Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64459
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

Summary

שגיאה בהפרדת כרומוזומים היא תכונה נפוצה בביציות. לכן, חקר מחסום הרכבת הציר נותן רמזים חשובים על המנגנונים הדרושים לייצור ביצים בריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש בדיקות משלימות להערכת שלמות מחסום הרכבת ציר בביציות עכבר.

Abstract

Aneuploidy היא החריגה הגנטית המובילה הגורמת להפלה מוקדמת וכישלון הריון בבני אדם. רוב הטעויות בהפרדת הכרומוזומים הגורמות לאנאופלואידיות מתרחשות במהלך מיוזה בביציות, אך עדיין לא ברור לחלוטין מדוע מיוזה ביצית מועדת לשגיאות. במהלך חלוקת התא, תאים מונעים טעויות בהפרדת הכרומוזומים על ידי הפעלת מחסום הרכבת הציר (SAC). מנגנון בקרה זה מסתמך על זיהוי חיבורי קינטוחור (KT)-מיקרוטובול (MT) וחישת מתח שנוצר על ידי סיבי ציר. כאשר KT אינם מחוברים, ה- SAC מופעל ומונע התקדמות מחזור התא. ה-SAC מופעל תחילה על ידי MPS1 קינאז, אשר מפעיל את הגיוס וההיווצרות של קומפלקס נקודות הביקורת המיטוטיות (MCC), המורכב מ-MAD1, MAD2, BUB3 ו-BUBR1. לאחר מכן, MCC מתפזר לתוך הציטופלסמה ו sequesters CDC20, מפעיל קומפלקס / ציקלוזום מקדם anaphase (APC/C). ברגע ש-KT מתחברים למיקרוטובולים והכרומוזומים מיושרים בלוח המטא-פאזה, ה-SAC מושתק, CDC20 משתחרר, וה-APC/C מופעל, מה שגורם להתפרקות של ציקלין B וסקורין, ובכך מאפשר הופעת אנאפאזה. בהשוואה לתאים סומטיים, SAC בביציות אינו יעיל באותה מידה מכיוון שתאים יכולים לעבור אנאפאזות למרות שיש להם KT לא מחוברים. ההבנה מדוע ה- SAC מתירני יותר ואם מתירנות זו היא אחד הגורמים לטעויות בהפרדת כרומוזומים בביציות עדיין דורשת חקירה נוספת. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שלוש הטכניקות להערכה מקיפה של שלמות SAC בביציות עכבר. טכניקות אלה כוללות שימוש בנוקודזול לדה-פולימריזציה של MTs כדי להעריך את תגובת SAC, מעקב אחר השתקת SAC על ידי מעקב אחר הקינטיקה של הרס סקורין, והערכת הגיוס של MAD2 ל-KT על ידי אימונופלואורסצנציה. יחד, טכניקות אלה בודקות את מנגנוני הבדיקה הדרושים לייצור ביציות בריאות על ידי מתן הערכה מלאה של שלמות SAC.

Introduction

Aneuploidy, אשר נובע מטעויות בהפרדת כרומוזומים, הוא הגורם המוביל להפלות מוקדמות והוא קשור מאוד לטעויות במיוזה1. מיוזה נבדלת ממיטוזה מכיוון שהיא מורכבת משני סבבים של חלוקת תאים ללא שלב שכפול DNA מתערב. במיוזה I, כרומוזומים הומולוגיים נפרדים בעוד כרומטידים אחים נשארים יחד. בביציות, שלב זה נוטה לשגיאות, מה שמוביל לייצור ביציות אנופלואידיות2.

כדי למנוע שגיאות בהפרדת כרומוזומים, רוב סוגי התאים מפעילים מנגנון מעקב המשהה את מחזור התא, הנקרא מחסום הרכבת ציר (SAC). מנגנון זה חש את חיבורי הקינטוחור (KT)-מיקרוטובול (MT) והמתח נוצר כאשר הכרומוזומים מכוונים באופן דו-קוטבי3. קינטוכורים לא מחוברים מעוררים תגובת SAC שמתחילה בגיוס MPS1, הרגולטור הראשי של SAC, לקינטוכורים 3,4. MPS1 יוזמת גיוס של רכיבי SAC אחרים, ופועלת כפלטפורמה ליצירת קומפלקס נקודות הביקורת המיטוטיות (MCC). ה-MCC, המורכב מ-MAD1, MAD2, BUB3 ו-BUBR1, מתפזר לתוך הציטופלסמה ומעכב את הפעלת APC/C על ידי תפיסת המפעיל שלו CDC20. ברגע שכל הקינטוכורים מחוברים ביציבות ל-MTs והכרומוזומים מיושרים בלוח המטא-פאזה, ה-SAC מושתק, וה-MCC מפרק ומשחרר CDC20, ובכך מאפשר הפעלת APC/C. APC/C פעיל משפיל את סקורין וציקלין B, שני שלבים מרכזיים בהפעלת הופעת אנאפאזה 5,6. בתאים סומטיים, ה-SAC מחמיר מכיוון שהוא מופעל על ידי קינטוחור יחיד שאינו מחובר ומספיק כדי לגרום למעצר מחזור התא6. עם זאת, במהלך מיוזה של ביציות, SAC הוא מתירני יותר, וביציות יכולות להיכנס anaphase I עם אחד או יותר kinetochores unconnected 6,7,8,9,10. ההבנה מדוע SAC מתירני יותר בביציות היא תחום מתמשך של התמקדות בתחום. מנגנונים הגורמים לפגמים בהפעלת SAC או השתקת SAC עלולים להוביל לטעויות בהפרדת הכרומוזומים או למעצר ממושך של מחזור התא ולמוות תאי. לכן, הערכת המנגנונים השומרים על שלמות SAC בביציות חשובה להבנת תהליך יצירת הביציות האופלואידיות הבריאות.

פרוטוקול זה מתאר טכניקות להערכה מקיפה של שלמות SAC במיוזה של ביציות עכבר על ידי בחינת שלבים קריטיים שונים של המחסום. ראשית, מתוארת הערכת תגובת SAC לאחר גרימת הפעלת SAC. הפעלה זו מושגת על ידי יצירת kinetochores unattached באמצעות nocodazole, תרופה depolymerizes MTs11. שנית, שיטה לניטור השתקת SAC מתוארת על ידי מעקב אחר הדינמיקה של פירוק סקורין במהלך הבשלת הביציות. לבסוף, נעשה שימוש בבדיקה מבוססת אימונופלואורסנציה כדי למדוד את הגיוס של MAD2, אחד מרכיבי MCC, לקינטוכורות. יחד, בדיקות אלה מעריכות באופן מקיף את שלמות SAC במהלך הבשלה מיוטית של ביציות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העכברים ששימשו בפרוטוקולים אלה שוכנו וגודלו על פי הוועדה המוסדית לשימוש וטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ראטגרס (פרוטוקול 201702497) והנחיות המכונים הלאומיים לבריאות. גופים רגולטוריים אלה אישרו את כל הליכי הניסויים הכוללים ניסויים בבעלי חיים. כל העכברים ששימשו במחקר הנוכחי היו נקבות CF-1 בנות 6-8 שבועות.

1. הכנה ניסיונית

  1. לפני תחילת הערכות SAC, אספו ביציות עכבר בעקבות דוח12 שפורסם בעבר. חלקו את הביציות שנאספו לשלוש קבוצות בגודל שווה ושמרו אותן בתרבית Chatot, Ziomek ו-Bavister (CZB) המכילות 2.5 מיקרומטר מילינון (ראו טבלת חומרים) כדי למנוע חידוש מיוטי13.
    הערה: הרכב CZB: 81.6 mM NaCL; 4.8 mM KCl; 1.2 mM KH2PO4; 1.2 mM MgSO4-7H 2O; 0.27 מ"מ פירובט; 1.7 mM CaCl2; 30.8 mM DL-חומצה לקטית; 7 מ"מ טאורין; 0.1 מ"מ EDTA; 25 mM NaHCO3; גנטמיצין; ו-0.3% BSA.
  2. הכינו את ה-cRNA למיקרו-הזרקה כפי שתואר קודם לכן12,14. הגבירו את הגן Securin של העכבר מה-cDNA המשובט מביציות שלפוחית נבט של עכברים, ולאחר מכן תת-שיבוט לווקטור pMDL2 המכיל רצף Gfp15,16.
    1. כדי להכין Securin-Gfp cRNA, ליניארי את פלסמיד עם עיכול Nde I. בצע שעתוק חוץ גופי באמצעות T3 RNA פולימראז וטיהור cRNA16.
      הערה: יש לאחסן cRNA באליציטוטים של 2-3 μL בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

2. טיפול Nocodazole והדמיה חיה

  1. הכן 1 מ"ל של מדיה תרבותית (CZB) המכילה 5 מיקרומטר nocodazole (NOC), 1 מ"ל של מדיה תרבותית עם 5 μM של NOC בתוספת 0.5 μM reversine (NOC + REV), ו 1 מ"ל של מדיה תרבית עם Dimethyl sulfoxide (DMSO) (1:2000) כבקרה (ראה טבלה של חומרים).
  2. להבשלת ביציות והדמיה חיה, יש להשתמש בצלחת 96 בארות שחוממה מראש באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-80% לחות. בבאר הראשונה, עומס 150 μL של טיפול DMSO בקרה; בבאר השנייה, עומס 150 μL של טיפול NOC; ובבאר השלישית, עומס 150 μL של טיפול NOC + REV. שומרים את הצלחת באינקובטור באותם תנאים כנ"ל עד לצורך.
    הערה: בלוח של 96 בארות, הימנע משימוש בשורה הראשונה ובעמודה הראשונה מכיוון שצל הגבול מפריע לאיכות התמונות.
  3. כדי להתחיל התבגרות מיוטית, להסיר milrinone. תוך כדי צפייה בביציות תחת סטריאומיקרוסקופ באמצעות הגדלה בין 30x-64x, שטפו את המילרינון מהמדיה על ידי העברה רציפה של הביציות דרך שש טיפות של 100 μL של מדיה תרבית נטולת מילרינון המכילה DMSO והניחו אותן בבאר המתאימה של צלחת 96 הבארות באמצעות פיפטה המופעלת ביד או בפה.
    1. ספרו ביציות על ידי הרמתן באמצעות פיפטה המופעלת ביד או בפה והעברתן לטיפה הבאה כדי להימנע מאיבודן. הביציות הן יחידות, גדולות (~ 80 מיקרומטר קוטר), ותאים עגולים. הגרעין ייראה כמו כפתור במרכז התא, והקרום והזונה פלוצ'ידה מקיפים את הביצית.
      הערה: העבירו את הביציות בין טיפות תוך כדי הזזת כמות קטנה ככל האפשר של נוזלים. זה מאפשר הסרה אופטימלית של המילרינון מאמצעי התקשורת. אם הביציות לא מצליחות לחדש את המיוזה, סביר להניח שהמילרינון לא הוסר ביעילות.
  4. חזור על אותו תהליך (שלב 2.3) לטיפול NOC ו- NOC + REV.
  5. דמיינו את הביציות באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד המצויד בתא אינקובטור עם סביבה מבוקרת בתנאים הבאים: 37°C, 5%CO2 ו-80% לחות. צלם תמונות במישור האמצעי של הביציות במרווחים של 20 דקות במשך 24 שעות.
  6. כמת את מספר הביציות שפולטות גוף קוטבי (PB) על ידי זיהוי התאים שעוברים ציטוקינזיס אסימטרי. התוצאה תהיה תא קטן (PB) ליד הביצית ובתוך הזונה פלוצ'ידה המשותפת. הצג את התמונות באמצעות תוכנת הדמיה (ImageJ, ראה רשימת חומרים).
  7. ייבאו רצף תמונות לתוכנת ניתוח התמונה וקדמו את המסגרות עד שתא אחד או יותר יעבור ציטוקינזיס אסימטרי. חישוב אחוז הביציות הפולטות PB מסך הביציות17.

3. מעקב אחר דפוס התפרקות Securin-gfp במהלך הבשלה מיוטית

  1. צנטריפוגה 3 μL של Securin-Gfp cRNA (שלב 1.2) ב 19,283 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C18.
    הערה: השתמש בסופרנאטנט כדי למנוע העמסת זיהומים שעלולים לגרום לחסימת מחטים במהלך מיקרו-הזרקה.
  2. בצע שלב אחר שלב מיקרו-הזרקת ביציות, המתוארת בהרחבה בהפניה12. מיקרו-הזרקת ביציות שלב I עם 100 ng/μL של Securin-gfp cRNA מוכן בשלב 1.2.
  3. לאחר מיקרו-הזרקה, לאפשר לביציות להתאושש ולתרגם את הרנ"א באינקובטור CO2 למשך 3 שעות לפחות. בדוק את הביטוי על ידי התבוננות בביציות במערכת הדמיה פלואורסצנטית רב-ערוצית אוטומטית (ראה טבלת חומרים) כדי להציג את אות GFP.
  4. כמתואר בשלב 2.2, טען 150 μL של מדיה תרבותית עם או בלי 5 μM של nocodazole ו 150 μL של מדיה תרבותית עם 0.5 μM של reversine בשלוש בארות שונות של צלחת 96 בארות.
  5. שטפו את הביציות המוזרקות באמצעות שש טיפות של תרבית ללא מילרין והעבירו 1/3 מהביציות לכל טיפול.
  6. שמרו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, עם 5%CO2 ו-80% לחות עד שהביציות יחזרו למיוזה, כ-3 שעות לאחר שטיפת המילרינון.
    הערה: השתמש בסטריאומיקרוסקופ עם הגדלה בין 30x-64x כדי להעריך את התמוטטות המעטפת הגרעינית כסימן היכר של חידוש meiotic.
  7. הקלט תמונות של הבשלת ביציות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בתא אינקובטור כמתואר בשלב 2.6. השתמש בהגדרות שדה בהיר כדי למצוא את הביציות בבאר. השתמש במסנן 488 כדי לזהות את אות Securin-gfp ולהתאים את עוצמת הפלואורסצנטיות כדי למנוע חשיפת יתר של התאים.
    1. אם מערכת ההדמיה אוטומטית, שמרו את מיקומי הביציות בכל באר. מכיוון שסקורין-gfp מופץ באופן שווה לתוך הציטופלסמה, צלם תמונות במישור האמצעי של הביציות במרווחים של 20 דקות במשך 24 שעות. כדי ללכוד קבוצות של ביציות בתמונה אחת, השתמש בעדשה אובייקטיבית בהגדלה נמוכה יותר, כגון 10x.
  8. השתמש בתוכנה לניתוח תמונות כדי לכמת הרס Securin-gfp. פתח את התמונות של ערוץ GFP. התחל בנקודת זמן 1. בתוכנת הניתוח המועדפת, השתמש בכלי בחירה או צורה כדי לסמן כל ביצית וליצור אזור עניין (ROI) עבור כל תא.
    1. השתמש באותו החזר השקעה כדי לבחור אזור רקע לחיסור מאוחר יותר. מדוד את עוצמת הפיקסלים של GFP בכל החזר השקעה.
  9. באמצעות החזר ההשקעה עבור כל ביצית הנוצרת בשלב 3.8, למדוד את עוצמת GFP בכל נקודות הזמן.
    הערה: בתוכנות מסוימות, כרטיסיית "נתח" מאפשרת בחירה של הפונקציה מדידה.
    1. לאחר מכן, התקדם למסגרת הזמן הבאה וחזור על תהליך זה כדי למדוד את עוצמת ה- GFP בכל מסגרת זמן. לבסוף, לכל ערך GFP, החסר את מדידת החזר ההשקעה ברקע שנבחר בשלב 3.8. ניתוח זה ייתן ערך עבור עוצמת Securin-gfp עבור כל ביצית בכל נקודת זמן.
  10. חלץ פרמטרים שונים מדפוס הרס סקורין: (א) הזמן שבו החלה השפלת סקורין-GFP. זה אומר מתי השתקת SAC החלה; (ב) זמן האות המינימלי Securin-gfp. זה אומר מתי השתקת SAC ירדה מתחת לרמת סף כדי לאפשר הפעלה גבוהה של APC/C והשפלה מלאה של Securin-GFP; (ג) שיעור ההרס של סקורין-GFP19. זה אומר באיזו מהירות פעילות SAC יורדת מתחת לרמת סף להפעלת APC/C והשפלת Securin-GFP.

4. גיוס MAD2 בקינטוכורים על ידי אימונופלואורסנציה במהלך הבשלה מיוטית

הערה: לאיסוף ביציות והבשלהן, עיין בדוח12 שפורסם בעבר.

  1. חלקו את הביציות לשלוש קבוצות. העבירו כל קבוצת ביציות לטיפות של 100 μL של תרבית ללא מילרינון. כסו את הטיפות בשמן מינרלי והניחו אותן באינקובטור (37°C, 5% CO2 ו-80% לחות) למשך 3 שעות, 5 שעות ו-7 שעות כדי להגיע לשלב המוקדם של prometaphase I, שלב Prometaphase I מאוחר ושלב metaphase I, בהתאמה.
    הערה: מניחים כל נקודת זמן בכלי אחר כדי להימנע מהוצאת אותה מנה מהאינקובטור מספר פעמים, מה שמשפיע על העיתוי הרגיל של ההבשלה המיוטית.
  2. בנקודות הזמן שהוקצו, תקן את הביציות על ידי העברתן לטיפות של 500 μL של 2% PFA במאגר PHEM 1x למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, באמצעות צלחת זכוכית 9 בארות כפי שתואר קודם לכן20. לאחר מכן, להעביר את התאים לבאר נקייה המכילה טיפה 500 μL של פתרון חסימה (PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% NaN3).
    הערה: הרכב PHEM: 60 mM PIPES; 25 מ"מ HEPES; 10 mM EGTA; ו 2 mM MgCl2.
    הערה: ניתן לעצור בשלב זה ולאחסן את הביציות בתמיסה חוסמת בצלחת 9 בארות ב 4 ° C עד הזמן הנוח כדי להשלים immunofluorescence.
  3. להמשך גילוי MAD2, העבירו את הביציות לבאר נקייה המכילה טיפה של 500 μL של תמיסת חדירה (PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN3). דוגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מעבירים את התאים לבאר חדשה של תמיסת חסימה ודגרים במשך 10 דקות.
  4. עבור שאר השלבים immunofluorescence, להשתמש מכסה צלחת 96 היטב עם כניסות כפי שתואר קודם20. השתמשו בתא כהה ולח כדי למנוע חשיפה לאור ואידוי. מעבירים את הביציות לטיפת 30 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת עם נוגדן אנטי-MAD2 (1:1000, ארנבת) ונוגדן אנטי-צנטרומרי (ACA) (1:30, אנושי) (ראו טבלת חומרים) ודגורים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
    הערה: מכסה צלחת 96 בארות מאפשר מקום לעיבוד של מספר חלבונים וקבוצות בו זמנית.
  5. כדי לשטוף נוגדנים ראשוניים עודפים, להעביר את התאים לטיפה 30 μL של 1x PHEM מאגר בתוספת 0.5% טריטון לדגור במשך 10 דקות בתא לחות. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
  6. בצע את השטיפה הרביעית, העברת התאים לטיפה של 30 μL של חיץ PHEM 1x ללא 0.5% 1x טריטון, ודגרה במשך 10 דקות.
  7. מעבירים את התאים לטיפת 30 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת המכילה נוגדנים משניים כגון אנטי-אדם-633 (1:200) ואנטי-ארנב-568 (1:200) (ראו טבלת חומרים) ודגורים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    הערה: בחר את השילוב של פלואורופורים בהתבסס על לייזרים או מסננים במיקרוסקופ.
  8. כדי לשטוף נוגדנים משניים עודפים, חזור על שלבים 4.5-4.6.
  9. כדי להרכיב את התאים בשקופית המיקרוסקופ, העבר את התאים לטיפה של 10 μL של מדיית הרכבה המכילה DAPI (0.1 מ"ג/מ"ל) (ראה טבלת חומרים). הוסף נקודות קטנות של וזלין לכל פינה של הכיסוי, הנח אותן בזהירות על גבי טיפת המדיה ההרכבה ולחץ לאט כדי לפזר. השתמשי בלק שקוף כדי לאטום את הכיסוי למגלשה. לתיאור מפורט יותר של תהליך ההרכבה, ראה הפניה20.
  10. צלם קינטוכורים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים) המצויד במטרה של 40x או 63x. באמצעות אות ACA, לקבוע את טווח z המאפשר הדמיה של כל אזור הכרומוזומים.
    הערה: ניתן להשתמש בזום אופטי של 4.0 וגודל z-step של 0.5 מיקרומטר במערכות הדמיה מסוימות. פרמטרים אלה עשויים להשתנות ממערכת למערכת, ואופטימיזציה יהיה צורך.
  11. נתח את עוצמת MAD2 בקינטוכורים באמצעות תוכנה לניתוח תמונה. בצע הקרנה מקסימלית של ערימת z ולאחר מכן פצל את הערוצים.
  12. ראשית, צור מסיכה באמצעות ערוץ ACA על ידי בחירת ערוץ ACA כדי לקבוע סף המזהה את כל אותות הקינטוחור. עבור אל הכרטיסיה עריכה וצור בחירה. לאחר מכן, צור החזר השקעה באמצעות בחירה זו.
  13. בחר את ערוץ MAD2 והבא את הבחירה שנוצרה בשלב 4.12. בחר שיטת סף המתאימה יותר לאות MAD2. מדדו את העוצמה.
    הערה: בחר את שיטת הסף בטיפול הבקרה ושמור אותה קבועה בעת ניתוח טיפולים שונים.
  14. כדי לבצע חישובי עוצמת פיקסלים יחסית, חלקו את העוצמה של כל תא בעוצמה הממוצעת של ביציות WT בניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הערכת היענות SAC על ידי טיפול nocodazole
מטרת ניסוי זה היא להעריך את ההפעלה והחוזק של SAC. על ידי שימוש בנוקודזול לדה-פולימריזציה של מיקרוטובולים של צירים, כל הקינטוכורים לא יהיו מחוברים, מה שיגרום למעצר מחזור התא בתיווך SAC. במערכת ההדמיה הנוכחית, ביציות בקרה שטופלו ב-DMSO הוציאו גוף קוטבי כ-14 שעות לאחר שחרורו ממילרינון (איור 1, לוחות עליונים). בהתאם להפעלת SAC, ביציות שטופלו בנוקודזול נעצרו במטא-פאזה I ולא הוציאו גוף קוטבי (איור 1, פאנלים אמצעיים). כדי להוכיח כי בדיקה זו היא אינדיקטור אמין לפעילות SAC, נעשה שימוש ב- reversine, מעכב MPS1, למניעת הפעלת SAC21. כאשר SAC אינו יכול לפעול, הביציות מוציאות גוף קוטבי למרות שאין להן חיבורי KT-MT (איור 1, לוחות תחתונים). לביציות עם SAC מוחלש יהיה שילוב של תוצאות - חלק מהביציות נעצרות וחלק מגופי הקוטב החיצוניים17. שיטה זו של הבשלת ביציות עכבר עם ובלי nocodazole יכולה לשמש כצעד ראשון וקל כדי לאתגר את הפעלת SAC.

תבנית של התפרקות Securin-gfp במהלך הבשלה מיוטית
אחד האירועים במורד הזרם בעקבות שביעות הרצון וההשתקה של SAC הוא הפעלת הנגמ"ש, מה שהוביל להתדרדרות סקורין22. לכן, הערכה של דפוס השפלת סקורין היא קריאה ישירה של פונקציית SAC ויש לבצע אותה כדי לקבוע אם תוצאת הנוקודזול הייתה הפרעה תלוית SAC. בדיקה זו כוללת ביטוי חוץ רחמי של Securin-gfp לביציות והדמיית תאים חיים לאחר מכן. לאחר ביצוע עקומה העוקבת אחר השפלת סקורין, ניתן לקבוע שלושה פרמטרים: (א) זמן תחילת ההשפלה (השתקה); (ב) הזמן שלוקח להגיע לרמת Securin המינימלית; ו-(ג) שיעור ההשפלה (איור 2A). בביציות שטופלו ב-DMSO, עוצמת Securin-gfp מתחילה לרדת ב~10 שעות לאחר שטיפת המילרינון (איור 2B,C). כאשר הביציות הבשילו בנוכחות הסוכן המפעיל SAC נוקודזול, רמות Securin-gfp היו יציבות במהלך כל תקופת ההבשלה המיוטית. לעומת זאת, בעת מניעת הפעלת SAC עם טיפול הפיך, דפוס Securin-gfp הואץ; ההתפרקות החלה ב~4 שעות לאחר שטיפת המילרינון החוצה, בהתאם לעיכוב SAC (איור 2B,C).

גיוס MAD2 לקינטוכורים על ידי אימונופלואורסנציה במהלך הבשלה מיוטית
אם הנתונים תומכים בפגם בפונקציית SAC, השלב הבא הוא להעריך את הגיוס של מתווכי SAC מרכזיים. ה-SAC מופעל בתגובה לקינטוכורות לא מחוברות. קינטוכורים לעתים קרובות אינם מחוברים בשלב הפרומטאפאזי המוקדם כאשר הציר נבנה, וחיבורים לא תקינים מתערערים לצורך תיקון. ברגע שקינטוכורים מחוברים ביציבות למיקרוטובולים, ה-SAC מושתק כדי לאפשר הופעת אנאפאזות22. צעד מוקדם בתגובת SAC הוא גיוס סדרה של חלבונים לקינטוכורים המשמשים פלטפורמה ליצירת MCC22,23. הערכת הלוקליזציה של רכיבי SAC אלה לקינטוכורים היא אסטרטגיה נוספת להערכת תגובת SAC. לדוגמה, הערכה של MAD2, רכיב MCC, היא גישה נפוצה. ניתן להשתמש בתמונות מיקרוסקופ קונפוקלי שמזהות צנטרומרים (ACA) ו-MAD2 של ביציות שהבשילו לתחילת פרומטאפאזה I, פרומטאפאזה I מאוחרת ומטה-פאזה I (איור 3A). כדי להעריך את עוצמת אות ה-SAC, כמת את עוצמת הפיקסלים MAD2 המותאמת ל-KT (איור 3B). רמות משמעותיות של גיוס MAD2 ל-KT מתרחשות בשלב I מוקדם כאשר רוב ה-KT אינם מחוברים ל-MTs. רמות MAD2 ירדו בפרומטאפאזות מאוחרות יותר וכמעט נעדרו במטא-פאזות I כאשר כל ה-KT היו מחוברים ביציבות ל-MTs (איור 3A,B). לכן, שיטה זו יכולה להעריך את תגובת SAC בשילוב עם שני המבחנים האחרים.

Figure 1
איור 1: הערכת הפעלת SAC עם nocodazole. תמונות מייצגות מהדמיית קיטוע בזמן של ביציות שהבשילו בנוכחות DMSO (בקרה), 5 μM nocodazole (NOC), או 5 μM nocodazole + 0.5 μM reversine (NOC + REV). הריבוע האדום מציין את מסגרת הזמן של שחול גוף הקוטב. שני ניסויים עצמאיים נותחו. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דפוס השפלה של Securin-gfp. (A) סכמטי של עקומת השפלה Securin-gfp עם שלושה פרמטרים שניתן לבחון. (B) תמונות מייצגות מתוך קיטוע זמן של ביציות שהוזרקו במיקרו-סינ"א Securin-gfp והבשילו בנוכחות DMSO (בקרה), 5 μM nocodazole, או 0.5 μM reversine. הריבוע האדום מציין את מסגרת הזמן של שחול גוף הקוטב. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) עקומת פירוק מייצגת של Securin-gfp של ביציות שהוזרקו במיקרו עם Securin-gfp cRNA והבשילו בנוכחות DMSO (עיגולים כחולים), 5 מיקרומטר nocodazole (ריבועים ורודים), או 0.5 μM reversine (משולשים שחורים). קווי שגיאה = שגיאת תקן. # של ביציות לטיפול: DMSO = 10; NOC = 15; REV = 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: גיוס MAD2 לקינטוכורים במהלך הבשלה מיוטית של ביציות. (A) תמונות קונפוקליות מייצגות של ביציות שהבשילו לפרומטאפאזות I מוקדמות, פרומטאפאזות I מאוחרות ומטה-פאזה I, שהוכתמו במערכת החיסון כדי לזהות MAD2 (אפור) וקינטוכורים (ACA) (אדום). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר; כניסה: 2 מיקרומטר. (B) כימות העוצמה היחסית של MAD2 מתמונות ב-(A). קווי שגיאה = שגיאת תקן. (C) סכמטי של מסלול הפעלה לא מחובר של קינטוחור ו-SAC. # של ביציות לנקודת זמן: פרומטאפאזה מוקדמת I = 23; פרומטאפאזה מאוחרת I = 13; מטאפאזה I = 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחסום הרכבת הציר הוא מנגנון בקרה קריטי במהלך חלוקת התא שנועד למנוע טעויות בהפרדת כרומוזומים. זה מאפשר לתא מספיק זמן לתקן קבצים מצורפים KT-MT לא תקינים. מיוזה בביציות היא תהליך נוטה לשגיאות, שבו רוב ההפרדה השגויה של הכרומוזומים מתרחשת במהלך מיוזה I, מה שמוביל ליצירת ביציות אנאופלואידיות שהן הגורם העיקרי להפלות מוקדמות ואי פוריות בבני אדם 1,24. מספר השערות נבדקות כדי להתיר מדוע במיוזה הנשית יש שגיאות. סיבה אפשרית אחת היא שה-SAC פחות יעיל מאשר בתאים סומטיים ומאפשר הופעת אנאפאזה עם KT 9,10,25 אחד או יותר שאינם מחוברים כהלכה. לכן, יש צורך במחקר מקיף של מנגנוני SAC בביציות וזיהוי רגולטורים מרכזיים כדי להבין את תהליך יצירת הביצית האופלואידית.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש טכניקות להערכת היבטים שונים של שלמות SAC: הפעלה והשתקה. מכיוון שלכל אחת מהבדיקות הללו יש מגבלות מסוימות בפרשנות, ביצוע אחת בלבד אינו מספיק כדי לאפיין את תפקוד SAC בביציות. מסיבה זו, ביצוע שילוב של שיטות אלה כדי להעריך את שלמות SAC במחקר מוצע.

הערכה של הפעלת SAC באמצעות nocodazole היא פשוטה כי זה פשוט ומהיר. עם זאת, יש כמה נקודות חשובות שיש לקחת בחשבון בעת פירוש התוצאות. ראשית, החוקר חייב לקבוע את הריכוז של nocodazole כדי depolymerize לחלוטין microtubules של ציר כדי ליצור kinetochores מחובר ולהפעיל את SAC. אובדן מוצלח של מיקרוטובולים יכול להיקבע על ידי קיבוע ביציות וגילוי טובולין באמצעות מיקרוסקופ מבוסס immunofluorescence20. מגבלה קריטית נוספת של טכניקה זו היא קריאת בדיקה זו: אקסטרוזיה של גוף הקוטב הראשון (PBE). כישלון PBE לא בהכרח יכול להיות עדות מספקת לתפקוד SAC מכיוון שאם חלבון המחקר משפיע על שלבים מאוחרים יותר כגון ציטוקינזיס ואבסציה, התוצאות יהיו גם כישלון של PBE. לכן, השתמש בטיפול nocodazole כצעד ראשון כדי להעריך פגמים SAC, אבל אז לשתף אותו עם טכניקות אחרות המתוארות.

ברגע ש-KT מחוברים ביציבות ל-MTs והכרומוזומים מיושרים בלוח המטא-פאזה, ה-SAC מושתק, וה-APC/C מופעל, מה שמוביל להתפרקות סקורין וציקלין B. לכן, מעקב אחר דפוס השפלת סקורין או ציקלין B הם אינדיקטורים נפוצים להשתקת SAC25,26,27. שינוי דפוס ההשפלה מספק מידע על ההאצה או ההשהיה של מחזור התא. תאוצה מצביעה על SAC חלש, ואילו עיכוב מצביע על פגמים בסיפוק ה-SAC. מגבלה של ניסוי זה היא שהוא דורש מתקן מיקרו-הזרקה וסט כישורים מיוחד. שימו לב כי טיטרציה של הריכוז הנכון של Securin-gfp cRNA המשמש למיקרו-הזרקה היא קריטית, מכיוון שיותר מדי יעצור את מחזור התא28.

לבסוף, הערכת הגיוס של MAD2 לקינטוכורים היא אינדיקטור ומדד להפעלת SAC. דפוס הגיוס של MAD2 במהלך מיוזה I, עם רמות מקסימליות של MAD2 בקינטוכורים בשלב הראשון של פרומטאפאזה I ורמות מופחתות ככל ש-KT מתחברים. בדומה לדפוס השפלת סקורין, כל שינוי בגיוס MAD2 לקינטוכורים יכול להצביע על האצה או עיכוב של השתקת SAC. פגמים בגיוס MAD2 בשלב פרומטאפאזי מוקדם יכולים להצביע על כשלים במנגנון ההפעלה או הגיוס29 או על כמויות מופחתות של MAD2 בתא17. כדי להבחין בין שתי האפשרויות הללו, מומלץ מאוד להעריך את רמות ביטוי החלבון MAD2 על ידי כתם מערבי 17. כאשר משווים בין שני טיפולים או יותר, חשוב לקחת בחשבון כי תזמון ההבשלה המיאוטית ויישור הכרומוזומים עשוי להשתנות בין הטיפולים. לכן, ראשית, הגדר את תזמון מחזור התא עבור כל טיפול כדי להשוות כראוי את רמות MAD2 ולפרש במדויק את התוצאות. מגבלה אחת של שיטה זו היא כי MAD2 הוא אחד המשפיעים האחרונים של תגובת SAC3. לכן, הערכת MAD2 אינה מאפשרת לאתר איזה חלק של מנגנון SAC מוטרד. כדי להעריך מנגנוני SAC אפשר לקבוע את הגיוס של רכיב SAC אחר כמו MPS1, BUB1 ו/או קומפלקס RZZ (איור 3C). נקודה נוספת שיש לקחת בחשבון היא ששלב הקיבעון הוא קריטי. בדיקות אלה השתמשו ב-2% PFA ב-1x PHEM buffer, קיבוע הפועל לזיהוי חלבוני קינטוחור בביציות שלמות. עם זאת, מעבדות אחרות משתמשות בטכניקת פיזור כרומוזומים שתוארה בהרחבה לפניגיל 30.

לסיכום, במאמר זה מתוארים שלושה מבדקים, המספקים מידע קריטי על יכולתו של התא לנטר את מצב ההתקשרות של מיקרוטובול קינטוחור-ציר כדי לשלוט במדויק בהפרדת הכרומוזומים. מידע זה חשוב לחקירת מצבים תאיים שבהם SAC עלול להיפגע כדי לקבל תובנה לגבי איזה שלב של המחסום מוטרד. מכיוון שאנאופלואידיות היא תכונה נפוצה בגמטות ובסרטן, כלים אלה חלים על מערכות ביולוגיות רבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

Acknowledgments

המימון לפרויקט זה ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R35GM136340 ל-KS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A4503
DAPI Life Technologies D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) Sigma D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 Life Technologies A10042
EVOS FL Auto Imaging System Life Technologies Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator Life Technologies Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated MatTek Corporation P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633 Life Technologies A21091
HEPES Sigma H3537
Human anti-ACA Antibodies Incorporated 15-234 Dilution 1/30
ImageJ NIH
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective Leica
MgSO4·7H20 Sigma M7774
Milrinone Sigma M4659
Na2HPO4 Sigma S2429
NaCl Sigma S5886
NaN3 Sigma S2002
Nocodazole Sigma M1404
Paraformaldhyde (PFA) Sigma P6148
PIPES Sigma P6757
Rabbit anti- MAD2 Biolegend 924601 Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine Cayman Chemical 10004412
Triton-X Sigma 274348
Tween-20 Sigma X100
Vectashield Vector laboratories H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
  3. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  4. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
  5. London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
  6. Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
  7. Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  8. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  9. Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
  10. Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
  11. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  12. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
  13. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
  14. Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
  15. Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
  16. Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
  17. Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
  18. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  19. Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
  20. Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
  21. Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  22. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  23. Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
  24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
  25. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  26. Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
  27. Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
  28. Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
  29. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  30. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 187
הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aboelenain, M., Schindler, K.,… More

Aboelenain, M., Schindler, K., Blengini, C. S. Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (187), e64459, doi:10.3791/64459 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter