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Developmental Biology

Évaluation de l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64459
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

Summary

L’erreur dans la ségrégation chromosomique est une caractéristique commune dans les ovocytes. Par conséquent, l’étude du point de contrôle de l’assemblage de la broche donne des indices importants sur les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains. Le présent protocole décrit trois essais complémentaires pour évaluer l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris.

Abstract

L’aneuploïdie est la principale anomalie génétique causant une fausse couche précoce et un échec de grossesse chez l’homme. La plupart des erreurs dans la ségrégation chromosomique qui donnent lieu à l’aneuploïdie se produisent pendant la méiose dans les ovocytes, mais pourquoi la méiose ovocytaire est sujette aux erreurs n’est toujours pas entièrement comprise. Pendant la division cellulaire, les cellules préviennent les erreurs de ségrégation chromosomique en activant le point de contrôle de l’assemblage du fuseau (SAC). Ce mécanisme de contrôle repose sur la détection des attaches kinétochore (KT)-microtubule (MT) et la détection de la tension générée par les fibres de fuseau. Lorsque les KT ne sont pas attachés, le SAC est activé et empêche la progression du cycle cellulaire. Le SAC est activé d’abord par la kinase MPS1, qui déclenche le recrutement et la formation du complexe de points de contrôle mitotiques (MCC), composé de MAD1, MAD2, BUB3 et BUBR1. Ensuite, le MCC diffuse dans le cytoplasme et séquestre CDC20, un activateur du complexe/cyclosome favorisant l’anaphase (APC/C). Une fois que les KT se fixent aux microtubules et que les chromosomes sont alignés sur la plaque de métaphase, le SAC est réduit au silence, CDC20 est libéré et l’APC / C est activé, déclenchant la dégradation de la cycline B et de la sécurine, permettant ainsi l’apparition de l’anaphase. Comparé aux cellules somatiques, le SAC dans les ovocytes n’est pas aussi efficace parce que les cellules peuvent subir une anaphase malgré des KT non attachées. Comprendre pourquoi le SAC est plus permissif et si cette permissivité est l’une des causes des erreurs de ségrégation chromosomique dans les ovocytes nécessite encore des recherches plus approfondies. Le présent protocole décrit les trois techniques permettant d’évaluer de manière exhaustive l’intégrité des OAC dans les ovocytes de souris. Ces techniques comprennent l’utilisation du nocodazole pour dépolymériser les MT afin d’évaluer la réponse au SAC, le suivi du silençage du SAC en suivant la cinétique de destruction de la sécurine et l’évaluation du recrutement de MAD2 en KT par immunofluorescence. Ensemble, ces techniques sondent les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains en fournissant une évaluation complète de l’intégrité du SAC.

Introduction

L’aneuploïdie, qui résulte d’erreurs dans la ségrégation chromosomique, est la principale cause de fausses couches précoces et est fortement liée aux erreurs de la méiose1. La méiose est distincte de la mitose parce qu’elle consiste en deux cycles de division cellulaire sans étape intermédiaire de réplication de l’ADN. Dans la méiose I, les chromosomes homologues se séparent tandis que les chromatides sœurs restent ensemble. Dans les ovocytes, cette étape est sujette aux erreurs, conduisant à la production d’œufs aneuploïdes2.

Pour éviter les erreurs de ségrégation chromosomique, la plupart des types de cellules activent un mécanisme de surveillance qui interrompt le cycle cellulaire, appelé point de contrôle de l’assemblage du fuseau (SAC). Ce mécanisme détecte les attaches kinétochore (KT)-microtubule (MT) et la tension est générée lorsque les chromosomes sont orientés de manière bipolaire3. Les kinétochores non attachées déclenchent une réponse SAC qui commence par le recrutement de MPS1, le régulateur maître du SAC, aux kinétochores 3,4. MPS1 initie le recrutement d’autres composants du SAC, agissant comme une plate-forme pour former le complexe de points de contrôle mitotiques (MCC). Le MCC, composé de MAD1, MAD2, BUB3 et BUBR1, diffuse dans le cytoplasme et inhibe l’activation de l’APC/C en séquestrant son activateur CDC20. Une fois que tous les kinétochores sont fixés de manière stable aux MT et que les chromosomes sont alignés sur la plaque de métaphase, le SAC est réduit au silence et le MCC se désassemble et libère CDC20, permettant ainsi l’activation de l’APC / C. L’APC/C actif dégrade la sécurine et la cycline B, deux étapes clés dans le déclenchement de l’apparition de l’anaphase 5,6. Dans les cellules somatiques, le SAC est rigoureux car il est activé par un seul kinétochore non attaché et est suffisant pour induire l’arrêt du cycle cellulaire6. Cependant, au cours de la méiose ovocytaire, le SAC est plus permissif, et les ovocytes peuvent entrer en anaphase I avec une ou plusieurs kinétochores 6,7,8,9,10 non attachées. Comprendre pourquoi le SAC est plus permissif dans les ovocytes est un domaine d’intérêt continu dans le domaine. Les mécanismes qui causent des défauts dans l’activation du SAC ou le silençage SAC pourraient entraîner des erreurs dans la ségrégation chromosomique ou un arrêt prolongé du cycle cellulaire et la mort cellulaire. Par conséquent, l’évaluation des mécanismes qui maintiennent l’intégrité du SAC dans les ovocytes est importante pour comprendre le processus de formation d’œufs euploïdes sains.

Ce protocole décrit des techniques permettant d’évaluer de manière exhaustive l’intégrité du SAC dans la méiose ovocytaire de souris en examinant différentes étapes critiques du point de contrôle. Tout d’abord, l’évaluation de la réponse du SAC après avoir induit l’activation du SAC est décrite. Cette activation est obtenue en générant des kinétochores non attachées à l’aide de nocodazole, un médicament qui dépolymérise MTs11. Deuxièmement, une méthode de surveillance du silençage des SAC est décrite en suivant la dynamique de la dégradation de la sécurine pendant la maturation des ovocytes. Enfin, un test basé sur l’immunofluorescence est utilisé pour mesurer le recrutement de MAD2, l’un des composants du MCC, dans les kinétochores. Ensemble, ces tests évaluent de manière exhaustive l’intégrité du SAC au cours de la maturation méiotique des ovocytes.

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Protocol

Toutes les souris utilisées dans ces protocoles ont été hébergées et élevées conformément au Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (Protocol 201702497) et aux directives des National Institutes of Health. Ces organismes de réglementation ont approuvé toutes les procédures expérimentales impliquant des études sur les animaux. Toutes les souris utilisées dans la présente étude étaient des femelles CF-1 âgées de 6 à 8 semaines.

1. Préparation expérimentale

  1. Avant de commencer les évaluations du SAC, prélever des ovocytes de souris en suivant le rapport publié précédemment12. Diviser les ovocytes prélevés en trois groupes de taille égale et les conserver dans des milieux de culture Chatot, Ziomek et Bavister (CZB) contenant 2,5 μM de milrinone (voir le tableau des matériaux) pour éviter la reprise méiotique13.
    NOTE: Composition CZB: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH2PO4; 1,2 mM MgSO 4-7H2O; 0,27 mM de pyruvate; 1,7 mM CaCl2; 30,8 mM d’acide DL-lactique; 7 mM de taurine; 0,1 mM d’EDTA; NaHCO3 25 mM; Gentamicine; et 0,3 % BSA.
  2. Préparer l’ARNc pour la micro-injection comme décrit précédemment12,14. Amplifier le gène de la sécurine de souris à partir de l’ADNc cloné à partir d’ovocytes germinaux de souris, puis le sous-clonage dans le vecteur pMDL2 contenant la séquence Gfp15,16.
    1. Pour préparer l’ARNc Securin-Gfp, linéariser le plasmide avec digestion Nde I. Effectuer une transcription in vitro en utilisant l’ARN polymérase T3 et en purifiant l’ARNc16.
      REMARQUE : Conserver l’ARNc dans des aliquotes de 2 à 3 μL à -80 °C jusqu’à utilisation.

2. Traitement au nocodazole et imagerie en direct

  1. Préparer 1 mL de milieu de culture (CZB) contenant 5 μM de nocodazole (AC), 1 mL de milieu de culture contenant 5 μM de NOC plus 0,5 μM de réversine (AC + REV) et 1 mL de milieu de culture avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) (1:2000) comme témoin (voir le tableau des matières).
  2. Pour la maturation ovocytaire et l’imagerie en direct, utilisez une plaque de 96 puits préchauffée dans l’incubateur à 37 °C, 5% de CO2 et 80% d’humidité. Dans le premier puits, charger 150 μL du traitement DMSO témoin; dans le deuxième puits, charger 150 μL de traitement par ACN; et dans le troisième puits, charger 150 μL de traitement AC + REV. Gardez la plaque dans l’incubateur dans les mêmes conditions que ci-dessus jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
    REMARQUE: Dans la plaque de 96 puits, évitez d’utiliser la première ligne et la première colonne car l’ombre de la bordure interfère avec la qualité des images.
  3. Pour commencer la maturation méiotique, retirez la milrinone. Tout en observant les ovocytes sous un stéréomicroscope en utilisant un grossissement compris entre 30x-64x, laver la milrinone hors du milieu en transférant séquentiellement les ovocytes à travers six gouttes de 100 μL de milieux de culture sans milrinone contenant du DMSO et les placer dans le puits correspondant de la plaque de 96 puits à l’aide d’une pipette manuelle ou buccale.
    1. Comptez les ovocytes en les ramassant à l’aide d’une pipette manuelle ou buccale et en les livrant à la goutte suivante pour éviter d’en perdre. Les ovocytes sont des cellules simples, grandes (~80 μm de diamètre) et rondes. Le noyau apparaîtra comme un bouton au centre de la cellule, et la membrane et la zone pellucide entourent l’ovocyte.
      REMARQUE: Transférer les ovocytes entre les gouttes tout en déplaçant le moins de liquide possible. Cela permet une élimination optimale de la milrinone des milieux de culture. Si les ovocytes ne parviennent pas à reprendre la méiose, il est probable que la milrinone n’a pas été éliminée efficacement.
  4. Répéter le même processus (étape 2.3) pour le traitement AC et AC + REV.
  5. Imagez les ovocytes à l’aide d’un microscope à fond clair équipé d’une chambre d’incubateur avec un environnement contrôlé dans ces conditions : 37 °C, 5% de CO2 et 80% d’humidité. Prenez des images au plan médian des ovocytes à des intervalles de 20 minutes pendant 24 h.
  6. Quantifier le nombre d’ovocytes qui extrudent un corps polaire (PB) en identifiant les cellules qui subissent une cytocinèse asymétrique. Le résultat sera une petite cellule (PB) à côté de l’œuf et dans la zone pellucide partagée. Visualisez les images à l’aide d’un logiciel d’imagerie (ImageJ, voir Tableau des matériaux).
  7. Importez la séquence d’images dans le logiciel d’analyse d’image et avancez les images jusqu’à ce qu’une ou plusieurs cellules subissent une cytocinèse asymétrique. Calculer le pourcentage d’ovocytes qui extrudent un PB du total des ovocytes17.

3. Surveillance du schéma de dégradation de Securin-gfp pendant la maturation méiotique

  1. Centrifuger 3 μL d’ARNc Securin-Gfp (étape 1.2) à 19,283 x g pendant 30 min à 4 °C18.
    REMARQUE : Utilisez le surnageant pour éviter de charger des impuretés qui pourraient causer le blocage de l’aiguille pendant la micro-injection.
  2. Suivre étape par étape la microinjection ovocytaire, décrite en détail dans la référence12. Microinjecter des ovocytes arrêtés par la prophase I avec 100 ng/μL d’ARNc Securin-gfp préparé à l’étape 1.2.
  3. Après micro-injection, laisser les ovocytes récupérer et traduire l’ARN dans l’incubateur de CO2 pendant au moins 3 h. Vérifiez l’expression en observant les ovocytes dans un système automatisé d’imagerie par fluorescence multicanal (voir le tableau des matériaux) pour visualiser le signal GFP.
  4. Tel que décrit à l’étape 2.2, charger 150 μL de milieux de culture avec ou sans 5 μM de nocodazole et 150 μL de milieu de culture avec 0,5 μM de réversine dans trois puits différents d’une plaque de 96 puits.
  5. Lavez les ovocytes micro-injectés à travers six gouttes de milieu de culture sans milrinone et transférez 1/3 des ovocytes dans chaque traitement.
  6. Conserver la plaque dans l’incubateur à 37 °C, avec 5% de CO2 et 80% d’humidité jusqu’à ce que les ovocytes reprennent la méiose, environ 3 h après le lavage de la milrinone.
    REMARQUE: Utilisez un stéréomicroscope avec un grossissement compris entre 30x et 64x pour évaluer la dégradation de l’enveloppe nucléaire comme caractéristique de la reprise méiotique.
  7. Enregistrer des images de la maturation ovocytaire à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’une chambre d’incubateur comme décrit à l’étape 2.6. Utilisez les paramètres de fond clair pour trouver les ovocytes dans le puits. Utilisez un filtre 488 pour détecter le signal Securin-gfp et ajustez l’intensité de fluorescence pour éviter de surexposer les cellules.
    1. Si le système d’imagerie est automatisé, enregistrez les positions des ovocytes dans chaque puits. Étant donné que la sécurine-gfp est répartie uniformément dans le cytoplasme, capturez des images dans le plan médian des ovocytes à des intervalles de 20 minutes pendant 24 h. Pour capturer des groupes d’ovocytes dans une image, utilisez un objectif de grossissement inférieur tel que 10x.
  8. Utilisez un logiciel d’analyse d’images pour quantifier la destruction de Securin-gfp. Ouvrez les images du canal GFP. Commencez au point temporel 1. Dans le logiciel d’analyse préféré, utilisez un outil de sélection ou de forme pour marquer chaque ovocyte et générer une région d’intérêt (ROI) pour chaque cellule.
    1. Utilisez le même retour sur investissement pour sélectionner une zone d’arrière-plan à soustraire ultérieurement. Mesurez l’intensité des pixels GFP dans chaque retour sur investissement.
  9. À l’aide des ROI pour chaque ovocyte généré à l’étape 3.8, mesurez l’intensité de la GFP à tous les points temporels.
    REMARQUE: Dans certains logiciels, un onglet « Analyser » permet la sélection de la fonction Mesurer.
    1. Ensuite, passez à la période suivante et répétez ce processus pour mesurer l’intensité de la GFP dans chaque période. Enfin, à chaque valeur GFP, soustrayez la mesure du ROI dans l’arrière-plan sélectionné à l’étape 3.8. Cette analyse donnera une valeur pour l’intensité de Securin-gfp pour chaque ovocyte à chaque point temporel.
  10. Extraire différents paramètres du modèle de destruction de Securin : (a) le moment où la dégradation de Securin-gfp a commencé. Cela indique quand le silence du SAC a commencé; b) l’heure du signal minimal Securin-gfp. Cela indique quand le silence SAC est tombé en dessous d’un seuil pour permettre une activation élevée de l’APC/C et une dégradation complète de la Securin-GFP ; c) le taux de destruction de Securin-GFP19. Cela indique à quelle vitesse l’activité du SAC tombe en dessous d’un seuil pour l’activation de l’APC/C et la dégradation de la Securine-GFP.

4. Recrutement de MAD2 au niveau des kinétochores par immunofluorescence au cours de la maturation méiotique

REMARQUE : Pour la collecte et la maturation des ovocytes, se reporter au rapport12 publié précédemment.

  1. Diviser les ovocytes en trois groupes. Transférer chaque groupe d’ovocytes dans des gouttes de 100 μL de milieux de culture sans milrinone. Couvrir les gouttes d’huile minérale et les placer dans l’incubateur (37 °C, 5% CO2 et 80% d’humidité) pendant 3 h, 5 h et 7 h pour atteindre respectivement le stade précoce de prométaphase I, de prométaphase I tardive et de métaphase I.
    REMARQUE: Placez chaque point temporel dans un plat différent pour éviter de sortir le même plat de l’incubateur plusieurs fois, ce qui affecte le moment régulier de la maturation méiotique.
  2. Aux points temporels assignés, fixez les ovocytes en les transférant dans des gouttes de 500 μL de PFA à 2% dans 1x tampon PHEM pendant 20 min à température ambiante, en utilisant un plat en verre à 9 puits comme décrit précédemment20. Ensuite, transférer les cellules dans un puits propre contenant une goutte de 500 μL de solution de blocage (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3).
    NOTE: Composition PHEM: 60 mM PIPES; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; et 2 mM MgCl2.
    REMARQUE: On peut s’arrêter à ce stade et stocker les ovocytes dans une solution de blocage dans la plaque à 9 puits à 4 ° C jusqu’au moment opportun pour compléter l’immunofluorescence.
  3. Pour poursuivre la détection MAD2, transférer les ovocytes dans un puits propre contenant une goutte de 500 μL de solution de perméabilisation (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3). Incuber pendant 20 min à température ambiante, puis transférer les cellules dans un nouveau puits de solution bloquante et incuber pendant 10 min.
  4. Pour le reste des étapes d’immunofluorescence, utilisez un couvercle à 96 puits avec des indentations comme décrit précédemment20. Utilisez une chambre sombre humidifiée pour éviter l’exposition à la lumière et l’évaporation. Transférer les ovocytes dans une goutte de 30 μL de solution bloquante avec anticorps anti-MAD2 (1:1000, lapin) et anticorps anti-centromérique (ACA) (1:30, humain) (voir Tableau des matières) et incuber pendant 2 h à température ambiante.
    REMARQUE: Le couvercle à 96 puits permet le traitement de plusieurs protéines et groupes en même temps.
  5. Pour laver l’excès d’anticorps primaires, transférer les cellules dans une goutte de 30 μL de 1x tampon PHEM supplémenté avec 0,5% de Triton et incuber pendant 10 minutes dans la chambre humidifiée. Répétez cette étape deux fois de plus.
  6. Effectuer le quatrième lavage, en transférant les cellules dans une goutte de 30 μL de 1x tampon PHEM sans 0,5% 1x Triton, et incuber pendant 10 min.
  7. Transférer les cellules dans une goutte de 30 μL de solution bloquante contenant des anticorps secondaires tels que l’anti-humain-633 (1:200) et l’anti-lapin-568 (1:200) (voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 1 h à température ambiante.
    REMARQUE: Choisissez la combinaison de fluorophores en fonction de vos lasers ou filtres de microscope.
  8. Pour laver l’excès d’anticorps secondaires, répétez les étapes 4.5-4.6.
  9. Pour monter les cellules sur la lame de microscope, transférez-les dans une goutte de 10 μL de support de montage contenant du DAPI (0,1 mg/mL) (voir le tableau des matériaux). Ajoutez de petits points de vaseline à chaque coin de la lame, placez-les soigneusement sur la goutte de support de montage et appuyez lentement pour distribuer. Utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller le couvercle à la glissière. Pour une description plus détaillée du processus de montage, voir la référence20.
  10. Image des kinétochores à l’aide d’un microscope confocal (voir Tableau des matériaux) équipé d’un objectif 40x ou 63x. À l’aide du signal ACA, déterminez la plage z qui permet l’imagerie de toute la zone chromosomique.
    REMARQUE: Un zoom optique de 4,0 et une taille z-step de 0,5 μm peuvent être utilisés sur certains systèmes d’imagerie. Ces paramètres peuvent varier d’un système à l’autre, et une optimisation sera nécessaire.
  11. Analysez l’intensité MAD2 à kinétochores à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Faites une projection maximale z-stack, puis divisez les canaux.
  12. Tout d’abord, créez un masque en utilisant le canal ACA en sélectionnant le canal ACA pour établir un seuil qui identifie tous les signaux kinétochore . Accédez à l’onglet Modifier et créez une sélection. Ensuite, créez un retour sur investissement avec cette sélection.
  13. Sélectionnez le canal MAD2 et importez la sélection créée à l’étape 4.12. Sélectionnez une méthode de seuil qui s’adapte mieux au signal MAD2. Mesurez l’intensité.
    REMARQUE: Sélectionnez la méthode de seuil dans le traitement de contrôle et maintenez-la constante lors de l’analyse de différents traitements.
  14. Pour calculer l’intensité relative des pixels, divisez l’intensité de chaque cellule par l’intensité moyenne des ovocytes WT dans l’expérience.

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Representative Results

Évaluation de la réactivité au SAC par le traitement au nocodazole
Le but de cette expérience est d’évaluer l’activation et la force de SAC. En utilisant le nocodazole pour dépolymériser les microtubules fuseau, tous les kinétochores seront détachés, ce qui provoquera un arrêt du cycle cellulaire médié par le SAC. Dans le système d’imagerie actuel, les ovocytes témoins traités par DMSO extrudaient un corps polaire environ 14 heures après la libération de la milrinone (Figure 1, panneaux supérieurs). Conformément à l’activation du SAC, les ovocytes traités au nocodazole se sont arrêtés en métaphase I et n’ont pas extrudé un corps polaire (Figure 1, panneaux du milieu). Pour démontrer que ce test est un indicateur fiable de l’activité du SAC, la réversine, un inhibiteur de la MPS1, a été utilisée pour empêcher l’activation du SAC21. Lorsque le SAC ne peut pas s’activer, les ovocytes extrudent un corps polaire malgré l’absence d’attaches KT-MT (Figure 1, panneaux inférieurs). Les ovocytes avec un SAC affaibli auront un mélange de résultats - certains ovocytes arrêtent et certains extrudent des corps polaires17. Cette méthode de maturation des ovocytes de souris avec et sans nocodazole peut être utilisée comme première étape facile pour contester l’activation de SAC.

Modèle de dégradation de la Securine-gfp au cours de la maturation méiotique
L’un des événements en aval suivant la satisfaction et le silence du CCS est l’activation de l’APC/C, qui a entraîné la dégradation de la sécurité22. Par conséquent, l’évaluation du profil de dégradation de la sécurine est une lecture directe de la fonction SAC et devrait être effectuée pour déterminer si le résultat du nocodazole était une perturbation dépendante de la SAC. Ce test implique l’expression ectopique de Securin-gfp dans les ovocytes et l’imagerie ultérieure de cellules vivantes. Après avoir fait une courbe qui suit la dégradation de Securin, trois paramètres peuvent être déterminés: a) le temps de début de la dégradation (silençage); b) le temps nécessaire pour atteindre le niveau minimum de Securin; et c) le taux de dégradation (figure 2A). Dans les ovocytes témoins traités par DMSO, l’intensité de Securin-gfp commence à diminuer à ~10 h après le lavage de la milrinone (Figure 2B,C). Lorsque les ovocytes ont mûri en présence de l’agent activateur du SAC nocodazole, les taux de Securin-gfp étaient stables pendant toute la période de maturation méiotique. En revanche, lors de la prévention de l’activation de SAC avec un traitement par réversine, le schéma Securin-gfp s’est accéléré; la dégradation a commencé à ~4 h après le lavage de la milrinone, ce qui correspond à l’inhibition de la SAC (figure 2B,C).

Recrutement de MAD2 en kinétochores par immunofluorescence au cours de la maturation méiotique
Si les données confirment une défectuosité dans la fonction SAC, l’étape suivante consiste à évaluer le recrutement des principaux médiateurs du CCI. Le SAC est activé en réponse à des kinétochores non attachées. Les kinetochores sont souvent détachés au début de la prométaphase lorsque la broche se construit, et les attaches incorrectes sont déstabilisées pour la correction. Une fois que les kinétochores sont fixés de manière stable aux microtubules, le SAC est réduit au silence pour permettre l’apparition de l’anaphase22. Une première étape de la réponse du SAC est le recrutement d’une série de protéines aux kinétochores qui servent de plate-forme pour la formation de MCC22,23. L’évaluation de la localisation de ces composants SAC aux kinétochores est une autre stratégie pour évaluer la réponse du SAC. Par exemple, l’évaluation de MAD2, une composante du CMC, est une approche courante. Des images au microscope confocal détectant les centromères (ACA) et MAD2 d’ovocytes matures au début de la prométaphase I, à la prométaphase I tardive et à la métaphase I peuvent être utilisées (Figure 3A). Pour évaluer la force du signal SAC, quantifier l’intensité des pixels MAD2 localisés par KT (Figure 3B). Des niveaux significatifs de recrutement de MAD2 dans les AC se produisent au début de la prométaphase I, lorsque la plupart des AC ne sont pas rattachés aux MT. Les niveaux de MAD2 ont diminué dans la prométaphase ultérieure et étaient presque absents à la métaphase I lorsque toutes les KT étaient fixées de manière stable aux MT (Figure 3A,B). Par conséquent, cette méthode peut évaluer la réponse SAC lorsqu’elle est combinée avec les deux autres tests.

Figure 1
Figure 1 : Évaluation de l’activation du SAC avec le nocodazole. Des images représentatives de l’imagerie accélérée des ovocytes ont mûri en présence de DMSO (témoin), de 5 μM de nocodazole (NOC) ou de 5 μM de nocodazole + 0,5 μM de réversine (NOC + REV). Le carré rouge indique le cadre temporel de l’extrusion du corps polaire. Deux expériences indépendantes ont été analysées. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Modèle de dégradation de la sécurine-gfp. (A) Schéma de la courbe de dégradation Securin-gfp avec trois paramètres qui peuvent être examinés. (B) Images représentatives d’un time-lapse d’ovocytes microinjectés avec Securin-gfp cRNA et mûris en présence de DMSO (témoin), de 5 μM de nocodazole ou de 0,5 μM de réversine. Le carré rouge indique le cadre temporel de l’extrusion du corps polaire. Barre d’échelle = 50 μm. (C) Courbe de dégradation représentative Securin-gfp des ovocytes microinjectés avec l’ARNc Securin-gfp et mûris en présence de DMSO (cercles bleus), de nocodazole 5 μM (carrés roses) ou de réversine 0,5 μM (triangles noirs). Barres d’erreur = erreur type. # d’ovocytes par traitement : DMSO = 10 ; CNP = 15; REV = 5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Recrutement de MAD2 dans les kinétochores au cours de la maturation méiotique des ovocytes. (A) Images confocales représentatives des ovocytes matures au début de la prométaphase I, à la prométaphase I tardive et à la métaphase I, immunocolorées pour détecter MAD2 (gris) et kinétochores (ACA) (rouge). Barre d’échelle = 10 μm; encart : 2 μm. (B) Quantification de l’intensité relative de MAD2 à partir d’images en (A). Barres d’erreur = erreur type. (C) Schéma d’une voie d’activation de kinétochore et de SAC non attachée. # d’ovocytes par point temporel : Prométaphase I précoce = 23 ; Prométaphase tardive I = 13; Métaphase I = 18. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le point de contrôle de l’assemblage de la broche est un mécanisme de contrôle critique pendant la division cellulaire conçu pour prévenir les erreurs de ségrégation chromosomique. Cela permet à la cellule d’avoir suffisamment de temps pour corriger les attachements KT-MT inappropriés. La méiose dans les ovocytes est un processus sujet aux erreurs, où la plupart des erreurs de ségrégation chromosomiques se produisent pendant la méiose I, conduisant à la génération d’ovules aneuploïdes qui sont la principale cause de fausses couches précoces et d’infertilité chez l’homme 1,24. Plusieurs hypothèses sont testées pour démêler pourquoi la méiose féminine comporte des erreurs. Une raison potentielle est que le SAC est moins efficace que dans les cellules somatiques et permet l’apparition d’anaphase avec un ou plusieurs KT mal attachés 9,10,25. Par conséquent, une étude approfondie des mécanismes de la SAC dans les ovocytes et l’identification des régulateurs clés sont nécessaires pour comprendre le processus de génération d’un ovule euploïde.

Le présent protocole décrit trois techniques pour évaluer différents aspects de l’intégrité du CCI : l’activation et le silençage. Étant donné que chacun de ces tests présente certaines limites d’interprétation, la réalisation d’un seul essai est insuffisante pour caractériser la fonction du SAC dans les ovocytes. Pour cette raison, il est suggéré d’effectuer une combinaison de ces méthodes pour évaluer l’intégrité du CCI dans une étude.

L’évaluation de l’activation de SAC à l’aide du nocodazole est simple car simple et rapide. Cependant, il y a quelques points importants à considérer lors de l’interprétation des résultats. Tout d’abord, l’investigateur doit établir la concentration de nocodazole pour dépolymériser complètement les microtubules de la broche afin de générer des kinétochores non attachées et d’activer le SAC. La perte réussie de microtubules peut être déterminée en fixant les ovocytes et en détectant la tubuline par microscopie basée sur l’immunofluorescence20. Une autre limite critique de cette technique est la lecture de ce test : l’extrusion du premier corps polaire (PBE). L’échec de l’EBP n’est pas nécessairement une preuve suffisante de la fonction SAC, car si la protéine étudiée affecte les stades ultérieurs tels que la cytocinèse et l’abscission, les résultats seront également l’échec de la PBE. Par conséquent, utilisez le traitement au nocodazole comme première étape pour évaluer les défauts SAC, mais associez-le ensuite aux autres techniques décrites.

Une fois que les KT sont fixés de manière stable aux MT et que les chromosomes sont alignés sur la plaque de métaphase, le SAC est réduit au silence et l’APC / C est activé, conduisant à la dégradation de la sécurine et de la cycline B. Par conséquent, le suivi du profil de dégradation de la sécurine ou de la cycline B sont des indicateurs couramment utilisés du silence du SAC25,26,27. L’altération du schéma de dégradation donne des informations sur l’accélération ou le retard du cycle cellulaire. Une accélération suggère un PAS faible, tandis qu’un retard suggère des défauts dans la satisfaction du SAC. Une limite de cette expérience est qu’elle nécessite une plate-forme de micro-injection et un ensemble de compétences spécialisées. Notez que le titrage de la concentration appropriée d’ARNc Securin-gfp utilisé pour la micro-injection est critique, car trop arrêtera le cycle cellulaire28.

Enfin, l’évaluation du recrutement de MAD2 aux kinétochores est un indicateur et une mesure de l’activation des SAC. Le schéma de recrutement MAD2 pendant la méiose I, avec des niveaux maximaux de MAD2 aux kinétochores au début de la prométaphase I et des niveaux réduits à mesure que les KT se fixent. Comme le modèle de dégradation de la sécurine, toute modification du recrutement de MAD2 en kinétochores pourrait indiquer une accélération ou un retard du silençage du SAC. Des défauts dans le recrutement de MAD2 au début de la prométaphase pourraient indiquer des défaillances dans le mécanisme d’activation ou de recrutement29 ou des quantités réduites de MAD2 dans la cellule17. Pour distinguer ces deux possibilités, il est fortement recommandé d’évaluer les niveaux d’expression de la protéine MAD2 par transfert Western 17. Lorsque vous comparez deux traitements ou plus, il est important de considérer que le moment de la maturation méiotique et de l’alignement chromosomique peut varier d’un traitement à l’autre. Par conséquent, tout d’abord, définissez le calendrier du cycle cellulaire pour chaque traitement afin de comparer correctement les niveaux de MAD2 et d’interpréter avec précision les résultats. Une limitation de cette méthode est que MAD2 est l’un des derniers effecteurs de la réponse SAC3. Par conséquent, l’évaluation de MAD2 ne permet pas de déterminer quelle partie du mécanisme SAC est perturbée. Pour évaluer les mécanismes du CCI, on peut déterminer le recrutement d’une autre composante du CCI telle que MPS1, BUB1 et/ou le complexe RZZ (figure 3C). Un autre point à considérer est que l’étape de fixation est critique. Ces tests ont utilisé 2% de PFA dans 1x tampon PHEM, une fixation qui fonctionne pour la détection des protéines kinétochores dans les ovocytes montés entiers. Cependant, d’autres laboratoires utilisent une technique de propagation chromosomique qui a été largement décrite avant30 ans.

En résumé, trois tests qui fournissent des informations essentielles sur la capacité d’une cellule à surveiller l’état de fixation des microtubules kinétochore-fuseau pour contrôler avec précision la ségrégation chromosomique sont décrits dans cet article. Cette information est importante pour enquêter sur les situations cellulaires où le SAC peut être compromis afin de mieux comprendre quelle étape du point de contrôle est perturbée. Parce que l’aneuploïdie est une caractéristique commune dans les gamètes et les cancers, ces outils s’appliquent à de nombreux systèmes biologiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit à révéler.

Acknowledgments

Le financement de ce projet a été fourni par les National Institutes of Health (R35GM136340 à KS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A4503
DAPI Life Technologies D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) Sigma D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 Life Technologies A10042
EVOS FL Auto Imaging System Life Technologies Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator Life Technologies Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated MatTek Corporation P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633 Life Technologies A21091
HEPES Sigma H3537
Human anti-ACA Antibodies Incorporated 15-234 Dilution 1/30
ImageJ NIH
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective Leica
MgSO4·7H20 Sigma M7774
Milrinone Sigma M4659
Na2HPO4 Sigma S2429
NaCl Sigma S5886
NaN3 Sigma S2002
Nocodazole Sigma M1404
Paraformaldhyde (PFA) Sigma P6148
PIPES Sigma P6757
Rabbit anti- MAD2 Biolegend 924601 Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine Cayman Chemical 10004412
Triton-X Sigma 274348
Tween-20 Sigma X100
Vectashield Vector laboratories H-1000

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References

  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
  3. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  4. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
  5. London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
  6. Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
  7. Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  8. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  9. Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
  10. Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
  11. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  12. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
  13. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
  14. Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
  15. Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
  16. Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
  17. Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
  18. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  19. Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
  20. Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
  21. Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  22. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  23. Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
  24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
  25. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  26. Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
  27. Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
  28. Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
  29. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  30. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).

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Biologie du développement numéro 187
Évaluation de l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris
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Aboelenain, M., Schindler, K., Blengini, C. S. Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (187), e64459, doi:10.3791/64459 (2022).

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