Summary
염색체 분리의 오류는 난 모세포에서 공통적 인 특징입니다. 따라서 스핀들 어셈블리 체크 포인트를 연구하면 건강한 알을 생산하는 데 필요한 메커니즘에 대한 중요한 단서를 얻을 수 있습니다. 본 프로토콜은 마우스 난모세포에서 스핀들 어셈블리 체크포인트 무결성을 평가하기 위한 세 가지 보완 분석을 설명합니다.
Abstract
이배체는 인간의 조기 유산과 임신 실패를 유발하는 주요 유전적 이상입니다. 이수성을 유발하는 염색체 분리의 대부분의 오류는 난 모세포에서 감수 분열 중에 발생하지만 난 모세포 감수 분열이 오류가 발생하기 쉬운 이유는 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 세포 분열 중에 세포는 스핀들 어셈블리 체크포인트(SAC)를 활성화하여 염색체 분리의 오류를 방지합니다. 이 제어 메커니즘은 키네토코어(KT)-미세소관(MT) 부착물을 감지하고 스핀들 섬유에서 발생하는 장력을 감지하는 데 의존합니다. KT가 부착되지 않으면 SAC가 활성화되어 세포주기 진행을 방지합니다. SAC는 먼저 MPS1 키나아제에 의해 활성화되며, 이는 MAD1, MAD2, BUB3 및 BUBR1로 구성된 유사분열 체크포인트 복합체(MCC)의 모집 및 형성을 유발합니다. 그런 다음 MCC는 세포질로 확산되어 아나페이즈 촉진 복합체/사이클로솜(APC/C) 활성제인 CDC20을 격리합니다. KT가 미세소관에 부착되고 염색체가 중기 판에 정렬되면 SAC가 침묵하고 CDC20이 방출되며 APC/C가 활성화되어 사이클린 B와 세큐린의 분해를 유발하여 후기가 시작됩니다. 체세포와 비교할 때, 난 모세포의 SAC는 세포가 부착되지 않은 KT를 가지고 있음에도 불구하고 퇴보를 겪을 수 있기 때문에 효과적이지 않습니다. SAC가 더 관대 한 이유와이 방임성이 난 모세포에서 염색체 분리 오류의 원인 중 하나인지 이해하려면 여전히 추가 조사가 필요합니다. 본 프로토콜은 마우스 난모세포에서 SAC 무결성을 종합적으로 평가하기 위한 세 가지 기술을 기술한다. 이러한 기술에는 노코다졸을 사용하여 MT를 해중합하여 SAC 반응을 평가하고, Securin 파괴의 동역학에 따라 SAC 침묵을 추적하고, 면역형광법에 의한 KT로의 MAD2 모집 평가가 포함됩니다. 이러한 기술을 함께 조사하여 SAC 무결성에 대한 완전한 평가를 제공하여 건강한 난자를 생산하는 데 필요한 메커니즘을 조사합니다.
Introduction
염색체 분리의 오류로 인해 발생하는 이배체는 조기 유산의 주요 원인이며 감수 분열1의 실수와 밀접한 관련이 있습니다. 감수 분열은 개입 DNA 복제 단계없이 두 차례의 세포 분열로 구성되기 때문에 유사 분열과 구별됩니다. 감수 분열 I에서는 상동 염색체가 분리되고 자매 염색분체는 함께 유지됩니다. 난 모세포에서이 단계는 오류가 발생하기 쉽고 이수성 알 생산2.
염색체 분리 오류를 방지하기 위해 대부분의 세포 유형은 스핀들 어셈블리 체크포인트(SAC)라고 하는 세포 주기를 일시 중지하는 감시 메커니즘을 활성화합니다. 이 메커니즘은 키네토코어(KT)-미세소관(MT) 부착물을 감지하고 염색체가 양극성 방식으로 배향될 때 장력이 생성됩니다3. 부착되지 않은 키네토코어는 SAC의 마스터 레귤레이터인 MPS1을 키네토코레스 3,4에 모집하는 것으로 시작하는 SAC 반응을 트리거합니다. MPS1은 유사분열 체크포인트 복합체(MCC)를 형성하는 플랫폼 역할을 하는 다른 SAC 구성 요소의 모집을 시작합니다. MAD1, MAD2, BUB3 및 BUBR1로 구성된 MCC는 세포질로 확산되고 활성제 CDC20을 격리하여 APC/C 활성화를 억제합니다. 모든 키네토코레가 MT에 안정적으로 부착되고 염색체가 중기 플레이트에서 정렬되면 SAC가 침묵되고 MCC가 CDC20을 분해 및 방출하여 APC/C 활성화를 허용합니다. 활성 APC/C는 아나페이즈 발병 5,6을 유발하는 두 가지 주요 단계인 Securin과 Cyclin B를 분해합니다. 체세포에서 SAC는 부착되지 않은 단일 키네토코어에 의해 활성화되고 세포 주기 정지를 유도하기에 충분하기 때문에 엄격합니다6. 그러나, 난 모세포 감수 분열 동안, SAC는보다 관대하며, 난 모세포는 하나 이상의 부착되지 않은 키네 토코 레스 6,7,8,9,10으로 아나 페이즈 I에 들어갈 수있다. SAC가 난 모세포에서 더 관대 한 이유를 이해하는 것은이 분야에서 지속적인 초점 영역입니다. SAC 활성화 또는 SAC 침묵에 결함을 일으키는 메커니즘은 염색체 분리 또는 장기간의 세포주기 정지 및 세포 사멸에 오류를 초래할 수 있습니다. 따라서 난 모세포에서 SAC 무결성을 유지하는 메커니즘을 평가하는 것은 건강한 유배체 난자를 형성하는 과정을 이해하는 데 중요합니다.
이 프로토콜은 체크포인트의 여러 중요한 단계를 검사하여 마우스 난모세포 감수분열에서 SAC 무결성을 종합적으로 평가하는 기술을 설명합니다. 먼저, SAC 활성화 유도 후의 SAC 반응의 평가에 대해 설명한다. 이 활성화는MTs 11을 해중합하는 약물 인 노코다졸을 사용하여 부착되지 않은 키네토 코를 생성함으로써 달성됩니다. 둘째, SAC 침묵을 모니터링하는 방법은 난 모세포 성숙 동안 Securin 분해의 역학을 추적함으로써 설명됩니다. 마지막으로, 면역형광법 기반 분석을 사용하여 MCC 구성 요소 중 하나인 MAD2를 키네토코어에 동원합니다. 함께, 이러한 분석은 난 모세포 감수 분열 성숙 동안 SAC 무결성을 종합적으로 평가합니다.
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Protocol
이 프로토콜에 사용 된 모든 마우스는 Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (Protocol 201702497) 및 National Institutes of Health 지침에 따라 사육되고 사육되었습니다. 이 규제 기관은 동물 연구와 관련된 모든 실험 절차를 승인했습니다. 본 연구에 사용된 모든 마우스는 6-8주령의 CF-1 암컷이었다.
1. 실험 준비
- SAC 평가를 시작하기 전에, 이전에 공개된 보고서12에 따라 마우스 난모세포를 수집한다. 수집된 난모세포를 3개의 균일한 크기의 그룹으로 나누고 감수 분열 재개를 피하기 위해 2.5μM 밀리논(재료 표 참조)을 포함하는 Chatot, Ziomek 및 Bavister(CZB) 배양 배지에 보관합니다.
참고: CZB 조성: 81.6 mM NaCL; 4.8 mM KCl; 1.2 mMKH2PO4; 1.2 mM MgSO4-7H2O; 0.27 mM 피루브산; 1.7 mMCaCl2; 30.8 mM DL- 락트산; 7 mM 타우린; 0.1 mM EDTA; 25 mM NaHCO3; 겐타마이신; 및 0.3% BSA. - 앞서 설명한 바와 같이 미세주입을 위한 cRNA를 준비한다12,14. 마우스 배아 소포 난 모세포에서 클로닝 된 cDNA로부터 마우스 Securin 유전자를 증폭 한 다음, Gfp 서열15,16을 포함하는 pMDL2 벡터로 서브 클로닝한다.
- Securin-Gfp cRNA를 제조하기 위해, Nde I 소화로 플라스미드를 선형화한다. T3 RNA 중합효소를 사용하여 시험관내 전사를 수행하고 cRNA16을 정제한다.
참고: cRNA를 사용할 때까지 -80°C에서 2-3μL의 분취량으로 보관하십시오.
- Securin-Gfp cRNA를 제조하기 위해, Nde I 소화로 플라스미드를 선형화한다. T3 RNA 중합효소를 사용하여 시험관내 전사를 수행하고 cRNA16을 정제한다.
2. 노코다졸 치료 및 라이브 이미징
- 5μM 노코다졸(NOC)이 포함된 배양 배지(CZB) 1mL, NOC 5μC와 0.5μM 리버신(NOC + REV)이 포함된 배양 배지 1mL, 디메틸설폭사이드(DMSO)(1:2000)를 대조군으로 하는 배양 배지 1mL를 준비합니다( 재료 표 참조).
- 난모세포 성숙 및 라이브 이미징을 위해 37°C, 5%CO2 및 80% 습도의 인큐베이터에서 예열된 96웰 플레이트를 사용합니다. 제1 웰에서, 대조군 DMSO 처리된 150 μL를 로딩하고; 두 번째 웰에서 150μL의 NOC 처리를 로드합니다. 세 번째 웰에서 150μL의 NOC + REV 처리를 로드합니다. 필요할 때까지 위와 동일한 조건에서 플레이트를 인큐베이터에 보관하십시오.
참고: 96웰 플레이트에서는 테두리의 그림자가 이미지 품질을 방해하므로 첫 번째 행과 첫 번째 열을 사용하지 마십시오. - 감수 분열 성숙을 시작하려면 밀리 논을 제거하십시오. 30x-64x 사이의 배율을 사용하여 실체 현미경으로 난모세포를 관찰하는 동안 DMSO가 포함된 밀리논이 없는 배양 배지 100μL 6방울을 통해 난모세포를 순차적으로 옮겨 배지에서 밀리논을 씻어내고 수동 또는 구강 작동식 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 해당 웰에 넣습니다.
- 손 또는 입으로 작동하는 피펫을 사용하여 난모세포를 집어 들고 손실이 없도록 다음 방울로 전달하여 난모세포를 세십시오. 난 모세포는 단일, 큰 (직경 ~ 80 μm) 및 둥근 세포입니다. 핵은 세포 중앙의 버튼처럼 보이고 막과 조내 펠루시다가 난 모세포를 둘러 쌉니다.
알림: 가능한 한 최소한의 액체를 이동하면서 난 모세포를 방울 사이로 옮깁니다. 이를 통해 배양 배지에서 밀리 논을 최적으로 제거 할 수 있습니다. 난 모세포가 감수 분열을 재개하지 못하면 밀리 논이 효과적으로 제거되지 않았을 가능성이 있습니다.
- 손 또는 입으로 작동하는 피펫을 사용하여 난모세포를 집어 들고 손실이 없도록 다음 방울로 전달하여 난모세포를 세십시오. 난 모세포는 단일, 큰 (직경 ~ 80 μm) 및 둥근 세포입니다. 핵은 세포 중앙의 버튼처럼 보이고 막과 조내 펠루시다가 난 모세포를 둘러 쌉니다.
- NOC 및 NOC + REV 처리에 대해 동일한 과정(단계 2.3)을 반복합니다.
- 37°C, 5%CO2 및 80% 습도 조건에서 제어된 환경을 갖춘 인큐베이터 챔버가 장착된 명시야 현미경을 사용하여 난모세포를 이미지화합니다. 난모세포의 중간 평면에서 24시간 동안 20분 간격으로 이미지를 캡처합니다.
- 비대칭 세포질 분열을 거치는 세포를 식별하여 극성체(PB)를 돌출시키는 난모세포의 수를 정량화합니다. 결과는 계란 옆과 공유 구역 펠루시다 내에 작은 세포(PB)가 됩니다. 이미징 소프트웨어(ImageJ, 재료 표 참조)를 사용하여 이미지를 봅니다.
- 이미지 시퀀스를 이미지 분석 소프트웨어로 가져오고 하나 이상의 세포가 비대칭 세포질 분열을 겪을 때까지 프레임을 진행합니다. 전체 난모세포17의 PB를 압출하는 난모세포의 백분율을 계산한다.
3. 감수 분열 성숙 중 Securin-gfp 분해 패턴 모니터링
- 3 μL의 Securin-Gfp cRNA (단계 1.2)를 19,283 x g 에서 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리합니다18.
알림: 미세 주입 중에 바늘이 막힐 수 있는 불순물이 적재되지 않도록 상청액을 사용하십시오. - 참고자료12에 광범위하게 설명된 단계별 난모세포 미세주입을 따르십시오. 단계 1.2에서 제조된 100ng/μL의 Securin-gfp cRNA로 프로상 I-체포된 난모세포를 미세 주입합니다.
- 미세 주입 후, 난 모세포가 적어도 3 시간 동안 CO2 인큐베이터에서 RNA를 회수하고 번역하도록한다. GFP 신호를 보기 위해 자동화된 다중채널 형광 이미징 시스템( 재료 표 참조)에서 난모세포를 관찰하여 발현을 확인합니다.
- 단계 2.2에 설명된 대로 5μM의 노코다졸이 있거나 없는 배양 배지 150μL와 0.5μM의 리버신이 포함된 150μL의 배양 배지를 96웰 플레이트의 3개의 다른 웰에 로드합니다.
- 미세 주입된 난모세포를 밀리논이 없는 배양 배지 6방울을 통해 세척하고 난모세포의 1/3을 각 처리에 옮깁니다.
- 플레이트를 37 ° C, 5 % CO2 및 80 % 습도의 인큐베이터에 보관하여 난 모세포가 감수 분열을 재개 할 때까지 약 3 시간 후에 밀리 논 세척 후 3 시간 후에 보관하십시오.
참고: 배율이 30x-64x 사이인 실체현미경을 사용하여 감수 분열 재개의 특징으로 핵 포락선 파괴를 평가하십시오. - 단계 2.6에 설명된 대로 인큐베이터 챔버가 장착된 형광 현미경을 사용하여 난모세포 성숙의 이미지를 기록합니다. 명시야 설정을 사용하여 우물에서 난모세포를 찾습니다. 488 필터를 사용하여 Securin-gfp 신호를 감지하고 형광 강도를 조정하여 세포가 과도하게 노출되지 않도록 합니다.
- 이미징 시스템이 자동화 된 경우 각 웰에서 난 모세포의 위치를 저장하십시오. Securin-gfp는 세포질에 고르게 분포되어 있기 때문에 24시간 동안 20분 간격으로 난모세포의 중간 평면에서 이미지를 캡처합니다. 한 장의 사진에서 난모세포 그룹을 캡처하려면 10x와 같은 저배율 대물 렌즈를 사용하십시오.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 Securin-gfp 파괴를 정량화합니다. GFP 채널의 이미지를 엽니다. 시점 1에서 시작합니다. 선호하는 분석 소프트웨어에서 선택 또는 모양 도구를 사용하여 각 난 모세포를 표시하고 각 세포에 대한 관심 영역 (ROI)을 생성합니다.
- 동일한 ROI를 사용하여 나중에 뺄 배경 영역을 선택합니다. 각 ROI에서 GFP 픽셀 강도를 측정합니다.
- 단계 3.8에서 생성된 각 난모세포에 대한 ROI를 사용하여, 모든 시점에서의 GFP 강도를 측정한다.
참고: 일부 소프트웨어 프로그램에서는 "분석" 탭에서 측정 기능을 선택할 수 있습니다.- 그런 다음 다음 시간 프레임으로 진행하고 이 과정을 반복하여 각 시간 프레임에서 GFP의 강도를 측정합니다. 마지막으로 각 GFP 값에 3.8단계에서 선택한 배경의 ROI 측정값을 뺍니다. 이 분석은 각 시점에서 각 난 모세포에 대한 Securin-gfp 강도 값을 제공합니다.
- Securin 파괴 패턴에서 다른 매개 변수를 추출합니다 : (a) Securin-gfp 분해가 시작된 시간. 이것은 SAC 침묵이 시작된 시기를 알려줍니다. (b) Securin-gfp 최소 신호의 시간. 이는 SAC 사일런싱이 임계 수준 아래로 떨어졌을 때 높은 APC/C 활성화 및 완전한 Securin-GFP 성능 저하를 허용할 때를 알려줍니다. (c) Securin-gfp 파괴율19. 이는 SAC 활성이 APC/C 활성화 및 Securin-GFP 저하에 대한 임계값 수준 아래로 얼마나 빠르게 떨어지는지 알려줍니다.
4. 감수 분열 성숙 동안 면역 형광법에 의한 키네토코레스에서의 MAD2 모집
참고: 난모세포 수집 및 성숙에 대해서는 이전에 발표된 보고서12를 참조하십시오.
- 난 모세포를 세 그룹으로 나눕니다. 난 모세포의 각 그룹을 100 μL 방울의 밀리 논이없는 배양 배지로 옮깁니다. 방울을 미네랄 오일로 덮고 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO2 및 80 % 습도)에 3 시간, 5 시간 및 7 시간 동안 두어 각각 초기 전구 중기 I, 후기 중기 I 및 중기 I 단계에 도달합니다.
알림: 감수 분열 성숙의 규칙적인시기에 영향을 미치는 인큐베이터에서 동일한 접시를 여러 번 꺼내지 않도록 각 시점을 다른 접시에 넣으십시오. - 할당된 시점에서, 앞서 기술된 바와 같이 9-웰 유리 접시를 사용하여, 실온에서 20분 동안 1x PHEM 완충액 중 2% PFA의 500μL 방울로 옮겨 난자를 고정시킨다(20). 이어서, 세포를 500 μL 방울의 블로킹 용액 (PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02%NaN3)을 함유하는 깨끗한 웰로 옮긴다.
참고: 펨 조성: 60 mM 파이프; 25 mM 헤페스; 10 mM 에그타; 및 2 mMMgCl2를 포함한다.
참고: 이 시점에서 멈추고 면역형광을 완료하기에 편리한 시간이 될 때까지 4°C에서 9-웰 플레이트의 블로킹 용액에 난모세포를 저장할 수 있습니다. - MAD2 검출을 계속하려면 난모세포를 500μL 방울의 투과화 용액(PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02%NaN3)이 포함된 깨끗한 웰로 옮깁니다. 실온에서 20분 동안 배양한 다음, 세포를 블로킹 용액의 새로운 웰로 옮기고 10분 동안 배양한다.
- 나머지 면역형광 단계의 경우, 앞서 설명한 바와 같이 압흔이 있는 96웰 접시 뚜껑을 사용하십시오20. 빛 노출과 증발을 피하기 위해 가습된 어두운 챔버를 사용하십시오. 난모세포를 항-MAD2 항체(1:1000, 토끼) 및 항중심체 항체(ACA)(1:30, 인간)가 있는 차단 용액 30μL 방울로 옮기고( 재료 표 참조) 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
알림: 96웰 접시 뚜껑은 여러 단백질과 그룹을 동시에 처리할 수 있는 공간을 제공합니다. - 과잉 1차 항체를 세척하려면 세포를 0.5% 트리톤이 보충된 1x PHEM 완충액 30μL 방울로 옮기고 가습된 챔버에서 10분 동안 배양합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
- 네 번째 세척을 수행하고, 세포를 0.5% 1x 트리톤 없이 30 μL 방울의 1x PHEM 완충액으로 옮기고, 10분 동안 인큐베이션한다.
- 세포를 항-인간-633 (1:200) 및 항-토끼-568 (1:200) ( 재료 표 참조)과 같은 2차 항체를 함유하는 차단 용액 30μL 방울로 옮기고 실온에서 1시간 동안 배양한다.
참고: 현미경 레이저 또는 필터를 기반으로 형광단의 조합을 선택하십시오. - 과도한 2 차 항체를 세척하려면 4.5-4.6 단계를 반복하십시오.
- 현미경 슬라이드에 세포를 장착하려면 DAPI (0.1 mg / mL)가 포함 된 장착 배지 10 μL 방울로 세포를 옮깁니다 ( 재료 표 참조). 커버 슬립의 각 모서리에 작은 바셀린 점을 추가하고 장착 미디어 드롭 위에 조심스럽게 놓고 천천히 눌러 분배합니다. 투명 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 슬라이드에 밀봉하십시오. 장착 과정에 대한 자세한 설명은 참고자료20을 참조하십시오.
- 40x 또는 63x 대물렌즈가 장착된 컨포칼 현미경( 재료 표 참조)을 사용한 키네토코어를 이미지화합니다. ACA 신호를 사용하여 전체 염색체 영역의 이미징을 허용하는 z 범위를 결정합니다.
참고: 일부 이미징 시스템에서는 4.0의 광학 줌과 0.5μm의 z단계 크기를 사용할 수 있습니다. 이러한 매개 변수는 시스템마다 다를 수 있으며 최적화가 필요합니다. - 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 키네토코어에서 MAD2 강도를 분석합니다. z 스택 최대 투영을 만든 다음 채널을 분할합니다.
- 먼저 ACA 채널을 선택하여 ACA 채널을 사용하여 마스크를 생성하여 모든 키네토코어 신호를 식별하는 임계값을 설정합니다. 편집 탭으로 이동하여 선택 항목을 만듭니다. 그런 다음 이 선택 항목으로 ROI를 생성합니다.
- MAD2 채널을 선택하고 4.12단계에서 만든 선택 항목을 가져옵니다. MAD2 신호에 더 잘 적응하는 임계값 방법을 선택합니다. 강도를 측정하십시오.
알림: 대조 처리에서 역치 방법을 선택하고 다른 처리를 분석할 때 일정하게 유지하십시오. - 상대적인 픽셀 강도를 계산하려면 각 세포의 강도를 실험에서 WT 난 모세포의 평균 강도로 나눕니다.
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Representative Results
노코다졸 처리에 의한 SAC 반응성 평가
이 실험의 목적은 SAC 활성화 및 강도를 평가하는 것입니다. nocodazole을 사용하여 스핀들 미세 소관을 해중합하면 모든 키네토 코어가 부착되지 않아 SAC 매개 세포주기 정지가 발생합니다. 본 이미징 시스템에서, DMSO 처리된 대조군 난모세포는 밀리논으로부터 방출된 후 약 14시간 후에 극성체를 압출하였다(도 1, 상단 패널). SAC 활성화와 일치하여, 노코다졸로 처리된 난모세포는 중기 I에서 체포되었고 극성체를 압출하지 않았습니다(그림 1, 중간 패널). 이 분석이 SAC 활성의 신뢰할 수 있는 지표임을 입증하기 위해, MPS1 억제제인 리버신을 사용하여 SAC 활성화21을 방지하였다. SAC가 활성화되지 않으면 KT-MT 부착물이 없음에도 불구하고 난모세포가 극성체를 압출했습니다(그림 1, 하단 패널). 약화 된 SAC를 가진 난 모세포는 일부 난 모세포 정지 및 일부 극체돌출 (17)과 같은 결과가 혼합됩니다. 노코다졸을 사용하거나 사용하지 않고 마우스 난모세포를 성숙시키는 이 방법은 SAC 활성화에 도전하는 첫 번째이자 쉬운 단계로 사용할 수 있습니다.
감수 분열 성숙 중 Securin-gfp 분해 패턴
SAC 만족 및 침묵에 따른 다운스트림 이벤트 중 하나는 APC/C의 활성화로 Securin 성능 저하22로 이어집니다. 따라서 Securin 분해 패턴의 평가는 SAC 기능의 직접 판독이며 노코다졸 결과가 SAC 의존적 섭동인지 확인하기 위해 수행되어야 합니다. 이 분석은 Securin-gfp의 난모세포로의 이소성 발현 및 후속 생세포 이미징을 포함합니다. Securin 분해를 따르는 곡선을 만든 후 세 가지 매개 변수를 결정할 수 있습니다 : (a) 분해 시작 시간 (침묵); (b) 최소 Securin 수준에 도달하는 데 걸리는 시간; 및 (c) 분해 속도 (그림 2A). 대조군에서 DMSO 처리된 난모세포인 Securin-gfp 강도는 밀리논이 씻겨진 후 ~10시간에 감소하기 시작합니다(그림 2B, C). 난 모세포가 SAC 활성화제 인 노코 다졸의 존재하에 성숙되었을 때, Securin-gfp 수준은 감수 분열 성숙의 전체 기간 동안 안정했다. 대조적으로, 역전 처리로 SAC 활성화를 방지 할 때, Securin-gfp 패턴은 가속화되었다; 분해는 밀리논 세척 후 ~4시간에 시작되었으며 SAC 억제와 일치합니다(그림 2B, C).
감수 분열 성숙 동안 면역 형광법에 의한 키네토코어에 대한 MAD2의 모집
데이터가 SAC 기능의 결함을 지원하는 경우 다음 단계는 주요 SAC 중재자의 모집을 평가하는 것입니다. SAC는 연결되지 않은 키네토코어에 대한 응답으로 활성화됩니다. Kinetochores는 스핀들이 형성됨에 따라 초기 중기에서 종종 부착되지 않으며 부적절한 부착물은 수정을 위해 불안정합니다. 키네토코어가 미세소관에 안정적으로 부착되면 SAC는 아나페이즈 발병22를 허용하도록 침묵됩니다. SAC 반응의 초기 단계는 MCC 형성22,23을 위한 플랫폼 역할을 하는 키네토코어에 일련의 단백질을 동원하는 것입니다. 키네토코어에 대한 이러한 SAC 성분의 국소화를 평가하는 것은 SAC 반응을 평가하는 또 다른 전략이다. 예를 들어 MCC 구성 요소인 MAD2를 평가하는 것이 일반적인 방법입니다. 초기 전구 중기 I, 후기 전구 중기 I 및 중기 I로 성숙된 난모세포의 중심체(ACA) 및 MAD2를 검출하는 컨포칼 현미경 이미지를 사용할 수 있습니다(그림 3A). SAC 신호의 강도를 평가하려면 KT 국소화 MAD2 픽셀 강도를 정량화합니다(그림 3B). KT에 대한 상당한 수준의 MAD2 모집은 대부분의 KT가 MT에 연결되지 않은 초기 중기 I에서 발생합니다. MAD2의 수준은 후기 중기에서 감소했으며 모든 KT가 MT에 안정적으로 부착되었을 때 중기 I에서는 거의 없었습니다 (그림 3A, B). 따라서이 방법은 다른 두 분석과 결합 될 때 SAC 반응을 평가할 수 있습니다.
그림 1 : 노코다졸을 사용한 SAC 활성화 평가. DMSO (대조군), 5 μM 노코다졸 (NOC) 또는 5 μM 노코다졸 + 0.5 μM 리버신 (NOC + REV)의 존재하에 성숙된 난모세포의 타임 랩스 이미징으로부터의 대표적인 이미지. 빨간색 사각형은 극체 압출 기간을 나타냅니다. 2개의 독립적인 실험을 분석하였다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 시큐린-gfp 성능 저하 패턴. (A) 검사 할 수있는 세 가지 매개 변수가있는 Securin-gfp 분해 곡선의 개략도. (B) Securin-gfp cRNA로 미세주입되고 DMSO (대조군), 5 μM 노코다졸, 또는 0.5 μM 리버신의 존재 하에 성숙된 난모세포의 시간 경과로부터의 대표 이미지. 빨간색 사각형은 극체 압출 기간을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. (C) Securin-gfp cRNA로 미세 주입되고 DMSO (파란색 원), 5 μM 노코다졸 (분홍색 사각형) 또는 0.5 μM 역전 (검은 색 삼각형)의 존재하에 성숙 된 난 모세포의 대표적인 Securin-gfp 분해 곡선. 오차 막대 = 표준 오차. # 처리당 난모세포의 수: DMSO = 10; NOC = 15; 레브 = 5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 난모세포 감수 분열 성숙 동안 키네토코어에 대한 MAD2 모집. (A) 초기 전구 중기 I, 후기 중기 I 및 중기 I로 성숙 된 난 모세포의 대표적인 공초점 이미지는 MAD2 (회색) 및 키네 토코 레스 (ACA) (빨간색)를 검출하기 위해 면역 염색되었습니다. 스케일 바 = 10 μm; 삽입 : 2 μm. (B) (A)의 이미지에서 MAD2의 상대 강도 정량화. 오차 막대 = 표준 오차. (C) 부착되지 않은 키네토코어 및 SAC 활성화 경로의 개략도. 시점당 난모세포의 #: 초기 전구기 I = 23; 후기 중기 I = 13; 중기 I = 18. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
스핀들 어셈블리 체크포인트는 염색체 분리 오류를 방지하기 위해 설계된 세포 분열 중 중요한 제어 메커니즘입니다. 이를 통해 셀은 부적절한 KT-MT 부착물을 교정할 수 있는 충분한 시간을 가질 수 있습니다. 난 모세포의 감수 분열은 오류가 발생하기 쉬운 과정으로, 대부분의 염색체 분리 오류가 감수 분열 I 중에 발생하여 인간의 조기 유산과 불임의 주요 원인 인 이수성 난자가 생성됩니다 1,24. 여성 감수 분열에 오류가있는 이유를 풀기 위해 몇 가지 가설이 테스트되고 있습니다. 한 가지 잠재적인 이유는 SAC가 체세포에서보다 덜 효율적이고, 하나 이상의 잘못 부착된 KTs 9,10,25로 아나페이즈 발병을 허용하기 때문이다. 따라서 난모세포의 SAC 메커니즘에 대한 포괄적인 연구와 주요 조절자 식별은 유배체 난자 생성 과정을 이해하는 데 필요합니다.
본 프로토콜은 SAC 무결성의 다양한 측면을 평가하는 세 가지 기술인 활성화 및 침묵을 설명합니다. 이러한 각 분석에는 해석에 약간의 제한이 있기 때문에 하나만 수행하는 것만으로는 난 모세포에서 SAC 기능을 특성화하기에 충분하지 않습니다. 이러한 이유로 연구에서 SAC 무결성을 평가하기 위해 이러한 방법의 조합을 수행하는 것이 좋습니다.
노코다졸을 사용한 SAC 활성화 평가는 간단하고 빠르기 때문에 간단합니다. 그러나 결과를 해석할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 사항이 있습니다. 첫째, 조사자는 스핀들의 미세 소관을 완전히 해중합하여 부착되지 않은 키네토코어를 생성하고 SAC를 활성화하기 위해 노코다졸의 농도를 설정해야 합니다. 미세소관의 성공적인 손실은 난모세포를 고정하고 면역형광 기반 현미경을 통해 튜불린을 검출함으로써 결정할 수 있다20. 이 기술의 또 다른 중요한 한계는이 분석의 판독입니다 : 첫 번째 극체 (PBE)의 압출. PBE 실패는 연구 단백질이 세포질 분열 및 이탈과 같은 후기 단계에 영향을 미치는 경우 결과도 PBE의 실패가 될 것이기 때문에 반드시 SAC 기능의 충분한 증거가 아닐 수 있습니다. 따라서 SAC 결함을 평가하기위한 첫 번째 단계로 nocodazole 처리를 사용하고 설명 된 다른 기술과 협력하십시오.
KT가 MT에 안정적으로 부착되고 염색체가 중기 판에 정렬되면 SAC가 침묵되고 APC/C가 활성화되어 Securin 및 Cyclin B 분해가 발생합니다. 따라서 Securin 또는 Cyclin B 분해 패턴을 추적하는 것은 SAC 침묵25,26,27의 일반적으로 사용되는 지표입니다. 분해 패턴의 변경은 세포주기의 가속 또는 지연에 대한 정보를 제공합니다. 가속은 약한 SAC를 나타내고 지연은 SAC를 만족시키는 데 결함이 있음을 나타냅니다. 이 실험의 한계는 미세 주입 장비와 전문 기술 세트가 필요하다는 것입니다. 미세 주사에 사용되는 Securin-gfp cRNA의 적절한 농도의 적정은 너무 많으면 세포주기28을 정지시키기 때문에 중요합니다.
마지막으로, 키네토코어에 대한 MAD2의 동원 평가는 SAC 활성화의 지표이자 척도입니다. 감수 분열 I 동안 MAD2 모집 패턴, 초기 중기 I에서 키네토코어에서 MAD2의 최대 수준과 KT가 부착됨에 따라 감소된 수준. Securin 분해 패턴과 마찬가지로 키네토코어에 대한 MAD2의 모집이 변경되면 SAC 침묵의 가속 또는 지연을 나타낼 수 있습니다. 초기 prometaphase에서의 MAD2 모집에서의 결함은 활성화 또는 모집29 의 메커니즘에서의 실패 또는 세포17에서 MAD2의 감소된 양을 나타낼 수 있다. 이러한 두 가지 가능성을 구별하기 위해, 웨스턴 블롯에 의한 MAD2 단백질 발현의 수준을 평가하는 것이 강력히 권장된다 17. 두 가지 이상의 치료법을 비교할 때 감수 분열 성숙시기와 염색체 정렬시기가 치료마다 다를 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 따라서 먼저 각 처리에 대한 세포 주기 타이밍을 정의하여 MAD2 수준을 적절하게 비교하고 결과를 정확하게 해석합니다. 이 방법의 한 가지 제한은 MAD2가 SAC 응답3의 마지막 이펙터 중 하나라는 것입니다. 따라서 MAD2를 평가해도 SAC 메커니즘의 어느 부분이 교란되었는지 정확히 파악할 수 없습니다. SAC 메커니즘을 평가하기 위해 MPS1, BUB1 및/또는 RZZ 복합체와 같은 다른 SAC 구성 요소의 모집을 결정할 수 있습니다(그림 3C). 고려해야 할 또 다른 사항은 고정 단계가 중요하다는 것입니다. 이 분석은 1x PHEM 완충액에서 2% PFA를 사용했으며, 이는 전체 마운트 난모세포에서 키네토코어 단백질 검출에 작동하는 고정제입니다. 그러나 다른 실험실에서는30 이전에 광범위하게 설명 된 염색체 확산 기술을 사용합니다.
요약하면, 염색체 분리를 정확하게 제어하기 위해 키네토코어-스핀들 미세소관 부착 상태를 모니터링하는 세포의 능력에 대한 중요한 정보를 제공하는 세 가지 분석이 이 기사에 설명되어 있습니다. 이 정보는 SAC가 손상될 수 있는 셀룰러 상황을 조사하여 체크포인트의 어느 단계가 교란되는지에 대한 통찰력을 얻는 데 중요합니다. 이수성은 배우자와 암의 일반적인 특징이기 때문에 이러한 도구는 많은 생물학적 시스템에 적용됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트에 대한 자금은 국립 보건원 (R35GM136340에서 KS로)에서 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
References
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