Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Оценка целостности контрольной точки сборки шпинделя в ооцитах мыши

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64459
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

Summary

Ошибка в сегрегации хромосом является общей чертой в ооцитах. Поэтому изучение контрольной точки сборки веретена дает важные подсказки о механизмах, необходимых для производства здоровых яиц. Настоящий протокол описывает три дополнительных анализа для оценки целостности контрольных точек сборки веретена в ооцитах мыши.

Abstract

Анеуплоидия является ведущей генетической аномалией, вызывающей ранний выкидыш и неудачу беременности у людей. Большинство ошибок в сегрегации хромосом, которые приводят к анеуплоидии, происходят во время мейоза в ооцитах, но почему мейоз ооцитов подвержен ошибкам, до сих пор не до конца понятно. Во время деления клеток клетки предотвращают ошибки в сегрегации хромосом, активируя контрольную точку сборки веретена (SAC). Этот механизм управления основан на обнаружении кинетохорных (КТ)-микротрубочек (МТ) креплений и зондировании напряжения, создаваемого волокнами шпинделя. Когда КТ не прикреплены, SAC активируется и предотвращает прогрессирование клеточного цикла. SAC активируется сначала киназой MPS1, которая запускает набор и формирование комплекса митотических контрольных точек (MCC), состоящего из MAD1, MAD2, BUB3 и BUBR1. Затем MCC диффундирует в цитоплазму и изолирует CDC20, активатор анафаз-стимулирующего комплекса/ циклосомы (APC / C). Как только KTs прикрепляются к микротрубочкам и хромосомы выравниваются на метафазной пластине, SAC заглушается, CDC20 высвобождается, а APC / C активируется, вызывая деградацию циклина B и Securin, тем самым позволяя анафазному началу. По сравнению с соматическими клетками, SAC в ооцитах не так эффективен, потому что клетки могут подвергаться анафазе, несмотря на наличие неприкрепленных КТ. Понимание того, почему SAC является более разрешительным и является ли эта разрешительность одной из причин ошибок сегрегации хромосом в ооцитах, все еще нуждается в дальнейшем изучении. Настоящий протокол описывает три метода всесторонней оценки целостности SAC в ооцитах мыши. Эти методы включают использование нокодазола для деполимеризации МТ для оценки реакции SAC, отслеживание глушения SAC путем отслеживания кинетики разрушения Securin и оценку набора MAD2 в KTs путем иммунофлуоресценции. Вместе эти методы исследуют механизмы, необходимые для производства здоровых яйцеклеток, обеспечивая полную оценку целостности SAC.

Introduction

Анеуплоидия, которая возникает из-за ошибок в сегрегации хромосом, является основной причиной ранних выкидышей и тесно связана с ошибками в мейозе1. Мейоз отличается от митоза тем, что он состоит из двух раундов деления клеток без промежуточного этапа репликации ДНК. При мейозе I гомологичные хромосомы разделяются, в то время как сестринские хроматиды остаются вместе. В ооцитах этот этап подвержен ошибкам, что приводит к производству анеуплоидных яиц2.

Чтобы предотвратить ошибки сегрегации хромосом, большинство типов клеток активируют механизм наблюдения, который приостанавливает клеточный цикл, называемый контрольной точкой сборки веретена (SAC). Этот механизм определяет прикрепления кинетохора (КТ)-микротрубочек (МТ), и напряжение генерируется, когда хромосомы ориентированы биполярным образом3. Неприкрепленные кинетохоры вызывают реакцию SAC, которая начинается с набора MPS1, главного регулятора SAC, в кинетохоры 3,4. MPS1 инициирует набор других компонентов SAC, выступая в качестве платформы для формирования комплекса митотических контрольных точек (MCC). MCC, состоящий из MAD1, MAD2, BUB3 и BUBR1, диффундирует в цитоплазму и ингибирует активацию APC / C путем секвестрации ее активатора CDC20. Как только все кинетохоры стабильно прикреплены к МТ и хромосомы выровнены на метафазной пластине, SAC заглушается, а MCC разбирается и высвобождает CDC20, тем самым позволяя активировать APC / C. Активный APC/C разлагает Securin и Cyclin B, два ключевых шага в запуске анафазного начала 5,6. В соматических клетках SAC является строгим, поскольку он активируется одним неприкрепленным кинетохором и достаточен для индуцирования остановки клеточного цикла6. Однако во время мейоза ооцитов SAC более разрешителен, и ооциты могут входить в анафазу I с одним или несколькими неприкрепленными кинетохорами 6,7,8,9,10. Понимание того, почему SAC является более разрешительным в ооцитах, является постоянной областью внимания в этой области. Механизмы, которые вызывают дефекты активации SAC или глушения SAC, могут привести к ошибкам в сегрегации хромосом или длительной остановке клеточного цикла и гибели клеток. Поэтому оценка механизмов, которые поддерживают целостность SAC в ооцитах, важна для понимания процесса формирования здоровых, эуплоидных яйцеклеток.

Этот протокол описывает методы всесторонней оценки целостности SAC при мейозе ооцитов мыши путем изучения различных критических этапов контрольной точки. Во-первых, описана оценка ответа SAC после индуцирования активации SAC. Эта активация достигается путем генерации неприкрепленных кинетохоров с использованием нокодазола, препарата, который деполимеризует MTs11. Во-вторых, метод мониторинга глушения SAC описан отслеживанием динамики деградации Securin во время созревания ооцитов. Наконец, иммунофлуоресцентный анализ используется для измерения набора MAD2, одного из компонентов MCC, к кинетохорам. Вместе эти анализы всесторонне оценивают целостность SAC во время мейотического созревания ооцитов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все мыши, используемые в этих протоколах, были размещены и выращены в соответствии с руководящими принципами Комитета по институциональному использованию и уходу за животными Университета Рутгерса (Протокол 201702497) и Национальными институтами здравоохранения. Эти регулирующие органы одобрили все экспериментальные процедуры, связанные с исследованиями на животных. Все мыши, использованные в настоящем исследовании, были 6-8-недельными самками CF-1.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Прежде чем начать оценку SAC, соберите мышиные ооциты в соответствии с ранее опубликованным отчетом12. Разделите собранные ооциты на три группы одинакового размера и храните их в питательных средах Chatot, Ziomek и Bavister (CZB), содержащих 2,5 мкМ милринона (см. Таблицу материалов), чтобы избежать мейотического возобновления13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав CZB: 81,6 мМ NaCL; 4,8 мМ KCl; 1,2 мМ KH2PO4; 1,2 мМ МгСО4-7Н 2О; 0,27 мМ Пируват; 1,7 мМ CaCl2; 30,8 мМ DL-молочная кислота; 7 мМ Таурин; 0,1 мМ ЭДТА; 25 мМ NaHCO3; Гентамицин; и 0,3% BSA.
  2. Подготовьте цРНК к микроинъекции, как описано ранее12,14. Амплифицируйте мышиный ген Securin из кДНК, клонированной из мышиных зародышевых пузырчатых ооцитов, с последующим субклонированием в вектор pMDL2, содержащий последовательность Gfp15,16.
    1. Для получения кРНК Securin-Gfp линеаризуйте плазмиду с помощью Nde I пищеварения. Выполняйте транскрипцию in vitro с помощью Т3-РНК-полимеразы и очищая цРНК16.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните цРНК в аликвотах по 2-3 мкл при -80 °C до начала использования.

2. Лечение нокодазолом и визуализация в реальном времени

  1. Готовят 1 мл культуральной среды (CZB), содержащей 5 мкМ нокодазола (NOC), 1 мл культуральной среды с 5 мкМ NOC плюс 0,5 мкМ реверсина (NOC + REV) и 1 мл питательной среды с диметилсульфоксидом (DMSO) (1:2000) в качестве контроля (см. Таблицу материалов).
  2. Для созревания ооцитов и визуализации в реальном времени используйте 96-луночную пластину, предварительно нагретую в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2 и влажности 80%. В первой скважине нагрузка 150 мкл контрольной обработки ДМСО; во второй скважине нагрузка 150 мкл обработки НОК; и в третьей скважине нагрузка 150 мкл обработки NOC + REV. Храните пластину в инкубаторе в тех же условиях, что и выше, до тех пор, пока это не понадобится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В 96-луночной пластине избегайте использования первой строки и первого столбца, поскольку тень границы мешает качеству изображений.
  3. Чтобы начать мейотическое созревание, удалите мильринон. При просмотре ооцитов под стереомикроскопом с использованием увеличения между 30x-64x вымывайте мильринон из среды, последовательно перенося ооциты через шесть капель 100 мкл свободной от милринона культуральной среды, содержащей ДМСО, и поместите их в соответствующий колодец 96-луночной пластины с помощью пипетки, управляемой вручную или ртом.
    1. Подсчитывайте ооциты, подбирая их с помощью пипетки, управляемой рукой или ртом, и доставляя их к следующей капле, чтобы избежать потери ни одной. Ооциты одиночные, крупные (~80 мкм в диаметре) и круглые клетки. Ядро будет выглядеть как кнопка в центре клетки, а мембрана и пеллюцидная зона будут окружать ооцит.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переносите ооциты между каплями при перемещении наименьшего количества жидкости. Это позволяет оптимально удалять милринон из питательных сред. Если ооциты не могут возобновить мейоз, вполне вероятно, что милринон не был эффективно удален.
  4. Повторите тот же процесс (шаг 2.3) для лечения NOC и NOC + REV.
  5. Визуализируйте ооциты с помощью микроскопа Brightfield, оснащенного камерой инкубатора с контролируемой средой в следующих условиях: 37 ° C, 5% CO2 и 80% влажности. Захват изображений в средней плоскости ооцитов с интервалом 20 мин в течение 24 ч.
  6. Количественно оценить количество ооцитов, которые выдавливают полярное тело (ПБ), путем идентификации клеток, которые проходят через асимметричный цитокинез. Результатом будет маленькая клетка (ПБ) рядом с яйцеклеткой и в пределах общей зоны пеллюцида. Просмотр изображений с помощью программного обеспечения для обработки изображений (ImageJ, см. Таблица материалов).
  7. Импортируйте последовательность изображений в программное обеспечение для анализа изображений и выдвигайте кадры до тех пор, пока одна или несколько клеток не пройдут через асимметричный цитокинез. Рассчитайте процент ооцитов, которые выдавливают ПБ от общего количества ооцитов17.

3. Мониторинг паттерна деградации Securin-gfp во время мейотического созревания

  1. Центрифуга 3 мкл кРНК Securin-Gfp (стадия 1.2) при 19,283 х г в течение 30 мин при 4 °C18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте супернатант, чтобы избежать загрузки примесей, которые могут вызвать закупорку иглы во время микроинъекции.
  2. Следуйте пошаговой микроинъекции ооцитов, подробно описанной в ссылке12. Микроинъекционные профазные I-арестованные ооциты со 100 нг/мкл цекурин-гфп цРНК, полученные на стадии 1.2.
  3. После микроинъекции дайте ооцитам восстановиться и перевести РНК в инкубаторСО2 в течение не менее 3 ч. Проверьте экспрессию, наблюдая за ооцитами в автоматизированной многоканальной флуоресцентной системе визуализации (см. Таблицу материалов) для просмотра сигнала GFP.
  4. Как описано на этапе 2.2, загрузка 150 мкл культуральной среды с или без 5 мкМ нокодазола и 150 мкл культуральной среды с 0,5 мкМ реверсина в трех различных скважинах 96-луночной пластины.
  5. Промывайте микроинъекционные ооциты через шесть капель культуральных сред без милринона и переносите 1/3 ооцитов в каждую обработку.
  6. Держите пластину в инкубаторе при температуре 37 °C, с влажностью 5% CO2 и 80% до тех пор, пока ооциты не возобновятся мейозом, примерно через 3 ч после промывания милриноном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стереомикроскоп с увеличением между 30x-64x для оценки разрушения ядерной оболочки как отличительной черты мейотического возобновления.
  7. Запись изображений созревания ооцитов с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного камерой инкубатора, как описано на этапе 2.6. Используйте настройки яркого поля, чтобы найти ооциты в колодце. Используйте фильтр 488 для обнаружения сигнала Securin-gfp и регулировки интенсивности флуоресценции, чтобы избежать чрезмерного воздействия на клетки.
    1. Если система визуализации автоматизирована, сохраните положения ооцитов в каждой лунке. Поскольку Securin-gfp равномерно распределяется в цитоплазму, захватывают изображения в средней плоскости ооцитов с интервалом 20 мин в течение 24 ч. Чтобы запечатлеть группы ооцитов на одном снимке, используйте объектив с меньшим увеличением, такой как 10x.
  8. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки разрушения Securin-gfp. Откройте изображения канала GFP. Начните с точки времени 1. В предпочтительном программном обеспечении для анализа используйте инструмент выделения или формы, чтобы отметить каждую яйцеклетку и сгенерировать интересующую область (ROI) для каждой клетки.
    1. Используйте ту же рентабельность инвестиций, чтобы выбрать фоновую область, которая будет вычтена позже. Измерьте интенсивность пикселей GFP в каждом ROI.
  9. Используя ROI для каждого ооцита, сгенерированного на шаге 3.8, измерьте интенсивность GFP во всех временных точках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых программах вкладка «Анализ» позволяет выбрать функцию «Измерение».
    1. Затем перейдите к следующему таймфрейму и повторите этот процесс, чтобы измерить интенсивность GFP в каждом таймфрейме. Наконец, из каждого значения GFP вычтите измерение ROI в фоновом режиме, выбранном на шаге 3.8. Этот анализ даст значение интенсивности Securin-gfp для каждого ооцита в каждый момент времени.
  10. Извлеките различные параметры из паттерна разрушения Securin: (a) время начала деградации Securin-gfp. Это говорит о том, когда началось замалчивание SAC; (b) время минимального сигнала Securin-gfp. Это говорит о том, когда глушение SAC упало ниже порогового уровня, чтобы обеспечить высокую активацию APC / C и полную деградацию Securin-GFP; c) скорость разрушения Securin-gfp19. Это говорит о том, как быстро активность SAC падает ниже порогового уровня для активации APC / C и деградации Securin-GFP.

4. Рекрутирование MAD2 у кинетохоров иммунофлуоресценцией при мейотическом созревании

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора и созревания ооцитов обратитесь к ранее опубликованному отчету12.

  1. Расщепление ооцитов на три группы. Переведите каждую группу ооцитов в 100 мкл капель культуральной среды без милринона. Залейте капли минеральным маслом и поместите их в инкубатор (37 °C, 5% CO2 и 80% влажности) на 3 ч, 5 ч и 7 ч, чтобы достичь ранней прометафазы I, поздней прометафазы I и метафазы I стадии соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите каждую точку времени в другую посуду, чтобы избежать извлечения одного и того же блюда из инкубатора несколько раз, что влияет на регулярные сроки созревания мейотии.
  2. В назначенные моменты времени фиксируют ооциты, перенося их в 500 мкл капель 2% PFA в 1x буфере PHEM в течение 20 мин при комнатной температуре, используя стеклянную посуду с 9 лунками, как описано ранее20. Затем переложите клетки в чистый колодец, содержащий 500 мкл капли блокирующего раствора (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав PHEM: трубы 60 мМ; 25 мМ HEPES; 10 мМ ЭГТА; и 2 мМMgCl2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой точке можно остановиться и хранить ооциты в блокирующем растворе в 9-луночной пластине при 4 °C до удобного времени для завершения иммунофлуоресценции.
  3. Для продолжения обнаружения MAD2 переводят ооциты в чистую лунку, содержащую каплю пермеабилизационного раствора объемом 500 мкл (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3). Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем перенести клетки в новую лунку блокирующего раствора и инкубировать в течение 10 мин.
  4. Для остальных стадий иммунофлуоресценции используйте крышку для посуды с 96 лунками с углублениями, как описано ранее20. Используйте увлажненную темную камеру, чтобы избежать воздействия света и испарения. Переведите ооциты в каплю блокирующего раствора объемом 30 мкл с антителом анти-MAD2 (1:1000, кролик) и антицентромерным антителом (ACA) (1:30, человек) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка для посуды на 96 лунок позволяет одновременно обрабатывать несколько белков и групп.
  5. Чтобы промыть избыток первичных антител, переместите клетки в 30 мкл капли 1x буфера PHEM, дополненного 0,5% тритоном, и инкубируйте в течение 10 мин в увлажненной камере. Повторите этот шаг еще два раза.
  6. Выполняют четвертую промывку, перенося клетки в каплю 30 мкл 1x буфера PHEM без 0,5% 1x Тритона, и инкубируют в течение 10 мин.
  7. Переместите клетки в 30 мкл капли блокирующего раствора, содержащего вторичные антитела, такие как античеловек-633 (1:200) и анти-кролик-568 (1:200) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите комбинацию флуорофоров на основе лазеров или фильтров вашего микроскопа.
  8. Чтобы промыть избыток вторичных антител, повторите шаги 4,5-4,6.
  9. Чтобы установить клетки на предметное стекло микроскопа, перенесите клетки на 10 мкл монтажной среды, содержащей DAPI (0,1 мг/мл) (см. Таблицу материалов). Добавьте небольшие точки вазелина в каждый угол крышки, аккуратно поместите их поверх монтажного носителя и медленно нажмите, чтобы распределить. Используйте прозрачный лак для ногтей, чтобы закрепить крышку на слайде. Более подробное описание процесса монтажа см. в ссылке20.
  10. Изображение кинетохоров с помощью конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов), оснащенного объективом 40x или 63x. Используя сигнал ACA, определите z-диапазон, который позволяет визуализировать всю область хромосомы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптический зум 4,0 и размер z-шага 0,5 мкм могут использоваться в некоторых системах визуализации. Эти параметры могут варьироваться от системы к системе, и потребуется оптимизация.
  11. Анализ интенсивности MAD2 на кинетохорах с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Сделайте максимальную проекцию z-стека, а затем разделите каналы.
  12. Во-первых, создайте маску с помощью канала ACA, выбрав канал ACA, чтобы установить пороговое значение, которое идентифицирует все кинетохорные сигналы. Перейдите на вкладку редактирования и создайте выделенную область. Затем создайте рентабельность инвестиций с этим выбором.
  13. Выберите канал MAD2 и введите выборку, созданную на шаге 4.12. Выберите пороговый метод, который лучше адаптируется к сигналу MAD2. Измерьте интенсивность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите пороговый метод в контрольной обработке и сохраняйте его постоянным при анализе различных методов лечения.
  14. Чтобы произвести расчет относительной интенсивности пикселей, разделите интенсивность каждой клетки на среднюю интенсивность ооцитов WT в эксперименте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оценка чувствительности SAC при лечении нокодазолом
Целью данного эксперимента является оценка активации и силы SAC. При использовании нокодазола для деполимеризации микротрубочек веретена все кинетохоры будут не прикреплены, что вызовет остановку клеточного цикла, опосредованную SAC. В настоящей системе визуализации контрольные ооциты, обработанные ДМСО, экструдировали полярное тело примерно через 14 ч после высвобождения из милринона (рисунок 1, верхние панели). В соответствии с активацией SAC, ооциты, обработанные нокодазолом, останавливались в метафазе I и не экструдировали полярное тело (рисунок 1, средние панели). Чтобы продемонстрировать, что этот анализ является надежным индикатором активности SAC, для предотвращения активации SAC21 был использован реверсин, ингибитор MPS1. Когда SAC не может активироваться, ооциты экструдируют полярное тело, несмотря на отсутствие прикреплений KT-MT (рисунок 1, нижние панели). Ооциты с ослабленным SAC будут иметь смесь исходов - некоторые ооциты останавливаются, а некоторые выдавливают полярные тела17. Этот метод созревания мышиных ооцитов с нокодазолом и без него может быть использован в качестве первого и простого шага для оспаривания активации SAC.

Картина деградации Securin-gfp при мейотическом созревании
Одним из последующих событий, последовавших за удовлетворенностью и замалчиванием SAC, является активация APC/C, что приводит к деградации Securin22. Таким образом, оценка картины деградации секурина является прямым считыванием функции SAC и должна проводиться для определения того, был ли результат нокодазола SAC-зависимым возмущением. Этот анализ включает эктопическую экспрессию Securin-gfp в ооциты и последующую визуализацию живых клеток. После создания кривой, следующей за деградацией секурина, можно определить три параметра: а) время начала деградации (глушение); (b) время, необходимое для достижения минимального уровня Securin; и с) темпы деградации (диаграмма 2А). В контроле, обработанных ДМСО ооцитами, интенсивность Securin-gfp начинает снижаться через ~10 ч после вымывания милринона (рисунок 2B,C). Когда ооциты созревали в присутствии SAC-активирующего агента нокодазола, уровни Securin-gfp были стабильными в течение всего периода мейотического созревания. Напротив, при профилактике активации SAC при лечении реверсином картина Securin-gfp ускорялась; деградация началась через ~4 ч после вымывания милринона, что согласуется с ингибированием SAC (рисунок 2B, C).

Рекрутирование MAD2 в кинетохоры иммунофлуоресценцией во время мейотического созревания
Если данные подтверждают дефект в функции SAC, следующим шагом является оценка набора ключевых посредников SAC. SAC активируется в ответ на неприкрепленные кинетохоры. Кинетохоры часто не прикрепляются в начале прометафазы, когда веретено строится, и неправильные крепления дестабилизируются для коррекции. Как только кинетохоры стабильно прикреплены к микротрубочкам, SAC заглушается, чтобы обеспечить начало анафазы22. Ранним шагом в ответе SAC является набор серии белков в кинетохоры, которые служат платформой для формирования MCC22,23. Оценка локализации этих компонентов SAC на кинетохоры является еще одной стратегией оценки реакции SAC. Например, оценка MAD2, компонента MCC, является распространенным подходом. Можно использовать изображения конфокального микроскопа, обнаруживающие центромеры (ACA) и MAD2 ооцитов, созревших до ранней прометафазы I, поздней прометафазы I и метафазы I (рисунок 3A). Чтобы оценить силу сигнала SAC, количественно оцените KT-локализованную интенсивность пикселей MAD2 (рисунок 3B). Значительные уровни набора MAD2 в КТ происходят в начале прометафазы I, когда большинство КТ не прикреплены к МТ. Уровни MAD2 снижались в более поздней прометафазе и почти отсутствовали на метафазе I, когда все КТ были стабильно прикреплены к МТ (рисунок 3A,B). Таким образом, этот метод может оценивать реакцию SAC в сочетании с двумя другими анализами.

Figure 1
Рисунок 1: Оценка активации SAC с нокодазолом. Репрезентативные изображения с помощью покадровой визуализации ооцитов, созревших в присутствии DMSO (контроль), нокодазола 5 мкМ (NOC) или 5 мкМ нокодазола + 0,5 мкМ реверсина (NOC + REV). Красный квадрат указывает временные рамки экструзии полярного тела. Были проанализированы два независимых эксперимента. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схема деградации Securin-gfp. (A) Схема кривой деградации Securin-gfp с тремя параметрами, которые могут быть изучены. (B) Репрезентативные изображения из покадровой фазы ооцитов, микроинъецированных с кРНК Securin-gfp и созревших в присутствии DMSO (контроль), 5 мкМ нокодазола или 0,5 мкМ реверсина. Красный квадрат указывает временные рамки экструзии полярного тела. Шкала бара = 50 мкм. (C) Репрезентативная кривая деградации Securin-gfp микроинъецированных с securin-gfp цРНК и созревших в присутствии DMSO (синие круги), 5 мкМ нокодазола (розовые квадраты) или 0,5 мкМ реверсина (черные треугольники). Полосы ошибок = стандартная ошибка. количество ооцитов на лечение: ДМСО = 10; НОК = 15; REV = 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Рекрутирование MAD2 к кинетохорам во время мейотического созревания ооцитов. (A) Репрезентативные конфокальные изображения ооцитов, созревших до ранней прометафазы I, поздней прометафазы I и метафазы I, иммуноокрашенные для обнаружения MAD2 (серый) и кинетохор (ACA) (красный). Шкала бара = 10 мкм; вставка: 2 мкм. (B) Количественная оценка относительной интенсивности MAD2 по изображениям в (A). Полосы ошибок = стандартная ошибка. (C) Схема неприсоединенного пути активации кинетохора и SAC. количество ооцитов за точку времени: ранняя прометафаза I = 23; Поздняя прометафаза I = 13; Метафаза I = 18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Контрольная точка сборки веретена является критическим механизмом управления во время деления клеток, предназначенным для предотвращения ошибок сегрегации хромосом. Это позволяет ячейке иметь достаточно времени для исправления неправильных насадок KT-MT. Мейоз в ооцитах является подверженным ошибкам процессом, при котором большая часть неправильного разделения хромосом происходит во время мейоза I, что приводит к генерации анеуплоидных яйцеклеток, которые являются основной причиной ранних выкидышей и бесплодия у людей 1,24. Несколько гипотез проверяются, чтобы разобраться, почему женский мейоз имеет ошибки. Одна из потенциальных причин заключается в том, что SAC менее эффективен, чем в соматических клетках, и позволяет начинать анафазу с одним или несколькими неправильно прикрепленнымиKTs 9,10,25. Поэтому необходимо всестороннее изучение механизмов SAC в ооцитах и выявление ключевых регуляторов, чтобы понять процесс генерации эуплоидной яйцеклетки.

Настоящий протокол описывает три метода оценки различных аспектов целостности SAC: активацию и глушение. Поскольку каждый из этих анализов имеет некоторые ограничения в интерпретации, проведение только одного недостаточно для характеристики функции SAC в ооцитах. По этой причине предлагается выполнить комбинацию этих методов для оценки целостности SAC в исследовании.

Оценка активации SAC с использованием нокодазола проста, потому что она проста и быстра. Тем не менее, есть некоторые важные моменты, которые следует учитывать при интерпретации результатов. Во-первых, исследователь должен установить концентрацию нокодазола, чтобы полностью деполимеризовать микротрубочки веретена для генерации неприкрепленных кинетохор и активации SAC. Успешная потеря микротрубочек может быть определена путем фиксации ооцитов и обнаружения тубулина с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии20. Другим критическим ограничением этого метода является считывание этого анализа: экструзия первого полярного тела (PBE). Недостаточность ПБЭ не обязательно может быть достаточным доказательством функции SAC, потому что, если исследуемый белок влияет на более поздние стадии, такие как цитокинез и абсциссия, результатом также будет отказ ПБЭ. Поэтому используйте лечение нокодазолом в качестве первого шага для оценки дефектов SAC, но затем сочетайте его с другими описанными методами.

Как только КТ стабильно прикрепляются к МТ и хромосомы выравниваются на метафазной пластине, SAC заглушается, а APC / C активируется, что приводит к деградации Securin и Cyclin B. Таким образом, отслеживание картины деградации Securin или Cyclin B является обычно используемым показателем глушения SAC 25,26,27. Изменение картины деградации дает информацию об ускорении или задержке клеточного цикла. Ускорение предполагает слабый SAC, тогда как задержка предполагает дефекты в удовлетворении SAC. Ограничением этого эксперимента является то, что он требует установки микроинъекции и специализированного набора навыков. Обратите внимание, что титрование надлежащей концентрации цРНК Securin-gfp, используемой для микроинъекции, имеет решающее значение, так как слишком много остановит клеточный цикл28.

Наконец, оценка набора MAD2 в кинетохоры является показателем и мерой активации SAC. Картина рекрутирования MAD2 во время мейоза I, с максимальными уровнями MAD2 у кинетохор на ранних прометафазах I и сниженными уровнями по мере прикрепления КТ. Как и в случае с деградацией Securin, любое изменение набора MAD2 в кинетохоры может указывать на ускорение или задержку глушения SAC. Дефекты при наборе MAD2 на ранних прометафазах могут указывать на сбои в механизме активации или набора29 или снижение количества MAD2 в ячейке17. Чтобы различать эти две возможности, настоятельно рекомендуется оценивать уровни экспрессии белка MAD2 с помощью вестерн-блоттинга 17. При сравнении двух или более методов лечения важно учитывать, что сроки мейотического созревания и выравнивания хромосом могут варьироваться в зависимости от лечения. Поэтому, во-первых, определите время клеточного цикла для каждого лечения, чтобы правильно сравнить уровни MAD2 и точно интерпретировать результаты. Одним из ограничений этого метода является то, что MAD2 является одним из последних эффекторов ответа SAC3. Поэтому оценка MAD2 не позволяет точно определить, какая часть механизма SAC нарушена. Для оценки механизмов SAC можно определить набор другого компонента SAC, такого как MPS1, BUB1 и/или комплекс RZZ (рисунок 3C). Еще один момент, который следует учитывать, заключается в том, что шаг фиксации является критическим. Эти анализы использовали 2% PFA в 1x буфере PHEM, фиксацию, которая работает для обнаружения кинетохорных белков в целых ооцитах. Тем не менее, другие лаборатории используют метод распространения хромосом, который был подробно описан до30.

Таким образом, в этой статье описаны три анализа, которые предоставляют важную информацию о способности клетки контролировать состояние прикрепления кинетохор-веретенообразных микротрубочек для точного контроля сегрегации хромосом. Эта информация важна для исследования сотовых ситуаций, когда SAC может быть скомпрометирован, чтобы понять, какой шаг контрольной точки нарушен. Поскольку анеуплоидия является общей чертой при гаметах и раке, эти инструменты применяются ко многим биологическим системам.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов для раскрытия.

Acknowledgments

Финансирование этого проекта было предоставлено Национальными институтами здравоохранения (R35GM136340 to KS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A4503
DAPI Life Technologies D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) Sigma D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 Life Technologies A10042
EVOS FL Auto Imaging System Life Technologies Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator Life Technologies Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated MatTek Corporation P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633 Life Technologies A21091
HEPES Sigma H3537
Human anti-ACA Antibodies Incorporated 15-234 Dilution 1/30
ImageJ NIH
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective Leica
MgSO4·7H20 Sigma M7774
Milrinone Sigma M4659
Na2HPO4 Sigma S2429
NaCl Sigma S5886
NaN3 Sigma S2002
Nocodazole Sigma M1404
Paraformaldhyde (PFA) Sigma P6148
PIPES Sigma P6757
Rabbit anti- MAD2 Biolegend 924601 Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine Cayman Chemical 10004412
Triton-X Sigma 274348
Tween-20 Sigma X100
Vectashield Vector laboratories H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
  3. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  4. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
  5. London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
  6. Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
  7. Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  8. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  9. Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
  10. Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
  11. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  12. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
  13. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
  14. Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
  15. Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
  16. Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
  17. Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
  18. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  19. Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
  20. Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
  21. Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  22. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  23. Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
  24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
  25. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  26. Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
  27. Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
  28. Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
  29. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  30. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).

Tags

Биология развития выпуск 187
Оценка целостности контрольной точки сборки шпинделя в ооцитах мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aboelenain, M., Schindler, K.,… More

Aboelenain, M., Schindler, K., Blengini, C. S. Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (187), e64459, doi:10.3791/64459 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter