Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Evaluering av spindelenhetens kontrollpunktintegritet i museoocytter

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64459
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

Summary

Feil i kromosomsegregering er et vanlig trekk i oocytter. Derfor gir studier av spindelmonteringskontrollpunktet viktige ledetråder om mekanismene som trengs for å produsere sunne egg. Den nåværende protokollen beskriver tre komplementære analyser for å evaluere spindelmonteringens kontrollpunktintegritet i museoocytter.

Abstract

Aneuploidy er den ledende genetiske abnormiteten som forårsaker tidlig abort og graviditetssvikt hos mennesker. De fleste feil i kromosomsegregering som gir opphav til aneuploidi oppstår under meiose i oocytter, men hvorfor oocytmeiose er feilutsatt er fortsatt ikke fullt ut forstått. Under celledeling forhindrer celler feil i kromosomsegregering ved å aktivere spindelmonteringskontrollpunktet (SAC). Denne kontrollmekanismen er avhengig av å oppdage kinetochore (KT)-mikrotubuli (MT) vedlegg og føle spenning generert av spindelfibre. Når KT er ufestet, aktiveres SAC og forhindrer cellesyklusprogresjon. SAC aktiveres først av MPS1-kinase, som utløser rekruttering og dannelse av det mitotiske sjekkpunktkomplekset (MCC), sammensatt av MAD1, MAD2, BUB3 og BUBR1. Deretter diffunderer MCC inn i cytoplasma og sekvestrere CDC20, en anafasefremmende kompleks / syklosom (APC / C) aktivator. Når KT blir festet til mikrotubuli og kromosomer er justert ved metafaseplaten, blir SAC dempet, CDC20 frigjøres, og APC / C aktiveres, noe som utløser nedbrytningen av cyklin B og Securin, og derved tillater anafasestart. Sammenlignet med somatiske celler er SAC i oocytter ikke like effektiv fordi celler kan gjennomgå anafase til tross for at de ikke har festet KT. Å forstå hvorfor SAC er mer ettergivende, og hvis denne permissiviteten er en av årsakene til kromosomsegregeringsfeil i oocytter, trenger fortsatt ytterligere undersøkelser. Den nåværende protokollen beskriver de tre teknikkene for omfattende evaluering av SAC-integritet i museoocytter. Disse teknikkene inkluderer bruk av nocodazol for å depolymerisere MTs for å evaluere SAC-responsen, spore SAC-silencing ved å følge kinetikken til Securin-destruksjon og evaluere rekrutteringen av MAD2 til KT ved immunfluorescens. Sammen undersøker disse teknikkene mekanismer som trengs for å produsere sunne egg ved å gi en fullstendig evaluering av SACs integritet.

Introduction

Aneuploidi, som oppstår ved feil i kromosomsegregering, er den ledende årsaken til tidlige miscarriages og er sterkt knyttet til feil i meiose1. Meiose er forskjellig fra mitose fordi den består av to runder med celledeling uten et intervenerende DNA-replikasjonstrinn. I meiose I skilles homologe kromosomer mens søsterkromatider forblir sammen. I oocytter er dette trinnet feilutsatt, noe som fører til aneupploid eggproduksjon2.

For å forhindre kromosomsegregeringsfeil, aktiverer de fleste celletyper en overvåkingsmekanisme som pauser cellesyklusen, kalt spindelmonteringskontrollpunktet (SAC). Denne mekanismen registrerer kinetochore (KT)-mikrotubuli (MT) vedlegg og spenningen genereres når kromosomer er orientert på en bipolar måte3. Utilknyttede kinetokorer utløser en SAC-respons som starter med rekruttering av MPS1, hovedregulatoren til SAC, til kinetochores 3,4. MPS1 initierer rekruttering av andre SAC-komponenter, som fungerer som en plattform for å danne det mitotiske sjekkpunktkomplekset (MCC). MCC, sammensatt av MAD1, MAD2, BUB3 og BUBR1, diffunderer inn i cytoplasma og hemmer APC / C-aktivering ved å binde aktivatoren CDC20. Når alle kinetokorer er stabilt festet til MT og kromosomer er justert ved metafaseplaten, blir SAC dempet, og MCC demonterer og frigjør CDC20, og tillater dermed APC / C-aktivering. Aktiv APC/C nedbryter Securin og Cyclin B, to viktige trinn i å utløse anafaseutbrudd 5,6. I somatiske celler er SAC streng fordi den aktiveres av en enkelt ufestet kinetochore og er tilstrekkelig til å indusere cellesyklusstans6. Under oocytmeiose er SAC imidlertid mer ettergivende, og oocytter kan gå inn i anafase I med en eller flere ufestede kinetokorer 6,7,8,9,10. Å forstå hvorfor SAC er mer ettergivende i oocytter er et pågående fokusområde i feltet. Mekanismer som forårsaker defekter i SAC-aktivering eller SAC-deaktivering kan føre til feil i kromosomsegregering eller langvarig cellesyklusarrest og celledød. Derfor er evaluering av mekanismene som opprettholder SAC-integritet i oocytter viktig for å forstå prosessen med å danne sunne, euploide egg.

Denne protokollen beskriver teknikker for omfattende evaluering av SAC-integriteten i museoocyttmeiose ved å undersøke forskjellige kritiske trinn i sjekkpunktet. Først beskrives evalueringen av SAC-responsen etter indusering av SAC-aktivering. Denne aktiveringen oppnås ved å generere ikke-tilknyttede kinetokorer ved bruk av nocodazol, et stoff som depolymeriserer MTs11. For det andre beskrives en metode for å overvåke SAC-silencing ved å spore dynamikken i Securin-nedbrytning under oocytmodning. Til slutt brukes en immunfluorescensbasert analyse for å måle rekrutteringen av MAD2, en av MCC-komponentene, til kinetochores. Sammen vurderer disse analysene SAC-integriteten grundig under oocytmeiotisk modning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle mus som ble brukt i disse protokollene ble plassert og oppdratt i henhold til Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (protokoll 201702497) og National Institutes of Health retningslinjer. Disse tilsynsorganene godkjente alle eksperimentelle prosedyrer som involverer dyreforsøk. Alle musene som ble brukt i denne studien var 6-8 uker gamle CF-1 hunner.

1. Eksperimentell forberedelse

  1. Før du starter SAC-evalueringene, samle museoocytter etter den tidligere publiserte rapporten12. Del innsamlede oocytter i tre jevnt store grupper og hold dem i Chatot, Ziomek og Bavister (CZB) kulturmedier som inneholder 2,5 μM milrinon (se materialtabell) for å unngå meiotisk gjenopptakelse13.
    MERK: CZB sammensetning: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH2PO4; 1,2 mM MgSO 4-7H 2O; 0,27 mM pyruvat; 1,7 mM CaCl2; 30,8 mM DL-melkesyre; 7 mM taurin; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO3; Gentamicin; og 0,3 % BSA.
  2. Forbered cRNA for mikroinjeksjon som beskrevet tidligere12,14. Forsterk musens Securin-gen fra cDNA klonet fra musens germinale vesikkel-oocytter, etterfulgt av subkloning i pMDL2-vektoren som inneholder Gfp-sekvens15,16.
    1. For å forberede Securin-Gfp cRNA, lineariser plasmidet med Nde I fordøyelsen. Utfør in vitro transkripsjon ved å bruke T3 RNA-polymerase og rense cRNA16.
      MERK: Oppbevar cRNA i alikoter på 2-3 μL ved -80 °C til bruk.

2. Nocodazolbehandling og levende bildebehandling

  1. Klargjør 1 ml kulturmedier (CZB) som inneholder 5 μM nokodazol (NOC), 1 ml kulturmedier med 5 μM NOC pluss 0,5 μM reversin (NOC + REV) og 1 ml kulturmedium med dimetylsulfoksid (DMSO) (1:2000) som kontroll (se materialfortegnelse).
  2. For oocytmodning og levende bildebehandling, bruk en 96-brønnplate forvarmet i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2 og 80% fuktighet. I den første brønnen, last 150 μL av kontrollen DMSO-behandlingen; i den andre brønnen, last 150 μL NOC-behandling; og i den tredje brønnen, last 150 μL NOC + REV-behandling. Hold platen i inkubatoren under samme forhold som ovenfor til nødvendig.
    MERK: I 96-brønnsplaten, unngå å bruke den første raden og den første kolonnen fordi skyggen av rammen forstyrrer kvaliteten på bildene.
  3. For å starte meiotisk modning, fjern milrinon. Mens du ser på oocyttene under et stereomikroskop ved hjelp av forstørrelse mellom 30x-64x, vask milrinon ut av media ved sekvensielt å overføre oocyttene gjennom seks dråper 100 μL milrinonfrie kulturmedier som inneholder DMSO og plasser dem i den tilsvarende brønnen på 96-brønnplaten ved hjelp av en hånd- eller munnoperert pipette.
    1. Tell oocytter ved å plukke dem opp ved hjelp av en hånd- eller munnoperert pipette og levere dem til neste dråpe for å unngå å miste noen. Oocyttene er enkle, store (~ 80 μm i diameter) og runde celler. Kjernen vil vises som en knapp i midten av cellen, og membranen og zona pellucida omgir oocytten.
      MERK: Overfør oocyttene mellom dråper mens du flytter minst mulig væske. Dette muliggjør optimal fjerning av milrinon fra kulturmediet. Hvis oocytter ikke gjenopptar meiose, er det sannsynlig at milrinon ikke ble fjernet effektivt.
  4. Gjenta samme prosess (trinn 2.3) for NOC- og NOC + REV-behandling.
  5. Bilde oocyttene ved hjelp av et lysfeltmikroskop utstyrt med et inkubatorkammer med et kontrollert miljø under disse forholdene: 37 ° C, 5% CO2 og 80% fuktighet. Ta bilder i midtplanet av oocyttene med intervaller på 20 minutter i 24 timer.
  6. Kvantifiser antall oocytter som ekstruderer en polar kropp (PB) ved å identifisere cellene som går gjennom asymmetrisk cytokinese. Resultatet blir en liten celle (PB) ved siden av egget og innenfor den delte zona pellucida. Se bildene ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare (ImageJ, se Materialfortegnelse).
  7. Importer bildesekvens til bildeanalyseprogramvaren og avanser rammene til en eller flere celler går gjennom asymmetrisk cytokinese. Beregn prosentandelen oocytter som ekstruderer en PB av totalt antall oocytter17.

3. Overvåke mønsteret av Securin-gfp nedbrytning under meiotisk modning

  1. Sentrifuge 3 μL Securin-Gfp cRNA (trinn 1,2) ved 19 283 x g i 30 minutter ved 4 °C18.
    MERK: Bruk supernatanten for å unngå urenheter som kan forårsake blokkering av nålen under mikroinjeksjon.
  2. Følg trinnvis oocyttmikroinjeksjon, omfattende beskrevet i referanse12. Mikroinjiser profase I-arresterte oocytter med 100 ng / μL Securin-gfp cRNA fremstilt i trinn 1.2.
  3. Etter mikroinjeksjon, la oocyttene gjenopprette og oversette RNA i CO2 -inkubatoren i minst 3 timer. Kontroller uttrykket ved å observere oocyttene i et automatisert flerkanals fluorescensavbildningssystem (se materialfortegnelse) for å vise GFP-signalet.
  4. Som beskrevet i trinn 2.2, last 150 μL kulturmedier med eller uten 5 μM nocodazol og 150 μL kulturmedier med 0,5 μM revers i tre forskjellige brønner i en 96-brønnsplate.
  5. Vask de mikroinjiserte oocytter gjennom seks dråper milrinonfrie kulturmedier og overfør 1/3 av oocytter til hver behandling.
  6. Hold platen i inkubatoren ved 37 ° C, med 5% CO2 og 80% fuktighet til oocyttene gjenopptar meiose, rundt 3 timer etter milrinonvask.
    MERK: Bruk et stereomikroskop med forstørrelse mellom 30x-64x for å evaluere kjernefysisk konvoluttbrudd som et kjennetegn på meiotisk gjenopptakelse.
  7. Ta bilder av oocytmodning ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt med et inkubatorkammer som beskrevet i trinn 2.6. Bruk brightfield-innstillinger for å finne oocyttene i brønnen. Bruk et 488-filter for å oppdage Securin-gfp-signalet og juster fluorescensintensiteten for å unngå å overeksponere cellene.
    1. Hvis bildebehandlingssystemet er automatisert, lagre posisjonene til oocyttene i hver brønn. Fordi Securin-gfp er jevnt fordelt i cytoplasma, ta bilder i midtplanet av oocyttene med intervaller på 20 minutter i 24 timer. For å fange grupper av oocytter i ett bilde, bruk en objektivlinse med lavere forstørrelse, for eksempel 10x.
  8. Bruk bildeanalyse programvare for å kvantifisere Securin-gfp ødeleggelse. Åpne bildene av GFP-kanalen. Start på tidspunkt punkt 1. I den foretrukne analyseprogramvaren, bruk et utvalgs- eller formverktøy for å markere hver oocyt og generere et interesseområde (ROI) for hver celle.
    1. Bruk samme avkastning til å velge et bakgrunnsområde som skal trekkes fra senere. Mål GFP-pikselintensiteten i hver avkastning.
  9. Ved å bruke avkastningen for hver oocyt generert i trinn 3.8, måler du GFP-intensiteten i alle tidspunktene.
    MERK: I noen programmer tillater en "Analyser"-fane valg av Mål-funksjonen.
    1. Gå deretter videre til neste tidsramme og gjenta denne prosessen for å måle intensiteten av GFP i hver tidsramme. Til slutt, til hver GFP-verdi, trekker du målingen av avkastningen i bakgrunnen som ble valgt i trinn 3.8. Denne analysen vil gi en verdi for Securin-gfp intensitet for hver oocytt på hvert tidspunkt.
  10. Trekk ut forskjellige parametere fra mønsteret av Securin destruksjon: (a) den tiden som Securin-gfp nedbrytning begynte. Dette forteller når SAC-silencing startet; (b) tidspunktet for Securin-gfp minimumssignal. Dette forteller når SAC-silencing har falt under et terskelnivå for å tillate høy APC / C-aktivering og full Securin-GFP-nedbrytning; (c) frekvensen av Securin-GFP ødeleggelse19. Dette forteller hvor raskt SAC-aktiviteten faller under et terskelnivå for APC / C-aktivering og Securin-GFP-nedbrytning.

4. Rekruttering av MAD2 ved kinetochores ved immunfluorescens under meiotisk modning

MERK: For oocyttinnsamling og modning, se tidligere publisert rapport12.

  1. Del oocytter i tre grupper. Overfør hver gruppe oocytter til 100 μL dråper milrinonfrie kulturmedier. Dekk dråpene med mineralolje og legg dem i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2 og 80% fuktighet) i 3 timer, 5 timer og 7 timer for å nå henholdsvis tidlig prometafase I, sen prometafase I og metafase I stadium.
    MERK: Plasser hvert tidspunkt i en annen tallerken for å unngå å ta ut den samme parabolen fra inkubatoren flere ganger, noe som påvirker den vanlige timingen av meiotisk modning.
  2. På de tildelte tidspunktene, fikser du oocyttene ved å overføre dem til 500 μL dråper 2% PFA i 1x PHEM-buffer i 20 minutter ved romtemperatur, ved bruk av en 9-brønns glassfat som tidligere beskrevet20. Overfør deretter cellene til en ren brønn som inneholder en 500 μL dråpe blokkeringsløsning (PBS + 0, 3% BSA + 0, 01% Tween-20 + 0, 02% NaN3).
    MERK: PHEM sammensetning: 60 mM RØR; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; og 2 mM MgCl2.
    MERK: Man kan stoppe på dette punktet og lagre oocyttene i blokkeringsløsning i 9-brønnsplaten ved 4 ° C til passende tidspunkt for å fullføre immunfluorescens.
  3. For å fortsette MAD2-deteksjon, overfør oocyttene til en ren brønn som inneholder en 500 μL dråpe permeabiliseringsløsning (PBS + 0, 3% BSA + 0, 1% TritonX-100 + 0, 02% NaN3). Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur, og overfør deretter cellene til en ny brønn med blokkeringsløsning og inkuber i 10 minutter.
  4. For resten av immunfluorescenstrinnene, bruk et 96-brønns oppvasklokk med fordypninger som tidligere beskrevet20. Bruk et fuktet mørkt kammer for å unngå lyseksponering og fordampning. Overfør oocyttene til en 30 μL dråpe blokkeringsløsning med anti-MAD2 antistoff (1:1000, kanin) og anti-centromeric antistoff (ACA) (1:30, human) (se materialtabell) og inkuber i 2 timer ved romtemperatur.
    MERK: 96-brønns oppvasklokket gir rom for behandling av flere proteiner og grupper samtidig.
  5. For å vaske overflødige primære antistoffer, overfør cellene til en 30 μL dråpe 1x PHEM-buffer supplert med 0,5% Triton og inkuber i 10 minutter i det fuktede kammeret. Gjenta dette trinnet to ganger til.
  6. Utfør den fjerde vasken, overfør cellene til en 30 μL dråpe 1x PHEM-buffer uten 0,5% 1x Triton, og inkuber i 10 minutter.
  7. Overfør cellene til en 30 μL dråpe blokkeringsløsning som inneholder sekundære antistoffer som anti-human-633 (1:200) og anti-kanin-568 (1:200) (se materialtabell) og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
    MERK: Velg kombinasjonen av fluorforer basert på mikroskoplasere eller filtre.
  8. For å vaske overflødige sekundære antistoffer, gjenta trinn 4,5-4,6.
  9. For å montere cellene på mikroskoplysbildet, overfør cellene til en 10 μL dråpe monteringsmedium som inneholder DAPI (0,1 mg / ml) (se materialfortegnelse). Legg små prikker av vaselin til hvert hjørne av dekselet, legg dem forsiktig på toppen av monteringsmediedråpen, og trykk sakte for å fordele. Bruk klar neglelakk for å forsegle dekselet til lysbildet. For en mer detaljert beskrivelse av monteringsprosessen, se referanse20.
  10. Bildekinetokorer ved hjelp av et konfokalmikroskop (se materialfortegnelse) utstyrt med et 40x eller 63x objektiv. Bruk ACA-signalet til å bestemme z-området som tillater avbildning av hele kromosomområdet.
    MERK: En optisk zoom på 4,0 og z-trinns størrelse på 0,5 μm kan brukes på noen bildesystemer. Disse parametrene kan variere fra system til system, og optimalisering vil være nødvendig.
  11. Analyser MAD2-intensitet ved kinetochores ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Lag en maksimal z-stack-projeksjon og del deretter kanalene.
  12. Først oppretter du en maske ved hjelp av ACA-kanalen ved å velge ACA-kanalen for å etablere en terskel som identifiserer alle kinetochore-signalene. Gå til redigeringsfanen og opprett et utvalg. Deretter oppretter du en avkastning med dette valget.
  13. Velg MAD2-kanalen og hent inn utvalget som ble opprettet i trinn 4.12. Velg en terskelmetode som bedre tilpasser seg MAD2-signalet. Mål intensiteten.
    MERK: Velg terskelmetoden i kontrollbehandlingen og hold den konstant når du analyserer ulike behandlinger.
  14. For å gjøre relative pikselintensitetsberegninger, del intensiteten til hver celle med den gjennomsnittlige intensiteten til WT-oocyttene i eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Evaluering av SAC-respons ved nokodazolbehandling
Hensikten med dette eksperimentet er å evaluere SAC-aktivering og styrke. Ved å bruke nokodazol til å depolymerisere spindelmikrotubuli, vil alle kinetokorer bli ufestet, noe som vil forårsake en SAC-mediert cellesyklusstans. I det nåværende avbildningssystemet ekstruderte DMSO-behandlede kontrolloocytter et polarlegeme rundt 14 timer etter frigjøring fra milrinon (figur 1, topppaneler). I samsvar med SAC-aktivering stoppet nokodazolbehandlede oocytter i metafase I og ekstruderte ikke et polarlegeme (figur 1, midtpaneler). For å demonstrere at denne analysen er en pålitelig indikator på SAC-aktivitet, ble reversin, en MPS1-hemmer, brukt for å forhindre SAC-aktivering21. Når SAC ikke kan aktiveres, ekstruderte oocytter et polarlegeme til tross for at de ikke hadde KT-MT-vedlegg (figur 1, bunnpaneler). Oocytter med svekket SAC vil ha en blanding av utfall - noen oocytter arresterer og noen ekstruderer polare legemer17. Denne metoden for modning av museocytter med og uten nocodazol kan brukes som et første og enkelt skritt for å utfordre SAC-aktivering.

Mønster av Securin-gfp nedbrytning under meiotisk modning
En av nedstrømshendelsene etter SAC-tilfredshet og silencing er aktiveringen av APC / C, noe som fører til Securin-degradering22. Derfor er evaluering av mønsteret for Securin-nedbrytning en direkte avlesning av SAC-funksjonen og bør utføres for å avgjøre om nocodazolresultatet var en SAC-avhengig forstyrrelse. Denne analysen innebærer ektopisk ekspresjon av Securin-gfp i oocytter og påfølgende levende celleavbildning. Etter å ha laget en kurve som følger Securin-nedbrytningen, kan tre parametere bestemmes: (a) Starttidspunktet for nedbrytning (silencing); b) tiden det tar å nå det minste Securin-nivået, og (c) nedbrytningshastigheten (figur 2A). I kontrollen, DMSO-behandlede oocytter, begynner Securin-gfp-intensiteten å synke ved ~ 10 timer etter at milrinon er vasket ut (figur 2B, C). Når oocytter ble modnet i nærvær av SAC-aktiverende middel nocodazol, var Securin-gfp-nivåene stabile i hele perioden med meiotisk modning. I kontrast, når man forhindret SAC-aktivering med reversinbehandling, akselererte Securin-gfp-mønsteret; nedbrytningen begynte ved ~4 timer etter utvasking av milrinon, forenlig med SAC-hemming (figur 2B,C).

Rekruttering av MAD2 til kinetokorer ved immunfluorescens under meiotisk modning
Hvis dataene støtter en feil i SAC-funksjonen, er neste trinn å evaluere rekrutteringen av viktige SAC-meklere. SAC aktiveres som svar på kinetochores uten tilknytning. Kinetochores er ofte unattached i tidlig prometafase som spindelen bygger, og feil vedlegg er destabilisert for korreksjon. Når kinetochores er stabilt festet til mikrotubuli, blir SAC dempet for å tillate anafaseutbrudd22. Et tidlig skritt i SAC-responsen er rekrutteringen av en serie proteiner til kinetochores som fungerer som en plattform for MCC-dannelse22,23. Evaluering av lokaliseringen av disse SAC-komponentene til kinetochores er en annen strategi for å evaluere SAC-respons. For eksempel er evaluering av MAD2, en MCC-komponent, en vanlig tilnærming. Konfokale mikroskopbilder som detekterer sentromerer (ACA) og MAD2 av oocytter modnet til tidlig prometafase I, sen prometafase I og metafase I kan brukes (figur 3A). For å evaluere styrken til SAC-signalet, kvantifiser den KT-lokaliserte MAD2-pikselintensiteten (figur 3B). Betydelige nivåer av MAD2-rekruttering til KT forekommer i tidlig prometafase I når de fleste KT ikke er knyttet til MT. Nivåene av MAD2 ble redusert i senere prometafase og var nesten fraværende ved metafase I når alle KT var stabilt festet til MT (figur 3A, B). Derfor kan denne metoden evaluere SAC-respons når den kombineres med de to andre analysene.

Figure 1
Figur 1: Vurdering av SAC-aktivering med nokodazol. Representative bilder fra time-lapse-avbildning av oocytter modnet i nærvær av DMSO (kontroll), 5 μM nocodazol (NOC) eller 5 μM nocodazole + 0,5 μM reversin (NOC + REV). Den røde firkanten indikerer tidsrammen for polar kroppsekstrudering. To uavhengige eksperimenter ble analysert. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Securin-gfp nedbrytningsmønster. (A) Skjematisk av Securin-gfp degraderingskurve med tre parametere som kan undersøkes. (B) Representative bilder fra en time-lapse av oocytter mikroinjisert med Securin-gfp cRNA og modnet i nærvær av DMSO (kontroll), 5 μM nocodazole, eller 0,5 μM reversin. Den røde firkanten indikerer tidsrammen for polar kroppsekstrudering. Skala bar = 50 μm. (C) Representativ Securin-gfp nedbrytningskurve for oocytter mikroinjisert med Securin-gfp cRNA og modnet i nærvær av DMSO (blå sirkler), 5 μM nocodazol (rosa firkanter), eller 0,5 μM reversin (svarte trekanter). Feilfelt = standardfeil. # av oocytter per behandling: DMSO = 10; NOC = 15; REV = 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: MAD2 rekruttering til kinetokorer under oocytt meiotisk modning. (A) Representative konfokale bilder av oocytter modnet til tidlig prometafase I, sen prometafase I og metafase I, immunfarget for å oppdage MAD2 (grå) og kinetokorer (ACA) (rød). Skala bar = 10 μm; innfelt: 2 μm. (B) Kvantifisering av den relative intensiteten til MAD2 fra bilder i (A). Feilfelt = standardfeil. (C) Skjematisk fremstilling av en ikke-tilknyttet kinetochore og SAC aktiveringsvei. # av oocytter per tidspunkt: Tidlig prometafase I = 23; Sen prometafase I = 13; Metafase I = 18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kontrollpunktet for spindelmontering er en kritisk kontrollmekanisme under celledeling designet for å forhindre kromosomsegregeringsfeil. Det gjør at cellen får nok tid til å korrigere feil KT-MT-vedlegg. Meiose i oocytter er en feilutsatt prosess, hvor det meste av kromosom-missegregeringen oppstår under meiose I, noe som fører til generering av aneuploide egg som er hovedårsaken til tidlige spontanaborter og infertilitet hos mennesker 1,24. Flere hypoteser blir testet for å disentangle hvorfor kvinnelig meiose har feil. En mulig årsak er at SAC er mindre effektiv enn i somatiske celler og tillater anafasedebut med en eller flere feilfestede KT 9,10,25. Derfor er det nødvendig med en omfattende studie av SAC-mekanismer i oocytter og identifisering av nøkkelregulatorer for å forstå prosessen med å generere et euploid egg.

Denne protokollen beskriver tre teknikker for å evaluere ulike aspekter av SAC-integritet: aktivering og aktivering. Fordi hver av disse analysene har noen begrensninger i tolkning, er det ikke tilstrekkelig å gjennomføre bare en for å karakterisere SAC-funksjonen i oocytter. Av denne grunn foreslås det å utføre en kombinasjon av disse metodene for å evaluere SAC-integriteten i en studie.

Evaluering av SAC-aktivering ved bruk av nocodazole er grei fordi den er enkel og rask. Det er imidlertid noen viktige punkter å vurdere når du tolker resultatene. Først må etterforskeren etablere konsentrasjonen av nocodazol for å fullstendig depolymerisere spindelens mikrotubuli for å generere ufestede kinetokorer og aktivere SAC. Vellykket tap av mikrotubuli kan bestemmes ved å fikse oocytter og påvise tubulin via immunfluorescensbasert mikroskopi20. En annen kritisk begrensning ved denne teknikken er avlesningen av denne analysen: ekstruderingen av det første polare legemet (PBE). PBE-svikt trenger ikke nødvendigvis være tilstrekkelig bevis for SAC-funksjonen, fordi hvis studieproteinet påvirker senere stadier som cytokinese og abscission, vil resultatene også være svikt i PBE. Bruk derfor nokodazolbehandling som et første skritt for å evaluere SAC-defekter, men samarbeid deretter med de andre teknikkene som er beskrevet.

Når KT er stabilt festet til MT og kromosomer er justert ved metafaseplaten, blir SAC dempet, og APC / C aktiveres, noe som fører til Securin og Cyclin B-nedbrytning. Derfor er sporing av mønsteret for Securin eller Cyclin B-nedbrytning ofte brukte indikatorer for SAC-deaktivering25,26,27. Endring av nedbrytningsmønsteret gir informasjon om cellesyklusens akselerasjon eller forsinkelse. En akselerasjon antyder en svak SAC, mens en forsinkelse antyder mangler i å tilfredsstille SAC. En begrensning av dette eksperimentet er at det krever en mikroinjeksjonsrigg og et spesialisert ferdighetssett. Merk at titrering av riktig konsentrasjon av Securin-gfp cRNA som brukes til mikroinjeksjon er kritisk, da for mye vil arrestere cellesyklusen28.

Endelig er evaluering av rekruttering av MAD2 til kinetochores en indikator og et mål på SAC-aktivering. Mønsteret av MAD2-rekruttering under meiose I, med maksimale nivåer av MAD2 ved kinetokorer ved tidlig prometafase I og reduserte nivåer etter hvert som KT blir festet. I likhet med Securin-nedbrytningsmønsteret kan enhver endring av rekrutteringen av MAD2 til kinetochores indikere akselerasjon eller forsinkelse av SAC-aktivering. Defekter i MAD2-rekruttering ved tidlig prometafase kan indikere svikt i aktiveringsmekanismen eller rekruttering29 eller reduserte mengder MAD2 i cellen17. For å skille mellom disse to mulighetene, anbefales det sterkt å evaluere nivåene av MAD2-proteinuttrykk ved Western blot. 17. Når man sammenligner to eller flere behandlinger, er det viktig å vurdere at tidspunktet for meiotisk modning og kromosomjustering kan variere mellom behandlinger. Derfor må du først definere cellesyklustimingen for hver behandling for å sammenligne MAD2-nivåene riktig og tolke resultatene nøyaktig. En begrensning ved denne metoden er at MAD2 er en av de siste effektorene av SAC-responsen3. Derfor tillater ikke vurdering av MAD2 en å finne ut hvilken del av SAC-mekanismen som er forstyrret. For å evaluere SAC-mekanismer kan man bestemme rekrutteringen av en annen SAC-komponent som MPS1, BUB1 og/eller RZZ-komplekset (figur 3C). Et annet poeng å vurdere er at fikseringstrinnet er kritisk. Disse analysene brukte 2% PFA i 1x PHEM-buffer, en fiksering som virker for påvisning av kinetochore-proteiner i hele mount oocytter. Imidlertid bruker andre laboratorier en kromosomspredningsteknikk som ble omfattende beskrevet før30.

Oppsummert er tre analyser som gir kritisk informasjon om en celles evne til å overvåke kinetochore-spindel mikrotubuli festestatus for å kontrollere kromosomsegregering nøyaktig, beskrevet i denne artikkelen. Denne informasjonen er viktig for å undersøke cellulære situasjoner der SAC kan bli kompromittert for å få innsikt i hvilket trinn i sjekkpunktet som er forstyrret. Fordi aneuploidi er en vanlig funksjon i kjønnsceller og kreftformer, gjelder disse verktøyene for mange biologiske systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.

Acknowledgments

Finansiering for dette prosjektet ble gitt av National Institutes of Health (R35GM136340 til KS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A4503
DAPI Life Technologies D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) Sigma D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 Life Technologies A10042
EVOS FL Auto Imaging System Life Technologies Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator Life Technologies Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated MatTek Corporation P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633 Life Technologies A21091
HEPES Sigma H3537
Human anti-ACA Antibodies Incorporated 15-234 Dilution 1/30
ImageJ NIH
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective Leica
MgSO4·7H20 Sigma M7774
Milrinone Sigma M4659
Na2HPO4 Sigma S2429
NaCl Sigma S5886
NaN3 Sigma S2002
Nocodazole Sigma M1404
Paraformaldhyde (PFA) Sigma P6148
PIPES Sigma P6757
Rabbit anti- MAD2 Biolegend 924601 Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine Cayman Chemical 10004412
Triton-X Sigma 274348
Tween-20 Sigma X100
Vectashield Vector laboratories H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
  3. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  4. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
  5. London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
  6. Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
  7. Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  8. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  9. Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
  10. Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
  11. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  12. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
  13. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
  14. Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
  15. Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
  16. Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
  17. Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
  18. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  19. Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
  20. Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
  21. Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  22. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  23. Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
  24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
  25. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  26. Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
  27. Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
  28. Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
  29. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  30. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 187
Evaluering av spindelenhetens kontrollpunktintegritet i museoocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aboelenain, M., Schindler, K.,… More

Aboelenain, M., Schindler, K., Blengini, C. S. Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (187), e64459, doi:10.3791/64459 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter