Summary
染色体分配の誤りは、卵母細胞に共通する特徴です。したがって、紡錘体アセンブリのチェックポイントを研究することは、健康な卵を生産するために必要なメカニズムについての重要な手がかりを与えます。本プロトコルは、マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性を評価するための3つの相補的アッセイを記載する。
Abstract
異数性は、ヒトの早期流産および妊娠不全を引き起こす主要な遺伝的異常である。異数性を引き起こす染色体分配のほとんどのエラーは、卵母細胞の減数分裂中に発生しますが、卵母細胞の減数分裂がエラーを起こしやすい理由はまだ完全には理解されていません。細胞分裂中、細胞は紡錘体アセンブリチェックポイント(SAC)を活性化することにより、染色体分配のエラーを防ぎます。この制御メカニズムは、動原体(KT)-微小管(MT)付着の検出と、紡錘体繊維によって発生する張力の検出に依存しています。KTが結合解除されると、SACが活性化され、細胞周期の進行が妨げられます。SACは最初にMPS1キナーゼによって活性化され、MAD1、MAD2、BUB3、およびBUBR1で構成される有糸分裂チェックポイント複合体(MCC)の動員と形成を引き起こします。次に、MCCは細胞質に拡散し、後期促進複合体/サイクロソーム(APC / C)アクチベーターであるCDC20を隔離します。KTが微小管に付着し、染色体が中期プレートに整列すると、SACがサイレンシングされ、CDC20が放出され、APC/Cが活性化され、サイクリンBとセクリンの分解が引き起こされ、後期発症が起こります。体細胞と比較して、卵母細胞のSACは、KTが付着していないにもかかわらず細胞が後期を迎えることができるため、それほど効果的ではありません。 SACがより寛容である理由と、この寛容性が卵母細胞の染色体分配エラーの原因の1つであるかどうかを理解することは、さらに調査する必要があります。本プロトコルは、マウス卵母細胞におけるSAC完全性を包括的に評価するための3つの技術を記載する。これらの技術には、ノコダゾールを使用してMTを解重合してSAC応答を評価すること、セクリン破壊の速度論を追跡することによってSACサイレンシングを追跡すること、免疫蛍光によるKTへのMAD2の動員を評価することが含まれます。これらの技術を組み合わせることで、SACの完全性を完全に評価することにより、健康な卵子を生産するために必要なメカニズムを調査します。
Introduction
染色体分配の誤りから生じる異数性は、早期流産の主な原因であり、減数分裂の間違いと強く関連しています1。減数分裂は、DNA複製ステップを介さずに2ラウンドの細胞分裂で構成されるため、有糸分裂とは異なります。減数分裂Iでは、相同染色体は分離し、姉妹染色分体は一緒に残ります。卵母細胞では、このステップはエラーが発生しやすく、異数性卵の生成につながります2。
染色体分配エラーを防ぐために、ほとんどの細胞タイプは、スピンドルアセンブリチェックポイント(SAC)と呼ばれる細胞周期を一時停止する監視メカニズムを活性化します。このメカニズムは、動原体(KT)-微小管(MT)の付着を感知し、染色体が双極性に配向すると張力が発生します3。接続されていない動原体は、SACのマスターレギュレーターであるMPS1の動原体3,4への採用から始まるSAC応答をトリガーします。MPS1は、他のSACコンポーネントのリクルートを開始し、有糸分裂チェックポイント複合体(MCC)を形成するためのプラットフォームとして機能します。MCCは、MAD1、MAD2、BUB3、およびBUBR1で構成され、細胞質に拡散し、アクチベーターCDC20を隔離することによりAPC/C活性化を阻害します。すべての動原体がMTに安定して結合し、染色体が中期プレートに整列すると、SACがサイレンシングされ、MCCがCDC20を分解して放出し、APC/C活性化が可能になります。活性APC / Cは、後期発症を引き起こす2つの重要なステップであるセクリンとサイクリンBを分解します5,6。体細胞では、SACは単一の未付着の動原体によって活性化され、細胞周期停止を誘導するのに十分であるため、厳格です6。しかしながら、卵母細胞減数分裂の間、SACはより寛容であり、卵母細胞は1つ以上の未付着の動原体6、7、8、9、10で後期Iに入ることができる。SACが卵母細胞においてより寛容である理由を理解することは、この分野で進行中の焦点分野です。SAC活性化またはSACサイレンシングに欠陥を引き起こすメカニズムは、染色体分配のエラーまたは長期の細胞周期停止および細胞死につながる可能性があります。したがって、卵母細胞のSAC完全性を維持するメカニズムを評価することは、健康な倍数体の卵を形成するプロセスを理解するために重要です。
このプロトコルは、チェックポイントのさまざまな重要なステップを調べることにより、マウス卵母細胞減数分裂におけるSAC完全性を包括的に評価する技術について説明しています。まず、SAC活性化誘導後のSAC応答の評価について説明する。この活性化は、MTs11を解重合する薬物であるノコダゾールを使用して、付着していない動原体を生成することによって達成されます。第二に、SACサイレンシングをモニタリングする方法は、卵母細胞成熟中のSecurin分解のダイナミクスを追跡することによって説明されています。最後に、免疫蛍光ベースのアッセイを使用して、MCC成分の1つであるMAD2の動原体への動員を測定します。一緒に、これらのアッセイは、卵母細胞の減数分裂成熟中のSACの完全性を包括的に評価します。
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Protocol
これらのプロトコルで使用されたすべてのマウスは、ラトガース大学施設動物使用およびケア委員会(プロトコル201702497)および国立衛生研究所のガイドラインに従って飼育および飼育されました。これらの規制機関は、動物実験を含むすべての実験手順を承認しました。本研究で使用した全てのマウスは、6〜8週齢のCF-1雌であった。
1. 実験準備
- SAC評価を開始する前に、以前に発表された第12報告書に従ってマウス卵母細胞を採取してください。採取した卵母細胞を3つの均等なサイズのグループに分け、減数分裂の再開を避けるために、2.5 μMミルリノンを含むChatot、Ziomek、およびBavister(CZB)培養培地( 材料の表を参照)に保管します13。
注: CZB 組成: 81.6 mM NaCl;4.8 ミリリットル KCl;1.2 mM KH2PO4;1.2 mM MgSO4-7H 2O;0.27 mMピルビン酸;1.7 mM CaCl2;30.8 mM DL-乳酸;7 mMタウリン;0.1 mM EDTA;25 mM NaHCO3;ゲンタマイシン;および0.3%のBSA。 - 前述のようにマイクロインジェクション用のcRNAを調製する12、14。マウス胚小胞卵母細胞からクローニングしたcDNAからマウスSecurin遺伝子を増幅し、続いてGfp配列15、16を含むpMDL2ベクターにサブクローニングする。
- セクリン-Gfp cRNAを調製するには、プラスミドをNde I消化で直鎖化します。T3 RNAポリメラーゼを使用し、cRNA16を精製することにより、in vitro転写を実行します。
注:cRNAは、使用するまで-80°Cで2〜3 μLのアリコートで保存してください。
- セクリン-Gfp cRNAを調製するには、プラスミドをNde I消化で直鎖化します。T3 RNAポリメラーゼを使用し、cRNA16を精製することにより、in vitro転写を実行します。
2.ノコダゾール治療とライブイメージング
- 5 μMのノコダゾール(NOC)を含む培地(CZB)1 mL、5 μMのNOCと0.5 μMのリバーシン(NOC + REV)を含む1 mLの培地、および対照としてジメチルスルホキシド(DMSO)を含む1 mLの培地(1:2000)を準備します( 材料表を参照)。
- 卵母細胞の成熟とライブイメージングには、インキュベーター内で37°C、5%CO2、湿度80%で予熱した96ウェルプレートを使用します。最初のウェルに、150 μLのコントロールDMSO処理を負荷します。2番目のウェルに、150 μLのNOC処理を負荷します。そして3番目のウェルに、150μLのNOC + REV処理を負荷します。必要になるまで、プレートを上記と同じ条件下でインキュベーターに保管してください。
注:96ウェルプレートでは、境界線の影が画像の品質を妨げるため、最初の行と最初の列の使用は避けてください。 - 減数分裂成熟を開始するには、ミルリノンを除去します。30倍から64倍の倍率を使用して実体顕微鏡下で卵母細胞を観察しながら、DMSOを含む100 μLのミリノンフリー培養培地を6滴ずつ卵母細胞を順次移して培地からミリノンを洗い流し、手動または口操作のピペットを使用して96ウェルプレートの対応するウェルに入れます。
- 手または口で操作するピペットを使用して卵母細胞を拾い上げ、次の滴に送達して卵母細胞を数え、卵母細胞を失うことを防ぎます。卵母細胞は単一で、大きく(直径~80μm)、丸い細胞です。核は細胞の中心にボタンのように現れ、膜と透明帯が卵母細胞を囲みます。
注:卵母細胞を滴の間で移動させ、可能な限り少ない量の液体を移動します。これにより、培地からミルリノンを最適に除去することができます。卵母細胞が減数分裂を再開できない場合は、ミルリノンが効果的に除去されなかった可能性があります。
- 手または口で操作するピペットを使用して卵母細胞を拾い上げ、次の滴に送達して卵母細胞を数え、卵母細胞を失うことを防ぎます。卵母細胞は単一で、大きく(直径~80μm)、丸い細胞です。核は細胞の中心にボタンのように現れ、膜と透明帯が卵母細胞を囲みます。
- NOCおよびNOC + REV処理に対して同じプロセス(ステップ2.3)を繰り返します。
- 37°C、5%CO2、湿度80%の条件下で制御された環境を備えたインキュベーターチャンバーを備えた明視野顕微鏡を使用して卵母細胞を画像化します。卵母細胞の中央面で20分間隔で24時間画像を撮影します。
- 非対称の細胞質分裂を経る細胞を特定することにより、極体(PB)を押し出す卵母細胞の数を定量化します。その結果、卵の隣と共有透明帯内に小さな細胞(PB)ができます。イメージングソフトウェアを使用して画像を表示します(ImageJ、 材料表を参照)。
- 画像配列を画像解析ソフトウェアにインポートし、1つ以上の細胞が非対称の細胞質分裂を経験するまでフレームを進めます。全卵母細胞17のうちPBを押し出す卵母細胞の割合を算出する。
3. 減数分裂成熟期のセクリン-gfp分解パターンのモニタリング
- 3 μLの セクリン-Gfp cRNAを19,283 x g で4°Cで30分間遠心分離(ステップ1.2)します 18.
注意: マイクロインジェクション中に針の詰まりを引き起こす可能性のある不純物の負荷を避けるために、上清を使用してください。 - 以下の段階的な卵母細胞マイクロインジェクションは、参考文献12に広く記載されている。ステップ1.2で調製した100 ng/μLのSecurin-gfp cRNAを前期I-停止卵母細胞にマイクロインジェクションします。
- マイクロインジェクション後、卵母細胞をCO2 インキュベーター内で少なくとも3時間回収してRNAを翻訳させます。自動マルチチャンネル蛍光イメージングシステム( 材料表参照)で卵母細胞を観察して発現を確認し、GFPシグナルを表示します。
- ステップ2.2で説明したように、5 μMのノコダゾールの有無にかかわらず150 μLの培養培地、および0.5 μMのリバーシンを含む150 μLの培養培地を96ウェルプレートの3つの異なるウェルにロードします。
- マイクロインジェクションした卵母細胞を6滴のミリノンフリー培養培地で洗浄し、卵母細胞の1/3を各処理に移します。
- ミルリノン洗浄の約3時間後に、卵母細胞が減数分裂を再開するまで、5%のCO2 および80%の湿度で、プレートを37°Cのインキュベーターに保ちます。
注:倍率が30x〜64xの実体顕微鏡を使用して、減数分裂再開の特徴として核エンベロープの破壊を評価します。 - ステップ2.6に記載されるようにインキュベーターチャンバーを備えた蛍光顕微鏡を使用して卵母細胞成熟の画像を記録する。明視野設定を使用して、ウェル内の卵母細胞を見つけます。488フィルターを使用してSecurin-gfpシグナルを検出し、細胞が過剰に露出しないように蛍光強度を調整します。
- イメージングシステムが自動化されている場合は、各ウェル内の卵母細胞の位置を保存します。Securin-gfpは細胞質に均等に分布しているため、卵母細胞の中央面で20分間隔で24時間画像を撮影します。卵母細胞のグループを1枚の写真に収めるには、10倍などの低倍率の対物レンズを使用します。
- 画像解析ソフトウェアを使用して、Securin-gfp破壊を定量化します。GFP チャネルの画像を開きます。時点 1 から開始します。好みの解析ソフトウェアでは、選択ツールまたは形状ツールを使用して各卵母細胞をマークし、各細胞の関心領域(ROI)を生成します。
- 同じROIを使用して、後で減算する背景領域を選択します。各ROIのGFPピクセル強度を測定します。
- ステップ3.8で生成された各卵母細胞のROIを使用して、すべての時点でGFP強度を測定します。
注意: 一部のソフトウェアプログラムでは、[分析]タブで測定機能を選択できます。- 次に、次の時間枠に進み、このプロセスを繰り返して、各時間枠におけるGFPの強度を測定します。最後に、各GFP値に対して、ステップ3.8で選択したバックグラウンドでのROIの測定値を差し引きます。この分析により、各時点での各卵母細胞のSecurin-gfp強度の値が得られます。
- セクリン破壊のパターンから異なるパラメータを抽出する:(a)セクリン-gfp分解が始まった時間。これは、SAC サイレンシングがいつ開始されたかを示します。(b)セクリン-gfp最小シグナルの時間。これは、SACサイレンシングが閾値レベルを下回ったときに、高いAPC/C活性化と完全なSecurin-GFP分解を可能にすることを示します。(c) セクリン-gfp破壊率19.これは、SAC活性がAPC/C活性化およびSecurin-GFP分解の閾値レベルを下回る速さを示します。
4. 減数分裂成熟期の免疫蛍光による動原体におけるMAD2の動員
注:卵母細胞の採取と成熟については、以前に発表されたレポート12を参照してください。
- 卵母細胞を3つのグループに分けます。卵母細胞の各グループを100 μL滴のミリノンフリー培養培地に移します。滴を鉱油で覆い、インキュベーター(37°C、5%CO2、湿度80%)に3時間、5時間、7時間入れて、それぞれ前中期初期I期、後期前中期I期、中期I期に到達させます。
注意: 減数分裂成熟の定期的なタイミングに影響を与えるインキュベーターから同じ皿を数回取り出さないように、各時点を異なる皿に入れます。 - 割り当てられた時点で、前述の9ウェルガラス皿を使用して、1x PHEMバッファー中の2%PFAの500 μL滴に卵母細胞を室温で20分間移し、卵母細胞を固定します20。次に、細胞を500 μLドロップのブロッキング溶液(PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% NaN3)を含むクリーンウェルに移します。
注:PHEM組成:60 mMパイプ;25 mM HEPES;10 mM EGTA;および2mMマグネシウムCl2。
注:この時点で停止し、免疫蛍光を完了するのに都合の良い時間まで、4°Cの9ウェルプレートのブロッキング溶液に卵母細胞を保存することができます。 - MAD2検出を継続するには、500 μL滴の透過処理溶液(PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN3)を含むクリーンウェルに卵母細胞を移します。室温で20分間インキュベートし、次いで細胞をブロッキング溶液の新しいウェルに移し、10分間インキュベートする。
- 残りの免疫蛍光ステップでは、前述のようにくぼみのある96ウェルディッシュ蓋を使用します20。光への露出と蒸発を避けるために、加湿された暗いチャンバーを使用してください。卵母細胞を抗MAD2抗体(1:1000、ウサギ)および抗セントロメア抗体(ACA)(1:30、ヒト)を含む30 μL滴のブロッキング溶液に移し( 材料の表を参照)、室温で2時間インキュベートします。
注:96ウェルディッシュの蓋は、複数のタンパク質とグループを同時に処理するためのスペースを確保します。 - 過剰な一次抗体を洗浄するには、細胞を0.5%トリトンを添加した1x PHEMバッファーの30 μL滴に移し、加湿チャンバーで10分間インキュベートします。この手順をさらに 2 回繰り返します。
- 4回目の洗浄を行い、細胞を0.5%1xトリトンを含まない1x PHEMバッファーの30 μL滴に移し、10分間インキュベートします。
- 抗ヒト-633(1:200)や抗ウサギ-568(1:200)などの二次抗体を含むブロッキング溶液30 μL滴に細胞を移し( 材料の表を参照)、室温で1時間インキュベートします。
注:蛍光色素の組み合わせは、顕微鏡レーザーまたはフィルターに基づいて選択してください。 - 過剰な二次抗体を洗浄するには、手順4.5〜4.6を繰り返します。
- 細胞を顕微鏡スライドにマウントするには、DAPI(0.1 mg/mL)を含む10 μL滴の封入培地に細胞を移します( 材料の表を参照)。カバーガラスの各角にワセリンの小さなドットを追加し、それらをマウントメディアドロップの上に慎重に置き、ゆっくりと押して分散させます。透明なマニキュアを使用して、カバーガラスをスライドにシールします。実装プロセスの詳細な説明については、参考文献20を参照してください。
- 40倍または63倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡( 材料表を参照)を使用した画像運動原体。ACAシグナルを使用して、染色体領域全体のイメージングを可能にするz範囲を決定します。
メモ: 一部のイメージングシステムでは、4.0 の光学ズームと 0.5 μm の z ステップサイズを使用できます。これらのパラメータはシステムによって異なる場合があり、最適化が必要になります。 - 画像解析ソフトを用いて動原体におけるMAD2強度を解析します。Z スタックの最大投影を作成し、チャネルを分割します。
- まず、ACAチャネルを選択してACAチャネルを使用してマスクを作成し、すべての動原体信号を識別するしきい値を確立します。 編集 タブに移動し、選択を作成します。次に、この選択でROIを作成します。
- MAD2チャンネルを選択し、手順4.12で作成した選択範囲を取り込みます。MAD2信号によりよく適応するしきい値方式を選択します。強度を測定します。
注:対照処理で閾値法を選択し、異なる処理を分析するときは一定に保ちます。 - 相対ピクセル強度の計算を行うには、各細胞の強度を実験中のWT卵母細胞の平均強度で割ります。
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Representative Results
ノコダゾール処理によるSAC応答性の評価
この実験の目的は、SACの活性化と強度を評価することです。ノコダゾールを使用して紡錘体微小管を解重合することにより、すべての動原体が付着しなくなり、SACを介した細胞周期停止を引き起こします。本画像化システムでは、DMSO処理されたコントロール卵母細胞は、ミルリノンから放出されてから約14時間後に極性体を押し出した(図1、上パネル)。SAC活性化と一致して、ノコダゾール処理された卵母細胞は中期Iで停止し、極性体を押し出さなかった(図1、中央のパネル)。このアッセイがSAC活性の信頼できる指標であることを実証するために、MPS1阻害剤であるリバーシンを使用してSAC活性化を予防しました21。SACが活性化できない場合、卵母細胞はKT-MTアタッチメントがないにもかかわらず極性体を押し出しました(図1、下のパネル)。SACが弱体化した卵母細胞は、いくつかの卵母細胞が停止し、いくつかの極体が押し出されるなど、さまざまな結果をもたらします17。ノコダゾールの有無にかかわらずマウス卵母細胞を成熟させるこの方法は、SAC活性化に挑戦するための最初の簡単なステップとして使用できます。
減数分裂成熟期におけるセクリン-gfp分解のパターン
SACの満足とサイレンシングに続く下流のイベントの1つは、APC / Cの活性化であり、Securin分解につながります22。したがって、セクリン分解のパターンの評価はSAC機能の直接読み出しであり、ノコダゾールの結果がSAC依存性の摂動であったかどうかを判断するために実施する必要があります。.このアッセイには、卵母細胞へのSecurin-gfpの異所性発現とその後の生細胞イメージングが含まれます。Securin分解に続く曲線を作成した後、3つのパラメータを決定することができます:(a)分解の開始時間(サイレンシング);(b)最低セクリンレベルに達するのにかかる時間。(c)劣化速度(図2A)。コントロールのDMSO処理卵母細胞では、Securin-gfp強度はミルリノンウォッシュアウト後~10時間で減少し始めます(図2B、C)。SAC活性化剤ノコダゾールの存在下で卵母細胞を成熟させると、Securin-gfpレベルは減数分裂成熟の全期間にわたって安定していた。対照的に、リバーシン処理でSAC活性化を防ぐと、セクリン-gfpパターンが加速しました。分解はミルリノンウォッシュアウト後~4時間で始まり、SAC阻害と一致しました(図2B、C)。
減数分裂成熟期の免疫蛍光による動原体へのMAD2の動員
データがSAC機能の欠陥をサポートしている場合、次のステップは主要なSACメディエーターの採用を評価することです。SACは、未付着の動原体に応答して活性化される。動原体は、紡錘体が構築されている前中期初期に付着していないことが多く、不適切な付着は矯正のために不安定になります。動原体が微小管に安定して付着すると、SACはサイレンシングされ、後期発症が可能になります22。SAC応答の初期段階は、MCC形成のプラットフォームとして機能する動原体への一連のタンパク質の動員です22,23。これらのSAC成分の動原体への局在化の評価は、SAC応答を評価するための別の戦略である。たとえば、MCC コンポーネントである MAD2 の評価は一般的なアプローチです。初期前中期I期、後期前中期I期、および中期I期に成熟した卵母細胞のセントロメア(ACA)およびMAD2を検出する共焦点顕微鏡画像が使用できる(図3A)。SAC信号の強度を評価するには、KT局在MAD2ピクセル強度を定量化します(図3B)。KTへの有意なレベルのMAD2リクルートメントは、ほとんどのKTがMTに結合していない初期前中期Iで発生します。MAD2のレベルは、後期中期に減少し、すべてのKTがMTに安定して結合した中期Iではほとんど存在しませんでした(図3A、B)。したがって、この方法は、他の2つのアッセイと組み合わせた場合のSAC応答を評価することができる。
図1:ノコダゾールによるSAC活性化の評価。 DMSO(コントロール)、5 μMノコダゾール(NOC)、または5 μMノコダゾール+ 0.5 μMリバーシン(NOC + REV)の存在下で成熟した卵母細胞のタイムラプスイメージングからの代表的な画像。赤い四角は、極体押し出しの時間枠を示します。2つの独立した実験を分析した。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:セクリン-gfp分解パターン。 (A)調べることができる3つのパラメータを持つSecurin-gfp分解曲線の模式図。(B)Securin-gfp cRNAをマイクロインジェクションし、DMSO(コントロール)、5 μMノコダゾール、または0.5 μMリバーシンの存在下で成熟させた卵母細胞のタイムラプスからの代表的な画像。赤い四角は、極体押し出しの時間枠を示します。スケールバー = 50 μm。 (C)Securin-gfp cRNAをマイクロインジェクションし、DMSO(青い丸)、5 μMのノコダゾール(ピンクの四角)、または0.5 μMのリバーシン(黒い三角形)の存在下で成熟させた卵母細胞の代表的なセクリン-gfp分解曲線。エラーバー=標準エラー。#治療あたりの卵母細胞数:DMSO = 10;国内オリンピック委員会 = 15;参照= 5。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:卵母細胞減数分裂成熟時の動原体へのMAD2動員 。 (A)前中期I期初期、後期前中期I期、中期I期に成熟した卵母細胞の代表的な共焦点画像を免疫染色してMAD2(灰色)および動原体(ACA)(赤)を検出した。スケールバー= 10 μm;挿入図:2μm。 (B)(A)の画像からのMAD2の相対強度の定量化。エラーバー=標準エラー。(C)未付着の動原体およびSAC活性化経路の概略図。#時点あたりの卵母細胞数:初期前中期I = 23;後期前中期I = 13;中期I = 18。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
紡錘体アセンブリチェックポイントは、染色体分配エラーを防ぐために設計された細胞分裂中の重要な制御メカニズムです。これにより、セルは不適切なKT-MTアタッチメントを修正するのに十分な時間を確保できます。卵母細胞の減数分裂はエラーが発生しやすいプロセスであり、染色体の誤分離のほとんどは減数分裂I中に発生し、ヒトの早期流産と不妊の主な原因である異数性卵の生成につながります1,24。女性の減数分裂に誤りがある理由を解きほぐすために、いくつかの仮説がテストされています。考えられる理由の1つは、SACが体細胞よりも効率が低く、1つ以上のKTの誤付着による後期発症を可能にすることです9、10、25。したがって、卵母細胞におけるSACメカニズムの包括的な研究と主要な調節因子の特定は、倍数体卵を生成するプロセスを理解するために必要です。
本プロトコルは、SAC完全性の異なる側面を評価するための3つの技術、すなわち活性化およびサイレンシングを記述する。これらのアッセイのそれぞれは解釈にいくつかの制限があるため、卵母細胞におけるSAC機能を特徴付けるには、1つだけを実施するだけでは不十分です。このため、これらの方法を組み合わせて、研究におけるSAC完全性を評価することが提案されている。
ノコダゾールを使用したSAC活性化の評価は、簡単で高速であるため簡単です。ただし、結果を解釈する際に考慮すべき重要な点がいくつかあります。まず、研究者はノコダゾールの濃度を確立して、紡錘体の微小管を完全に解重合し、 未付着の動原体を生成し、SACを活性化します。微小管の正常な喪失は、卵母細胞を固定し、免疫蛍光ベースの顕微鏡20を介してチューブリンを検出することによって決定することができる。この技術のもう一つの重要な制限は、このアッセイの読み出し、すなわち第1極体(PBE)の押し出しである。PBE障害は、研究対象のタンパク質が細胞質分裂や離脱などの後期に影響を与える場合、結果もPBEの障害になるため、必ずしもSAC機能の十分な証拠ではない可能性があります。したがって、SACの欠陥を評価するための最初のステップとしてノコダゾール治療を使用しますが、その後、説明されている他の手法と提携します。
KTがMTに安定に結合し、染色体が中期プレートに整列すると、SACがサイレンシングされ、APC/Cが活性化され、セクリンとサイクリンBが分解されます。したがって、セクリンまたはサイクリンB分解のパターンを追跡することは、SACサイレンシング25、26、27の指標として一般的に使用される。分解パターンの変更は、細胞周期の加速または遅延に関する情報を提供します。加速は弱いSACを示唆し、遅延はSACを満たす欠陥を示唆します。この実験の制限は、マイクロインジェクションリグと特殊なスキルセットが必要なことです。マイクロインジェクションに使用されるSecurin-gfp cRNAの適切な濃度の滴定は、多すぎると細胞周期を阻止するので重要であることに留意されたい28。
最後に、動原体へのMAD2の動員の評価は、SAC活性化の指標および尺度である。減数分裂I中のMAD2リクルートメントのパターンは、初期前中期Iの動原体で最大レベルのMAD2があり、KTが付着するにつれてレベルが低下します。Securin分解パターンと同様に、MAD2の動員の動力の動量の変化は、SACサイレンシングの加速または遅延を示している可能性があります。初期前中期におけるMAD2動員の欠陥は、活性化または動員のメカニズムの失敗29 、または細胞17におけるMAD2の量の減少を示している可能性がある。これら2つの可能性を区別するために、ウェスタンブロットによってMAD2タンパク質発現のレベルを評価することが強く推奨されます 17。2つ以上の治療を比較する場合、減数分裂の成熟と染色体の整列のタイミングは治療によって異なる可能性があることを考慮することが重要です。したがって、まず、各治療の細胞周期タイミングを定義して、MAD2レベルを適切に比較し、結果を正確に解釈します。この方法の1つの制限は、MAD2がSAC応答3の最後のエフェクターの1つであることです。したがって、MAD2を評価しても、SACメカニズムのどの部分が摂動されているかを特定することはできません。SACメカニズムを評価するために、MPS1、BUB1、および/またはRZZ複合体などの別のSACコンポーネントのリクルートメントを決定できます(図3C)。考慮すべきもう一つのポイントは、固定ステップが重要であるということです。これらのアッセイでは、1x PHEMバッファーに2%PFAを使用し、マウント卵母細胞全体の動原体タンパク質の検出に有効な固定体を使用しました。ただし、他の研究所では、30年以前に広く説明されていた染色体拡散技術を使用しています。
要約すると、染色体分配を正確に制御するために動毛紡錘体微小管付着状態を監視する細胞の能力に関する重要な情報を提供する3つのアッセイがこの記事で説明されています。この情報は、SACが侵害される可能性のあるセルラー状況を調査して、チェックポイントのどのステップが乱されているかについての洞察を得るために重要です。異数性は配偶子や癌に共通する特徴であるため、これらのツールは多くの生物学的システムに適用されます。
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Disclosures
著者は開示する矛盾はありません。
Acknowledgments
このプロジェクトの資金は、国立衛生研究所(R35GM136340からKS)によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
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