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Developmental Biology

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64459
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

Summary

Fehler in der Chromosomentrennung sind ein häufiges Merkmal bei Eizellen. Daher gibt die Untersuchung des Spindelanordnungs-Checkpoints wichtige Hinweise auf die Mechanismen, die zur Produktion gesunder Eier erforderlich sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt drei komplementäre Assays zur Beurteilung der Integrität des Spindelaufbau-Checkpoints in Maus-Oozyten.

Abstract

Aneuploidie ist die häufigste genetische Anomalie, die beim Menschen zu frühen Fehlgeburten und Schwangerschaftsversagen führt. Die meisten Fehler in der Chromosomentrennung, die zu Aneuploidie führen, treten während der Meiose in Eizellen auf, aber warum die Eizellmeiose fehleranfällig ist, ist noch nicht vollständig geklärt. Während der Zellteilung verhindern Zellen Fehler in der Chromosomentrennung, indem sie den Spindle Assembly Checkpoint (SAC) aktivieren. Dieser Kontrollmechanismus beruht auf der Erkennung von Kinetochor (KT)-Mikrotubuli (MT) und der Erfassung der von Spindelfasern erzeugten Spannung. Wenn KTs nicht gebunden sind, wird der SAC aktiviert und verhindert das Fortschreiten des Zellzyklus. Das SAC wird zuerst durch die MPS1-Kinase aktiviert, die die Rekrutierung und Bildung des mitotischen Checkpoint-Komplexes (MCC) auslöst, der aus MAD1, MAD2, BUB3 und BUBR1 besteht. Dann diffundiert das MCC in das Zytoplasma und sequestriert CDC20, einen anaphasenfördernden Komplex/Zyklosom-Aktivator (APC/C). Sobald KTs an Mikrotubuli gebunden sind und die Chromosomen an der Metaphasenplatte ausgerichtet sind, wird der SAC zum Schweigen gebracht, CDC20 wird freigesetzt und der APC/C wird aktiviert, wodurch der Abbau von Cyclin B und Securin ausgelöst wird, wodurch der Beginn der Anaphase ermöglicht wird. Im Vergleich zu somatischen Zellen ist die SAC in Eizellen nicht so effektiv, da Zellen trotz ungebundener KTs eine Anaphase durchlaufen können. Um zu verstehen, warum die SAC freizügiger ist und ob diese Permissivität eine der Ursachen für Chromosomentrennungsfehler in Eizellen ist, bedarf es noch weiterer Untersuchungen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die drei Techniken zur umfassenden Beurteilung der SAC-Integrität in Maus-Eizellen. Diese Techniken umfassen die Verwendung von Nocodazol zur Depolymerisierung von MTs zur Bewertung der SAC-Antwort, die Verfolgung der SAC-Stummschaltung durch Verfolgung der Kinetik der Securin-Zerstörung und die Bewertung der Rekrutierung von MAD2 zu KTs durch Immunfluoreszenz. Zusammen untersuchen diese Techniken Mechanismen, die benötigt werden, um gesunde Eier zu produzieren, indem sie eine vollständige Bewertung der SAC-Integrität liefern.

Introduction

Aneuploidie, die durch Fehler in der Chromosomentrennung entsteht, ist die Hauptursache für frühe Fehlgeburten und steht in engem Zusammenhang mit Fehlern in der Meiose1. Die Meiose unterscheidet sich von der Mitose dadurch, dass sie aus zwei Zellteilungsrunden ohne einen dazwischenliegenden DNA-Replikationsschritt besteht. In der Meiose I trennen sich homologe Chromosomen, während Schwesterchromatiden zusammen bleiben. In Eizellen ist dieser Schritt fehleranfällig und führt zur Produktion von aneuploiden Eizellen2.

Um Fehler bei der Chromosomentrennung zu vermeiden, aktivieren die meisten Zelltypen einen Überwachungsmechanismus, der den Zellzyklus anhält, den sogenannten Spindle Assembly Checkpoint (SAC). Dieser Mechanismus erkennt Kinetochor (KT)-Mikrotubuli (MT) -Anhaftungen und die Spannung wird erzeugt, wenn Chromosomen bipolar ausgerichtet sind3. Ungebundene Kinetochoren lösen eine SAC-Reaktion aus, die mit der Rekrutierung von MPS1, dem Master-Regulator des SAC, zu den Kinetochoren 3,4 beginnt. MPS1 initiiert die Rekrutierung anderer SAC-Komponenten und fungiert als Plattform für die Bildung des mitotischen Checkpoint-Komplexes (MCC). Das MCC, bestehend aus MAD1, MAD2, BUB3 und BUBR1, diffundiert in das Zytoplasma und hemmt die APC/C-Aktivierung, indem es seinen Aktivator CDC20 sequestriert. Sobald alle Kinetochoren stabil an MTs gebunden sind und die Chromosomen an der Metaphasenplatte ausgerichtet sind, wird der SAC zum Schweigen gebracht, und der MCC zerlegt und setzt CDC20 frei, wodurch eine APC/C-Aktivierung ermöglicht wird. Aktives APC/C baut Securin und Cyclin B ab, zwei wichtige Schritte bei der Auslösung des Beginnsder Anaphase 5,6. In somatischen Zellen ist das SAC stringent, da es durch ein einzelnes, nicht gebundenes Kinetochor aktiviert wird und ausreicht, um einen Zellzyklusstillstand zu induzieren6. Während der Meiose der Oozyten ist die SAC jedoch freizügiger, und die Eizellen können mit einer oder mehreren ungebundenen Kinetochorenin die Anaphase I eintreten 6,7,8,9,10. Zu verstehen, warum die SAC in Eizellen freizügiger ist, ist ein fortlaufender Schwerpunkt in diesem Bereich. Mechanismen, die Defekte in der SAC-Aktivierung oder SAC-Stummschaltung verursachen, können zu Fehlern in der Chromosomentrennung oder zu einem verlängerten Zellzyklusstillstand und Zelltod führen. Daher ist die Bewertung der Mechanismen, die die SAC-Integrität in Eizellen aufrechterhalten, wichtig, um den Prozess der Bildung gesunder, euploider Eizellen zu verstehen.

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur umfassenden Bewertung der SAC-Integrität in der Meiose von Maus-Eizellen durch die Untersuchung verschiedener kritischer Schritte des Checkpoints. Zunächst wird die Auswertung der SAC-Antwort nach Induktion der SAC-Aktivierung beschrieben. Diese Aktivierung wird durch die Erzeugung von ungebundenen Kinetochoren unter Verwendung von Nocodazol erreicht, einem Medikament, das MTs11 depolymerisiert. Zweitens wird eine Methode zur Überwachung der SAC-Stummschaltung beschrieben, indem die Dynamik des Securin-Abbaus während der Eizellreifung verfolgt wird. Schließlich wird ein Immunfluoreszenz-basierter Assay verwendet, um die Rekrutierung von MAD2, einer der MCC-Komponenten, zu Kinetochoren zu messen. Zusammen bewerten diese Assays umfassend die SAC-Integrität während der meiotischen Reifung der Eizellen.

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Protocol

Alle Mäuse, die in diesen Protokollen verwendet wurden, wurden gemäß den Richtlinien des Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (Protokoll 201702497) und der National Institutes of Health untergebracht und aufgezogen. Diese Aufsichtsbehörden genehmigten alle Versuchsverfahren mit Tierversuchen. Alle Mäuse, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden, waren 6-8 Wochen alte CF-1-Weibchen.

1. Experimentelle Vorbereitung

  1. Bevor Sie mit den SAC-Auswertungen beginnen, entnehmen Sie Maus-Eizellen gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht12. Die entnommenen Eizellen werden in drei gleich große Gruppen aufgeteilt und in Nährmedien von Chatot, Ziomek und Bavister (CZB) aufbewahrt, die 2,5 μM Milrinon enthalten (siehe Materialtabelle), um eine meiotische Wiederaufnahmezu vermeiden 13.
    HINWEIS: CZB-Zusammensetzung: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mMKH2PO4; 1,2 mM MgSO 4-7H2O; 0,27 mM Pyruvat; 1,7 mM CaCl2; 30,8 mM DL-Milchsäure; 7 mM Taurin; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO3; Gentamicin; und 0,3% BSA.
  2. Bereiten Sie die cRNA für die Mikroinjektion vor, wie zuvorbeschrieben 12,14. Amplifikation des Maus-Securin-Gens aus der cDNA, die aus den Keimvesikel-Eizellen der Maus kloniert wurde, gefolgt von der Subklonierung in den pMDL2-Vektor, der die Gfp-Sequenz15,16 enthält.
    1. Zur Herstellung von Securin-Gfp cRNA wird das Plasmid mit Nde I-Verdauung linearisiert. Führen Sie eine In-vitro-Transkription durch, indem Sie T3-RNA-Polymerase verwenden und die cRNA16 reinigen.
      HINWEIS: Lagern Sie cRNA in Aliquots von 2-3 μL bei -80 °C bis zur Verwendung.

2. Nocodazol-Behandlung und Live-Bildgebung

  1. Bereiten Sie 1 ml Nährmedium (CZB) mit 5 μM Nocodazol (NOC), 1 ml Nährmedium mit 5 μM NOC plus 0,5 μM Reversin (NOC + REV) und 1 ml Nährmedium mit Dimethylsulfoxid (DMSO) (1:2000) als Kontrolle vor (siehe Materialtabelle).
  2. Verwenden Sie für die Eizellreifung und Live-Bildgebung eine 96-Well-Platte, die im Inkubator bei 37 °C, 5 %CO2 und 80 % Luftfeuchtigkeit vorgewärmt wird. Laden Sie in der ersten Vertiefung 150 μL der kontrollierten DMSO-Behandlung; in die zweite Vertiefung 150 μL NOC-Behandlung laden; und in die dritte Vertiefung 150 μL NOC + REV-Behandlung laden. Bewahren Sie die Platte im Inkubator unter den gleichen Bedingungen wie oben auf, bis sie benötigt wird.
    HINWEIS: Vermeiden Sie bei der 96-Well-Platte die Verwendung der ersten Zeile und der ersten Spalte, da der Schatten des Rahmens die Qualität der Bilder beeinträchtigt.
  3. Um die meiotische Reifung zu beginnen, entfernen Sie Milrinon. Während Sie die Eizellen unter einem Stereomikroskop mit einer Vergrößerung zwischen 30x und 64x betrachten, waschen Sie Milrinon aus dem Medium, indem Sie die Eizellen nacheinander durch sechs Tropfen 100 μL milrononfreies Nährmedium mit DMSO übertragen und sie mit einer Hand- oder Mundpipette in die entsprechende Vertiefung der 96-Well-Platte legen.
    1. Zählen Sie Eizellen, indem Sie sie mit einer Hand- oder Mundpipette aufnehmen und in den nächsten Tropfen geben, um zu vermeiden, dass sie verloren gehen. Die Eizellen sind einzelne, große (~ 80 μm im Durchmesser) und runde Zellen. Der Zellkern erscheint wie ein Knopf in der Mitte der Zelle, und die Membran und die Zona pellucida umgeben die Eizelle.
      HINWEIS: Übertragen Sie die Eizellen zwischen den Tropfen und bewegen Sie dabei die geringstmögliche Menge an Flüssigkeit. Dies ermöglicht eine optimale Entfernung des Milrinons aus den Nährmedien. Wenn es den Eizellen nicht gelingt, die Meiose wieder aufzunehmen, ist es wahrscheinlich, dass das Milrinon nicht wirksam entfernt wurde.
  4. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang (Schritt 2.3) für die NOC- und NOC + REV-Behandlung.
  5. Bilden Sie die Eizellen mit einem Hellfeldmikroskop ab, das mit einer Inkubatorkammer ausgestattet ist, mit einer kontrollierten Umgebung unter folgenden Bedingungen: 37 °C, 5%CO2 und 80% Luftfeuchtigkeit. Nehmen Sie Bilder in der mittleren Ebene der Eizellen in Abständen von 20 Minuten für 24 Stunden auf.
  6. Quantifizieren Sie die Anzahl der Eizellen, die einen Polkörper (PB) extrudieren, indem Sie die Zellen identifizieren, die eine asymmetrische Zytokinese durchlaufen. Das Ergebnis ist eine kleine Zelle (PB) neben dem Ei und innerhalb der gemeinsamen Zona pellucida. Betrachten Sie die Bilder mit einer Bildbearbeitungssoftware (ImageJ, siehe Materialverzeichnis).
  7. Importieren Sie die Bildsequenz in die Bildanalysesoftware und verschieben Sie die Frames, bis eine oder mehrere Zellen eine asymmetrische Zytokinese durchlaufen. Berechnen Sie den Prozentsatz der Eizellen, die einen PB der Gesamtzahl der Eizellenextrudieren 17.

3. Überwachung des Musters des Securin-gfp-Abbaus während der meiotischen Reifung

  1. Zentrifuge 3 μL Securin-Gfp cRNA (Schritt 1.2) bei 19.283 x g für 30 min bei 4 °C18.
    HINWEIS: Verwenden Sie den Überstand, um Verunreinigungen zu vermeiden, die während der Mikroinjektion zu einer Verstopfung der Nadel führen könnten.
  2. Befolgen Sie die Schritt-für-Schritt-Mikroinjektion der Eizelle, die in Referenz12 ausführlich beschrieben ist. Mikroinjektion von Prophase-I-verhafteten Eizellen mit 100 ng/μL Securin-gfp cRNA, die in Schritt 1.2 hergestellt wurden.
  3. Lassen Sie die Eizellen nach der Mikroinjektion mindestens 3 h lang die RNA im CO2 -Inkubator erholen und übersetzen. Überprüfen Sie die Expression, indem Sie die Eizellen in einem automatisierten Mehrkanal-Fluoreszenz-Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle) beobachten, um das GFP-Signal anzuzeigen.
  4. Wie in Schritt 2.2 beschrieben, werden 150 μL Nährmedien mit oder ohne 5 μM Nocodazol und 150 μL Nährmedien mit 0,5 μM Reversin in drei verschiedenen Vertiefungen einer 96-Well-Platte geladen.
  5. Waschen Sie die mikroinjizierten Eizellen durch sechs Tropfen milrinonfreies Nährmedium und übertragen Sie 1/3 der Eizellen in jede Behandlung.
  6. Halten Sie die Platte im Inkubator bei 37 °C, mit 5%CO2 und 80% Luftfeuchtigkeit, bis die Eizellen die Meiose wieder aufnehmen, etwa 3 h nach dem Waschen von Milrinon.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einer Vergrößerung zwischen 30x und 64x, um den Zusammenbruch der Kernhülle als Kennzeichen der meiotischen Wiederaufnahme zu bewerten.
  7. Nehmen Sie Bilder der Eizellreifung mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, das mit einer Inkubatorkammer ausgestattet ist, wie in Schritt 2.6 beschrieben. Verwenden Sie Hellfeldeinstellungen, um die Eizellen in der Vertiefung zu finden. Verwenden Sie einen 488-Filter, um das Securin-gfp-Signal zu erkennen, und passen Sie die Fluoreszenzintensität an, um eine Überbelichtung der Zellen zu vermeiden.
    1. Wenn das Bildgebungssystem automatisiert ist, speichern Sie die Positionen der Eizellen in jeder Vertiefung. Da Securin-gfp gleichmäßig im Zytoplasma verteilt ist, sollten Bilder in der mittleren Ebene der Eizellen in Abständen von 20 Minuten für 24 Stunden aufgenommen werden. Um Gruppen von Eizellen in einem Bild zu erfassen, verwenden Sie ein Objektiv mit geringerer Vergrößerung, z. B. 10-fach.
  8. Verwenden Sie Bildanalysesoftware, um die Zerstörung von Securin-gfp zu quantifizieren. Öffnen Sie die Bilder des GFP-Kanals. Beginnen Sie mit dem Zeitpunkt 1. Verwenden Sie in der bevorzugten Analysesoftware ein Auswahl- oder Formwerkzeug, um jede Eizelle zu markieren und eine Region of Interest (ROI) für jede Zelle zu generieren.
    1. Verwenden Sie den gleichen ROI, um einen Hintergrundbereich auszuwählen, der später subtrahiert werden soll. Messen Sie die GFP-Pixelintensität in jedem ROI.
  9. Messen Sie anhand der ROIs für jede in Schritt 3.8 generierte Eizelle die GFP-Intensität in allen Zeitpunkten.
    HINWEIS: In einigen Softwareprogrammen können Sie auf der Registerkarte "Analysieren" die Funktion "Messen" auswählen.
    1. Fahren Sie dann mit dem nächsten Zeitrahmen fort und wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Intensität des GFP in jedem Zeitrahmen zu messen. Subtrahieren Sie abschließend für jeden GFP-Wert die Messung des ROI im Hintergrund, die in Schritt 3.8 ausgewählt wurde. Diese Analyse liefert einen Wert für die Securin-gfp-Intensität für jede Eizelle zu jedem Zeitpunkt.
  10. Extrahieren Sie verschiedene Parameter aus dem Muster der Securin-Zerstörung: (a) der Zeitpunkt, zu dem der Securin-gfp-Abbau begann. Dies gibt an, wann die SAC-Stummschaltung begonnen hat. b) die Zeit des Securin-gfp-Mindestsignals. Dies zeigt an, wann die SAC-Dämpfung unter einen Schwellenwert gefallen ist, um eine hohe APC/C-Aktivierung und eine vollständige Securin-GFP-Degradation zu ermöglichen. c) die Vernichtungsrate von Securin-gfp19. Dies gibt Aufschluss darüber, wie schnell die SAC-Aktivität unter einen Schwellenwert für die APC/C-Aktivierung und den Abbau von Securin-GFP fällt.

4. Rekrutierung von MAD2 an Kinetochoren durch Immunfluoreszenz während der meiotischen Reifung

ANMERKUNG: Informationen zur Entnahme und Reifung von Eizellen finden Sie im zuvor veröffentlichten Bericht12.

  1. Teilen Sie die Eizellen in drei Gruppen auf. Übertragen Sie jede Gruppe von Eizellen in 100 μL Tropfen milrinonfreies Nährmedium. Decken Sie die Tropfen mit Mineralöl ab und legen Sie sie für 3 h, 5 h und 7 h in den Inkubator (37 °C, 5 %CO2 und 80 % Luftfeuchtigkeit), um die frühe Prometaphase I, die späte Prometaphase I bzw. die Metaphase I zu erreichen.
    HINWEIS: Legen Sie jeden Zeitpunkt in eine andere Schale, um zu vermeiden, dass dieselbe Schale mehrmals aus dem Inkubator genommen wird, was sich auf den regelmäßigen Zeitpunkt der meiotischen Reifung auswirkt.
  2. Zu den zugewiesenen Zeitpunkten werden die Eizellen fixiert, indem sie in 500 μL Tropfen von 2% PFA in 1x PHEM-Puffer für 20 min bei Raumtemperatur überführt werden, wobei eine 9-Well-Glasschale verwendet wird, wie zuvor beschrieben20. Dann werden die Zellen in eine saubere Vertiefung überführt, die einen 500-μl-Tropfen Blocklösung enthält (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02%NaN3).
    HINWEIS: PHEM-Zusammensetzung: 60 mM ROHRE; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; und 2 mMMgCl2.
    HINWEIS: Man kann an dieser Stelle anhalten und die Eizellen in Blocklösung in der 9-Well-Platte bei 4 °C lagern, bis der Zeitpunkt der Immunfluoreszenz günstig ist.
  3. Um den MAD2-Nachweis fortzusetzen, werden die Eizellen in eine saubere Vertiefung überführt, die einen 500-μl-Tropfen Permeabilisierungslösung enthält (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3). Inkubieren Sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur, und dann übertragen Sie die Zellen in eine neue Vertiefung mit Blocklösung und inkubieren Sie für 10 Minuten.
  4. Verwenden Sie für die restlichen Immunfluoreszenzschritte einen 96-Well-Schalendeckel mit Vertiefungen, wie zuvor beschrieben20. Verwenden Sie eine befeuchtete dunkle Kammer, um Lichteinwirkung und Verdunstung zu vermeiden. Die Eizellen werden in einen 30 μl Tropfen Blocklösung mit Anti-MAD2-Antikörper (1:1000, Kaninchen) und Anti-Zentromer-Antikörper (ACA) (1:30, menschlich) überführt (siehe Materialtabelle) und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.
    HINWEIS: Der 96-Well-Schalendeckel bietet Platz für die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer Proteine und Gruppen.
  5. Um überschüssige Primärantikörper zu waschen, geben Sie die Zellen in einen 30 μL Tropfen 1x PHEM-Puffer, ergänzt mit 0,5% Triton, und inkubieren Sie für 10 min in der befeuchteten Kammer. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male.
  6. Führen Sie die vierte Wäsche durch, überführen Sie die Zellen in einen 30-μL-Tropfen 1x PHEM-Puffer ohne 0,5% 1x Triton und inkubieren Sie für 10 Minuten.
  7. Die Zellen werden in einen 30 μl Tropfen Blocklösung gegeben, der sekundäre Antikörper wie Anti-Human-633 (1:200) und Anti-Kaninchen-568 (1:200) enthält (siehe Materialtabelle) und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Wählen Sie die Kombination von Fluorophoren basierend auf Ihren Mikroskoplasern oder -filtern.
  8. Um überschüssige sekundäre Antikörper zu waschen, wiederholen Sie die Schritte 4.5-4.6.
  9. Um die Zellen auf dem Objektträger zu montieren, geben Sie die Zellen in einen 10-μl-Tropfen eines DAPI-haltigen Trägermediums (0,1 mg/ml) (siehe Materialtabelle). Fügen Sie kleine Punkte Vaseline in jede Ecke des Deckglases hinzu, legen Sie sie vorsichtig auf den Tropfen des Montagemediums und drücken Sie langsam, um sie zu verteilen. Verwenden Sie durchsichtigen Nagellack, um das Deckglas mit dem Objektträger zu versiegeln. Eine detailliertere Beschreibung des Montageprozesses finden Sie unter Referenz20.
  10. Bilden Sie Kinetochoren mit einem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle) ab, das mit einem 40-fachen oder 63-fachen Objektiv ausgestattet ist. Bestimmen Sie anhand des ACA-Signals den Z-Bereich, der die Bildgebung des gesamten Chromosomenbereichs ermöglicht.
    HINWEIS: Ein optischer Zoom von 4,0 und eine Z-Schrittweite von 0,5 μm können bei einigen Bildgebungssystemen verwendet werden. Diese Parameter können von System zu System variieren und müssen optimiert werden.
  11. Analysieren Sie die MAD2-Intensität bei Kinetochören mit Hilfe von Bildanalysesoftware. Erstellen Sie eine maximale Z-Stack-Projektion und teilen Sie dann die Kanäle auf.
  12. Erstellen Sie zunächst eine Maske mit dem ACA-Kanal, indem Sie den ACA-Kanal auswählen, um einen Schwellenwert festzulegen, der alle Kinetochor-Signale identifiziert. Gehen Sie auf die Registerkarte Bearbeiten und erstellen Sie eine Auswahl. Erstellen Sie dann mit dieser Auswahl einen ROI.
  13. Wählen Sie den MAD2-Kanal aus und rufen Sie die in Schritt 4.12 erstellte Auswahl auf. Wählen Sie eine Schwellwertmethode, die sich besser an das MAD2-Signal anpasst. Messen Sie die Intensität.
    HINWEIS: Wählen Sie die Schwellenwertmethode in der Kontrollbehandlung und halten Sie sie konstant, wenn Sie verschiedene Behandlungen analysieren.
  14. Um Berechnungen der relativen Pixelintensität durchzuführen, dividieren Sie die Intensität jeder Zelle durch die durchschnittliche Intensität der WT-Eizellen im Experiment.

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Representative Results

Bewertung des SAC-Ansprechens durch Nocodazol-Behandlung
Der Zweck dieses Experiments ist es, die SAC-Aktivierung und -Stärke zu bewerten. Durch die Verwendung von Nocodazol zur Depolymerisation von Spindelmikrotubuli werden alle Kinetochoren gelöst, was zu einem SAC-vermittelten Zellzyklusstillstand führt. Im vorliegenden Bildgebungssystem extrudierten DMSO-behandelte Kontroll-Eizellen etwa 14 Stunden nach der Freisetzung von Milrinon einen Polkörper (Abbildung 1, obere Tafeln). In Übereinstimmung mit der SAC-Aktivierung wurden mit Nocodazol behandelte Oozyten in Metaphase I blockiert und extrudierten keinen Polkörper (Abbildung 1, mittlere Felder). Um zu zeigen, dass dieser Assay ein zuverlässiger Indikator für die SAC-Aktivität ist, wurde Reversin, ein MPS1-Inhibitor, verwendet, um die SAC-Aktivierungzu verhindern 21. Wenn der SAC nicht aktiviert werden kann, extrudieren die Eizellen einen Polkörper, obwohl sie keine KT-MT-Anhänge aufweisen (Abbildung 1, Bodenplatten). Eizellen mit einem geschwächten SAC haben eine Mischung von Ergebnissen - einige Eizellen werden verhaftet und einige extrudieren Polkörper17. Diese Methode zur Reifung von Maus-Eizellen mit und ohne Nocodazol kann als erster und einfacher Schritt verwendet werden, um die SAC-Aktivierung in Frage zu stellen.

Muster des Securin-gfp-Abbaus während der meiotischen Reifung
Eines der nachgeschalteten Ereignisse nach SAC-Zufriedenheit und Stummschaltung ist die Aktivierung des APC/C, die zum Abbau von Securin22 führt. Daher ist die Bewertung des Musters des Securin-Abbaus ein direktes Auslesen der SAC-Funktion und sollte durchgeführt werden, um festzustellen, ob das Nocodazol-Ergebnis eine SAC-abhängige Störung war. Dieser Assay beinhaltet die ektopische Expression von Securin-gfp in Eizellen und die anschließende Bildgebung mit lebenden Zellen. Nach der Erstellung einer Kurve, die dem Securin-Abbau folgt, können drei Parameter bestimmt werden: (a) Die Startzeit des Abbaus (Silencing); b) die Zeit, die benötigt wird, um den Mindestgehalt an Securin zu erreichen; und (c) die Abbaugeschwindigkeit (Abbildung 2A). In den kontrollierten, DMSO-behandelten Eizellen beginnt die Securin-gfp-Intensität bei ~10 h nach dem Auswaschen von Milrinon abzunehmen (Abbildung 2B, C). Wenn Eizellen in Gegenwart des SAC-aktivierenden Wirkstoffs Nocodazol gereift wurden, waren die Securin-gfp-Spiegel während der gesamten Dauer der meiotischen Reifung stabil. Im Gegensatz dazu beschleunigte sich das Securin-gfp-Muster bei der Verhinderung der SAC-Aktivierung mit einer Reversin-Behandlung; Der Abbau begann bei ~4 h nach dem Auswaschen von Milrinon, was mit der SAC-Hemmung übereinstimmt (Abbildung 2B, C).

Rekrutierung von MAD2 zu Kinetochoren durch Immunfluoreszenz während der meiotischen Reifung
Wenn die Daten einen Defekt in der SAC-Funktion unterstützen, besteht der nächste Schritt darin, die Rekrutierung von wichtigen SAC-Mediatoren zu evaluieren. Das SAC wird als Reaktion auf nicht gebundene Kinetochoren aktiviert. Kinetochoren werden oft in der frühen Prometaphase gelöst, wenn sich die Spindel aufbaut, und unsachgemäße Befestigungen werden zur Korrektur destabilisiert. Sobald die Kinetochoren stabil an Mikrotubuli gebunden sind, wird der SAC stummgeschaltet, um den Beginn der Anaphase22 zu ermöglichen. Ein früher Schritt in der SAC-Antwort ist die Rekrutierung einer Reihe von Proteinen für Kinetocore, die als Plattform für die MCC-Bildung dienen22,23. Die Bewertung der Lokalisation dieser SAC-Komponenten für Kinetochoren ist eine weitere Strategie, um die SAC-Reaktion zu bewerten. Zum Beispiel ist die Evaluierung von MAD2, einer MCC-Komponente, ein gängiger Ansatz. Es können konfokale Mikroskopaufnahmen verwendet werden, die Zentromere (ACA) und MAD2 von Oozyten detektieren, die zu früher Prometaphase I, später Prometaphase I und Metaphase I gereift sind (Abbildung 3A). Um die Stärke des SAC-Signals zu bewerten, quantifizieren Sie die KT-lokalisierte MAD2-Pixelintensität (Abbildung 3B). Signifikante Raten der MAD2-Rekrutierung für KTs treten in der frühen Prometaphase I auf, wenn die meisten KTs nicht an MTs gebunden sind. Die MAD2-Spiegel reduzierten sich in der späteren Prometaphase und waren in der Metaphase I fast nicht vorhanden, als alle KTs stabil an MTs gebunden waren (Abbildung 3A, B). Daher kann diese Methode das SAC-Ansprechen bewerten, wenn sie mit den beiden anderen Assays kombiniert wird.

Figure 1
Abbildung 1: Beurteilung der SAC-Aktivierung mit Nocodazol. Repräsentative Bilder aus der Zeitraffer-Bildgebung von Oozyten, die in Gegenwart von DMSO (Kontrolle), 5 μM Nocodazol (NOC) oder 5 μM Nocodazol + 0,5 μM Reversin (NOC + REV) gereift sind. Das rote Quadrat zeigt den Zeitrahmen der Polkörperextrusion an. Es wurden zwei unabhängige Experimente analysiert. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Securin-gfp-Abbaumuster. (A) Schematische Darstellung der Securin-gfp-Degradationskurve mit drei Parametern, die untersucht werden können. (B) Repräsentative Bilder aus einem Zeitraffer von Eizellen, die mit Securin-gfp cRNA mikroinjiziert und in Gegenwart von DMSO (Kontrolle), 5 μM Nocodazol oder 0,5 μM Reversin gereift sind. Das rote Quadrat zeigt den Zeitrahmen der Polkörperextrusion an. Maßstabsbalken = 50 μm. (C) Repräsentative Securin-gfp-Abbaukurve von Oozyten, die mit Securin-gfp cRNA mikroinjiziert und in Gegenwart von DMSO (blaue Kreise), 5 μM Nocodazol (rosa Quadrate) oder 0,5 μM Reversin (schwarze Dreiecke) gereift sind. Fehlerbalken = Standardfehler. # Anzahl der Eizellen pro Behandlung: DMSO = 10; NOC = 15; REV = 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: MAD2-Rekrutierung zu Kinetochoren während der meiotischen Reifung der Oozyten. (A) Repräsentative konfokale Bilder von Oozyten, die zu früher Prometaphase I, später Prometaphase I und Metaphase I gereift sind, immungefärbt zum Nachweis von MAD2 (grau) und Kinetochoren (ACA) (rot). Maßstabsbalken = 10 μm; Einschub: 2 μm. (B) Quantifizierung der relativen Intensität von MAD2 aus Bildern in (A). Fehlerbalken = Standardfehler. (C) Schematische Darstellung eines nicht gebundenen Kinetochors und eines SAC-Aktivierungswegs. # Anzahl der Eizellen pro Zeitpunkt: Frühe Prometaphase I = 23; Späte Prometaphase I = 13; Metaphase I = 18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Der Kontrollpunkt für die Spindelmontage ist ein kritischer Kontrollmechanismus während der Zellteilung, der Fehler bei der Chromosomentrennung verhindern soll. Dadurch hat die Zelle genügend Zeit, um unsachgemäße KT-MT-Anhänge zu korrigieren. Die Meiose in Eizellen ist ein fehleranfälliger Prozess, bei dem der größte Teil der Chromosomentrennung während der Meiose I auftritt, was zur Bildung von aneuploiden Eiern führt, die die Hauptursache für frühe Fehlgeburten und Unfruchtbarkeit beim Menschen sind 1,24. Mehrere Hypothesen werden getestet, um zu entwirren, warum weibliche Meiose Fehler hat. Ein möglicher Grund dafür ist, dass der SAC weniger effizient ist als in somatischen Zellen und einen Anaphasenbeginn mit einem oder mehreren falsch gebundenen KTs 9,10,25 ermöglicht. Daher ist eine umfassende Untersuchung der SAC-Mechanismen in Eizellen und die Identifizierung der wichtigsten Regulatoren erforderlich, um den Prozess der Erzeugung einer euploiden Eizelle zu verstehen.

Das vorliegende Protokoll beschreibt drei Techniken, um verschiedene Aspekte der SAC-Integrität zu bewerten: Aktivierung und Stummschaltung. Da jeder dieser Assays einige Einschränkungen in der Interpretation hat, ist die Durchführung von nur einem nicht ausreichend, um die SAC-Funktion in Oozyten zu charakterisieren. Aus diesem Grund wird vorgeschlagen, eine Kombination dieser Methoden zur Bewertung der SAC-Integrität in einer Studie durchzuführen.

Die Bewertung der SAC-Aktivierung mit Nocodazol ist einfach, da sie einfach und schnell ist. Es gibt jedoch einige wichtige Punkte, die bei der Interpretation der Ergebnisse zu beachten sind. Zuerst muss der Forscher die Konzentration von Nocodazol bestimmen, um die Mikrotubuli der Spindel vollständig zu depolymerisieren, um ungebundene Kinetochoren zu erzeugen und den SAC zu aktivieren. Der erfolgreiche Verlust von Mikrotubuli kann durch die Fixierung von Oozyten und den Nachweis von Tubulin mittels Immunfluoreszenz-basierter Mikroskopiefestgestellt werden 20. Eine weitere kritische Einschränkung dieser Technik ist das Auslesen dieses Assays: die Extrusion des ersten Polkörpers (PBE). Ein PBE-Versagen ist nicht unbedingt ein ausreichender Beweis für die SAC-Funktion, denn wenn das untersuchte Protein spätere Stadien wie Zytokinese und Abszision beeinflusst, werden die Ergebnisse auch das Versagen von PBE sein. Verwenden Sie daher die Nocodazol-Behandlung als ersten Schritt, um SAC-Defekte zu bewerten, aber dann mit den anderen beschriebenen Techniken zu kombinieren.

Sobald KTs stabil an MTs gebunden sind und die Chromosomen an der Metaphasenplatte ausgerichtet sind, wird der SAC zum Schweigen gebracht und der APC/C aktiviert, was zum Abbau von Securin und Cyclin B führt. Daher sind die Verfolgung des Musters des Securin- oder Cyclin-B-Abbaus häufig verwendete Indikatoren für die SAC-Stummschaltung25,26,27. Die Veränderung des Abbaumusters gibt Aufschluss über die Beschleunigung oder Verzögerung des Zellzyklus. Eine Beschleunigung deutet auf einen schwachen SAC hin, während eine Verzögerung auf Mängel bei der Erfüllung des SAC hindeutet. Eine Einschränkung dieses Experiments besteht darin, dass es ein Mikroinjektionsgerät und spezielle Fähigkeiten erfordert. Es ist zu beachten, dass die Titration der richtigen Konzentration von Securin-gfp cRNA, die für die Mikroinjektion verwendet wird, von entscheidender Bedeutung ist, da zu viel den Zellzyklus stoppt28.

Schließlich ist die Bewertung der Rekrutierung von MAD2 zu Kinetochoren ein Indikator und Maß für die SAC-Aktivierung. Das Muster der MAD2-Rekrutierung während der Meiose I, mit maximalen MAD2-Spiegeln an Kinetocholen in der frühen Prometaphase I und reduzierten Konzentrationen, wenn KTs angebunden werden. Wie beim Securin-Abbaumuster könnte jede Veränderung der Rekrutierung von MAD2 zu Kinetochoren auf eine Beschleunigung oder Verzögerung der SAC-Stummschaltung hinweisen. Defekte in der MAD2-Rekrutierung in der frühen Prometaphase könnten auf ein Versagen des Aktivierungs- oder Rekrutierungsmechanismushinweisen 29 oder auf reduzierte Mengen von MAD2 in der Zelle17. Um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, wird dringend empfohlen, die Expression des MAD2-Proteins durch Western Blot zu bewerten 17. Beim Vergleich von zwei oder mehr Behandlungen ist es wichtig zu berücksichtigen, dass der Zeitpunkt der meiotischen Reifung und der Chromosomenausrichtung zwischen den Behandlungen variieren kann. Definieren Sie daher zunächst den Zellzyklus-Zeitpunkt für jede Behandlung, um die MAD2-Spiegel richtig zu vergleichen und die Ergebnisse genau zu interpretieren. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass MAD2 einer der letzten Effektoren der SAC-Antwort3 ist. Daher erlaubt die Bewertung von MAD2 nicht, genau zu bestimmen, welcher Teil des SAC-Mechanismus gestört ist. Um SAC-Mechanismen zu evaluieren, kann man die Rekrutierung einer anderen SAC-Komponente wie MPS1, BUB1 und/oder des RZZ-Komplexes bestimmen (Abbildung 3C). Ein weiterer zu berücksichtigender Punkt ist, dass der Fixierungsschritt kritisch ist. Diese Assays verwendeten 2% PFA in 1x PHEM-Puffer, eine Fixierung, die für den Nachweis von Kinetochorproteinen in ganzen Mount-Oozyten geeignet ist. Andere Laboratorien verwenden jedoch eine Chromosomenverbreitungstechnik, die vor30 ausführlich beschrieben wurde.

Zusammenfassend werden in diesem Artikel drei Assays beschrieben, die wichtige Informationen über die Fähigkeit einer Zelle liefern, den Status der Kinetochor-Spindel-Mikrotubuli-Bindung zu überwachen, um die Chromosomentrennung genau zu kontrollieren. Diese Informationen sind wichtig, um zelluläre Situationen zu untersuchen, in denen das SAC kompromittiert sein könnte, um Erkenntnisse darüber zu erhalten, welcher Schritt des Checkpoints gestört ist. Da Aneuploidie ein häufiges Merkmal bei Gameten und Krebs ist, gelten diese Werkzeuge für viele biologische Systeme.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Finanzierung für dieses Projekt wurde von den National Institutes of Health (R35GM136340 an KS) zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A4503
DAPI Life Technologies D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) Sigma D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 Life Technologies A10042
EVOS FL Auto Imaging System Life Technologies Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator Life Technologies Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated MatTek Corporation P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633 Life Technologies A21091
HEPES Sigma H3537
Human anti-ACA Antibodies Incorporated 15-234 Dilution 1/30
ImageJ NIH
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective Leica
MgSO4·7H20 Sigma M7774
Milrinone Sigma M4659
Na2HPO4 Sigma S2429
NaCl Sigma S5886
NaN3 Sigma S2002
Nocodazole Sigma M1404
Paraformaldhyde (PFA) Sigma P6148
PIPES Sigma P6757
Rabbit anti- MAD2 Biolegend 924601 Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine Cayman Chemical 10004412
Triton-X Sigma 274348
Tween-20 Sigma X100
Vectashield Vector laboratories H-1000

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Developmental Biology Heft 187
Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen
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Aboelenain, M., Schindler, K., Blengini, C. S. Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (187), e64459, doi:10.3791/64459 (2022).

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