Summary
Fout in chromosoomsegregatie is een veel voorkomend kenmerk in eicellen. Daarom geeft het bestuderen van het controlepunt voor de spindelassemblage belangrijke aanwijzingen over de mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren. Het huidige protocol beschrijft drie complementaire testen om de integriteit van het controlepunt van de spindelassemblage in muizenoöcyten te evalueren.
Abstract
Aneuploïdie is de belangrijkste genetische afwijking die een vroege miskraam en zwangerschapsfalen bij mensen veroorzaakt. De meeste fouten in chromosoomsegregatie die aanleiding geven tot aneuploïdie treden op tijdens meiose in eicellen, maar waarom oöcyten meiose foutgevoelig is, is nog steeds niet volledig begrepen. Tijdens de celdeling voorkomen cellen fouten in chromosoomsegregatie door het spindelassemblagecheckpoint (SAC) te activeren. Dit controlemechanisme is gebaseerd op het detecteren van kinetochore (KT) -microtubule (MT) hulpstukken en het detecteren van spanning gegenereerd door spindelvezels. Wanneer KT's niet worden losgemaakt, wordt de SAC geactiveerd en voorkomt de progressie van de celcyclus. De SAC wordt eerst geactiveerd door MPS1-kinase, wat de rekrutering en vorming van het mitotische checkpointcomplex (MCC) activeert, bestaande uit MAD1, MAD2, BUB3 en BUBR1. Vervolgens diffundeert de MCC in het cytoplasma en sekwesters CDC20, een anafase-bevorderende complex / cyclosoom (APC / C) activator. Zodra KT's gehecht raken aan microtubuli en chromosomen zijn uitgelijnd op de metafaseplaat, wordt de SAC gedempt, cdc20 vrijgegeven en wordt de APC / C geactiveerd, waardoor de afbraak van cycline B en securine wordt veroorzaakt, waardoor anafase kan beginnen. In vergelijking met somatische cellen is de SAC in eicellen niet zo effectief omdat cellen anafase kunnen ondergaan ondanks het feit dat ze niet-gehechte KT's hebben. Begrijpen waarom de SAC meer tolerant is en of deze permissiviteit een van de oorzaken is van chromosoomsegregatiefouten in eicellen moet nog verder worden onderzocht. Het huidige protocol beschrijft de drie technieken om de SAC-integriteit in muizenoöcyten uitgebreid te evalueren. Deze technieken omvatten het gebruik van nocodazol om MT's te depolymeriseren om de SAC-respons te evalueren, het volgen van SAC-uitschakeling door de kinetiek van Securin-vernietiging te volgen en het evalueren van de rekrutering van MAD2 naar KT's door immunofluorescentie. Samen onderzoeken deze technieken mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren door een volledige evaluatie van de SAC-integriteit te bieden.
Introduction
Aneuploïdie, die voortkomt uit fouten in chromosoomsegregatie, is de belangrijkste oorzaak van vroege miskramen en is sterk gekoppeld aan fouten bij meiose1. Meiose onderscheidt zich van mitose omdat het bestaat uit twee rondes van celdeling zonder een tussenliggende DNA-replicatiestap. Bij meiose I scheiden homologe chromosomen terwijl zusterchromatiden bij elkaar blijven. Bij eicellen is deze stap foutgevoelig, wat leidt tot aneuploïde eiproductie2.
Om fouten in chromosoomsegregatie te voorkomen, activeren de meeste celtypen een bewakingsmechanisme dat de celcyclus pauzeert, het spindelassemblagecontrolepunt (SAC) genoemd. Dit mechanisme detecteert kinetochore (KT)-microtubule (MT) aanhechtingen en de spanning wordt gegenereerd wanneer chromosomen op een bipolaire manier worden georiënteerd3. Ongebonden kinetochoren veroorzaken een SAC-respons die begint met de rekrutering van MPS1, de hoofdregulator van de SAC, tot kinetochoren 3,4. MPS1 initieert de werving van andere SAC-componenten en fungeert als een platform om het mitotische checkpointcomplex (MCC) te vormen. De MCC, bestaande uit MAD1, MAD2, BUB3 en BUBR1, diffundeert in het cytoplasma en remt APC / C-activering door zijn activator CDC20 te sekwestreren. Zodra alle kinetochoren stabiel aan MT's zijn bevestigd en chromosomen zijn uitgelijnd op de metafaseplaat, wordt de SAC gedempt en de MCC demonteert en geeft CDC20 vrij, waardoor APC / C-activering mogelijk wordt. Actieve APC/C degradeert Securin en Cyclin B, twee belangrijke stappen bij het activeren van het begin van de anafase 5,6. In somatische cellen is de SAC streng omdat deze wordt geactiveerd door een enkel niet-vastgemaakt kinetochore en voldoende is om celcyclusstilstand te induceren6. Tijdens eicel meiose is de SAC echter meer tolerant en kunnen eicellen anafase I binnengaan met een of meer niet-vastgemaakte kinetochoren 6,7,8,9,10. Begrijpen waarom de SAC meer toegeeflijk is in eicellen is een voortdurend aandachtsgebied in het veld. Mechanismen die defecten in SAC-activering of SAC-uitschakeling veroorzaken, kunnen leiden tot fouten in chromosoomsegregatie of langdurige celcyclusstilstand en celdood. Daarom is het evalueren van de mechanismen die de SAC-integriteit in eicellen handhaven belangrijk om het proces van het vormen van gezonde, euploïde eieren te begrijpen.
Dit protocol beschrijft technieken om de SAC-integriteit bij muizenoöcyten meiose uitgebreid te evalueren door verschillende kritieke stappen van het controlepunt te onderzoeken. Eerst wordt de evaluatie van de SAC-respons na het induceren van SAC-activering beschreven. Deze activering wordt bereikt door het genereren van niet-gehechte kinetochoren met behulp van nocodazol, een medicijn dat MT's11 depolymeriseert. Ten tweede wordt een methode om SAC-uitschakeling te monitoren beschreven door de dynamiek van Securin-afbraak tijdens de rijping van eicellen te volgen. Ten slotte wordt een op immunofluorescentie gebaseerde test gebruikt om de rekrutering van MAD2, een van de MCC-componenten, naar kinetochoren te meten. Samen beoordelen deze testen uitgebreid de SAC-integriteit tijdens de meiotische rijping van eicellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen die in deze protocollen werden gebruikt, werden gehuisvest en grootgebracht volgens de Richtlijnen van de Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (Protocol 201702497) en National Institutes of Health. Deze regelgevende instanties keurden alle experimentele procedures met dierproeven goed. Alle muizen die in deze studie werden gebruikt, waren 6-8 weken oude CF-1-vrouwtjes.
1. Experimentele voorbereiding
- Voordat u met de SAC-evaluaties begint, verzamelt u muizenoöcyten volgens het eerder gepubliceerde rapport12. Verdeel verzamelde eicellen in drie gelijkmatige groepen en bewaar ze in Chatot-, Ziomek- en Bavister (CZB) kweekmedia die 2,5 μM milrinon bevatten (zie Materiaaltabel) om meiotische hervatting te voorkomen13.
OPMERKING: CZB samenstelling: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH2PO4; 1,2 mM MgSO4-7H 2O; 0,27 mM Pyruvaat; CaCl 2 van 1,7mM; 30,8 mM DL-melkzuur; 7 mM Taurine; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO3; Gentamicine; en 0,3% BSA. - Bereid het cRNA voor op micro-injectie zoals eerder beschreven 12,14. Versterk het securin-gen van de muis uit het cDNA gekloond uit kiemende blaasjesoöcyten van muizen, gevolgd door subcloning in de pMDL2-vector met Gfp-sequentie15,16.
- Om Securin-Gfp cRNA te bereiden, lineariseer het plasmide met Nde I-spijsvertering. Voer in vitro transcriptie uit met behulp van T3 RNA polymerase en het zuiveren van het cRNA16.
OPMERKING: Bewaar cRNA in aliquots van 2-3 μL bij -80 °C tot gebruik.
- Om Securin-Gfp cRNA te bereiden, lineariseer het plasmide met Nde I-spijsvertering. Voer in vitro transcriptie uit met behulp van T3 RNA polymerase en het zuiveren van het cRNA16.
2. Behandeling met nocodazol en live beeldvorming
- Bereid 1 ml kweekmedia (CZB) met 5 μM nocodazol (NOC), 1 ml kweekmedia met 5 μM NOC plus 0,5 μM reversine (NOC + REV) en 1 ml kweekmedia met dimethylsulfoxide (DMSO) (1:2000) als controle (zie materiaaltabel).
- Gebruik voor de rijping van eicellen en live beeldvorming een plaat met 96 putten die in de incubator is voorverwarmd bij 37 °C, 5% CO2 en 80% vochtigheid. In de eerste put, laad 150 μL van de controle DMSO-behandeling; in de tweede put, laad 150 μL NOC-behandeling; en in de derde put, laad 150 μL NOC + REV-behandeling. Bewaar de plaat in de couveuse onder dezelfde omstandigheden als hierboven totdat het nodig is.
OPMERKING: Vermijd in de 96-well plaat het gebruik van de eerste rij en de eerste kolom omdat de schaduw van de rand de kwaliteit van de afbeeldingen verstoort. - Om de meiotische rijping te starten, verwijdert u milrinon. Terwijl u de eicellen onder een stereomicroscoop bekijkt met behulp van een vergroting tussen 30x-64x, wast u milrinon uit de media door de eicellen sequentieel over te brengen door zes druppels van 100 μL milrinonvrije kweekmedia die DMSO bevatten en plaatst u ze in de overeenkomstige put van de 96-well plaat met behulp van een hand- of mondbediende pipet.
- Tel eicellen door ze op te pakken met een hand- of mondbediende pipet en ze af te leveren bij de volgende druppel om te voorkomen dat ze verloren gaan. De eicellen zijn enkele, grote (~ 80 μm in diameter) en ronde cellen. De kern verschijnt als een knop in het midden van de cel en het membraan en de zona pellucida omringen de eicel.
OPMERKING: Breng de eicellen over tussen druppels terwijl u zo min mogelijk vloeistof verplaatst. Dit zorgt voor een optimale verwijdering van het milrinon uit de kweekmedia. Als de eicellen de meiose niet hervatten, is het waarschijnlijk dat het milrinon niet effectief is verwijderd.
- Tel eicellen door ze op te pakken met een hand- of mondbediende pipet en ze af te leveren bij de volgende druppel om te voorkomen dat ze verloren gaan. De eicellen zijn enkele, grote (~ 80 μm in diameter) en ronde cellen. De kern verschijnt als een knop in het midden van de cel en het membraan en de zona pellucida omringen de eicel.
- Herhaal hetzelfde proces (stap 2.3) voor NOC en NOC + REV behandeling.
- Breng de eicellen in beeld met behulp van een brightfield-microscoop die is uitgerust met een incubatorkamer met een gecontroleerde omgeving onder deze omstandigheden: 37 °C, 5% CO2 en 80% vochtigheid. Leg beelden vast in het middelste vlak van de eicellen met intervallen van 20 minuten gedurende 24 uur.
- Kwantificeer het aantal eicellen dat een polair lichaam (PB) extrudeert door de cellen te identificeren die door asymmetrische cytokinese gaan. Het resultaat is een kleine cel (PB) naast het ei en in de gedeelde zona pellucida. Bekijk de afbeeldingen met behulp van beeldbewerkingssoftware (ImageJ, zie Materiaaltabel).
- Importeer de beeldreeks in de beeldanalysesoftware en vervroeg de frames totdat een of meer cellen door asymmetrische cytokinese gaan. Bereken het percentage eicellen dat een PB extrudeert van het totaal van de eicellen17.
3. Monitoring van het patroon van Securin-gfp-afbraak tijdens meiotische rijping
- Centrifugeer 3 μL Securin-Gfp cRNA(stap 1.2) bij 19.283 x g gedurende 30 min bij 4 °C18.
OPMERKING: Gebruik het supernatant om te voorkomen dat onzuiverheden worden geladen die naaldverstopping kunnen veroorzaken tijdens microinjectie. - Volg stap-voor-stap oöcytenmicro-injectie, uitgebreid beschreven in referentie12. Micro-injectie profase I-gearresteerde eicellen met 100 ng/μL Securin-gfp cRNA bereid in stap 1.2.
- Laat na micro-injectie de eicellen het RNA in de CO2-incubator gedurende ten minste 3 uur herstellen en vertalen. Controleer de expressie door de eicellen te observeren in een geautomatiseerd meerkanaals fluorescentiebeeldvormingssysteem (zie Materiaaltabel) om het GFP-signaal te bekijken.
- Zoals beschreven in stap 2.2, laadt u 150 μL kweekmedia met of zonder 5 μM nocodazol en 150 μL kweekmedia met 0,5 μM reversine in drie verschillende putten van een 96-wellsplaat.
- Was de micro geïnjecteerde eicellen door zes druppels milrinonvrije kweekmedia en breng 1/3 van de eicellen over in elke behandeling.
- Houd de plaat in de couveuse op 37 °C, met 5% CO2 en 80% vochtigheid totdat de eicellen de meiose hervatten, ongeveer 3 uur na het wassen van milrinon.
OPMERKING: Gebruik een stereomicroscoop met een vergroting tussen 30x-64x om de afbraak van de nucleaire enveloppe te evalueren als een kenmerk van meiotische hervatting. - Registreer beelden van de rijping van eicellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een incubatorkamer zoals beschreven in stap 2.6. Gebruik brightfield-instellingen om de eicellen in de put te vinden. Gebruik een 488-filter om het Securin-gfp-signaal te detecteren en pas de fluorescentie-intensiteit aan om te voorkomen dat de cellen te veel worden blootgesteld.
- Als het beeldvormingssysteem geautomatiseerd is, slaat u de posities van de eicellen in elke put op. Omdat Securin-gfp gelijkmatig in het cytoplasma is verdeeld, legt u beelden vast in het middelste vlak van de eicellen met tussenpozen van 20 minuten gedurende 24 uur. Als u groepen eicellen in één foto wilt vastleggen, gebruikt u een lens met een lager vergrotingsobjectief, zoals 10x.
- Gebruik beeldanalysesoftware om Securin-gfp-vernietiging te kwantificeren. Open de afbeeldingen van het GFP-kanaal. Begin bij tijdstip 1. Gebruik in de gewenste analysesoftware een selectie- of vormtool om elke eicel te markeren en een interessante regio (ROI) voor elke cel te genereren.
- Gebruik dezelfde ROI om een achtergrondgebied te selecteren dat later moet worden afgetrokken. Meet de GFP-pixelintensiteit in elke ROI.
- Gebruik de ROI's voor elke eicel die in stap 3.8 is gegenereerd en meet de GFP-intensiteit in alle tijdspunten.
OPMERKING: In sommige softwareprogramma's kunt u op een tabblad "Analyseren" de functie Meten selecteren.- Ga vervolgens verder met het volgende tijdsbestek en herhaal dit proces om de intensiteit van GFP in elk tijdsbestek te meten. Trek ten slotte bij elke GFP-waarde de meting van de ROI af op de achtergrond die is geselecteerd in stap 3.8. Deze analyse geeft een waarde voor securin-gfp intensiteit voor elke eicel op elk tijdstip.
- Extraheer verschillende parameters uit het patroon van Securin-vernietiging: (a) de tijd dat Securin-gfp-afbraak begon. Dit vertelt wanneer SAC-uitschakeling begon; b) de tijd van het securin-gfp-minimumsignaal. Dit vertelt wanneer SAC-demping onder een drempelniveau is gedaald om een hoge APC / C-activering en volledige Securin-GFP-degradatie mogelijk te maken; c) de mate van securin-gfp-vernietiging19. Dit vertelt hoe snel de SAC-activiteit daalt tot onder een drempelniveau voor APC/C-activering en Securin-GFP-degradatie.
4. Rekrutering van MAD2 bij kinetochoren door immunofluorescentie tijdens meiotische rijping
OPMERKING: Voor het verzamelen en rijpen van eicellen, zie het eerder gepubliceerde rapport12.
- Splits eicellen in drie groepen. Breng elke groep eicellen over in 100 μL druppels milrinonvrije kweekmedia. Bedek de druppels met minerale olie en plaats ze in de incubator (37 °C, 5% CO2 en 80% vochtigheid) gedurende 3 uur, 5 uur en 7 uur om respectievelijk vroege prometafase I, late prometafase I en metafase I-stadium te bereiken.
OPMERKING: Plaats elk tijdstip in een ander gerecht om te voorkomen dat u hetzelfde gerecht meerdere keren uit de couveuse haalt, wat de normale timing van meiotische rijping beïnvloedt. - Fixeer de eicellen op de toegewezen tijdstippen door ze over te brengen in 500 μL druppels van 2% PFA in 1x PHEM-buffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, met behulp van een 9-well glazen schaal zoals eerder beschreven20. Breng vervolgens de cellen over naar een schone put met een druppel van 500 μL blokkerende oplossing (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3).
OPMERKING: PHEM samenstelling: 60 mM PIPES; 25 mM HEPES; EGTA van 10 mM; en 2 mM MgCl2.
OPMERKING: Men kan op dit punt stoppen en de eicellen opslaan in een blokkerende oplossing in de 9-well plaat bij 4 °C tot het geschikte moment om immunofluorescentie te voltooien. - Om de MAD2-detectie voort te zetten, brengt u de eicellen over naar een schone put met een druppel van 500 μL permeabilisatieoplossing (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3). Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en breng de cellen vervolgens over naar een nieuwe bron van blokkerende oplossing en incubeer gedurende 10 minuten.
- Gebruik voor de rest van de immunofluorescentiestappen een 96-wells schaaldeksel met inkepingen zoals eerder beschreven20. Gebruik een bevochtigde donkere kamer om blootstelling aan licht en verdamping te voorkomen. Breng de eicellen over in een druppel 30 μL blokkerende oplossing met anti-MAD2-antilichaam (1:1000, konijn) en anti-centromeer antilichaam (ACA) (1:30, humaan) (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Het 96-wells schoteldeksel biedt ruimte voor de verwerking van verschillende eiwitten en groepen tegelijkertijd. - Om overtollige primaire antilichamen te wassen, brengt u de cellen over naar een druppel van 30 μL van 1x PHEM-buffer aangevuld met 0,5% Triton en incubeert u gedurende 10 minuten in de bevochtigde kamer. Herhaal deze stap nog twee keer.
- Voer de vierde was uit, breng de cellen over naar een druppel van 30 μL van 1x PHEM-buffer zonder 0,5% 1x Triton en incubeer gedurende 10 minuten.
- Breng de cellen over naar een druppel van 30 μL blokkeringsoplossing met secundaire antilichamen zoals anti-human-633 (1:200) en anti-konijn-568 (1:200) (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Kies de combinatie van fluoroforen op basis van uw microscooplasers of filters. - Om overtollige secundaire antilichamen te wassen, herhaalt u stap 4.5-4.6.
- Om de cellen op de microscoopglaas te monteren, brengt u de cellen over naar een druppel van 10 μL van montagemedia die DAPI (0,1 mg / ml) bevatten (zie Materiaaltabel). Voeg kleine puntjes vaseline toe aan elke hoek van de coverslip, plaats ze voorzichtig op de bovenste druppel van het montagemedium en druk langzaam om te verdelen. Gebruik heldere nagellak om de coverslip af te dichten op de dia. Voor een meer gedetailleerde beschrijving van het montageproces, zie referentie20.
- Beeldkinochelen met behulp van een confocale microscoop (zie Materiaaltabel) uitgerust met een 40x of 63x objectief. Bepaal met behulp van het ACA-signaal het z-bereik dat beeldvorming van het hele chromosoomgebied mogelijk maakt.
OPMERKING: Een optische zoom van 4,0 en een z-stapgrootte van 0,5 μm kunnen op sommige beeldvormingssystemen worden gebruikt. Deze parameters kunnen van systeem tot systeem verschillen en optimalisatie is noodzakelijk. - Analyseer mad2-intensiteit bij kinetochoren met behulp van beeldanalysesoftware. Maak een maximale projectie van de z-stack en splits vervolgens de kanalen.
- Maak eerst een masker met behulp van het ACA-kanaal door het ACA-kanaal te selecteren om een drempel vast te stellen die alle kinetochore-signalen identificeert. Ga naar het tabblad Bewerken en maak een selectie. Maak vervolgens een ROI met deze selectie.
- Selecteer het MAD2-kanaal en breng de selectie binnen die in stap 4.12 is gemaakt. Selecteer een drempelmethode die zich beter aanpast aan het MAD2-signaal. Meet de intensiteit.
OPMERKING: Selecteer de drempelmethode in de controlebehandeling en houd deze constant bij het analyseren van verschillende behandelingen. - Om berekeningen van de relatieve pixelintensiteit te maken, deelt u de intensiteit van elke cel door de gemiddelde intensiteit van de WT-eicellen in het experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluatie van sac-responsiviteit door behandeling met nocodazol
Het doel van dit experiment is om SAC-activering en -sterkte te evalueren. Door nocodazol te gebruiken om spindelmicrotubuli te depolymeriseren, worden alle kinetochoren losgemaakt, wat een SAC-gemedieerde celcyclusstilstand zal veroorzaken. In het huidige beeldvormingssysteem extrudeerden met DMSO behandelde controle-eicellen een polair lichaam ongeveer 14 uur na afgifte van milrinon (figuur 1, bovenste panelen). In overeenstemming met SAC-activering werden met nocodazol behandelde eicellen gearresteerd in metafase I en extrudeerden ze geen polair lichaam (figuur 1, middelste panelen). Om aan te tonen dat deze test een betrouwbare indicator is van SAC-activiteit, werd reversine, een MPS1-remmer, gebruikt om SAC-activeringte voorkomen 21. Wanneer de SAC niet kan worden geactiveerd, hebben eicellen een polair lichaam geëxtrudeerd ondanks het feit dat ze geen KT-MT-bijlagen hebben (figuur 1, onderste panelen). Eicellen met een verzwakte SAC zullen een mix van uitkomsten hebben - sommige eicellen arresteren en sommige extruderen polaire lichamen17. Deze methode voor het rijpen van muizenoöcyten met en zonder nocodazol kan worden gebruikt als een eerste en eenvoudige stap om SAC-activering uit te dagen.
Patroon van Securin-gfp-afbraak tijdens meiotische rijping
Een van de downstream-gebeurtenissen na SAC-tevredenheid en -uitschakeling is de activering van de APC/C, wat leidt tot Securin-degradatie22. Daarom is evaluatie van het patroon van Securin-afbraak een directe uitlezing van de SAC-functie en moet worden uitgevoerd om te bepalen of het nocodazolresultaat een SAC-afhankelijke verstoring was. Deze test omvat ectopische expressie van Securin-gfp in eicellen en daaropvolgende live-cell imaging. Na het maken van een curve die securin-degradatie volgt, kunnen drie parameters worden bepaald: (a) De begintijd van degradatie (uitschakeling); b) de tijd die nodig is om het minimumniveau van securine te bereiken; en c) de afbraaksnelheid (figuur 2A). In de controle, met DMSO behandelde eicellen, begint de securin-gfp-intensiteit af te nemen na ~ 10 uur nadat milrinon is uitgespoeld (figuur 2B, C). Wanneer eicellen werden gerijpt in aanwezigheid van het SAC-activerende middel nocodazol, waren de Securin-gfp-niveaus stabiel gedurende de gehele periode van meiotische rijping. Daarentegen, bij het voorkomen van SAC-activering met reversinebehandeling, versnelde het Securin-gfp-patroon; de afbraak begon na ~4 uur na milrinonuitspoeling, in overeenstemming met SAC-remming (figuur 2B,C).
Rekrutering van MAD2 tot kinetochoren door immunofluorescentie tijdens meiotische rijping
Als de gegevens een defect in de SAC-functie ondersteunen, is de volgende stap het evalueren van de werving van belangrijke SAC-mediators. De SAC wordt geactiveerd als reactie op niet-vastgemaakte kinetochoren. Kinetochoren worden vaak niet bevestigd in de vroege prometafase omdat de spindel zich opbouwt en onjuiste aanhechtingen worden gedestabiliseerd voor correctie. Zodra kinetochoren stabiel zijn bevestigd aan microtubuli, wordt de SAC gedempt om anafase-aanvang22 mogelijk te maken. Een vroege stap in de SAC-respons is de rekrutering van een reeks eiwitten tot kinetochoren die dienen als een platform voor MCC-vorming22,23. Evaluatie van de lokalisatie van deze SAC-componenten naar kinetochoren is een andere strategie om de SAC-respons te evalueren. Evaluatie van MAD2, een MCC-component, is bijvoorbeeld een veel voorkomende aanpak. Confocale microscoopbeelden die centromeren (ACA) en MAD2 detecteren van eicellen die zijn gerijpt tot vroege prometafase I, late prometafase I en metafase I kunnen worden gebruikt (figuur 3A). Om de sterkte van het SAC-signaal te evalueren, kwantificeert u de KT-gelokaliseerde MAD2-pixelintensiteit (figuur 3B). Significante niveaus van MAD2-rekrutering voor KT's treden op in de vroege prometafase I wanneer de meeste KT's niet aan MT's zijn gehecht. De niveaus van MAD2 daalden in latere prometafase en waren bijna afwezig in metafas I toen alle KT's stabiel aan MT's waren gehecht (figuur 3A, B). Daarom kan deze methode de SAC-respons evalueren in combinatie met de andere twee testen.
Figuur 1: Beoordeling van SAC-activering met nocodazol. Representatieve beelden van time-lapse beeldvorming van eicellen gerijpt in aanwezigheid van DMSO (controle), 5 μM nocodazol (NOC) of 5 μM nocodazol + 0,5 μM reversine (NOC + REV). Het rode vierkant geeft het tijdsbestek van polaire lichaamsextrusie aan. Twee onafhankelijke experimenten werden geanalyseerd. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Securin-gfp degradatiepatroon. (A) Schematische securin-gfp-degradatiecurve met drie parameters die kunnen worden onderzocht. (B) Representatieve beelden van een time-lapse van eicellen micro geïnjecteerd met Securin-gfp cRNA en gerijpt in aanwezigheid van DMSO (controle), 5 μM nocodazol of 0,5 μM reversine. Het rode vierkant geeft het tijdsbestek van polaire lichaamsextrusie aan. Schaalbalk = 50 μm. (C) Representatieve Securin-gfp afbraakcurve van eicellen micro geïnjecteerd met Securin-gfp cRNA en gerijpt in aanwezigheid van DMSO (blauwe cirkels), 5 μM nocodazol (roze vierkanten) of 0,5 μM reversine (zwarte driehoeken). Foutbalken = standaardfout. Aantal eicellen per behandeling: DMSO = 10; NOC = 15; REV = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: MAD2-rekrutering naar kinetochoren tijdens de meiotische rijping van de eicel. (A) Representatieve confocale beelden van eicellen rijpten tot vroege prometafase I, late prometafase I en metafase I, immunostained om MAD2 (grijs) en kinetochoren (ACA) (rood) te detecteren. Schaalbalk = 10 μm; inzet: 2 μm. (B) Kwantificering van de relatieve intensiteit van MAD2 uit beelden in (A). Foutbalken = standaardfout. (C) Schematische weergave van een niet-vastgemaakt kinetochore en SAC-activeringsroute. Aantal eicellen per tijdspunt: Vroege prometafase I = 23; Late prometafase I = 13; Metafase I = 18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het controlepunt voor de assemblage van de spindel is een kritisch controlemechanisme tijdens de celdeling dat is ontworpen om fouten in de chromosoomsegregatie te voorkomen. Het stelt de cel in staat om voldoende tijd te hebben om onjuiste KT-MT-bijlagen te corrigeren. Meiose in eicellen is een foutgevoelig proces, waarbij het grootste deel van de chromosoommissegregatie optreedt tijdens meiose I, wat leidt tot het genereren van aneuploïde eieren die de belangrijkste oorzaak zijn van vroege miskramen en onvruchtbaarheid bij mensen 1,24. Verschillende hypothesen worden getest om te ontwarren waarom vrouwelijke meiose fouten heeft. Een mogelijke reden is dat de SAC minder efficiënt is dan in somatische cellen en anafase-aanvang mogelijk maakt met een of meer verkeerd gehechte KT's 9,10,25. Daarom is een uitgebreide studie van SAC-mechanismen in eicellen en het identificeren van belangrijke regulatoren nodig om het proces van het genereren van een euploïde eicel te begrijpen.
Het huidige protocol beschrijft drie technieken om verschillende aspecten van SAC-integriteit te evalueren: activering en stillegging. Omdat elk van deze testen enkele beperkingen in interpretatie heeft, is het uitvoeren van slechts één onvoldoende om de SAC-functie in eicellen te karakteriseren. Om deze reden wordt voorgesteld om een combinatie van deze methoden uit te voeren om de SAC-integriteit in een studie te evalueren.
Evaluatie van SAC-activering met nocodazol is eenvoudig omdat het eenvoudig en snel is. Er zijn echter enkele belangrijke punten om te overwegen bij het interpreteren van de resultaten. Ten eerste moet de onderzoeker de concentratie van nocodazol vaststellen om de microtubuli van de spil volledig te depolymeriseren om niet-vastgemaakte kinetochoren te genereren en de SAC te activeren. Succesvol verlies van microtubuli kan worden bepaald door eicellen te fixeren en tubuline te detecteren via immunofluorescentie-gebaseerde microscopie20. Een andere kritische beperking van deze techniek is de uitlezing van deze test: de extrusie van het eerste polaire lichaam (PBE). PBE-falen hoeft niet noodzakelijkerwijs voldoende bewijs te zijn voor de SAC-functie, omdat als het eiwit van onderzoek latere stadia zoals cytokinese en abscissie beïnvloedt, de resultaten ook het falen van PBE zullen zijn. Gebruik daarom nocodazolbehandeling als een eerste stap om SAC-defecten te evalueren, maar werk het vervolgens samen met de andere beschreven technieken.
Zodra KT's stabiel aan MT's zijn bevestigd en chromosomen zijn uitgelijnd op de metafaseplaat, wordt de SAC gedempt en wordt de APC / C geactiveerd, wat leidt tot Securin en Cyclin B-degradatie. Daarom zijn het volgen van het patroon van Securin- of Cyclin B-degradatie veelgebruikte indicatoren van SAC-uitschakeling 25,26,27. Verandering van het afbraakpatroon geeft informatie over de versnelling of vertraging van de celcyclus. Een versnelling suggereert een zwakke SAC, terwijl een vertraging defecten suggereert in het voldoen aan de SAC. Een beperking van dit experiment is dat het een micro-injectie-rig en een gespecialiseerde vaardigheden vereist. Merk op dat titratie van de juiste concentratie Securin-gfp cRNA gebruikt voor micro-injectie van cruciaal belang is, omdat te veel de celcyclus zal stoppen28.
Ten slotte is de evaluatie van de rekrutering van MAD2 voor kinetochoren een indicator en maatstaf voor SAC-activering. Het patroon van MAD2-rekrutering tijdens meiose I, met maximale niveaus van MAD2 bij kinetochoren bij vroege prometafase I en verlaagde niveaus naarmate KT's gehecht raken. Net als het Securin-degradatiepatroon kan elke verandering van de rekrutering van MAD2 naar kinetochoren wijzen op versnelling of vertraging van SAC-uitschakeling. Defecten in MAD2-rekrutering in de vroege prometafase kunnen wijzen op fouten in het mechanisme van activering of rekrutering29 of verminderde hoeveelheden MAD2 in de cel17. Om onderscheid te maken tussen deze twee mogelijkheden, wordt het evalueren van de niveaus van MAD2-eiwitexpressie door Western blot sterk aanbevolen 17. Bij het vergelijken van twee of meer behandelingen is het belangrijk om te bedenken dat de timing van meiotische rijping en chromosoomuitlijning kan variëren tussen behandelingen. Definieer daarom eerst de timing van de celcyclus voor elke behandeling om MAD2-niveaus goed te vergelijken en de resultaten nauwkeurig te interpreteren. Een beperking van deze methode is dat MAD2 een van de laatste effectoren is van de SAC-respons3. Daarom kan men met de beoordeling van MAD2 niet vaststellen welk deel van het SAC-mechanisme verstoord is. Om SAC-mechanismen te evalueren, kan men de rekrutering van een andere SAC-component zoals MPS1, BUB1 en /of het RZZ-complex bepalen (figuur 3C). Een ander punt om te overwegen is dat de fixatiestap van cruciaal belang is. Deze testen gebruikten 2% PFA in 1x PHEM-buffer, een fixatie die werkt voor de detectie van kinetochore-eiwitten in hele mount-eicellen. Andere laboratoria gebruiken echter een chromosoomverspreidingstechniek die vóór30 uitgebreid werd beschreven.
Samenvattend worden drie testen, die kritieke informatie verschaffen over het vermogen van een cel om de kinetochore-spindel microtubule-aanhechtingsstatus te controleren om chromosoomsegregatie nauwkeurig te controleren, in dit artikel beschreven. Deze informatie is belangrijk voor het onderzoeken van cellulaire situaties waarbij de SAC kan worden aangetast om inzicht te krijgen in welke stap van het checkpoint wordt verstoord. Omdat aneuploïdie een veel voorkomend kenmerk is bij gameten en kankers, zijn deze hulpmiddelen van toepassing op veel biologische systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.
Acknowledgments
Financiering voor dit project werd verstrekt door de National Institutes of Health (R35GM136340 naar KS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S.
- London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
- Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
- Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
- Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
- Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
- Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
- Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
- Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
- Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
- Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
- Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
- Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
- Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).
