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Developmental Biology

माउस ओसाइट्स में स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट अखंडता का मूल्यांकन

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64459
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

Summary

क्रोमोसोम अलगाव में त्रुटि अंडाणुओं में एक आम विशेषता है। इसलिए, स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट का अध्ययन स्वस्थ अंडे का उत्पादन करने के लिए आवश्यक तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण सुराग देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल माउस अंडाणुओं में स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए तीन पूरक परखों का वर्णन करता है।

Abstract

एन्यूप्लोइडी मनुष्यों में प्रारंभिक गर्भपात और गर्भावस्था की विफलता का कारण बनने वाली प्रमुख आनुवंशिक असामान्यता है। क्रोमोसोम अलगाव में अधिकांश त्रुटियां जो एन्यूप्लोइडी को जन्म देती हैं, अंडाणुओं में अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान होती हैं, लेकिन अंडाणु अर्धसूत्रीविभाजन त्रुटि-प्रवण क्यों है, यह अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं गया है। कोशिका विभाजन के दौरान, कोशिकाएं स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट (एसएसी) को सक्रिय करके गुणसूत्र अलगाव में त्रुटियों को रोकती हैं। यह नियंत्रण तंत्र किनेटोकोर (केटी)-माइक्रोट्यूबुल्स (एमटी) संलग्नक का पता लगाने और स्पिंडल फाइबर द्वारा उत्पन्न तनाव को महसूस करने पर निर्भर करता है। जब केटी असंबद्ध होते हैं, तो एसएसी सक्रिय होती है और सेल-चक्र प्रगति को रोकती है। एसएसी को पहले एमपीएस 1 किनेज द्वारा सक्रिय किया जाता है, जो एमएडी 1, एमएडी 2, बीयूबी 3 और बीयूबीआर 1 से बना माइटोटिक चेकपॉइंट कॉम्प्लेक्स (एमसीसी) की भर्ती और गठन को ट्रिगर करता है। फिर, एमसीसी साइटोप्लाज्म में फैलता है और सीडीसी 20, एक एनाफ़ेज़-बढ़ावा देने वाले कॉम्प्लेक्स / साइक्लोसोम (एपीसी / सी) एक्टिवेटर को अनुक्रमित करता है। एक बार जब केटी सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़ जाते हैं और क्रोमोसोम मेटाफ़ेज़ प्लेट पर संरेखित हो जाते हैं, तो एसएसी को चुप कर दिया जाता है, सीडीसी 20 जारी किया जाता है, और एपीसी / सी सक्रिय होता है, जिससे साइक्लिन बी और सिक्योरिन का क्षरण होता है, जिससे एनाफ़ेज़ की शुरुआत होती है। दैहिक कोशिकाओं की तुलना में, अंडाणुओं में एसएसी उतना प्रभावी नहीं है क्योंकि कोशिकाएं असंबद्ध केटी होने के बावजूद एनाफेज से गुजर सकती हैं। यह समझना कि एसएसी अधिक अनुमेय क्यों है और यदि यह अनुमेयता अंडाणुओं में गुणसूत्र पृथक्करण त्रुटियों के कारणों में से एक है, अभी भी आगे की जांच की आवश्यकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल माउस अंडाणुओं में एसएसी अखंडता का व्यापक रूप से मूल्यांकन करने के लिए तीन तकनीकों का वर्णन करता है। इन तकनीकों में एसएसी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए एमटी को डीपोलीमराइज करने के लिए नोकोडाज़ोल का उपयोग करना, सिक्युरिन विनाश के कैनेटीक्स का पालन करके एसएसी साइलेंसिंग को ट्रैक करना और इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा केटी के लिए एमएडी 2 की भर्ती का मूल्यांकन करना शामिल है। साथ में ये तकनीक एसएसी अखंडता का पूर्ण मूल्यांकन प्रदान करके स्वस्थ अंडे का उत्पादन करने के लिए आवश्यक जांच तंत्र।

Introduction

एन्यूप्लोइडी, जो क्रोमोसोम अलगाव में त्रुटियों से उत्पन्न होती है, प्रारंभिक गर्भपात का प्रमुख कारण है और अर्धसूत्रीविभाजन1 में गलतियों से अत्यधिक जुड़ा हुआ है। अर्धसूत्रीविभाजन माइटोसिस से अलग है क्योंकि इसमें हस्तक्षेप डीएनए प्रतिकृति चरण के बिना कोशिका विभाजन के दो दौर होते हैं। अर्धसूत्रीविभाजन I में, समरूप गुणसूत्र अलग होते हैं जबकि बहन क्रोमैटिड एक साथ रहते हैं। अंडाणुओं में, यह चरण त्रुटि-प्रवण है, जिससे एन्यूप्लोइड अंडे का उत्पादनहोता है।

क्रोमोसोम अलगाव त्रुटियों को रोकने के लिए, अधिकांश सेल प्रकार एक निगरानी तंत्र को सक्रिय करते हैं जो सेल चक्र को रोकता है, जिसे स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट (एसएसी) कहा जाता है। यह तंत्र किनेटोकोर (केटी)-सूक्ष्मनलिका (एमटी) संलग्नक को महसूस करता है और तनाव तब उत्पन्न होता है जब गुणसूत्रद्विध्रुवीय तरीके से उन्मुख होते हैं। असंबद्ध किनेटोकोर्स एक एसएसी प्रतिक्रिया को ट्रिगर करते हैं जो एसएसी के मास्टर नियामक एमपीएस 1 की भर्ती के साथ शुरू होता है। एमपीएस 1 अन्य एसएसी घटकों की भर्ती शुरू करता है, जो माइटोटिक चेकपॉइंट कॉम्प्लेक्स (एमसीसी) बनाने के लिए एक मंच के रूप में कार्य करता है। एमएडी 1, एमएडी 2, बीयूबी 3 और बीयूबीआर 1 से बना एमसीसी, साइटोप्लाज्म में फैलता है और अपने एक्टिवेटर सीडीसी 20 को अनुक्रमित करके एपीसी / सी सक्रियण को रोकता है। एक बार जब सभी किनेटोकोर्स एमटी से स्थिर रूप से जुड़े होते हैं और क्रोमोसोम मेटाफ़ेज़ प्लेट पर संरेखित होते हैं, तो एसएसी को चुप कर दिया जाता है, और एमसीसी सीडीसी 20 को अलग और जारी करता है, जिससे एपीसी / सी सक्रियण की अनुमति मिलती है। सक्रिय एपीसी / सी सिक्युरिन और साइक्लिन बी को नीचा दिखाता है, एनाफ़ेज़ की शुरुआत 5,6 को ट्रिगर करने में दो महत्वपूर्ण कदम। दैहिक कोशिकाओं में, एसएसी कठोर होता है क्योंकि यह एकल असंबद्ध किनेटोकोर द्वारा सक्रिय होता है और सेल-चक्र गिरफ्तारी6 को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त होता है। हालांकि, अंडाणु अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान, एसएसी अधिक अनुमेय होता है, और अंडाणु एक या अधिक असंबद्ध किनेटोकोर्स 6,7,8,9,10 के साथ एनाफ़ेज़ आई में प्रवेश कर सकते हैं। यह समझना कि एसएसी अंडाणुओं में अधिक अनुमेय क्यों है, क्षेत्र में फोकस का एक सतत क्षेत्र है। तंत्र जो एसएसी सक्रियण या एसएसी साइलेंसिंग में दोष का कारण बनते हैं, गुणसूत्र अलगाव या लंबे समय तक सेल चक्र गिरफ्तारी और कोशिका मृत्यु में त्रुटियां पैदा कर सकते हैं। इसलिए, अंडाणुओं में एसएसी अखंडता को बनाए रखने वाले तंत्र का मूल्यांकन स्वस्थ, यूप्लोइड अंडे बनाने की प्रक्रिया को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

यह प्रोटोकॉल चेकपॉइंट के विभिन्न महत्वपूर्ण चरणों की जांच करके माउस ओओसाइट अर्धसूत्रीविभाजन में एसएसी अखंडता का व्यापक रूप से मूल्यांकन करने के लिए तकनीकों का वर्णन करता है। सबसे पहले, एसएसी सक्रियण को प्रेरित करने के बाद एसएसी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन वर्णित है। यह सक्रियण नोकोडाज़ोल का उपयोग करके असंबद्ध किनेटोकोर्स उत्पन्न करके प्राप्त किया जाता है, एक दवा जो एमटी11 को डीपोलीमराइज करती है। दूसरा, एसएसी साइलेंसिंग की निगरानी करने की एक विधि को अंडाणु परिपक्वता के दौरान सिक्युरिन क्षरण की गतिशीलता को ट्रैक करके वर्णित किया गया है। अंत में, एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित परख को एमसीसी घटकों में से एक एमएडी 2 की भर्ती को मापने के लिए नियोजित किया जाता है। साथ में, ये परख व्यापक रूप से अंडाणु मीओटिक परिपक्वता के दौरान एसएसी अखंडता का आकलन करते हैं।

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Protocol

इन प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी चूहों को रटगर्स विश्वविद्यालय संस्थागत पशु उपयोग और देखभाल समिति (प्रोटोकॉल 201702497) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के दिशानिर्देशों के अनुसार रखा और उठाया गया था। इन नियामक निकायों ने पशु अध्ययन से जुड़ी सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को मंजूरी दी। वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए गए सभी चूहे 6-8 सप्ताह के सीएफ -1 महिलाएं थीं।

1. प्रयोगात्मक तैयारी

  1. एसएसी मूल्यांकन शुरू करने से पहले, पहले प्रकाशित रिपोर्ट12 के बाद माउस अंडाणुओं को इकट्ठा करें। एकत्रित अंडाणुओं को तीन समान आकार के समूहों में विभाजित करें और उन्हें चैटोट, जिओमेक और बाविस्टर (सीजेडबी) संस्कृति मीडिया में रखें जिसमें 2.5 μM milrinone ( सामग्री की तालिका देखें) शामिल है ताकि मियोटिकबहाली से बचा जा सके।
    नोट: सीजेडबी संरचना: 81.6 एमएम एनएसीएल; 4.8 mM KCl; 1.2 एमएम केएच2पीओ4; 1.2 एमएम एमजीएसओ4-7 एच2ओ; 0.27 एमएम पाइरूवेट; 1.7 mM CaCl2; 30.8 एमएम डीएल-लैक्टिक एसिड; 7 एमएम टॉरिन; 0.1 एमएम ईडीटीए; 25 mM NaHCO3; जेंटामाइसिन; और 0.3% बीएसए।
  2. माइक्रोइंजेक्शन के लिए सीआरएनए तैयार करें जैसा कि पहले12,14 वर्णित है। माउस जर्मिनल पुटिका अंडाणुओं से क्लोन किए गए सीडीएनए से माउस सिक्योरिन जीन को बढ़ाएं, इसके बाद जीएफपी अनुक्रम15,16 वाले पीएमडीएल 2 वेक्टर में सबक्लोनिंग करें।
    1. सिक्योरिन-जीएफपी सीआरएनए तैयार करने के लिए, एनडीई आई पाचन के साथ प्लास्मिड को रैखिक करें। टी 3 आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके और सीआरएनए16 को शुद्ध करके इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन करें।
      नोट: उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 μL के एलिकोट में सीआरएनए स्टोर करें।

2. नोकोडाज़ोल उपचार और लाइव इमेजिंग

  1. एक नियंत्रण के रूप में 1 एमएल कल्चर मीडिया (सीजेडबी) तैयार करें जिसमें 5 μM nocodazole (NOC), 1 mL संस्कृति मीडिया के साथ 5 μM noC प्लस 0.5 μM रेवर्सिन (NOC + REV), और 1 mL संस्कृति मीडिया के साथ डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) (1:2000) हो ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. अंडाणु परिपक्वता और लाइव इमेजिंग के लिए, इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 80% आर्द्रता पर पूर्व-गर्म 96-वेल प्लेट का उपयोग करें। पहले कुएं में, नियंत्रण डीएमएसओ उपचार के 150 μL लोड करें; दूसरे कुएं में, एनओसी उपचार के 150 μL लोड करें; और तीसरे कुएं में, एनओसी + आरईवी उपचार के 150 μL लोड करें। प्लेट को इनक्यूबेटर में ऊपर की तरह ही परिस्थितियों में रखें जब तक कि आवश्यकता न हो।
    नोट: 96-वेल प्लेट में, पहली पंक्ति और पहले कॉलम का उपयोग करने से बचें क्योंकि सीमा की छाया छवियों की गुणवत्ता में हस्तक्षेप करती है।
  3. मियोटिक परिपक्वता शुरू करने के लिए, मिल्रिनोन को हटा दें। 30x-64x के बीच आवर्धन का उपयोग करके स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत अंडाणुओं को देखते समय, डीएमएसओ युक्त मिल्रिनोन-मुक्त संस्कृति मीडिया के 100 μL की छह बूंदों के माध्यम से अंडाणुओं को क्रमिक रूप से स्थानांतरित करके मीडिया से बाहर निकालें और उन्हें हाथ या मुंह से संचालित पिपेट का उपयोग करके 96-वेल प्लेट के संबंधित कुएं में रखें।
    1. हाथ या मुंह से संचालित पिपेट का उपयोग करके उन्हें उठाकर अंडाणुओं की गणना करें और किसी को भी खोने से बचने के लिए उन्हें अगली बूंद तक पहुंचाएं। अंडाणु एकल, बड़े (~ 80 μm व्यास), और गोल कोशिकाएं हैं। नाभिक कोशिका के केंद्र में एक बटन की तरह दिखाई देगा, और झिल्ली और ज़ोना पेलुसीडा अंडाणु को घेर लेंगे।
      नोट: कम से कम तरल को स्थानांतरित करते हुए बूंदों के बीच अंडाणुओं को स्थानांतरित करें। यह संस्कृति मीडिया से मिल्रिनोन के इष्टतम निष्कासन की अनुमति देता है। यदि अंडाणु अर्धसूत्रीविभाजन को फिर से शुरू करने में विफल रहते हैं, तो यह संभावना है कि मिल्रिनोन को प्रभावी ढंग से नहीं हटाया गया था।
  4. एनओसी और एनओसी + आरईवी उपचार के लिए एक ही प्रक्रिया (चरण 2.3) दोहराएं।
  5. इन परिस्थितियों में नियंत्रित वातावरण के साथ इनक्यूबेटर कक्ष से लैस एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अंडाणुओं की छवि: 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 80% आर्द्रता। 24 घंटे के लिए 20 मिनट के अंतराल पर अंडाणुओं के मध्य तल पर छवियों को कैप्चर करें।
  6. विषम साइटोकिनेसिस से गुजरने वाली कोशिकाओं की पहचान करके एक ध्रुवीय शरीर (पीबी) को बाहर निकालने वाले अंडाणुओं की संख्या निर्धारित करें। परिणाम अंडे के बगल में और साझा ज़ोना पेलुसीडा के भीतर एक छोटी कोशिका (पीबी) होगी। इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवियों को देखें (छविजे, सामग्री की तालिका देखें)।
  7. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में छवि अनुक्रम आयात करें और फ्रेम को तब तक आगे बढ़ाएं जब तक कि एक या अधिक कोशिकाएं विषम साइटोकिनेसिस से न गुजरें। अंडाणुओं के प्रतिशत की गणना करें जो कुल अंडाणुओं के एक पीबी को बाहर निकालते हैं17.

3. मियोटिक परिपक्वता के दौरान सिक्युरिन-जीएफपी गिरावट के पैटर्न की निगरानी

  1. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस 18 पर 19,283 x g पर सिक्युरिन-जीएफपी सीआरएनए (चरण1.2) का सेंट्रीफ्यूज 3 μL।
    नोट: अशुद्धियों को लोड करने से बचने के लिए सुपरनैटेंट का उपयोग करें जो माइक्रोइंजेक्शन के दौरान सुई रुकावट का कारण बन सकता है।
  2. संदर्भ12 में बड़े पैमाने पर वर्णित चरण-दर-चरण अंडाणु माइक्रोइंजेक्शन का पालन करें। चरण 1.2 में तैयार 100 एनजी/1एल सिक्योरिन-जीएफपी सीआरएनए के साथ माइक्रोइंजेक्ट प्रोफ़ेज़ आई-अरेस्टेड अंडाणुओं को।
  3. माइक्रोइंजेक्शन के बाद, अंडाणुओं को ठीक होने दें और कम से कम 3 घंटे के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में आरएनए का अनुवाद करें। जीएफपी सिग्नल को देखने के लिए एक स्वचालित मल्टीचैनल फ्लोरेसेंस इमेजिंग सिस्टम ( सामग्री की तालिका देखें) में अंडाणुओं का अवलोकन करके अभिव्यक्ति की जांच करें।
  4. जैसा कि चरण 2.2 में वर्णित है, 96-वेल प्लेट के तीन अलग-अलग कुओं में 0.5 μM रिवर्सिन के साथ 5 μM नोकोडाज़ोल और 150 μL कल्चर मीडिया के साथ या उसके बिना कल्चर मीडिया के 150 μL लोड करें।
  5. माइक्रोइंजेक्शन अंडाणुओं को मिलरिनोन-मुक्त संस्कृति मीडिया की छह बूंदों के माध्यम से धोएं और प्रत्येक उपचार में 1/3 अंडाणुओं को स्थानांतरित करें।
  6. इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें, जिसमें 5% सीओ2 और 80% आर्द्रता हो, जब तक कि अंडाणु अर्धसूत्रीविभाजन फिर से शुरू न करें, लगभग 3 घंटे बाद मिल्रिनोन धोने के बाद।
    नोट: 30x-64x के बीच आवर्धन के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें ताकि परमाणु लिफाफा टूटने का मूल्यांकन किया जा सके।
  7. चरण 2.6 में वर्णित इनक्यूबेटर कक्ष से लैस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अंडाणु परिपक्वता की छवियों को रिकॉर्ड करें। कुएं में अंडाणुओं को खोजने के लिए ब्राइटफील्ड सेटिंग्स का उपयोग करें। सिक्योरिन-जीएफपी सिग्नल का पता लगाने और कोशिकाओं को अधिक उजागर करने से बचने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता को समायोजित करने के लिए 488 फ़िल्टर का उपयोग करें।
    1. यदि इमेजिंग सिस्टम स्वचालित है, तो प्रत्येक कुएं में अंडाणुओं की स्थिति को सहेजें। क्योंकि सिक्योरिन-जीएफपी को साइटोप्लाज्म में समान रूप से वितरित किया जाता है, इसलिए 24 घंटे के लिए 20 मिनट के अंतराल पर अंडाणुओं के मध्य तल में छवियों को कैप्चर करें। एक तस्वीर में अंडाणुओं के समूहों को पकड़ने के लिए, 10x जैसे कम आवर्धन उद्देश्य लेंस का उपयोग करें।
  8. सिक्योरिन-जीएफपी विनाश की मात्रा निर्धारित करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। GFP चैनल की छवियाँ खोलें। समय बिंदु 1 से शुरू करें। पसंदीदा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, प्रत्येक अंडाणु को चिह्नित करने के लिए एक चयन या आकार उपकरण का उपयोग करें और प्रत्येक सेल के लिए रुचि का क्षेत्र (आरओआई) उत्पन्न करें।
    1. बाद में घटाए जाने वाले पृष्ठभूमि क्षेत्र का चयन करने के लिए उसी ROI का उपयोग करें। प्रत्येक ROI में GFP पिक्सेल तीव्रता मापें।
  9. चरण 3.8 में उत्पन्न प्रत्येक अंडाणु के लिए आरओआई का उपयोग करके, सभी समय बिंदुओं में जीएफपी तीव्रता को मापें।
    नोट: कुछ सॉफ्टवेयर कार्यक्रमों में, एक "विश्लेषण" टैब माप फ़ंक्शन के चयन की अनुमति देता है।
    1. फिर, अगली समय सीमा पर आगे बढ़ें और प्रत्येक समय सीमा में जीएफपी की तीव्रता को मापने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। अंत में, प्रत्येक जीएफपी मान के लिए, चरण 3.8 में चयनित पृष्ठभूमि में आरओआई के माप को घटाएं। यह विश्लेषण प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक अंडाणु के लिए सिक्योरिन-जीएफपी तीव्रता के लिए एक मूल्य देगा।
  10. सिक्योरिन विनाश के पैटर्न से विभिन्न मापदंडों को निकालें: (ए) वह समय जब सिक्योरिन-जीएफपी गिरावट शुरू हुई। यह बताता है कि एसएसी साइलेंसिंग कब शुरू हुई; (ख) सिक्योरिन-जीएफपी न्यूनतम संकेत का समय क्या है? यह बताता है कि उच्च एपीसी / सी सक्रियण और पूर्ण सिक्योरिन-जीएफपी गिरावट की अनुमति देने के लिए एसएसी साइलेंसिंग एक सीमा स्तर से नीचे गिर गई है; (ग) सिक्योरिन-जीएफपी विनाश की दरक्या है? यह बताता है कि एपीसी / सी सक्रियण और सिक्युरिन-जीएफपी गिरावट के लिए एसएसी गतिविधि कितनी तेजी से एक सीमा स्तर से नीचे गिर जाती है।

4. मीओटिक परिपक्वता के दौरान इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किनेटोकोर्स में एमएडी 2 की भर्ती

नोट: अंडाणु संग्रह और परिपक्वता के लिए, पहले प्रकाशित रिपोर्ट12 देखें।

  1. अंडाणुओं को तीन समूहों में विभाजित करें। अंडाणुओं के प्रत्येक समूह को मिल्रिनोन-मुक्त संस्कृति मीडिया की 100 μL बूंदों में स्थानांतरित करें। बूंदों को खनिज तेल के साथ कवर करें और उन्हें क्रमशः प्रारंभिक प्रोमेटाफ़ेज़ I, लेट प्रोमेटाफ़ेज़ I, और मेटाफ़ेज़ I चरण तक पहुंचने के लिए 3 घंटे, 5 घंटे और 7 घंटे के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 80% आर्द्रता) में रखें।
    नोट: इनक्यूबेटर से एक ही डिश को कई बार बाहर निकालने से बचने के लिए प्रत्येक समय बिंदु को एक अलग डिश में रखें, जो मियोटिक परिपक्वता के नियमित समय को प्रभावित करता है।
  2. निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर,पहले वर्णित 20 के रूप में वर्णित 9-वेल ग्लास डिश का उपयोग करके, कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 1x PHEM बफर में 2% PFA की 500 μL बूंदों में स्थानांतरित करके अंडाणुओं को ठीक करें। फिर, कोशिकाओं को ब्लॉकिंग समाधान की 500 μL बूंद वाले एक साफ कुएं में स्थानांतरित करें (पीबीएस + 0.3% बीएसए + 0.01% ट्वीन -20 + 0.02% एनएएन3)।
    नोट: पीएचईएम संरचना: 60 एमएम पाइप; 25 mM HEPES; 10 एमएम ईजीटीए; और 2 mM MgCl2.
    नोट: कोई इस बिंदु पर रुक सकता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस को पूरा करने के सुविधाजनक समय तक 9-वेल प्लेट में ब्लॉकिंग समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कर सकता है।
  3. एमएडी 2 का पता लगाने को जारी रखने के लिए, अंडाणुओं को एक साफ कुएं में स्थानांतरित करें जिसमें परमेबिलाइजेशन समाधान की 500 μL बूंद (पीबीएस + 0.3% बीएसए + 0.1% ट्राइटनएक्स -100 + 0.02% एनएएन3) हो। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर कोशिकाओं को ब्लॉकिंग समाधान के एक नए कुएं में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस चरणों के बाकी हिस्सों के लिए, इंडेंटेशन के साथ 96-वेल डिश ढक्कन का उपयोग करें जैसा कि पहले वर्णित20 है। प्रकाश जोखिम और वाष्पीकरण से बचने के लिए एक आर्द्र अंधेरे कक्ष का उपयोग करें। अंडाणुओं को एंटी-एमएडी 2 एंटीबॉडी (1: 1000, खरगोश) और एंटी-सेंट्रोमेरिक एंटीबॉडी (एसीए) (1: 30, मानव) ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ ब्लॉकिंग समाधान की 30 μL बूंद में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: 96-वेल डिश ढक्कन एक ही समय में कई प्रोटीन और समूहों के प्रसंस्करण के लिए जगह देता है।
  5. अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी को धोने के लिए, कोशिकाओं को 0.5% ट्राइटन के साथ पूरक 1x PHEM बफर की 30 μL बूंद में स्थानांतरित करें और ह्यूमिडिफायर कक्ष में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस चरण को दो बार दोहराएं।
  6. चौथा धोने का प्रदर्शन करें, कोशिकाओं को 0.5% 1x Triton के बिना 1x PHEM बफर की 30 μL बूंद में स्थानांतरित करें, और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. कोशिकाओं को अवरुद्ध समाधान की 30 μL बूंद में स्थानांतरित करें जिसमें द्वितीयक एंटीबॉडी जैसे कि एंटी-ह्यूमन -633 (1: 200) और एंटी-खरगोश -568 (1: 200) ( सामग्री की तालिका देखें) शामिल हैं और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: अपने माइक्रोस्कोप लेजर या फिल्टर के आधार पर फ्लोरोफोरे का संयोजन चुनें।
  8. अतिरिक्त द्वितीयक एंटीबॉडी को धोने के लिए, चरण 4.5-4.6 दोहराएं।
  9. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कोशिकाओं को माउंट करने के लिए, कोशिकाओं को डीएपीआई (0.1 मिलीग्राम / एमएल) युक्त माउंटिंग मीडिया की 10 μL बूंद में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। कवरस्लिप के प्रत्येक कोने में पेट्रोलियम जेली के छोटे बिंदु जोड़ें, सावधानी से उन्हें बढ़ते मीडिया ड्रॉप के शीर्ष पर रखें, और वितरित करने के लिए धीरे-धीरे दबाएं। स्लाइड पर कवरस्लिप को सील करने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग करें। बढ़ती प्रक्रिया के अधिक विस्तृत विवरण के लिए, संदर्भ20 देखें।
  10. 40x या 63x उद्देश्य से लैस एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके छवि किनेटोकोर्स। एसीए सिग्नल का उपयोग करके, जेड-रेंज निर्धारित करें जो पूरे गुणसूत्र क्षेत्र की इमेजिंग की अनुमति देता है।
    नोट: कुछ इमेजिंग सिस्टम पर 4.0 का ऑप्टिकल ज़ूम और 0.5 μm का z-step आकार का उपयोग किया जा सकता है। ये पैरामीटर सिस्टम से सिस्टम में भिन्न हो सकते हैं, और अनुकूलन आवश्यक होगा।
  11. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किनेटोकोर्स पर एमएडी 2 तीव्रता का विश्लेषण करें। जेड-स्टैक अधिकतम प्रक्षेपण बनाएं और फिर चैनलों को विभाजित करें।
  12. सबसे पहले, एक सीमा स्थापित करने के लिए एसीए चैनल का चयन करके एसीए चैनल का उपयोग करके एक मास्क बनाएं जो सभी किनेटोकोर संकेतों की पहचान करता है। संपादन टैब पर जाएँ और एक चयन बनाएँ. फिर, इस चयन के साथ एक ROI बनाएँ।
  13. MAD2 चैनल का चयन करें और चरण 4.12 में बनाए गए चयन को लाएं। एक दहलीज विधि का चयन करें जो MAD2 सिग्नल के लिए बेहतर अनुकूल है। तीव्रता को मापें।
    नोट: नियंत्रण उपचार में दहलीज विधि का चयन करें और विभिन्न उपचारों का विश्लेषण करते समय इसे स्थिर रखें।
  14. सापेक्ष पिक्सेल तीव्रता गणना करने के लिए, प्रयोग में डब्ल्यूटी अंडाणुओं की औसत तीव्रता से प्रत्येक कोशिका की तीव्रता को विभाजित करें।

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Representative Results

नोकोडाज़ोल उपचार द्वारा एसएसी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन
इस प्रयोग का उद्देश्य एसएसी सक्रियण और ताकत का मूल्यांकन करना है। स्पिंडल सूक्ष्मनलिकाएं को डीपोलीमराइज करने के लिए नोकोडाज़ोल का उपयोग करके, सभी किनेटोकोर्स असंबद्ध होंगे, जिससे एसएसी-मध्यस्थता सेल-चक्र गिरफ्तारी होगी। वर्तमान इमेजिंग प्रणाली में, डीएमएसओ-उपचारित नियंत्रण अंडाणुओं ने मिल्रिनोन (चित्रा 1, शीर्ष पैनल) से रिलीज के लगभग 14 घंटे बाद एक ध्रुवीय शरीर को बाहर निकाल दिया। एसएसी सक्रियण के अनुरूप, नोकोडाज़ोल-उपचारित अंडाणुओं को मेटाफ़ेज़ I में गिरफ्तार किया गया और एक ध्रुवीय शरीर को बाहर नहीं निकाला गया (चित्रा 1, मध्य पैनल)। यह प्रदर्शित करने के लिए कि यह परख एसएसी गतिविधि का एक विश्वसनीय संकेतक है, रिवर्सिन, एक एमपीएस 1 अवरोधक, का उपयोग एसएसी सक्रियण21 को रोकने के लिए किया गया था। जब एसएसी सक्रिय नहीं हो सकता है, तो केटी-एमटी संलग्नक नहीं होने के बावजूद अंडाणुओं ने एक ध्रुवीय शरीर को बाहर निकाल दिया (चित्रा 1, नीचे पैनल)। कमजोर एसएसी वाले अंडाणुओं में परिणामों का मिश्रण होगा- कुछ अंडाणुओं की गिरफ्तारी और कुछ बाहरी ध्रुवीय शरीर17. नोकोडाज़ोल के साथ और बिना परिपक्व माउस अंडाणुओं की इस विधि का उपयोग एसएसी सक्रियण को चुनौती देने के लिए पहले और आसान कदम के रूप में किया जा सकता है।

मियोटिक परिपक्वता के दौरान सिक्योरिन-जीएफपी गिरावट का पैटर्न
एसएसी संतुष्टि और साइलेंसिंग के बाद डाउनस्ट्रीम घटनाओं में से एक एपीसी / सी की सक्रियता है, जिससे सिक्योरिन क्षरणहोता है। इसलिए, सिक्योरिन क्षरण के पैटर्न का मूल्यांकन एसएसी फ़ंक्शन का प्रत्यक्ष रीड-आउट है और यह निर्धारित करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए कि क्या नोकोडाज़ोल परिणाम एसएसी-निर्भर गड़बड़ी थी। इस परख में ओसाइट्स में सिक्युरिन-जीएफपी की अस्थानिक अभिव्यक्ति और बाद में लाइव-सेल इमेजिंग शामिल है। एक वक्र बनाने के बाद जो सिक्योरिन गिरावट का अनुसरण करता है, तीन मापदंडों को निर्धारित किया जा सकता है: (ए) गिरावट का शुरुआती समय (साइलेंसिंग); (ख) न्यूनतम प्रतिभूति स्तर तक पहुंचने में कितना समय लगता है; और (ग) अवक्रमण की दर (रेखाचित्र 2क)। नियंत्रण में, डीएमएसओ-उपचारित अंडाणुओं, सिक्युरिन-जीएफपी तीव्रता मिल्रिनोन धोने के बाद ~ 10 घंटे पर कम होने लगती है (चित्रा 2 बी, सी)। जब एसएसी-सक्रिय एजेंट नोकोडाज़ोल की उपस्थिति में अंडाणुओं को परिपक्व किया गया था, तो मीओटिक परिपक्वता की पूरी अवधि के दौरान सिक्युरिन-जीएफपी का स्तर स्थिर था। इसके विपरीत, रिवर्सिन उपचार के साथ एसएसी सक्रियण को रोकते समय, सिक्योरिन-जीएफपी पैटर्न तेज हो गया; सैक निषेध (चित्रा 2 बी, सी) के अनुरूप, मिल्रिनोन वॉश-आउट के बाद ~ 4 घंटे में गिरावट शुरू हुई।

मीओटिक परिपक्वता के दौरान इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किनेटोकोर्स के लिए एमएडी 2 की भर्ती
यदि डेटा एसएसी फ़ंक्शन में एक दोष का समर्थन करता है, तो अगला कदम प्रमुख एसएसी मध्यस्थों की भर्ती का मूल्यांकन करना है। एसएसी असंबद्ध किनेटोकोर्स के जवाब में सक्रिय होता है। किनेटोकोर्स अक्सर शुरुआती प्रोमेटाफ़ेज़ में असंबद्ध होते हैं क्योंकि स्पिंडल का निर्माण हो रहा होता है, और अनुचित संलग्नक सुधार के लिए अस्थिर हो जाते हैं। एक बार जब किनेटोकोर्स सूक्ष्मनलिकाएं से स्थिर रूप से जुड़े होते हैं, तो एसएसी को एनाफ़ेज़ की शुरुआत22 की अनुमति देने के लिए चुप कर दिया जाता है। एसएसी प्रतिक्रिया में एक प्रारंभिक कदम किनेटोकोर्स के लिए प्रोटीन की एक श्रृंखला की भर्ती है जो एमसीसी गठन22,23 के लिए एक मंच के रूप में काम करता है। किनेटोकोर्स के लिए इन एसएसी घटकों के स्थानीयकरण का मूल्यांकन एसएसी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए एक और रणनीति है। उदाहरण के लिए, एमएडी 2 का मूल्यांकन, एक एमसीसी घटक, एक सामान्य दृष्टिकोण है। सेंट्रोमियर (एसीए) और एमएडी 2 का पता लगाने वाली कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप छवियों का उपयोग प्रारंभिक प्रोमेटाफ़ेज़ I, देर से प्रोमेटाफ़ेज़ I, और मेटाफ़ेज़ I के लिए परिपक्व किया जा सकता है (चित्रा 3 ए)। एसएसी सिग्नल की ताकत का मूल्यांकन करने के लिए, केटी-स्थानीयकृत एमएडी 2 पिक्सेल तीव्रता (चित्रा 3 बी) की मात्रा निर्धारित करें। केटी के लिए एमएडी 2 भर्ती के महत्वपूर्ण स्तर प्रारंभिक प्रोमेटाफेज़ I में होते हैं जब अधिकांश केटी एमटी से जुड़े नहीं होते हैं। एमएडी 2 का स्तर बाद में प्रोमेटाफ़ेज़ में कम हो गया और मेटाफ़ेज़ I पर लगभग अनुपस्थित था जब सभी केटी को एमटी (चित्रा 3 ए, बी) से स्थिर रूप से जोड़ा गया था। इसलिए, यह विधि अन्य दो परखों के साथ संयुक्त होने पर एसएसी प्रतिक्रिया का मूल्यांकन कर सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: नोकोडाज़ोल के साथ एसएसी सक्रियण का आकलन करना। अंडाणुओं की टाइम-लैप्स इमेजिंग से प्रतिनिधि छवियां डीएमएसओ (नियंत्रण), 5 μM nocodazole (NOC), या 5 μM nocodazole + 0.5 μM रिवर्सलाइन (एनओसी + REV) की उपस्थिति में परिपक्व होती हैं। लाल वर्ग ध्रुवीय शरीर के एक्सट्रूज़न की समय सीमा को इंगित करता है। दो स्वतंत्र प्रयोगों का विश्लेषण किया गया। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सिक्युरिन-जीएफपी गिरावट पैटर्न। (ए) तीन मापदंडों के साथ सिक्योरिन-जीएफपी गिरावट वक्र का योजनाबद्ध जिसकी जांच की जा सकती है। (बी) सिक्युरिन-जीएफपी सीआरएनए के साथ इंजेक्ट किए गए अंडाणुओं के समय-अंतराल से प्रतिनिधि छवियां और डीएमएसओ (नियंत्रण), 5 μM nocodazole, या 0.5 μM रिवर्सिन की उपस्थिति में परिपक्व हुईं। लाल वर्ग ध्रुवीय शरीर के एक्सट्रूज़न की समय सीमा को इंगित करता है। स्केल बार = 50 μm. (C) सिक्योरिन-gfp cRNA के साथ इंजेक्ट किए गए अंडाणुओं के प्रतिनिधि सिक्योरिन-gfp अवक्रमण वक्र और DMSO (नीले वृत्त), 5 μM nocodazole (गुलाबी वर्ग), या 0.5 μM रिवर्सिन (काले त्रिकोण) की उपस्थिति में परिपक्व होते हैं। त्रुटि पट्टियाँ = मानक त्रुटि. प्रति उपचार अंडाणुओं की # : डीएमएसओ = 10; एनओसी = 15; REV = 5. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: अंडाणु मीओटिक परिपक्वता के दौरान किनेटोकोर्स के लिए MAD2 भर्ती। (A) प्रारंभिक प्रोमेटाफ़ेज़ I, देर से प्रोमेटाफ़ेज़ I, और मेटाफ़ेज़ I, MAD2 (ग्रे) और किनेटोकोर्स (ACA) (लाल) का पता लगाने के लिए इम्यूनोस्टेन्ड अंडाणुओं की प्रतिनिधि कंफोकल छवियां। स्केल बार = 10 μm; (बी) (ए) में छवियों से एमएडी 2 की सापेक्ष तीव्रता का परिमाणीकरण। त्रुटि पट्टियाँ = मानक त्रुटि. (सी) असंबद्ध किनेटोकोर और एसएसी सक्रियण मार्ग का योजनाबद्ध। प्रति समय बिंदु अंडाणुओं की # : प्रारंभिक प्रोमेटाफ़ेज़ I = 23; लेट प्रोमेटाफ़ेज़ I = 13; मेटाफ़ेज़ I = 18. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट कोशिका विभाजन के दौरान एक महत्वपूर्ण नियंत्रण तंत्र है जिसे क्रोमोसोम अलगाव त्रुटियों को रोकने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह सेल को अनुचित केटी-एमटी संलग्नक को सही करने के लिए पर्याप्त समय देने की अनुमति देता है। अंडाणुओं में अर्धसूत्रीविभाजन एक त्रुटि-प्रवण प्रक्रिया है, जहां अधिकांश गुणसूत्र गलत-अलगाव अर्धसूत्रीविभाजन I के दौरान होता है, जिससे एन्यूप्लोइड अंडे की उत्पत्ति होती हैजो मनुष्यों में प्रारंभिक गर्भपात और बांझपन का मुख्य कारण हैं। महिला अर्धसूत्रीविभाजन में त्रुटियां क्यों हैं, यह समझने के लिए कई परिकल्पनाओं का परीक्षण किया जा रहा है। एक संभावित कारण यह है कि एसएसी दैहिक कोशिकाओं की तुलना में कम कुशल है और एक या अधिक गलत-संलग्न केटी 9,10,25 के साथ एनाफ़ेज़ की शुरुआत की अनुमति देता है। इसलिए, एक यूप्लोइड अंडे पैदा करने की प्रक्रिया को समझने के लिए अंडाणुओं में एसएसी तंत्र का एक व्यापक अध्ययन और प्रमुख नियामकों की पहचान करने की आवश्यकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल एसएसी अखंडता के विभिन्न पहलुओं का मूल्यांकन करने के लिए तीन तकनीकों का वर्णन करता है: सक्रियण और चुप कराना। क्योंकि इनमें से प्रत्येक परख की व्याख्या में कुछ सीमाएं हैं, केवल एक का संचालन अंडाणुओं में एसएसी फ़ंक्शन को चिह्नित करने के लिए अपर्याप्त है। इस कारण से, एक अध्ययन में एसएसी अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए इन तरीकों का संयोजन करने का सुझाव दिया जाता है।

नोकोडाज़ोल का उपयोग करके एसएसी सक्रियण का मूल्यांकन सीधा है क्योंकि यह सरल और तेज़ है। हालांकि, परिणामों की व्याख्या करते समय विचार करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण बिंदु हैं। सबसे पहले, अन्वेषक को असंबद्ध किनेटोकोर्स उत्पन्न करने और एसएसी को सक्रिय करने के लिए स्पिंडल के सूक्ष्मनलिकाएं पूरी तरह से डीपॉलीमराइज करने के लिए नोकोडाज़ोल की एकाग्रता स्थापित करनी चाहिए। सूक्ष्मनलिकाएं के सफल नुकसान को अंडाणुओं को ठीक करके और इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित माइक्रोस्कोपी20 के माध्यम से ट्यूबुलिन का पता लगाकर निर्धारित किया जा सकता है। इस तकनीक की एक और महत्वपूर्ण सीमा इस परख का रीड-आउट है: पहले ध्रुवीय शरीर (पीबीई) का एक्सट्रूज़न। पीबीई विफलता आवश्यक रूप से एसएसी फ़ंक्शन का पर्याप्त सबूत नहीं हो सकती है क्योंकि यदि अध्ययन का प्रोटीन साइटोकिनेसिस और एब्सिस जैसे बाद के चरणों को प्रभावित करता है, तो परिणाम पीबीई की विफलता भी होंगे। इसलिए, एसएसी दोषों का मूल्यांकन करने के लिए पहले कदम के रूप में नोकोडाज़ोल उपचार का उपयोग करें, लेकिन फिर इसे वर्णित अन्य तकनीकों के साथ भागीदार बनाएं।

एक बार जब केटी को एमटी से स्थिर रूप से जोड़ा जाता है और क्रोमोसोम मेटाफ़ेज़ प्लेट पर संरेखित होते हैं, तो एसएसी को चुप कर दिया जाता है, और एपीसी / सी सक्रिय हो जाता है, जिससे सिक्योरिन और साइक्लिन बी क्षरण होता है। इसलिए, सिक्योरिन या साइक्लिन बी गिरावट के पैटर्न को ट्रैक करना आमतौर पर एसएसी साइलेंसिंग 25,26,27 के संकेतक हैं। अवक्रमण पैटर्न का परिवर्तन सेल चक्र के त्वरण या देरी के बारे में जानकारी देता है। त्वरण एक कमजोर एसएसी का सुझाव देता है, जबकि देरी एसएसी को संतुष्ट करने में दोषों का सुझाव देती है। इस प्रयोग की एक सीमा यह है कि इसके लिए एक माइक्रोइंजेक्शन रिग और एक विशेष कौशल सेट की आवश्यकता होती है। ध्यान दें कि माइक्रोइंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले सिक्योरिन-जीएफपी सीआरएनए की उचित एकाग्रता का अनुमापन महत्वपूर्ण है, क्योंकि बहुत अधिक सेल चक्र28 को गिरफ्तार करेगा।

अंत में, किनेटोकोर्स के लिए एमएडी 2 की भर्ती का मूल्यांकन एसएसी सक्रियण का एक संकेतक और उपाय है। अर्धसूत्रीविभाजन I के दौरान एमएडी 2 भर्ती का पैटर्न, प्रारंभिक प्रोमेटाफ़ेज़ I पर किनेटोकोर्स में एमएडी 2 के अधिकतम स्तर के साथ और केटी के संलग्न होने के रूप में कम स्तर। सिक्योरिन क्षरण पैटर्न की तरह, किनेटोकोर्स में एमएडी 2 की भर्ती का कोई भी परिवर्तन एसएसी साइलेंसिंग के त्वरण या देरी का संकेत दे सकता है। प्रारंभिक प्रोमेटाफ़ेज़ पर एमएडी 2 भर्ती में दोष सक्रियणया भर्ती के तंत्र में विफलताओं या सेल17 में एमएडी 2 की कम मात्रा का संकेत दे सकते हैं। इन दो संभावनाओं के बीच अंतर करने के लिए, पश्चिमी धब्बा द्वारा एमएडी 2 प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन दृढ़ता से अनुशंसित है। दो या दो से अधिक उपचारों की तुलना करते समय, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि मियोटिक परिपक्वता और गुणसूत्र संरेखण का समय उपचार के बीच भिन्न हो सकता है। इसलिए, सबसे पहले, एमएडी 2 स्तरों की ठीक से तुलना करने और परिणामों की सटीक व्याख्या करने के लिए प्रत्येक उपचार के लिए सेल-चक्र समय को परिभाषित करें। इस विधि की एक सीमा यह है कि एमएडी 2 एसएसी प्रतिक्रिया3 के अंतिम प्रभावकों में से एक है। इसलिए, एमएडी 2 का आकलन करने से किसी को यह इंगित करने की अनुमति नहीं मिलती है कि एसएसी तंत्र का कौन सा हिस्सा परेशान है। एसएसी तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए, कोई अन्य एसएसी घटक जैसे एमपीएस 1, बीयूबी 1, और / या आरजेडजेड कॉम्प्लेक्स (चित्रा 3 सी) की भर्ती निर्धारित कर सकता है। विचार करने के लिए एक और बिंदु यह है कि निर्धारण चरण महत्वपूर्ण है। इन परखों ने 1x PHEM बफर में 2% PFA का उपयोग किया, एक निर्धारण जो पूरे माउंट अंडाणुओं में किनेटोकोर प्रोटीन का पता लगाने के लिए काम करता है। हालांकि, अन्य प्रयोगशालाएं क्रोमोसोम स्प्रेड तकनीक का उपयोग करती हैं जिसे30 से पहले बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया था।

सारांश में, क्रोमोसोम अलगाव को सही ढंग से नियंत्रित करने के लिए कीनेटोकोर-स्पिंडल माइक्रोट्यूबुल्स अटैचमेंट स्थिति की निगरानी करने की सेल की क्षमता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने वाले तीन परख, इस लेख में वर्णित हैं। यह जानकारी सेलुलर स्थितियों की जांच के लिए महत्वपूर्ण है जहां एसएसी से समझौता किया जा सकता है ताकि यह पता लगाया जा सके कि चेकपॉइंट का कौन सा कदम परेशान है। क्योंकि एन्यूप्लोइडी युग्मकों और कैंसर में एक आम विशेषता है, ये उपकरण कई जैविक प्रणालियों पर लागू होते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस परियोजना के लिए वित्त पोषण राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R35GM136340 केएस) द्वारा प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A4503
DAPI Life Technologies D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) Sigma D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 Life Technologies A10042
EVOS FL Auto Imaging System Life Technologies Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator Life Technologies Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated MatTek Corporation P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633 Life Technologies A21091
HEPES Sigma H3537
Human anti-ACA Antibodies Incorporated 15-234 Dilution 1/30
ImageJ NIH
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective Leica
MgSO4·7H20 Sigma M7774
Milrinone Sigma M4659
Na2HPO4 Sigma S2429
NaCl Sigma S5886
NaN3 Sigma S2002
Nocodazole Sigma M1404
Paraformaldhyde (PFA) Sigma P6148
PIPES Sigma P6757
Rabbit anti- MAD2 Biolegend 924601 Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine Cayman Chemical 10004412
Triton-X Sigma 274348
Tween-20 Sigma X100
Vectashield Vector laboratories H-1000

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 187
माउस ओसाइट्स में स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट अखंडता का मूल्यांकन
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Aboelenain, M., Schindler, K., Blengini, C. S. Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (187), e64459, doi:10.3791/64459 (2022).

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