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Developmental Biology

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64459
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

Summary

L'errore nella segregazione cromosomica è una caratteristica comune negli ovociti. Pertanto, lo studio del punto di controllo dell'assemblaggio del fuso fornisce importanti indizi sui meccanismi necessari per produrre uova sane. Il presente protocollo descrive tre saggi complementari per valutare l'integrità del checkpoint di assemblaggio del fuso negli ovociti di topo.

Abstract

L'aneuploidia è la principale anomalia genetica che causa l'aborto spontaneo precoce e il fallimento della gravidanza negli esseri umani. La maggior parte degli errori nella segregazione cromosomica che danno origine all'aneuploidia si verificano durante la meiosi negli ovociti, ma il motivo per cui la meiosi degli ovociti è soggetta a errori non è ancora completamente compreso. Durante la divisione cellulare, le cellule prevengono gli errori nella segregazione cromosomica attivando il punto di controllo dell'assemblaggio del fuso (SAC). Questo meccanismo di controllo si basa sul rilevamento degli attacchi cinetocomeri-microtubuli (MT) e sul rilevamento della tensione generata dalle fibre del mandrino. Quando i KT non sono attaccati, il SAC viene attivato e impedisce la progressione del ciclo cellulare. Il SAC viene attivato prima dalla chinasi MPS1, che innesca il reclutamento e la formazione del complesso del checkpoint mitotico (MCC), composto da MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1. Quindi, l'MCC si diffonde nel citoplasma e sequestra CDC20, un attivatore del complesso/ciclosoma che promuove l'anafase (APC/C). Una volta che i KT si attaccano ai microtubuli e i cromosomi sono allineati alla piastra di metafase, il SAC viene silenziato, CDC20 viene rilasciato e l'APC / C viene attivato, innescando la degradazione di ciclina B e Securin, consentendo così l'insorgenza dell'anafase. Rispetto alle cellule somatiche, il SAC negli ovociti non è altrettanto efficace perché le cellule possono subire anafase nonostante abbiano KT non attaccati. Capire perché il SAC è più permissivo e se questa permissività è una delle cause degli errori di segregazione cromosomica negli ovociti richiede ancora ulteriori indagini. Il presente protocollo descrive le tre tecniche per valutare in modo completo l'integrità del SAC negli ovociti di topo. Queste tecniche includono l'uso del nocodazolo per depolimerizzare MT per valutare la risposta SAC, il monitoraggio del silenziamento del SAC seguendo la cinetica della distruzione della Securin e la valutazione del reclutamento di MAD2 in KT mediante immunofluorescenza. Insieme, queste tecniche sondano i meccanismi necessari per produrre uova sane fornendo una valutazione completa dell'integrità del SAC.

Introduction

L'aneuploidia, che deriva da errori nella segregazione cromosomica, è la principale causa di aborti precoci ed è altamente legata agli errori nella meiosi1. La meiosi si distingue dalla mitosi perché consiste in due cicli di divisione cellulare senza una fase di replicazione del DNA intermedia. Nella meiosi I, i cromosomi omologhi si separano mentre i cromatidi fratelli rimangono insieme. Negli ovociti, questo passaggio è soggetto a errori, portando alla produzione di uova aneuploidi2.

Per prevenire errori di segregazione cromosomica, la maggior parte dei tipi di cellule attiva un meccanismo di sorveglianza che mette in pausa il ciclo cellulare, chiamato checkpoint di assemblaggio del fuso (SAC). Questo meccanismo rileva gli attaccamenti cinetocomeri-microtubuli (MT) e la tensione viene generata quando i cromosomi sono orientati in modo bipolare3. I cinetocori non collegati innescano una risposta SAC che inizia con il reclutamento di MPS1, il regolatore principale del SAC, ai cinetocori 3,4. MPS1 avvia il reclutamento di altri componenti SAC, fungendo da piattaforma per formare il complesso del checkpoint mitotico (MCC). L'MCC, composto da MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1, si diffonde nel citoplasma e inibisce l'attivazione di APC/C sequestrando il suo attivatore CDC20. Una volta che tutti i cinetocori sono stabilmente attaccati alle MT e i cromosomi sono allineati alla piastra metafase, il SAC viene silenziato e l'MCC si smonta e rilascia CDC20, consentendo così l'attivazione APC / C. L'APC/C attivo degrada Securin e Cyclin B, due passaggi chiave per innescare l'insorgenza dell'anafase 5,6. Nelle cellule somatiche, il SAC è rigoroso perché è attivato da un singolo cinetocore non attaccato ed è sufficiente per indurre l'arresto del ciclo cellulare6. Tuttavia, durante la meiosi ovocitaria, il SAC è più permissivo e gli ovociti possono entrare in anafase I con uno o più cinetocori non attaccati 6,7,8,9,10. Capire perché il SAC è più permissivo negli ovociti è un'area di interesse costante nel campo. I meccanismi che causano difetti nell'attivazione del SAC o nel silenziamento del SAC potrebbero portare a errori nella segregazione cromosomica o all'arresto prolungato del ciclo cellulare e alla morte cellulare. Pertanto, valutare i meccanismi che mantengono l'integrità del SAC negli ovociti è importante per comprendere il processo di formazione di uova sane ed euploidi.

Questo protocollo descrive le tecniche per valutare in modo completo l'integrità del SAC nella meiosi degli ovociti di topo esaminando diversi passaggi critici del checkpoint. In primo luogo, viene descritta la valutazione della risposta SAC dopo aver indotto l'attivazione del SAC. Questa attivazione si ottiene generando cinetocori non attaccati utilizzando nocodazolo, un farmaco che depolimerizza MTs11. In secondo luogo, un metodo per monitorare il silenziamento del SAC è descritto monitorando la dinamica della degradazione della Securin durante la maturazione degli ovociti. Infine, un saggio basato sull'immunofluorescenza viene impiegato per misurare il reclutamento di MAD2, uno dei componenti MCC, nei cinetori. Insieme, questi test valutano in modo completo l'integrità del SAC durante la maturazione meiotica degli ovociti.

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Protocol

Tutti i topi utilizzati in questi protocolli sono stati ospitati e allevati secondo il Comitato istituzionale per l'uso e la cura degli animali della Rutgers University (protocollo 201702497) e le linee guida del National Institutes of Health. Questi organismi di regolamentazione hanno approvato tutte le procedure sperimentali che coinvolgono studi sugli animali. Tutti i topi utilizzati nel presente studio erano femmine CF-1 di 6-8 settimane.

1. Preparazione sperimentale

  1. Prima di iniziare le valutazioni SAC, raccogliere ovociti di topo seguendo il rapporto12 precedentemente pubblicato. Dividere gli ovociti raccolti in tre gruppi di dimensioni uniformi e tenerli in terreni di coltura Chatot, Ziomek e Bavister (CZB) contenenti 2,5 μM di milrinone (vedi Tabella dei materiali) per evitare la ripresa meiotica13.
    NOTA: Composizione CZB: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH2PO4; 1,2 mM MgSO 4-7H 2O; 0,27 mM di piruvato; 1,7 mM CaCl2; 30,8 mM di acido DL-lattico; 7 mM di taurina; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO3; Gentamicina; e lo 0,3% BSA.
  2. Preparare il cRNA per la microiniezione come descritto in precedenza12,14. Amplificare il gene Securin di topo dal cDNA clonato da ovociti di vescicole germinali di topo, seguito da subclonazione nel vettore pMDL2 contenente la sequenza Gfp15,16.
    1. Per preparare Securin-Gfp cRNA, linearizzare il plasmide con digestione Nde I. Eseguire la trascrizione in vitro utilizzando la T3 RNA polimerasi e purificando il cRNA16.
      NOTA: Conservare il cRNA in aliquote di 2-3 μL a -80 °C fino all'uso.

2. Trattamento con nocodazolo e imaging dal vivo

  1. Preparare 1 mL di terreno di coltura (CZB) contenente 5 μM di nocodazolo (NOC), 1 mL di terreno di coltura con 5 μM di NOC più 0,5 μM di reversina (NOC + REV) e 1 mL di terreno di coltura con dimetilsolfossido (DMSO) (1:2000) come controllo (vedere Tabella dei materiali).
  2. Per la maturazione degli ovociti e l'imaging dal vivo, utilizzare una piastra da 96 pozzetti preriscaldata nell'incubatore a 37 ° C, 5% di CO2 e 80% di umidità. Nel primo pozzetto, caricare 150 μL del trattamento DMSO di controllo; nel secondo pozzetto, caricare 150 μL di trattamento NOC; e nel terzo pozzetto, caricare 150 μL di trattamento NOC + REV. Tenere la piastra nell'incubatore nelle stesse condizioni di cui sopra fino al momento del bisogno.
    NOTA: nella piastra a 96 pozzetti, evitare di utilizzare la prima riga e la prima colonna perché l'ombra del bordo interferisce con la qualità delle immagini.
  3. Per iniziare la maturazione meiotica, rimuovere milrinone. Durante la visualizzazione degli ovociti sotto uno stereomicroscopio utilizzando un ingrandimento tra 30x-64x, lavare il milrinone dal terreno trasferendo sequenzialmente gli ovociti attraverso sei gocce di 100 μL di terreni di coltura privi di milrinone contenenti DMSO e posizionarli nel pozzetto corrispondente della piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta azionata a mano o a bocca.
    1. Contare gli ovociti raccogliendoli con una pipetta azionata a mano o a bocca e consegnandoli alla goccia successiva per evitare di perderli. Gli ovociti sono cellule singole, grandi (~ 80 μm di diametro) e rotonde. Il nucleo apparirà come un pulsante al centro della cellula, e la membrana e la zona pellucida circondano l'ovocita.
      NOTA: Trasferire gli ovociti tra le gocce spostando la minor quantità possibile di liquido. Ciò consente una rimozione ottimale del milrinone dai terreni di coltura. Se gli ovociti non riescono a riprendere la meiosi, è probabile che il milrinone non sia stato rimosso efficacemente.
  4. Ripetere lo stesso processo (fase 2.3) per il trattamento NOC e NOC + REV.
  5. Visualizzare gli ovociti utilizzando un microscopio a campo luminoso dotato di una camera di incubazione con un ambiente controllato in queste condizioni: 37 °C, 5% CO2 e 80% di umidità. Cattura immagini sul piano intermedio degli ovociti ad intervalli di 20 minuti per 24 ore.
  6. Quantificare il numero di ovociti che estrudono un corpo polare (PB) identificando le cellule che attraversano la citochinesi asimmetrica. Il risultato sarà una piccola cellula (PB) accanto all'uovo e all'interno della zona pellucida condivisa. Visualizzare le immagini utilizzando un software di imaging (ImageJ, vedere Tabella dei materiali).
  7. Importare la sequenza di immagini nel software di analisi delle immagini e far avanzare i fotogrammi fino a quando una o più cellule passano attraverso la citochinesi asimmetrica. Calcola la percentuale di ovociti che estrudono un PB sul totale degli ovociti17.

3. Monitoraggio del pattern di degradazione di Securin-gfp durante la maturazione meiotica

  1. Centrifugare 3 μL di cRNA Securin-Gfp (fase 1.2) a 19.283 x g per 30 minuti a 4 °C18.
    NOTA: Utilizzare il surnatante per evitare di caricare impurità che potrebbero causare il blocco dell'ago durante la microiniezione.
  2. Seguire passo dopo passo la microiniezione di ovociti, ampiamente descritta nel riferimento12. Microiniettare ovociti arrestati in profase I con 100 ng/μL di cRNA Securin-gfp preparati nella fase 1.2.
  3. Dopo la microiniezione, lasciare che gli ovociti recuperino e traducano l'RNA nell'incubatore di CO2 per almeno 3 ore. Controllare l'espressione osservando gli ovociti in un sistema automatizzato di imaging a fluorescenza multicanale (vedi Tabella dei materiali) per visualizzare il segnale GFP.
  4. Come descritto al punto 2.2, caricare 150 μL di terreno di coltura con o senza 5 μM di nocodazolo e 150 μL di terreno di coltura con 0,5 μM di reversine in tre diversi pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
  5. Lavare gli ovociti microiniettati attraverso sei gocce di terreno di coltura privo di milrinone e trasferire 1/3 degli ovociti in ciascun trattamento.
  6. Tenere la piastra nell'incubatrice a 37 °C, con il 5% di CO2 e l'80% di umidità fino a quando gli ovociti non riprendono la meiosi, circa 3 ore dopo il lavaggio con milrinone.
    NOTA: Utilizzare uno stereomicroscopio con ingrandimento compreso tra 30x-64x per valutare la rottura dell'involucro nucleare come segno distintivo della ripresa meiotica.
  7. Registrare le immagini della maturazione degli ovociti utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di una camera di incubazione come descritto al punto 2.6. Utilizzare le impostazioni del campo luminoso per trovare gli ovociti nel pozzetto. Utilizzare un filtro 488 per rilevare il segnale Securin-gfp e regolare l'intensità della fluorescenza per evitare la sovraesposizione delle cellule.
    1. Se il sistema di imaging è automatizzato, salvare le posizioni degli ovociti in ciascun pozzetto. Poiché Securin-gfp è uniformemente distribuito nel citoplasma, catturare immagini nel piano intermedio degli ovociti ad intervalli di 20 minuti per 24 ore. Per catturare gruppi di ovociti in un'immagine, utilizzare un obiettivo a ingrandimento inferiore, ad esempio 10x.
  8. Utilizzare il software di analisi delle immagini per quantificare la distruzione di Securin-gfp. Aprire le immagini del canale GFP. Inizia dal punto temporale 1. Nel software di analisi preferito, utilizzare uno strumento di selezione o forma per contrassegnare ciascun ovocita e generare una regione di interesse (ROI) per ogni cellula.
    1. Utilizza lo stesso ROI per selezionare un'area di sfondo da sottrarre in seguito. Misura l'intensità dei pixel GFP in ogni ROI.
  9. Utilizzando i ROI per ogni ovocita generato nella fase 3.8, misurare l'intensità della GFP in tutti i punti temporali.
    NOTA: In alcuni programmi software, una scheda "Analizza" consente la selezione della funzione Misura.
    1. Quindi, passare al periodo successivo e ripetere questo processo per misurare l'intensità della GFP in ciascun intervallo di tempo. Infine, a ciascun valore GFP, sottrarre la misurazione del ROI sullo sfondo selezionato nel passaggio 3.8. Questa analisi darà un valore per l'intensità di Securin-gfp per ciascun ovocita in ogni punto temporale.
  10. Estrarre diversi parametri dal modello di distruzione di Securin: (a) il momento in cui è iniziata la degradazione di Securin-gfp. Questo dice quando è iniziato il silenziamento SAC; b) il tempo del segnale minimo Securin-gfp. Questo indica quando il silenziamento SAC è sceso al di sotto di un livello di soglia per consentire un'elevata attivazione APC/C e la completa degradazione della Securin-GFP; c) il tasso di distruzione di Securin-GFP19. Questo indica quanto rapidamente l'attività SAC scende al di sotto di un livello di soglia per l'attivazione APC/C e la degradazione di Securin-GFP.

4. Reclutamento di MAD2 a cinetocori mediante immunofluorescenza durante la maturazione meiotica

NOTA: Per la raccolta e la maturazione degli ovociti, fare riferimento al rapporto12 pubblicato in precedenza.

  1. Dividere gli ovociti in tre gruppi. Trasferire ogni gruppo di ovociti in 100 μL di gocce di terreno di coltura privo di milrinone. Coprire le gocce con olio minerale e metterle nell'incubatore (37 °C, 5% CO2 e 80% umidità) per 3 ore, 5 ore e 7 ore per raggiungere rispettivamente la prometafase I precoce, la prometafase I tardiva e la fase I della metafase I.
    NOTA: Posizionare ogni punto temporale in un piatto diverso per evitare di estrarre lo stesso piatto dall'incubatrice più volte, il che influisce sui tempi regolari di maturazione meiotica.
  2. Nei punti temporali assegnati, fissare gli ovociti trasferendoli in gocce da 500 μL di PFA al 2% in 1x tampone PHEM per 20 minuti a temperatura ambiente, utilizzando un piatto di vetro a 9 pozzetti come descritto in precedenza20. Quindi, trasferire le cellule in un pozzetto pulito contenente una goccia di 500 μL di soluzione bloccante (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3).
    NOTA: Composizione PHEM: 60 mM TUBAZIONI; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; e 2 mM MgCl2.
    NOTA: Ci si può fermare a questo punto e conservare gli ovociti in soluzione bloccante nella piastra a 9 pozzetti a 4 °C fino al momento opportuno per completare l'immunofluorescenza.
  3. Per continuare la rilevazione di MAD2, trasferire gli ovociti in un pozzetto pulito contenente una goccia di 500 μL di soluzione di permeabilizzazione (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3). Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente, quindi trasferire le cellule in un nuovo pozzetto di soluzione bloccante e incubare per 10 minuti.
  4. Per il resto delle fasi di immunofluorescenza, utilizzare un coperchio a 96 pozzetti con rientranze come descritto in precedenza20. Utilizzare una camera buia umidificata per evitare l'esposizione alla luce e l'evaporazione. Trasferire gli ovociti in una goccia da 30 μL di soluzione bloccante con anticorpo anti-MAD2 (1:1000, coniglio) e anticorpo anti-centromerico (ACA) (1:30, umano) (vedi Tabella dei materiali) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
    NOTA: Il coperchio del piatto a 96 pozzetti consente la lavorazione di diverse proteine e gruppi contemporaneamente.
  5. Per lavare gli anticorpi primari in eccesso, trasferire le cellule a una goccia di 30 μL di tampone PHEM 1x integrato con Triton allo 0,5% e incubare per 10 minuti nella camera umidificata. Ripetere questo passaggio altre due volte.
  6. Eseguire il quarto lavaggio, trasferendo le cellule su una goccia di 30 μL di tampone PHEM 1x senza 0,5% 1x Triton e incubare per 10 minuti.
  7. Trasferire le cellule in una goccia da 30 μL di soluzione bloccante contenente anticorpi secondari quali anti-umano-633 (1:200) e anti-coniglio-568 (1:200) (vedi Tabella dei materiali) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
    NOTA: Scegli la combinazione di fluorofori in base ai laser o ai filtri del tuo microscopio.
  8. Per lavare gli anticorpi secondari in eccesso, ripetere i passaggi 4.5-4.6.
  9. Per montare le cellule sul vetrino del microscopio, trasferire le cellule su una goccia di 10 μL di supporto di montaggio contenente DAPI (0,1 mg/ml) (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere piccoli punti di vaselina a ciascun angolo del vetrino, posizionarli con cura sopra la goccia del supporto di montaggio e premere lentamente per distribuire. Utilizzare uno smalto trasparente per sigillare la copertina sul vetrino. Per una descrizione più dettagliata del processo di montaggio, vedere il riferimento20.
  10. Cinetocori di immagini utilizzando un microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali) dotato di un obiettivo 40x o 63x. Utilizzando il segnale ACA, determinare la gamma z che consente l'imaging dell'intera area cromosomica.
    NOTA: su alcuni sistemi di imaging è possibile utilizzare uno zoom ottico di 4,0 e una dimensione z-step di 0,5 μm. Questi parametri possono variare da sistema a sistema e sarà necessaria un'ottimizzazione.
  11. Analizza l'intensità MAD2 ai cinetocori utilizzando il software di analisi delle immagini. Effettuare una proiezione massima z-stack e quindi dividere i canali.
  12. Innanzitutto, creare una maschera utilizzando il canale ACA selezionando il canale ACA per stabilire una soglia che identifichi tutti i segnali cinetocori. Vai alla scheda Modifica e crea una selezione. Quindi, crea un ROI con questa selezione.
  13. Selezionare il canale MAD2 e inserire la selezione creata nel passaggio 4.12. Selezionare un metodo di soglia che si adatti meglio al segnale MAD2. Misura l'intensità.
    NOTA: Selezionare il metodo di soglia nel trattamento di controllo e mantenerlo costante quando si analizzano trattamenti diversi.
  14. Per calcolare l'intensità relativa dei pixel, dividere l'intensità di ciascuna cellula per l'intensità media degli ovociti WT nell'esperimento.

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Representative Results

Valutazione della risposta al SAC mediante trattamento con nocodazolo
Lo scopo di questo esperimento è valutare l'attivazione e la forza del SAC. Utilizzando il nocodazolo per depolimerizzare i microtubuli del fuso, tutti i cinetocori saranno scollegati, il che causerà un arresto del ciclo cellulare mediato da SAC. Nell'attuale sistema di imaging, gli ovociti di controllo trattati con DMSO hanno estruso un corpo polare circa 14 ore dopo il rilascio dal milrinone (Figura 1, pannelli superiori). Coerentemente con l'attivazione del SAC, gli ovociti trattati con nocodazolo si sono arrestati nella metafase I e non hanno estrudito un corpo polare (Figura 1, pannelli centrali). Per dimostrare che questo test è un indicatore affidabile dell'attività SAC, è stato utilizzato reversine, un inibitore di MPS1, per prevenire l'attivazione del SAC21. Quando il SAC non può attivarsi, gli ovociti hanno estruso un corpo polare nonostante non avessero attacchi KT-MT (Figura 1, pannelli inferiori). Gli ovociti con un SAC indebolito avranno un mix di esiti: alcuni ovociti arrestano e alcuni estrudono corpi polari17. Questo metodo di maturazione degli ovociti di topo con e senza nocodazolo può essere utilizzato come primo e facile passo per sfidare l'attivazione del SAC.

Pattern di degradazione di Securin-gfp durante la maturazione meiotica
Uno degli eventi a valle dopo la soddisfazione e il silenziamento del SAC è l'attivazione dell'APC/C, che porta alla degradazione della Securin22. Pertanto, la valutazione del pattern di degradazione della Securin è una lettura diretta della funzione SAC e deve essere condotta per determinare se il risultato del nocodazolo è una perturbazione SAC-dipendente. Questo test prevede l'espressione ectopica di Securin-gfp negli ovociti e il successivo imaging di cellule vive. Dopo aver fatto una curva che segue la degradazione di Securin, è possibile determinare tre parametri: (a) L'ora di inizio della degradazione (silenziamento); b) il tempo necessario per raggiungere il livello minimo di Securin; e c) il tasso di degradazione (figura 2A). Nel controllo, gli ovociti trattati con DMSO, l'intensità di Securin-gfp inizia a diminuire a ~ 10 h dopo il lavaggio del milrinone (Figura 2B, C). Quando gli ovociti sono stati maturati in presenza dell'agente attivante il sacco nocodazolo, i livelli di Securin-gfp sono rimasti stabili durante l'intero periodo di maturazione meiotica. Al contrario, quando si impedisce l'attivazione del SAC con il trattamento reversino, il pattern Securin-gfp accelera; la degradazione è iniziata a ~4 ore dopo il dilavamento del milrinone, coerentemente con l'inibizione del SAC (Figura 2B,C).

Reclutamento di MAD2 nei cinetocori mediante immunofluorescenza durante la maturazione meiotica
Se i dati supportano un difetto nella funzione SAC, il passo successivo è valutare l'assunzione di mediatori chiave del SAC. Il SAC viene attivato in risposta a cinetocori non attaccati. I cinetocori sono spesso scollegati nella prometafase iniziale mentre il fuso sta costruendo e gli attacchi impropri sono destabilizzati per la correzione. Una volta che i cinetocori sono stabilmente attaccati ai microtubuli, il SAC viene silenziato per consentire l'insorgenza dell'anafase22. Un primo passo nella risposta SAC è il reclutamento di una serie di proteine nei cinetocori che fungono da piattaforma per la formazione di MCC22,23. La valutazione della localizzazione di questi componenti SAC nei cinetocori è un'altra strategia per valutare la risposta SAC. Ad esempio, la valutazione di MAD2, un componente MCC, è un approccio comune. Possono essere utilizzate immagini al microscopio confocale che rilevano centromeri (ACA) e MAD2 di ovociti maturati fino alla prometafase I precoce, alla prometafase I tardiva e alla metafase I (Figura 3A). Per valutare l'intensità del segnale SAC, quantificare l'intensità dei pixel MAD2 localizzata KT (Figura 3B). Livelli significativi di reclutamento di MAD2 per KT si verificano nella prometafase I precoce quando la maggior parte dei KT non sono attaccati alle MT. I livelli di MAD2 si sono ridotti nella prometafase successiva ed erano quasi assenti alla metafase I quando tutti i KT erano stabilmente attaccati alle MT (Figura 3A, B). Pertanto, questo metodo può valutare la risposta SAC quando combinato con gli altri due saggi.

Figure 1
Figura 1: Valutazione dell'attivazione del SAC con nocodazolo. Immagini rappresentative dall'imaging time-lapse di ovociti maturati in presenza di DMSO (controllo), 5 μM di nocodazolo (NOC) o 5 μM di nocodazolo + 0,5 μM di reversina (NOC + REV). Il quadrato rosso indica l'intervallo di tempo dell'estrusione del corpo polare. Sono stati analizzati due esperimenti indipendenti. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Modello di degradazione della sicurezza-gfp. (A) Schema della curva di degradazione Securin-gfp con tre parametri che possono essere esaminati. (B) Immagini rappresentative da un time-lapse di ovociti microiniettati con cRNA Securin-gfp e maturati in presenza di DMSO (controllo), nocodazolo 5 μM o 0,5 μM reversine. Il quadrato rosso indica l'intervallo di tempo dell'estrusione del corpo polare. Barra della scala = 50 μm. (C) Curva rappresentativa di degradazione Securin-gfp di ovociti microiniettati con cRNA Securin-gfp e maturati in presenza di DMSO (cerchi blu), 5 μM di nocodazolo (quadrati rosa) o 0,5 μM reversine (triangoli neri). Barre di errore = errore standard. # di ovociti per trattamento: DMSO = 10; NOC = 15; REV = 5. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Reclutamento di MAD2 nei cinetocori durante la maturazione meiotica degli ovociti. (A) Immagini confocali rappresentative di ovociti maturati all'inizio della prometafase I, della prometafase I tardiva e della metafase I, immunocolorate per rilevare MAD2 (grigio) e cinetocori (ACA) (rosso). Barra di scala = 10 μm; riquadro: 2 μm. (B) Quantificazione dell'intensità relativa di MAD2 dalle immagini in (A). Barre di errore = errore standard. (C) Schema di un cinetocore non collegato e di una via di attivazione SAC. # di ovociti per punto temporale: Prometafase precoce I = 23; Prometafase tardiva I = 13; Metafase I = 18. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Il checkpoint di assemblaggio del mandrino è un meccanismo di controllo critico durante la divisione cellulare progettato per prevenire errori di segregazione cromosomica. Consente alla cellula di avere abbastanza tempo per correggere gli attacchi KT-MT impropri. La meiosi negli ovociti è un processo soggetto a errori, in cui la maggior parte della mis-segregazione cromosomica si verifica durante la meiosi I, portando alla generazione di uova aneuploidi che sono la principale causa di aborti precoci e infertilità nell'uomo 1,24. Diverse ipotesi sono state testate per districare il motivo per cui la meiosi femminile ha errori. Una potenziale ragione è che il SAC è meno efficiente rispetto alle cellule somatiche econsente l'insorgenza dell'anafase con uno o più KT 9,10,25 mal attaccati. Pertanto, è necessario uno studio completo dei meccanismi SAC negli ovociti e l'identificazione dei regolatori chiave per comprendere il processo di generazione di un uovo euploide.

Il presente protocollo descrive tre tecniche per valutare diversi aspetti dell'integrità del SAC: attivazione e silenziamento. Poiché ciascuno di questi test ha alcune limitazioni nell'interpretazione, la conduzione di uno solo è insufficiente per caratterizzare la funzione SAC negli ovociti. Per questo motivo, si suggerisce di eseguire una combinazione di questi metodi per valutare l'integrità del SAC in uno studio.

La valutazione dell'attivazione del SAC mediante nocodazolo è semplice e veloce. Tuttavia, ci sono alcuni punti importanti da considerare quando si interpretano i risultati. In primo luogo, lo sperimentatore deve stabilire la concentrazione di nocodazolo per depolimerizzare completamente i microtubuli del fuso per generare cinetocori non attaccati e attivare il SAC. La perdita riuscita dei microtubuli può essere determinata fissando gli ovociti e rilevando la tubulina tramite microscopia basata sull'immunofluorescenza20. Un'altra limitazione critica di questa tecnica è la lettura di questo test: l'estrusione del primo corpo polare (PBE). Il fallimento del PBE potrebbe non essere necessariamente una prova sufficiente della funzione del SAC, perché se la proteina di studio colpisce gli stadi successivi come la citochinesi e l'abscissione, i risultati saranno anche il fallimento della PBE. Pertanto, utilizzare il trattamento con nocodazolo come primo passo per valutare i difetti SAC, ma poi associarlo alle altre tecniche descritte.

Una volta che i KT sono stabilmente attaccati alle MT e i cromosomi sono allineati alla piastra di metafase, il SAC viene silenziato e l'APC / C viene attivato, portando alla degradazione di Securin e Cyclin B. Pertanto, il monitoraggio del modello di degradazione di Securin o Cyclin B sono indicatori comunemente usati di silenziamento SAC25,26,27. L'alterazione del modello di degradazione fornisce informazioni sull'accelerazione o sul ritardo del ciclo cellulare. Un'accelerazione suggerisce un SAC debole, mentre un ritardo suggerisce difetti nel soddisfare il SAC. Una limitazione di questo esperimento è che richiede un impianto di microiniezione e un set di abilità specializzate. Si noti che la titolazione della corretta concentrazione di cRNA Securin-gfp utilizzato per la microiniezione è fondamentale, poiché troppo arresterà il ciclo cellulare28.

Infine, la valutazione del reclutamento di MAD2 nei cinetocori è un indicatore e una misura dell'attivazione del SAC. Il modello di reclutamento di MAD2 durante la meiosi I, con livelli massimi di MAD2 a cinetocori all'inizio della prometafase I e livelli ridotti quando i KT si attaccano. Come il modello di degradazione della Securin, qualsiasi alterazione del reclutamento di MAD2 nei cinetocori potrebbe indicare un'accelerazione o un ritardo del silenziamento del SAC. Difetti nel reclutamento di MAD2 all'inizio della prometafase potrebbero indicare fallimenti nel meccanismo di attivazione o reclutamento29 o quantità ridotte di MAD2 nella cellula17. Per distinguere tra queste due possibilità, si raccomanda vivamente di valutare i livelli di espressione della proteina MAD2 mediante Western blot 17. Quando si confrontano due o più trattamenti, è importante considerare che i tempi di maturazione meiotica e l'allineamento cromosomico potrebbero variare tra i trattamenti. Pertanto, in primo luogo, definire i tempi del ciclo cellulare per ciascun trattamento per confrontare correttamente i livelli di MAD2 e interpretare accuratamente i risultati. Una limitazione di questo metodo è che MAD2 è uno degli ultimi effettori della risposta SAC3. Pertanto, la valutazione di MAD2 non consente di individuare quale parte del meccanismo SAC è perturbata. Per valutare i meccanismi SAC, è possibile determinare il reclutamento di un altro componente SAC come MPS1, BUB1 e/o il complesso RZZ (Figura 3C). Un altro punto da considerare è che la fase di fissazione è critica. Questi test hanno utilizzato il 2% di PFA in 1x tampone PHEM, una fissazione che funziona per la rilevazione di proteine cinetocore in ovociti interi. Tuttavia, altri laboratori utilizzano una tecnica di diffusione cromosomica che è stata ampiamente descritta prima del30.

In sintesi, in questo articolo sono descritti tre saggi che forniscono informazioni critiche sulla capacità di una cellula di monitorare lo stato di attacco del microtubulo cinetocodoro-fuso per controllare accuratamente la segregazione cromosomica. Queste informazioni sono importanti per indagare su situazioni cellulari in cui il SAC può essere compromesso per ottenere informazioni su quale fase del checkpoint è perturbata. Poiché l'aneuploidia è una caratteristica comune nei gameti e nei tumori, questi strumenti si applicano a molti sistemi biologici.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Acknowledgments

Il finanziamento per questo progetto è stato fornito dal National Institutes of Health (R35GM136340 a KS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A4503
DAPI Life Technologies D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) Sigma D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 Life Technologies A10042
EVOS FL Auto Imaging System Life Technologies Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator Life Technologies Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated MatTek Corporation P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633 Life Technologies A21091
HEPES Sigma H3537
Human anti-ACA Antibodies Incorporated 15-234 Dilution 1/30
ImageJ NIH
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective Leica
MgSO4·7H20 Sigma M7774
Milrinone Sigma M4659
Na2HPO4 Sigma S2429
NaCl Sigma S5886
NaN3 Sigma S2002
Nocodazole Sigma M1404
Paraformaldhyde (PFA) Sigma P6148
PIPES Sigma P6757
Rabbit anti- MAD2 Biolegend 924601 Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine Cayman Chemical 10004412
Triton-X Sigma 274348
Tween-20 Sigma X100
Vectashield Vector laboratories H-1000

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Biologia dello sviluppo numero 187
Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo
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Aboelenain, M., Schindler, K., Blengini, C. S. Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (187), e64459, doi:10.3791/64459 (2022).

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