Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Evaluering af spindelsamlingens kontrolpunktintegritet i museoocytter

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64459
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

Summary

Fejl i kromosomadskillelse er et almindeligt træk ved oocytter. Derfor giver undersøgelse af spindelsamlingskontrolpunktet vigtige spor om de mekanismer, der er nødvendige for at producere sunde æg. Denne protokol beskriver tre komplementære assays til evaluering af spindelsamlingens kontrolpunktintegritet i museoocytter.

Abstract

Aneuploidi er den førende genetiske abnormitet, der forårsager tidlig abort og graviditetssvigt hos mennesker. De fleste fejl i kromosomadskillelse, der giver anledning til aneuploidi, forekommer under meiose i oocytter, men hvorfor oocytmeiose er fejlbehæftet, forstås stadig ikke fuldt ud. Under celledeling forhindrer celler fejl i kromosomadskillelse ved at aktivere spindelsamlingskontrolpunktet (SAC). Denne kontrolmekanisme er afhængig af detektering af kinetochore (KT)-mikrotubuli (MT) vedhæftede filer og sensing spænding genereret af spindelfibre. Når KT'er ikke er fastgjort, aktiveres SAC og forhindrer cellecyklusprogression. SAC aktiveres først af MPS1-kinase, som udløser rekruttering og dannelse af det mitotiske checkpointkompleks (MCC), der består af MAD1, MAD2, BUB3 og BUBR1. Derefter diffunderer MCC ind i cytoplasmaet og sekvestrerer CDC20, en anafasefremmende kompleks / cyclosom (APC / C) aktivator. Når KT'er bliver fastgjort til mikrotubuli, og kromosomer er justeret ved metafasepladen, dæmpes SAC, CDC20 frigives, og APC / C aktiveres, hvilket udløser nedbrydningen af Cyclin B og Securin og derved tillader anafasedebut. Sammenlignet med somatiske celler er SAC i oocytter ikke så effektiv, fordi celler kan gennemgå anafase på trods af at de har ubundne KT'er. At forstå, hvorfor SAC er mere tilladende, og hvis denne tilladelse er en af årsagerne til kromosomadskillelsesfejl i oocytter, skal stadig undersøges yderligere. Denne protokol beskriver de tre teknikker til omfattende evaluering af SAC-integritet i museoocytter. Disse teknikker omfatter anvendelse af nocodazol til depolymerisering af MT'er til evaluering af SAC-responsen, sporing af SAC-hæmning ved at følge kinetikken ved Securin-destruktion og evaluering af rekrutteringen af MAD2 til KT'er ved immunofluorescens. Sammen sonder disse teknikker de mekanismer, der er nødvendige for at producere sunde æg ved at give en komplet evaluering af SAC-integritet.

Introduction

Aneuploidi, der stammer fra fejl i kromosomadskillelse, er den førende årsag til tidlige aborter og er stærkt forbundet med fejl i meiose1. Meiose adskiller sig fra mitose, fordi den består af to runder af celledeling uden et mellemliggende DNA-replikationstrin. I meiose I adskilles homologe kromosomer, mens søsterkromatider forbliver sammen. I oocytter er dette trin udsat for fejl, hvilket fører til aneuploide ægproduktion2.

For at forhindre kromosomadskillelsesfejl aktiverer de fleste celletyper en overvågningsmekanisme, der sætter cellecyklussen på pause, kaldet spindelsamlingskontrolpunktet (SAC). Denne mekanisme registrerer kinetochore (KT)-mikrotubuli (MT) vedhæftede filer, og spændingen genereres, når kromosomer orienteres på en bipolær måde3. Ikke-tilknyttede kinetochores udløser et SAC-svar, der starter med rekrutteringen af MPS1, SAC's masterregulator, til kinetochores 3,4. MPS1 initierer rekruttering af andre SAC-komponenter, der fungerer som en platform til dannelse af mitotisk checkpoint-kompleks (MCC). MCC, der består af MAD1, MAD2, BUB3 og BUBR1, diffunderer ind i cytoplasmaet og hæmmer APC / C-aktivering ved at sekvestrere dens aktivator CDC20. Når alle kinetochores er stabilt fastgjort til MT'er, og kromosomer er justeret ved metafasepladen, dæmpes SAC'en, og MCC adskilles og frigiver CDC20, hvilket tillader APC / C-aktivering. Aktiv APC / C nedbryder Securin og Cyclin B, to vigtige trin i udløsning af anafase debut 5,6. I somatiske celler er SAC streng, fordi den aktiveres af en enkelt ikke-vedhæftet kinetochore og er tilstrækkelig til at inducere cellecyklusarrest6. Under oocytmeiose er SAC imidlertid mere tilladende, og oocytter kan komme ind i anafase I med en eller flere ikke-tilknyttede kinetochores 6,7,8,9,10. At forstå, hvorfor SAC er mere eftergivende i oocytter, er et løbende fokusområde på området. Mekanismer, der forårsager defekter i SAC-aktivering eller SAC-hæmning, kan føre til fejl i kromosomadskillelse eller langvarig cellecyklusstop og celledød. Derfor er evaluering af de mekanismer, der opretholder SAC-integritet i oocytter, vigtig for at forstå processen med at danne sunde, euploide æg.

Denne protokol beskriver teknikker til omfattende evaluering af SAC-integriteten i museoocytmeiose ved at undersøge forskellige kritiske trin i kontrolpunktet. Først beskrives evalueringen af SAC-responsen efter inducering af SAC-aktivering. Denne aktivering opnås ved at generere ikke-vedhæftede kinetochores ved hjælp af nocodazol, et lægemiddel, der depolymeriserer MT'er11. For det andet beskrives en metode til overvågning af SAC-hæmning ved at spore dynamikken i Securin-nedbrydning under oocytmodning. Endelig anvendes et immunofluorescensbaseret assay til at måle rekrutteringen af MAD2, en af MCC-komponenterne, til kinetochores. Sammen vurderer disse assays omfattende SAC-integritet under oocytmeiotisk modning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle mus, der blev brugt i disse protokoller, blev anbragt og opdrættet i henhold til Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (protokol 201702497) og National Institutes of Health retningslinjer. Disse tilsynsorganer godkendte alle forsøgsprocedurer, der involverede dyreforsøg. Alle mus, der blev brugt i denne undersøgelse, var 6-8 uger gamle CF-1-hunner.

1. Eksperimentel forberedelse

  1. Før SAC-evalueringerne påbegyndes, skal der indsamles museoocytter efter den tidligere offentliggjorte rapport12. Opdel indsamlede oocytter i tre lige store grupper og opbevar dem i Chatot, Ziomek og Bavister (CZB) kulturmedier indeholdende 2,5 μM milrinon (se materialetabel) for at undgå meiotisk genoptagelse13.
    BEMÆRK: CZB sammensætning: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH2PO4; 1,2 mM MgSO 4-7H 2O; 0,27 mM pyruvat; 1,7 mM CaCl2; 30,8 mM DL-mælkesyre; 7 mM Taurin; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO3; Gentamicin; og 0,3% BSA.
  2. CRNA'et klargøres til mikroinjektion som beskrevet tidligere12,14. Securin-genet fra musen forstærkes fra cDNA'et klonet fra musens germinale vesikeloocytter, efterfulgt af subkloning i pMDL2-vektoren indeholdende Gfp-sekvens15,16.
    1. For at forberede Securin-Gfp cRNA lineariseres plasmidet med Nde I-fordøjelsen. Udfør in vitro transkription ved hjælp af T3 RNA-polymerase og rensning af cRNA16.
      BEMÆRK: Opbevar cRNA i alikvoter på 2-3 μL ved -80 °C indtil brug.

2. Nocodazol-behandling og levende billeddannelse

  1. Der fremstilles 1 ml kulturmedier (CZB) indeholdende 5 μM nocodazol (NOC), 1 ml kulturmedier med 5 μM NOC plus 0,5 μM reversin (NOC + REV) og 1 ml kulturmedier med dimethylsulfoxid (DMSO) (1:2000) som kontrol (se materialetabel).
  2. Til oocytmodning og levende billeddannelse skal du bruge en 96-brøndplade, der er forvarmet i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2 og 80% fugtighed. I den første brønd skal du indlæse 150 μL af kontrollen DMSO-behandlingen; i den anden brønd skal du indlæse 150 μL NOC-behandling; og i den tredje brønd skal du indlæse 150 μL NOC + REV-behandling. Opbevar pladen i inkubatoren under de samme betingelser som ovenfor, indtil det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Undgå at bruge den første række og den første kolonne i 96-brøndspladen, da kantens skygge forstyrrer billedernes kvalitet.
  3. For at starte meiotisk modning skal du fjerne milrinon. Mens du ser oocytterne under et stereomikroskop ved hjælp af forstørrelse mellem 30x-64x, vaskes milrinon ud af mediet ved sekventielt at overføre oocytterne gennem seks dråber 100 μL milrinonfrie kulturmedier indeholdende DMSO og placere dem i den tilsvarende brønd på 96-brøndpladen ved hjælp af en hånd- eller mundbetjent pipette.
    1. Tæl oocytter ved at samle dem op ved hjælp af en hånd- eller mundbetjent pipette og levere dem til næste dråbe for at undgå at miste nogen. Oocytterne er enkelte, store (~ 80 μm i diameter) og runde celler. Kernen vises som en knap i midten af cellen, og membranen og zona pellucida omgiver oocyten.
      BEMÆRK: Overfør oocytterne mellem dråber, mens du flytter den mindst mulige mængde væske. Dette giver mulighed for optimal fjernelse af milrinon fra kulturmedierne. Hvis oocytter undlader at genoptage meiose, er det sandsynligt, at milrinon ikke blev effektivt fjernet.
  4. Gentag den samme proces (trin 2.3) for NOC- og NOC + REV-behandling.
  5. Tag billeder af oocytterne ved hjælp af et brightfieldmikroskop udstyret med et inkubatorkammer med et kontrolleret miljø under disse forhold: 37 °C, 5% CO2 og 80 % fugtighed. Tag billeder på oocytternes midterplan med intervaller på 20 minutter i 24 timer.
  6. Kvantificer antallet af oocytter, der ekstruderer et polært legeme (PB) ved at identificere de celler, der gennemgår asymmetrisk cytokinese. Resultatet vil være en lille celle (PB) ved siden af ægget og inden for den delte zona pellucida. Se billederne ved hjælp af billedbehandlingssoftware (ImageJ, se materialetabel).
  7. Importer billedsekvens til billedanalysesoftwaren, og fremfør rammerne, indtil en eller flere celler gennemgår asymmetrisk cytokinese. Beregn procentdelen af oocytter, der ekstruderer en PB af det samlede antal oocytter17.

3. Overvågning af mønsteret af Securin-gfp-nedbrydning under meiotisk modning

  1. Der centrifugeres 3 μl Securin-Gfp cRNA (trin 1.2) ved 19.283 x g i 30 minutter ved 4 °C18.
    BEMÆRK: Brug supernatanten for at undgå at fylde urenheder, der kan forårsage blokering af kanylen under mikroinjektion.
  2. Følg trin-for-trin oocytmikroinjektion, udførligt beskrevet i reference12. Profase I-arresterede oocytter med mikroinjektion med 100 ng/μl Securin-gfp cRNA fremstillet i trin 1.2.
  3. Efter mikroinjektion tillades oocytterne at genvinde og oversætte RNA'et i CO2 -inkubatoren i mindst 3 timer. Kontroller udtrykket ved at observere oocytterne i et automatiseret multikanals fluorescensbilleddannelsessystem (se materialetabellen) for at se GFP-signalet.
  4. Som beskrevet i trin 2.2 fyldes 150 μL kulturmedier med eller uden 5 μM nocodazol og 150 μL kulturmedier med 0,5 μM reversin i tre forskellige huller i en plade med 96 huller.
  5. Vask de mikroinjicerede oocytter gennem seks dråber milrinofrie kulturmedier og overfør 1/3 af oocytterne til hver behandling.
  6. Opbevar pladen i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2 og 80% fugtighed, indtil oocytterne genoptager meiose, ca. 3 timer efter milrinonvask.
    BEMÆRK: Brug et stereomikroskop med forstørrelse mellem 30x-64x til at evaluere nedbrydningen af den nukleare kappe som et kendetegn ved meiotisk genoptagelse.
  7. Der optages billeder af oocytmodning ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med et inkubatorkammer som beskrevet i trin 2.6. Brug brightfield-indstillinger til at finde oocytterne i brønden. Brug et 488-filter til at detektere Securin-gfp-signalet og justere fluorescensintensiteten for at undgå overeksponering af cellerne.
    1. Hvis billeddannelsessystemet er automatiseret, skal du gemme oocytternes positioner i hver brønd. Fordi Securin-gfp er jævnt fordelt i cytoplasmaet, skal du tage billeder i oocytternes midterplan med intervaller på 20 minutter i 24 timer. For at fange grupper af oocytter i et billede skal du bruge et objektivobjektiv med lavere forstørrelse, f.eks. 10x.
  8. Brug billedanalysesoftware til at kvantificere Securin-gfp-destruktion. Åbn billederne af GFP-kanalen. Start ved tidspunkt 1. I den foretrukne analysesoftware skal du bruge et markerings- eller formværktøj til at markere hver oocyt og generere et interesseområde (ROI) for hver celle.
    1. Brug det samme investeringsafkast til at vælge et baggrundsområde, der skal trækkes fra senere. Mål GFP-pixelintensitet i hvert investeringsafkast.
  9. Brug ROI'erne for hver oocyt, der genereres i trin 3.8, og mål GFP-intensiteten i alle tidspunkter.
    BEMÆRK: I nogle softwareprogrammer tillader fanen "Analyser" valg af målefunktionen.
    1. Gå derefter videre til næste tidsramme, og gentag denne proces for at måle intensiteten af GFP i hver tidsramme. Til sidst trækkes målingen af ROI i baggrunden valgt i trin 3.8 fra for hver GFP-værdi. Denne analyse giver en værdi for Securin-gfp-intensitet for hver oocyt på hvert tidspunkt.
  10. Uddrag forskellige parametre fra mønsteret af Securin-destruktion: (a) det tidspunkt, hvor Securin-gfp-nedbrydningen begyndte. Dette fortæller, hvornår SAC-lyddæmpning startede; b) tidspunktet for minimumssignalet Securin-gfp. Dette fortæller, hvornår SAC-hæmning er faldet til under et tærskelniveau for at tillade høj APC/C-aktivering og fuld nedbrydning af Securin-GFP; c) destruktionshastigheden for Securin-GFP19. Dette fortæller, hvor hurtigt SAC-aktiviteten falder til under et tærskelniveau for APC / C-aktivering og Securin-GFP-nedbrydning.

4. Rekruttering af MAD2 ved kinetochores ved immunofluorescens under meiotisk modning

BEMÆRK: For oocytopsamling og modning henvises til den tidligere offentliggjorte rapport12.

  1. Opdel oocytter i tre grupper. Overfør hver gruppe oocytter til 100 μL dråber milrinonfrie kulturmedier. Dæk dråberne med mineralolie og læg dem i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2 og 80% fugtighed) i 3 timer, 5 timer og 7 timer for at nå henholdsvis tidlig prometafase I, sen prometafase I og metafase I.
    BEMÆRK: Placer hvert tidspunkt i en anden skål for at undgå at tage den samme skål ud af inkubatoren flere gange, hvilket påvirker den regelmæssige timing af meiotisk modning.
  2. På de tildelte tidspunkter fastgøres oocytterne ved at overføre dem til 500 μL dråber 2% PFA i 1x PHEM-buffer i 20 minutter ved stuetemperatur ved hjælp af en 9-brønds glasskål som tidligere beskrevet20. Overfør derefter cellerne til en ren brønd, der indeholder en 500 μL dråbe blokeringsopløsning (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02%NaN3).
    BEMÆRK: PHEM-sammensætning: 60 mM RØR; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; og 2 mM MgCl2.
    BEMÆRK: Man kan stoppe på dette tidspunkt og opbevare oocytterne i blokerende opløsning i 9-brøndpladen ved 4 ° C, indtil det passende tidspunkt at fuldføre immunfluorescens.
  3. For at fortsætte MAD2-detektionen overføres oocytterne til et rent hul indeholdende en 500 μL dråbe permeabiliseringsopløsning (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02%NaN3). Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur, og overfør derefter cellerne til en ny brønd med blokerende opløsning og inkuber i 10 minutter.
  4. Til resten af immunfluorescenstrinnene skal du bruge et 96-brønds opvaskelåg med fordybninger som tidligere beskrevet20. Brug et befugtet mørkt kammer for at undgå lyseksponering og fordampning. Æggene overføres til en 30 μL dråbe blokerende opløsning med anti-MAD2-antistof (1:1000, kanin) og anticentromerisk antistof (ACA) (1:30, humant) (se materialetabel) og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Opvaskelåget med 96 brønde giver plads til behandling af flere proteiner og grupper på samme tid.
  5. For at vaske overskydende primære antistoffer overføres cellerne til en 30 μL dråbe 1x PHEM-buffer suppleret med 0,5% Triton og inkuberes i 10 minutter i det befugtede kammer. Gentag dette trin to gange mere.
  6. Udfør den fjerde vask, overfør cellerne til et 30 μL fald på 1x PHEM-buffer uden 0,5% 1x Triton, og inkuber i 10 minutter.
  7. Overfør cellerne til en 30 μL dråbe blokerende opløsning indeholdende sekundære antistoffer såsom anti-human-633 (1:200) og anti-kanin-568 (1:200) (se materialetabel) og inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Vælg kombinationen af fluoroforer baseret på dine mikroskoplasere eller filtre.
  8. Gentag trin 4.5-4.6 for at vaske overskydende sekundære antistoffer.
  9. For at montere cellerne på mikroskopobjektglasset overføres cellerne til en 10 μL dråbe monteringsmedier indeholdende DAPI (0,1 mg / ml) (se materialetabel). Tilføj små prikker vaselin til hvert hjørne af dækslet, placer dem forsigtigt oven på monteringsmediedråben, og tryk langsomt for at fordele. Brug klar neglelak til at forsegle dækslet til diaset. For en mere detaljeret beskrivelse af monteringsprocessen, se reference20.
  10. Billede kinetochores ved hjælp af et konfokalmikroskop (se materialetabel) udstyret med et 40x eller 63x mål. Brug ACA-signalet til at bestemme z-området, der tillader billeddannelse af hele kromosomområdet.
    BEMÆRK: En optisk zoom på 4,0 og z-trinstørrelse på 0,5 μm kan bruges på nogle billedbehandlingssystemer. Disse parametre kan variere fra system til system, og optimering vil være nødvendig.
  11. Analyser MAD2-intensitet ved kinetochores ved hjælp af billedanalysesoftware. Lav en maksimal projektion med z-stack, og opdel derefter kanalerne.
  12. Opret først en maske ved hjælp af ACA-kanalen ved at vælge ACA-kanalen for at etablere en tærskel, der identificerer alle kinetochore-signalerne. Gå til fanen Rediger , og opret et valg. Opret derefter et investeringsafkast med dette valg.
  13. Vælg MAD2-kanalen, og hent det valg, der blev oprettet i trin 4.12. Vælg en tærskelmetode, der bedre tilpasser sig MAD2-signalet. Mål intensiteten.
    BEMÆRK: Vælg tærskelmetoden i kontrolbehandlingen og hold den konstant, når du analyserer forskellige behandlinger.
  14. For at foretage beregninger af relativ pixelintensitet divideres intensiteten af hver celle med den gennemsnitlige intensitet af WT-oocytterne i eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Evaluering af SAC-respons ved nocodazolbehandling
Formålet med dette eksperiment er at evaluere SAC-aktivering og styrke. Ved at bruge nocodazol til at depolymerisere spindelmikrotubuli vil alle kinetochores blive løsnet, hvilket vil forårsage en SAC-medieret cellecyklusarrest. I det nuværende billeddannelsessystem ekstruderede DMSO-behandlede kontroloocytter et polært legeme omkring 14 timer efter frigivelse fra milrinon (figur 1, toppaneler). I overensstemmelse med SAC-aktivering arresterede nocodazolbehandlede oocytter i metafase I og ekstruderede ikke et polært legeme (figur 1, midterste paneler). For at demonstrere, at dette assay er en pålidelig indikator for SAC-aktivitet, blev reversin, en MPS1-hæmmer, brugt til at forhindre SAC-aktivering21. Når SAC ikke kan aktiveres, ekstruderede oocytter et polært legeme på trods af at de ikke havde nogen KT-MT-vedhæftede filer (figur 1, bundpaneler). Oocytter med svækket SAC vil have en blanding af resultater - nogle oocytter arresteres og nogle ekstruderede polære legemer17. Denne metode til modning af museoocytter med og uden nocodazol kan bruges som et første og let skridt til at udfordre SAC-aktivering.

Mønster af Securin-gfp nedbrydning under meiotisk modning
En af de efterfølgende hændelser efter SAC-tilfredshed og lyddæmpning er aktiveringen af APC/C, hvilket fører til Securin-nedbrydning22. Derfor er evaluering af mønsteret for Securin-nedbrydning en direkte aflæsning af SAC-funktionen og bør udføres for at bestemme, om nocodazol-resultatet var en SAC-afhængig forstyrrelse. Dette assay involverer ektopisk ekspression af Securin-gfp i oocytter og efterfølgende levende cellebilleddannelse. Efter at have lavet en kurve, der følger Securin-nedbrydning, kan tre parametre bestemmes: (a) starttidspunktet for nedbrydning (lyddæmpning); b) den tid, det tager at nå minimumsniveauet for Securin og c) nedbrydningshastigheden (figur 2A). I kontrol, DMSO-behandlede oocytter, begynder Securin-gfp-intensiteten at falde ved ~ 10 timer efter milrinonudvaskning (figur 2B, C). Når oocytter blev modnet i nærvær af SAC-aktiveringsmidlet nocodazol, var Securin-gfp-niveauerne stabile i hele perioden med meiotisk modning. I modsætning hertil accelererede Securin-gfp-mønsteret, når SAC-aktivering forhindres med reversinbehandling; nedbrydning begyndte ved ~ 4 timer efter milrinon udvaskning, i overensstemmelse med SAC-hæmning (figur 2B, C).

Rekruttering af MAD2 til kinetochores ved immunofluorescens under meiotisk modning
Hvis dataene understøtter en defekt i SAC-funktionen, er det næste skridt at evaluere rekrutteringen af centrale SAC-mæglere. SAC aktiveres som reaktion på ikke-vedhæftede kinetochores. Kinetochores er ofte løsrevet i tidlig prometafase, da spindlen bygger, og forkerte vedhæftede filer destabiliseres til korrektion. Når kinetochores er stabilt fastgjort til mikrotubuli, dæmpes SAC for at tillade anafasestart22. Et tidligt skridt i SAC-responsen er rekrutteringen af en række proteiner til kinetochores, der tjener som en platform for MCC-dannelse22,23. Evaluering af lokaliseringen af disse SAC-komponenter til kinetochores er en anden strategi til evaluering af SAC-respons. For eksempel er evaluering af MAD2, en MCC-komponent, en almindelig tilgang. Konfokale mikroskopbilleder, der detekterer centromerer (ACA) og MAD2 af oocytter modnet til tidlig prometafase I, sen prometafase I og metafase I, kan bruges (figur 3A). For at evaluere styrken af SAC-signalet skal du kvantificere den KT-lokaliserede MAD2-pixelintensitet (figur 3B). Betydelige niveauer af MAD2-rekruttering til KT'er forekommer i tidlig prometafase I, når de fleste KT'er ikke er knyttet til MT'er. Niveauerne af MAD2 faldt i senere prometafase og var næsten fraværende i metafase I, da alle KT'er var stabilt bundet til MT'er (figur 3A, B). Derfor kan denne metode evaluere SAC-respons, når den kombineres med de to andre assays.

Figure 1
Figur 1: Vurdering af SAC-aktivering med nocodazol. Repræsentative billeder fra time-lapse-billeddannelse af oocytter modnet ved tilstedeværelse af DMSO (kontrol), 5 μM nocodazol (NOC) eller 5 μM nocodazol + 0,5 μM reversin (NOC + REV). Den røde firkant angiver tidsrammen for polar kropsekstrudering. To uafhængige eksperimenter blev analyseret. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Securin-gfp nedbrydningsmønster. (A) Skematisk oversigt over Securin-gfp nedbrydningskurve med tre parametre, der kan undersøges. (B) Repræsentative billeder fra en time-lapse af oocytter mikroinjiceret med Securin-gfp cRNA og modnet under tilstedeværelse af DMSO (kontrol), 5 μM nocodazol eller 0,5 μM reversin. Den røde firkant angiver tidsrammen for polar kropsekstrudering. Skalabjælke = 50 μm. (C) Repræsentativ Securin-gfp nedbrydningskurve for oocytter mikroinjiceret med Securin-gfp cRNA og modnet i nærværelse af DMSO (blå cirkler), 5 μM nocodazol (lyserøde firkanter) eller 0,5 μM reversin (sorte trekanter). Fejlbjælker = standardfejl. # af oocytter pr. behandling: DMSO = 10; NOC = 15; REV = 5. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: MAD2 rekruttering til kinetochores under oocytmeiotisk modning. (A) Repræsentative konfokale billeder af oocytter modnet til tidlig prometafase I, sen prometafase I og metafase I, immunfarvet til påvisning af MAD2 (grå) og kinetochores (ACA) (rød). Skala bar = 10 μm; indsats: 2 μm. (B) Kvantificering af den relative intensitet af MAD2 fra billeder i (A). Fejlbjælker = standardfejl. (C) Skematisk over en ikke-vedhæftet kinetochore og SAC-aktiveringsvej. # af oocytter pr. tidspunkt: Tidlig prometafase I = 23; Sen prometafase I = 13; Metafase I = 18. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spindelsamlingskontrolpunktet er en kritisk kontrolmekanisme under celledeling designet til at forhindre kromosomadskillelsesfejl. Det gør det muligt for cellen at have tid nok til at rette forkerte KT-MT-vedhæftede filer. Meiose i oocytter er en fejlbehæftet proces, hvor det meste af kromosomets fejladskillelse forekommer under meiose I, hvilket fører til generering af aneuploide æg, der er hovedårsagen til tidlige aborter og infertilitet hos mennesker 1,24. Flere hypoteser testes for at adskille, hvorfor kvindelig meiose har fejl. En mulig årsag er, at SAC er mindre effektiv end i somatiske celler og tillader anafasedebut med en eller flere forkert bundne KT'er 9,10,25. Derfor er der behov for en omfattende undersøgelse af SAC-mekanismer i oocytter og identifikation af nøgleregulatorer for at forstå processen med at generere et euploidt æg.

Denne protokol beskriver tre teknikker til evaluering af forskellige aspekter af SAC-integritet: aktivering og lyddæmpning. Fordi hver af disse assays har nogle begrænsninger i fortolkningen, er det kun utilstrækkeligt at udføre en til at karakterisere SAC-funktionen i oocytter. Af denne grund foreslås det at udføre en kombination af disse metoder til evaluering af SAC-integriteten i en undersøgelse.

Evaluering af SAC-aktivering ved hjælp af nocodazol er ligetil, fordi det er enkelt og hurtigt. Der er dog nogle vigtige punkter at overveje, når man fortolker resultaterne. For det første skal efterforskeren fastslå koncentrationen af nocodazol for fuldstændigt at depolymerisere spindelens mikrotubuli for at generere ikke-vedhæftede kinetochores og aktivere SAC. Vellykket tab af mikrotubuli kan bestemmes ved at fiksere oocytter og detektere tubulin via immunofluorescensbaseret mikroskopi20. En anden kritisk begrænsning ved denne teknik er aflæsningen af dette assay: ekstruderingen af det første polære legeme (PBE). PBE-svigt er ikke nødvendigvis tilstrækkeligt bevis for SAC-funktion, fordi hvis studieproteinet påvirker senere stadier, såsom cytokinese og abscission, vil resultaterne også være svigt af PBE. Brug derfor nocodazol-behandling som et første skridt til at evaluere SAC-defekter, men partner det derefter med de andre beskrevne teknikker.

Når KT'er er stabilt fastgjort til MT'er, og kromosomer er justeret ved metafasepladen, dæmpes SAC'en, og APC / C aktiveres, hvilket fører til nedbrydning af Securin og Cyclin B. Derfor er sporing af mønsteret af Securin eller Cyclin B nedbrydning almindeligt anvendte indikatorer for SAC-hæmning25,26,27. Ændring af nedbrydningsmønsteret giver information om cellecyklusens acceleration eller forsinkelse. En acceleration tyder på en svag SAC, mens en forsinkelse tyder på mangler i opfyldelsen af SAC. En begrænsning ved dette eksperiment er, at det kræver en mikroinjektionsrig og et specialiseret færdighedssæt. Bemærk, at titrering af den korrekte koncentration af Securin-gfp cRNA, der anvendes til mikroinjektion, er kritisk, da for meget vil standse cellecyklussen28.

Endelig er evaluering af rekrutteringen af MAD2 til kinetochores en indikator og måling af SAC-aktivering. Mønsteret for MAD2-rekruttering under meiose I, med maksimale niveauer af MAD2 ved kinetochores ved tidlig prometafase I og reducerede niveauer, når KT'er bliver vedhæftet. Ligesom Securin-nedbrydningsmønsteret kan enhver ændring af rekrutteringen af MAD2 til kinetochores indikere acceleration eller forsinkelse af SAC-hæmning. Defekter i MAD2-rekruttering ved tidlig prometafase kan indikere fejl i aktiverings- eller rekrutteringsmekanismen29 eller reducerede mængder MAD2 i celle17. For at skelne mellem disse to muligheder anbefales det kraftigt at evaluere niveauerne af MAD2-proteinekspression ved Western blot 17. Når man sammenligner to eller flere behandlinger, er det vigtigt at overveje, at tidspunktet for meiotisk modning og kromosomjustering kan variere mellem behandlingerne. Derfor skal du først definere cellecyklustimingen for hver behandling for korrekt at sammenligne MAD2-niveauer og nøjagtigt fortolke resultaterne. En begrænsning ved denne metode er, at MAD2 er en af de sidste effektorer af SAC-responsen3. Derfor giver vurderingen af MAD2 ikke mulighed for at fastslå, hvilken del af SAC-mekanismen der er forstyrret. For at evaluere SAC-mekanismer kan man bestemme rekrutteringen af en anden SAC-komponent såsom MPS1, BUB1 og / eller RZZ-komplekset (figur 3C). Et andet punkt at overveje er, at fikseringstrinnet er kritisk. Disse analyser anvendte 2% PFA i 1x PHEM-buffer, en fiksering, der fungerer til påvisning af kinetochore-proteiner i helmonterede oocytter. Andre laboratorier bruger imidlertid en kromosomspredningsteknik, der blev grundigt beskrevet før30.

Sammenfattende beskrives tre assays, der giver kritisk information om en celles evne til at overvåge kinetochore-spindelmikrotubulusvedhæftningsstatus for at kontrollere kromosomadskillelse nøjagtigt, beskrevet i denne artikel. Disse oplysninger er vigtige for at undersøge cellulære situationer, hvor SAC kan blive kompromitteret for at få indsigt i, hvilket trin i kontrolpunktet der forstyrres. Fordi aneuploidi er et fælles træk i kønsceller og kræftformer, gælder disse værktøjer for mange biologiske systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.

Acknowledgments

Finansiering til dette projekt blev ydet af National Institutes of Health (R35GM136340 til KS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A4503
DAPI Life Technologies D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) Sigma D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 Life Technologies A10042
EVOS FL Auto Imaging System Life Technologies Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator Life Technologies Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated MatTek Corporation P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633 Life Technologies A21091
HEPES Sigma H3537
Human anti-ACA Antibodies Incorporated 15-234 Dilution 1/30
ImageJ NIH
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective Leica
MgSO4·7H20 Sigma M7774
Milrinone Sigma M4659
Na2HPO4 Sigma S2429
NaCl Sigma S5886
NaN3 Sigma S2002
Nocodazole Sigma M1404
Paraformaldhyde (PFA) Sigma P6148
PIPES Sigma P6757
Rabbit anti- MAD2 Biolegend 924601 Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine Cayman Chemical 10004412
Triton-X Sigma 274348
Tween-20 Sigma X100
Vectashield Vector laboratories H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
  3. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  4. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
  5. London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
  6. Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
  7. Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  8. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  9. Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
  10. Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
  11. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  12. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
  13. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
  14. Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
  15. Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
  16. Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
  17. Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
  18. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  19. Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
  20. Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
  21. Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  22. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  23. Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
  24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
  25. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  26. Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
  27. Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
  28. Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
  29. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  30. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 187
Evaluering af spindelsamlingens kontrolpunktintegritet i museoocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aboelenain, M., Schindler, K.,… More

Aboelenain, M., Schindler, K., Blengini, C. S. Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (187), e64459, doi:10.3791/64459 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter