطبي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (C) منحنى تحلل Securin-gfp التمثيلي للبويضات الدقيقة المحقونة ب Securin-gfp cRNA ونضجت في وجود DMSO (الدوائر الزرقاء) ، 5 ميكرومتر نوكودازول (المربعات الوردية) ، أو 0.5 ميكرومتر ريفيرسين (مثلثات سوداء). أشرطة الخطأ = خطأ قياسي. # من البويضات لكل علاج: DMSO = 10 ؛ شهادة عدم الممانعة = 15 ؛ REV = 5. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تجنيد MAD2 إلى حركية الخلايا أثناء النضج الاختزالي للخلية البيضية. (أ) صور تمثيلية متحدة البؤر للخلايا البيضية نضجت إلى الطور الأولي الأول المبكر، والطور الأولي الأول المتأخر، والطور الاستوائي الأول، الملطخة بالمناعة للكشف عن MAD2 (الرمادي) والحركية (ACA) (الحمراء). شريط المقياس = 10 ميكرومتر ؛ أقحم: 2 ميكرومتر. (B) القياس الكمي للكثافة النسبية ل MAD2 من الصور في (A). أشرطة الخطأ = خطأ قياسي. (ج) رسم تخطيطي لمسار تنشيط حركي غير مرتبط ومسار تنشيط SAC. # من البويضات لكل نقطة زمنية: الطور الأولي المبكر I = 23 ؛ المرحلة المتأخرة الأولى = 13 ؛ الطور الأول = 18. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقطة تفتيش تجميع المغزل هي آلية تحكم حرجة أثناء انقسام الخلايا مصممة لمنع أخطاء فصل الكروموسومات. يسمح للخلية بالحصول على وقت كاف لتصحيح مرفقات KT-MT غير الصحيحة. الانقسام الاختزالي في البويضات هو عملية معرضة للخطأ ، حيث يحدث معظم الفصل الخاطئ للكروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي الأول ، مما يؤدي إلى توليد بويضات اختلال الصيغة الصبغية التي هي السبب الرئيسي للإجهاض المبكر والعقم عند البشر 1,24. يتم اختبار العديد من الفرضيات لفك تشابك سبب وجود أخطاء في الانقسام الميوزي الأنثوي. أحد الأسباب المحتملة هو أن SAC أقل كفاءة مما هو عليه في الخلايا الجسدية ويسمح ببداية الطور مع واحد أو أكثر من KTs9،10،25 غير المرفقة. لذلك ، هناك حاجة إلى دراسة شاملة لآليات SAC في البويضات وتحديد المنظمين الرئيسيين لفهم عملية توليد بويضة euploid .

يصف البروتوكول الحالي ثلاث تقنيات لتقييم الجوانب المختلفة لسلامة SAC: التنشيط والإسكات. نظرا لأن كل من هذه المقايسات لها بعض القيود في التفسير ، فإن إجراء واحد فقط غير كاف لتوصيف وظيفة SAC في البويضات. لهذا السبب ، يقترح إجراء مجموعة من هذه الأساليب لتقييم سلامة SAC في الدراسة.

تقييم تنشيط SAC باستخدام نوكودازول واضح ومباشر لأنه بسيط وسريع. ومع ذلك ، هناك بعض النقاط المهمة التي يجب مراعاتها عند تفسير النتائج. أولا ، يجب على الباحث تحديد تركيز نوكودازول لإزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة للمغزل تماما لتوليد حركية غير متصلة وتنشيط SAC. يمكن تحديد الفقدان الناجح للأنابيب الدقيقة عن طريق تثبيت البويضات والكشف عن التوبولين عبر الفحص المجهري القائم على التألق المناعي20. هناك قيد حاسم آخر لهذه التقنية وهو قراءة هذا الفحص: قذف الجسم القطبي الأول (PBE). قد لا يكون فشل PBE بالضرورة دليلا كافيا على وظيفة SAC لأنه إذا كان بروتين الدراسة يؤثر على مراحل لاحقة مثل التحريك الخلوي والانقطاع ، فستكون النتائج أيضا فشل PBE. لذلك ، استخدم علاج نوكودازول كخطوة أولى لتقييم عيوب SAC ، ولكن بعد ذلك قم بمشاركته مع التقنيات الأخرى الموصوفة.

بمجرد ربط KTs بثبات ب MTs ومحاذاة الكروموسومات في لوحة الطور ، يتم إسكات SAC ، ويتم تنشيط APC / C ، مما يؤدي إلى تدهور Securin و Cyclin B. لذلك ، فإن تتبع نمط تدهور Securin أو Cyclin B هي مؤشرات شائعة الاستخدام لإسكات SAC25،26،27. يعطي تغيير نمط التدهور معلومات حول تسارع دورة الخلية أو تأخيرها. يشير التسارع إلى ضعف SAC ، بينما يشير التأخير إلى وجود عيوب في تلبية SAC. أحد قيود هذه التجربة هو أنها تتطلب جهاز حقن دقيق ومجموعة مهارات متخصصة. لاحظ أن معايرة التركيز المناسب ل Securin-gfp cRNA المستخدم في الحقن المجهري أمر بالغ الأهمية ، لأن الكثير منه سيوقف دورة الخلية28.

أخيرا ، يعد تقييم توظيف MAD2 في الحركية مؤشرا ومقياسا لتنشيط SAC. نمط تجنيد MAD2 أثناء الانقسام الاختزالي الأول ، مع مستويات قصوى من MAD2 في kinetochores في المرحلة الأولية الأولى المبكرة ومستويات منخفضة مع ارتباط KTs. مثل نمط تدهور Securin ، فإن أي تغيير في توظيف MAD2 إلى kinetochores يمكن أن يشير إلى تسارع أو تأخير إسكات SAC. يمكن أن تشير العيوب في تجنيد MAD2 في المرحلة الأولية المبكرة إلى فشل في آلية التنشيط أو التوظيف29 أو انخفاض كميات MAD2 في الخلية17. للتمييز بين هذين الاحتمالين ، يوصى بشدة بتقييم مستويات تعبير بروتين MAD2 بواسطة اللطخة الغربية 17. عند مقارنة علاجين أو أكثر ، من المهم مراعاة أن توقيت النضج الاختزالي ومحاذاة الكروموسوم يمكن أن يختلف بين العلاجات. لذلك ، أولا ، حدد توقيت دورة الخلية لكل علاج لمقارنة مستويات MAD2 بشكل صحيح وتفسير النتائج بدقة. أحد قيود هذه الطريقة هو أن MAD2 هو أحد المستجيبات الأخيرة لاستجابة SAC3. لذلك ، فإن تقييم MAD2 لا يسمح للمرء بتحديد أي جزء من آلية SAC مضطرب. لتقييم آليات SAC ، يمكن للمرء تحديد توظيف مكون SAC آخر مثل MPS1 و / أو BUB1 و / أو مجمع RZZ (الشكل 3C). نقطة أخرى يجب مراعاتها هي أن خطوة التثبيت أمر بالغ الأهمية. استخدمت هذه المقايسات 2٪ PFA في 1x PHEM buffer ، وهو تثبيت يعمل على اكتشاف بروتينات kinetochore في بويضات جبل كامل. ومع ذلك ، تستخدم المختبرات الأخرى تقنية انتشار الكروموسوم التي تم وصفها على نطاق واسع قبل30.

باختصار ، تم وصف ثلاثة مقايسات توفر معلومات مهمة حول قدرة الخلية على مراقبة حالة ارتباط الأنابيب الدقيقة الحركية والمغزلية للتحكم في فصل الكروموسومات بدقة في هذه المقالة. هذه المعلومات مهمة للتحقيق في المواقف الخلوية حيث قد يتم اختراق SAC للحصول على نظرة ثاقبة حول أي خطوة من نقطة التفتيش مضطربة. نظرا لأن اختلال الصيغة الصبغية سمة شائعة في الجاميتات والسرطانات، فإن هذه الأدوات تنطبق على العديد من الأجهزة البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تعارضات للكشف عنها.

Acknowledgments

تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R35GM136340 إلى KS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A4503
DAPI Life Technologies D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) Sigma D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 Life Technologies A10042
EVOS FL Auto Imaging System Life Technologies Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator Life Technologies Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated MatTek Corporation P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633 Life Technologies A21091
HEPES Sigma H3537
Human anti-ACA Antibodies Incorporated 15-234 Dilution 1/30
ImageJ NIH
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective Leica
MgSO4·7H20 Sigma M7774
Milrinone Sigma M4659
Na2HPO4 Sigma S2429
NaCl Sigma S5886
NaN3 Sigma S2002
Nocodazole Sigma M1404
Paraformaldhyde (PFA) Sigma P6148
PIPES Sigma P6757
Rabbit anti- MAD2 Biolegend 924601 Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine Cayman Chemical 10004412
Triton-X Sigma 274348
Tween-20 Sigma X100
Vectashield Vector laboratories H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
  3. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  4. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
  5. London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
  6. Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
  7. Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  8. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  9. Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
  10. Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
  11. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  12. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
  13. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
  14. Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
  15. Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
  16. Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
  17. Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
  18. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  19. Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
  20. Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
  21. Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  22. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  23. Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
  24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
  25. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  26. Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
  27. Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
  28. Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
  29. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  30. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 187 ،
تقييم سلامة نقطة تفتيش تجميع المغزل في بويضات الفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aboelenain, M., Schindler, K.,… More

Aboelenain, M., Schindler, K., Blengini, C. S. Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (187), e64459, doi:10.3791/64459 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter