Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Utvärdering av spindelaggregatets kontrollpunktsintegritet i musoocyter

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64459
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

Summary

Fel i kromosomsegregering är en vanlig egenskap hos oocyter. Att studera spindelmonteringskontrollpunkten ger därför viktiga ledtrådar om de mekanismer som behövs för att producera friska ägg. Detta protokoll beskriver tre kompletterande analyser för att utvärdera spindelmonteringskontrollpunktsintegritet i musoocyter.

Abstract

Aneuploidi är den ledande genetiska avvikelsen som orsakar tidigt missfall och graviditetsfel hos människor. De flesta fel i kromosomsegregering som ger upphov till aneuploidi uppstår under meios i oocyter, men varför oocytmeios är felbenägen är fortfarande inte helt klarlagd. Under celldelning förhindrar celler fel i kromosomsegregering genom att aktivera spindelmonteringskontrollpunkten (SAC). Denna kontrollmekanism bygger på detektering av kinetochore (KT)-mikrotubuli (MT) fästen och avkänning av spänning genererad av spindelfibrer. När KT är oanslutna aktiveras SAC och förhindrar cellcykelprogression. SAC aktiveras först av MPS1-kinas, vilket utlöser rekrytering och bildning av det mitotiska kontrollpunktskomplexet (MCC), bestående av MAD1, MAD2, BUB3 och BUBR1. Därefter diffunderar MCC in i cytoplasman och sekvestrerar CDC20, en anafasfrämjande komplex / cyklosom (APC / C) aktivator. När KT fästs vid mikrotubuli och kromosomer är inriktade vid metafasplattan tystas SAC, CDC20 frigörs och APC / C aktiveras, vilket utlöser nedbrytningen av cyklin B och Securin, vilket möjliggör anafasstart. Jämfört med somatiska celler är SAC i oocyter inte lika effektivt eftersom celler kan genomgå anafas trots att de har obundna KT. Att förstå varför SAC är mer tillåtande och om denna tillåtlighet är en av orsakerna till kromosomsegregeringsfel i oocyter behöver fortfarande undersökas ytterligare. Detta protokoll beskriver de tre teknikerna för att omfattande utvärdera SAC-integritet i musoocyter. Dessa tekniker inkluderar användning av nokodazol för att depolymerisera MT för att utvärdera SAC-svaret, spåra SAC-tystnad genom att följa kinetiken för Securin-förstörelse och utvärdera rekryteringen av MAD2 till KT genom immunofluorescens. Tillsammans undersöker dessa tekniker mekanismer som behövs för att producera friska ägg genom att tillhandahålla en fullständig utvärdering av SAC-integriteten.

Introduction

Aneuploidi, som uppstår på grund av fel i kromosomsegregering, är den främsta orsaken till tidiga missfall och är starkt kopplad till misstag i meios1. Meios skiljer sig från mitos eftersom den består av två omgångar av celldelning utan ett mellanliggande DNA-replikationssteg. I meios I separeras homologa kromosomer medan systerkromatider förblir tillsammans. I oocyter är detta steg felbenäget, vilket leder till aneuploid äggproduktion2.

För att förhindra kromosomsegregeringsfel aktiverar de flesta celltyper en övervakningsmekanism som pausar cellcykeln, kallad spindelmonteringskontrollpunkt (SAC). Denna mekanism känner av kinetochore (KT)-mikrotubuli (MT) fästen och spänningen genereras när kromosomer är orienterade på ett bipolärt sätt3. Fria kinetokorer utlöser ett SAC-svar som börjar med rekryteringen av MPS1, SAC: s huvudregulator, till kinetokorer 3,4. MPS1 initierar rekryteringen av andra SAC-komponenter och fungerar som en plattform för att bilda det mitotiska kontrollpunktskomplexet (MCC). MCC, som består av MAD1, MAD2, BUB3 och BUBR1, diffunderar in i cytoplasman och hämmar APC / C-aktivering genom att sekvestrera dess aktivator CDC20. När alla kinetokorer är stabilt fästa vid MT och kromosomerna är inriktade vid metafasplattan, tystas SAC och MCC demonteras och frigör CDC20, vilket möjliggör APC / C-aktivering. Aktiv APC/C bryter ned Securin och cyklin B, två viktiga steg för att utlösa anafasdebut 5,6. I somatiska celler är SAC sträng eftersom den aktiveras av en enda obunden kinetochore och är tillräcklig för att inducera cellcykelstopp6. Under oocytmeios är dock SAC mer tillåtande och oocyter kan gå in i anafas I med en eller flera obundna kinetokorer 6,7,8,9,10. Att förstå varför SAC är mer tillåtande i oocyter är ett pågående fokusområde inom området. Mekanismer som orsakar defekter i SAC-aktivering eller SAC-tystnad kan leda till fel i kromosomsegregering eller långvarigt cellcykelstopp och celldöd. Därför är det viktigt att utvärdera mekanismerna som upprätthåller SAC-integriteten i oocyter för att förstå processen att bilda friska, euploida ägg.

Detta protokoll beskriver tekniker för att omfattande utvärdera SAC-integriteten i musoocytmeios genom att undersöka olika kritiska steg i kontrollpunkten. Först beskrivs utvärderingen av SAC-svaret efter inducering av SAC-aktivering. Denna aktivering uppnås genom att generera obundna kinetokorer med användning av nokodazol, ett läkemedel som depolymeriserar MTs11. För det andra beskrivs en metod för att övervaka SAC-ljuddämpning genom att spåra dynamiken i Securin-nedbrytning under äggmognad. Slutligen används en immunofluorescensbaserad analys för att mäta rekryteringen av MAD2, en av MCC-komponenterna, till kinetokorer. Tillsammans utvärderar dessa analyser SAC-integriteten under oocytens meiotiska mognad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla möss som användes i dessa protokoll var inrymda och uppfödda enligt Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (protokoll 201702497) och National Institutes of Health riktlinjer. Dessa tillsynsorgan godkände alla experimentella förfaranden som involverade djurstudier. Alla möss som användes i den aktuella studien var 6-8 veckor gamla CF-1-honor.

1. Experimentell förberedelse

  1. Innan SAC-utvärderingarna påbörjas, samla in musäggceller enligt den tidigare publicerade rapporten12. Dela upp insamlade oocyter i tre jämnt stora grupper och förvara dem i Chatot, Ziomek och Bavister (CZB) odlingsmedier som innehåller 2,5 μM milrinon (se materialförteckning) för att undvika meiotiskt återupptagande13.
    OBS: CZB sammansättning: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH2PO4; 1,2 mM MgSO4-7H 2O; 0,27 mM pyruvat; 1,7 mM CaCl2; 30,8 mM DL-mjölksyra; 7 mM Taurin; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO3; Gentamicin; och 0,3 % BSA.
  2. Bered cRNA för mikroinjektion enligt beskrivningen tidigare12,14. Amplifiera Securin-genen från cDNA klonat från musens germinala vesikeläggceller, följt av subkloning till pMDL2-vektorn innehållande Gfp-sekvens15,16.
    1. För att förbereda Securin-Gfp cRNA, linjärisera plasmiden med Nde I-matsmältningen. Utför in vitro-transkription genom att använda T3 RNA-polymeras och rena cRNA16.
      OBS: Förvara cRNA i alikvoter på 2-3 μL vid -80 °C tills användning.

2. Nokodazolbehandling och levande bildbehandling

  1. Bered 1 ml odlingssubstrat (CZB) innehållande 5 μM nokodazol (NOC), 1 ml odlingssubstrat med 5 μM NOC plus 0,5 μM reversin (NOC + REV) och 1 ml odlingssubstrat med dimetylsulfoxid (DMSO) (1:2000) som kontroll (se Materialförteckning).
  2. För äggmognad och levande avbildning, använd en 96-brunnsplatta förvärmd i inkubatorn vid 37 ° C, 5% CO2 och 80% fuktighet. I den första brunnen, ladda 150 μL av kontroll-DMSO-behandlingen; i den andra brunnen, ladda 150 μL NOC-behandling; och i den tredje brunnen, ladda 150 μL NOC + REV-behandling. Håll plattan i inkubatorn under samma förhållanden som ovan tills det behövs.
    Undvik att använda den första raden och den första kolumnen på plattan med 96 brunnar eftersom skuggan av kantlinjen stör bildernas kvalitet.
  3. För att starta meiotisk mognad, ta bort milrinon. Medan du tittar på oocyterna under ett stereomikroskop med förstoring mellan 30x-64x, tvätta milrinon ur mediet genom att sekventiellt överföra oocyterna genom sex droppar 100 μL milrinonfritt odlingsmedium innehållande DMSO och placera dem i motsvarande brunn på 96-brunnsplattan med en hand- eller munmanövrerad pipett.
    1. Räkna äggceller genom att plocka upp dem med en hand- eller mundriven pipett och leverera dem till nästa droppe för att undvika att förlora några. Oocyterna är enkla, stora (~ 80 μm i diameter) och runda celler. Kärnan kommer att visas som en knapp i mitten av cellen, och membranet och zona pellucida omger äggcellen.
      OBS: Överför oocyterna mellan droppar medan du flyttar minsta möjliga mängd vätska. Detta möjliggör optimalt avlägsnande av milrinon från odlingsmediet. Om oocyter misslyckas med att återuppta meios är det troligt att milrinonen inte avlägsnades effektivt.
  4. Upprepa samma process (steg 2.3) för NOC och NOC + REV-behandling.
  5. Avbilda äggcellerna med hjälp av ett ljusfältmikroskop utrustat med en inkubatorkammare med kontrollerad miljö under följande förhållanden: 37 °C, 5%CO2 och 80% luftfuktighet. Ta bilder på oocyternas mittplan med intervaller på 20 min i 24 timmar.
  6. Kvantifiera antalet oocyter som extruderar en polär kropp (PB) genom att identifiera cellerna som går igenom asymmetrisk cytokinese. Resultatet blir en liten cell (PB) bredvid ägget och inom den delade zona pellucida. Visa bilderna med hjälp av bildåtergivningsprogram (ImageJ, se Materialförteckning).
  7. Importera bildsekvens till bildanalysprogrammet och flytta fram ramarna tills en eller flera celler går igenom asymmetrisk cytokinese. Beräkna procentandelen oocyter som extruderar ett PB av summan av oocyter17.

3. Övervakning av mönstret för Securin-gfp-nedbrytning under meiotisk mognad

  1. Centrifugera 3 μl securin-Gfp cRNA (steg 1.2) vid 19,283 x g i 30 min vid 4 °C18.
    OBS: Använd supernatanten för att undvika att fylla på föroreningar som kan orsaka nålblockering under mikroinjektion.
  2. Följ steg-för-steg oocytmikroinjektion, utförligt beskrivet i referens12. Mikroinjicera profas I-arresterade oocyter med 100 ng/μl Securin-gfp cRNA beredda i steg 1.2.
  3. Efter mikroinjektion, låt oocyterna återhämta sig och översätta RNA i CO 2-inkubatorn i minst 3 timmar. Kontrollera uttrycket genom att observera oocyterna i ett automatiserat flerkanaligt fluorescensbildningssystem (se materialförteckning) för att se GFP-signalen.
  4. Som beskrivs i steg 2.2, fyll 150 μL odlingsmedia med eller utan 5 μM nokodazol och 150 μL odlingsmedia med 0,5 μM reversin i tre olika brunnar på en 96-brunnsplatta.
  5. Tvätta de mikroinjicerade oocyterna genom sex droppar milrinonfritt odlingsmedium och överför 1/3 av oocyterna till varje behandling.
  6. Håll plattan i inkubatorn vid 37 °C, med 5% CO2 och 80% luftfuktighet tills oocyterna återupptar meios, cirka 3 timmar efter milrinontvätt.
    OBS: Använd ett stereomikroskop med förstoring mellan 30x-64x för att utvärdera kärnhöljets uppdelning som ett kännetecken för meiotisk återupptagning.
  7. Registrera bilder av äggmognad med hjälp av ett fluorescensmikroskop utrustat med en inkubatorkammare enligt beskrivningen i steg 2.6. Använd brightfield-inställningar för att hitta oocyterna i brunnen. Använd ett 488-filter för att detektera Securin-gfp-signalen och justera fluorescensintensiteten för att undvika överexponering av cellerna.
    1. Om bildsystemet är automatiserat, spara oocyternas positioner i varje brunn. Eftersom Securin-gfp är jämnt fördelat i cytoplasman, ta bilder i oocyternas mittplan med intervaller om 20 minuter i 24 timmar. För att fånga grupper av oocyter i en bild, använd en objektivlins med lägre förstoring, till exempel 10x.
  8. Använd bildanalysprogramvara för att kvantifiera Securin-gfp-förstörelse. Öppna bilderna på GFP-kanalen. Börja vid tidpunkt 1. I den föredragna analysprogramvaran använder du ett markerings- eller formverktyg för att markera varje oocyt och generera en intresseregion (ROI) för varje cell.
    1. Använd samma ROI för att välja ett bakgrundsområde som ska subtraheras senare. Mät GFP-pixelintensiteten i varje ROI.
  9. Använd ROI för varje oocyt som genereras i steg 3.8, mät GFP-intensiteten i alla tidpunkter.
    OBS: I vissa program tillåter fliken "Analysera" valet av mätfunktionen.
    1. Gå sedan vidare till nästa tidsram och upprepa denna process för att mäta intensiteten hos GFP i varje tidsram. Slutligen, till varje GFP-värde, subtrahera mätningen av ROI i bakgrunden som valdes i steg 3.8. Denna analys kommer att ge ett värde för Securin-gfp-intensitet för varje oocyt vid varje tidpunkt.
  10. Extrahera olika parametrar från mönstret för Securin-destruktion: (a) den tid då Securin-gfp-nedbrytningen började. Detta berättar när SAC-tystnaden började; b) Tiden för minimisignalen Securin-GFP. Detta berättar när SAC-tystnad har sjunkit under en tröskelnivå för att möjliggöra hög APC / C-aktivering och fullständig Securin-GFP-nedbrytning; c) Graden av förstörelse av Securin-GFP19. Detta visar hur snabbt SAC-aktiviteten sjunker under en tröskelnivå för APC/C-aktivering och Securin-GFP-nedbrytning.

4. Rekrytering av MAD2 vid kinetokorer genom immunofluorescens under meiotisk mognad

OBS: För insamling och mognad av äggceller, se tidigare publicerad rapport12.

  1. Dela oocyter i tre grupper. Överför varje grupp av oocyter till 100 μL droppar milrinonfria odlingsmedier. Täck dropparna med mineralolja och placera dem i inkubatorn (37 °C, 5%CO2 och 80% luftfuktighet) i 3 timmar, 5 timmar och 7 timmar för att nå tidigt prometafas I, sen prometafas I respektive metafas I.
    OBS: Placera varje tidpunkt i en annan maträtt för att undvika att ta ut samma maträtt från inkubatorn flera gånger, vilket påverkar den vanliga tidpunkten för meiotisk mognad.
  2. Vid de tilldelade tidpunkterna, fixera oocyterna genom att överföra dem till 500 μL droppar 2% PFA i 1x PHEM-buffert i 20 minuter vid rumstemperatur, med en 9-brunns glasskål som tidigare beskrivits20. Överför sedan cellerna till en ren brunn som innehåller en 500 μL droppe blockerande lösning (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3).
    OBS: PHEM sammansättning: 60 mM RÖR; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; och 2 mM MgCl2.
    OBS: Man kan stanna vid denna punkt och förvara oocyterna i blockerande lösning i 9-brunnsplattan vid 4 ° C tills den lämpliga tiden för att slutföra immunofluorescens.
  3. För att fortsätta MAD2-detektionen, överför oocyterna till en ren brunn innehållande en 500 μL droppe permeabiliseringslösning (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3). Inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur och överför sedan cellerna till en ny brunn med blockerande lösning och inkubera i 10 minuter.
  4. För resten av immunofluorescensstegen, använd ett 96-brunns skållock med fördjupningar som tidigare beskrivits20. Använd en fuktad mörk kammare för att undvika ljusexponering och avdunstning. Överför oocyterna till en 30 μL droppe blockerande lösning med anti-MAD2-antikropp (1:1000, kanin) och anticentromer antikropp (ACA) (1:30, människa) (se materialtabell) och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur.
    OBS: Skållocket med 96 brunnar ger utrymme för bearbetning av flera proteiner och grupper samtidigt.
  5. För att tvätta överskott av primära antikroppar, överför cellerna till en 30 μL droppe 1x PHEM-buffert kompletterad med 0,5% Triton och inkubera i 10 minuter i den fuktade kammaren. Upprepa detta steg två gånger till.
  6. Utför den fjärde tvätten, överför cellerna till en 30 μL droppe 1x PHEM-buffert utan 0,5% 1x Triton och inkubera i 10 minuter.
  7. Överför cellerna till en 30 μl droppe blockerande lösning innehållande sekundära antikroppar såsom anti-human-633 (1:200) och anti-kanin-568 (1:200) (se materialtabell) och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
    OBS: Välj kombinationen av fluoroforer baserat på dina mikroskoplasrar eller filter.
  8. För att tvätta överskott av sekundära antikroppar, upprepa steg 4.5-4.6.
  9. För att montera cellerna på mikroskopglaset, överför cellerna till en 10 μL droppe monteringsmedia innehållande DAPI (0,1 mg / ml) (se materialförteckning). Lägg till små prickar av vaselin i varje hörn av täckglaset, placera dem försiktigt ovanpå monteringsmediedroppen och tryck långsamt för att fördela. Använd genomskinligt nagellack för att försegla täckglaset till bilden. För en mer detaljerad beskrivning av monteringsprocessen, se referens20.
  10. Bildkinetokorer med hjälp av ett konfokalmikroskop (se materialförteckning) utrustat med ett 40x eller 63x objektiv. Använd ACA-signalen för att bestämma z-området som möjliggör avbildning av hela kromosomområdet.
    OBS: En optisk zoom på 4,0 och z-stegstorlek på 0,5 μm kan användas på vissa bildsystem. Dessa parametrar kan variera från system till system, och optimering kommer att vara nödvändig.
  11. Analysera MAD2-intensitet vid kinetokorer med hjälp av bildanalysprogram. Gör en z-stack maximal projektion och dela sedan kanalerna.
  12. Skapa först en mask med ACA-kanalen genom att välja ACA-kanalen för att upprätta ett tröskelvärde som identifierar alla kinetokorsignaler. Gå till redigeringsfliken och skapa ett urval. Skapa sedan en ROI med det här valet.
  13. Välj MAD2-kanalen och ta med markeringen som skapades i steg 4.12. Välj en tröskelmetod som bättre anpassar sig till MAD2-signalen. Mät intensiteten.
    OBS: Välj tröskelmetoden i kontrollbehandlingen och håll den konstant när du analyserar olika behandlingar.
  14. För att göra relativa pixelintensitetsberäkningar, dela intensiteten för varje cell med den genomsnittliga intensiteten hos WT-oocyterna i experimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utvärdering av SAC-respons genom nokodazolbehandling
Syftet med detta experiment är att utvärdera SAC-aktivering och styrka. Genom att använda nocodazol för att depolymerisera spindelmikrotubuli kommer alla kinetokorer att lossas, vilket kommer att orsaka ett SAC-medierat cellcykelstopp. I det nuvarande bildsystemet extruderade DMSO-behandlade kontrolloocyter en polär kropp cirka 14 timmar efter frisättning från milrinon (figur 1, övre paneler). I överensstämmelse med SAC-aktivering stannade nokodazolbehandlade oocyter i metafas I och extruderade inte en polär kropp (figur 1, mittpaneler). För att visa att denna analys är en tillförlitlig indikator på SAC-aktivitet användes reversin, en MPS1-hämmare, för att förhindra SAC-aktivering21. När SAC inte kan aktiveras extruderade oocyter en polär kropp trots att de inte hade några KT-MT-fästen (figur 1, nedre paneler). Oocyter med en försvagad SAC kommer att ha en blandning av resultat - vissa oocyter arresterar och vissa extruderar polära kroppar17. Denna metod för att mogna musäggceller med och utan nokodazol kan användas som ett första och enkelt steg för att utmana SAC-aktivering.

Mönster av Securin-gfp-nedbrytning under meiotisk mognad
En av händelserna nedströms efter SAC-tillfredsställelse och ljuddämpning är aktiveringen av APC/C, vilket leder till nedbrytning av Securin22. Därför är utvärdering av mönstret för Securin-nedbrytning en direkt avläsning av SAC-funktionen och bör utföras för att avgöra om nokodazolresultatet var en SAC-beroende störning. Denna analys involverar ektopiskt uttryck av Securin-gfp i oocyter och efterföljande levande cellavbildning. Efter att ha gjort en kurva som följer Securins nedbrytning kan tre parametrar bestämmas: (a) Starttiden för nedbrytning (ljuddämpning); b) Den tid det tar att nå Securins miniminivå. och c) nedbrytningshastigheten (figur 2A). I kontrollen, DMSO-behandlade oocyter, börjar Securin-gfp-intensiteten minska vid ~ 10 timmar efter milrinontvätt (figur 2B, C). När oocyter mognade i närvaro av det SAC-aktiverande medlet nokodazol var securin-gfp-nivåerna stabila under hela perioden av meiotisk mognad. Däremot accelererade Securin-gfp-mönstret när SAC-aktivering förhindrades med reversin behandling; nedbrytningen började vid ~4 timmar efter tvättning av milrinon, i överensstämmelse med SAC-hämning (figur 2B,C).

Rekrytering av MAD2 till kinetokorer genom immunofluorescens under meiotisk mognad
Om uppgifterna stöder en defekt i SAC-funktionen är nästa steg att utvärdera rekryteringen av viktiga SAC-medlare. SAC aktiveras som svar på obundna kinetokorer. Kinetokorer lossas ofta i tidig prometafas när spindeln byggs upp, och felaktiga fästen destabiliseras för korrigering. När kinetokorer är stabilt fästa vid mikrotubuli tystas SAC för att tillåta anafasstart22. Ett tidigt steg i SAC-svaret är rekryteringen av en serie proteiner till kinetokorer som fungerar som en plattform för MCC-bildning22,23. Utvärdering av lokaliseringen av dessa SAC-komponenter till kinetokorer är en annan strategi för att utvärdera SAC-svar. Till exempel är utvärdering av MAD2, en MCC-komponent, ett vanligt tillvägagångssätt. Konfokala mikroskopbilder som detekterar centromerer (ACA) och MAD2 av oocyter mogna till tidig prometafas I, sen prometafas I och metafas I kan användas (figur 3A). För att utvärdera styrkan hos SAC-signalen, kvantifiera den KT-lokaliserade MAD2-pixelintensiteten (figur 3B). Betydande nivåer av MAD2-rekrytering till KT sker i tidig prometafas I när de flesta KT inte är knutna till MT. Nivåerna av MAD2 minskade i senare prometafas och var nästan frånvarande vid metafas I när alla KT var stabilt kopplade till MT (figur 3A, B). Därför kan denna metod utvärdera SAC-svar i kombination med de andra två analyserna.

Figure 1
Figur 1: Bedömning av SAC-aktivering med nokodazol. Representativa bilder från timelapse-avbildning av oocyter mogna i närvaro av DMSO (kontroll), 5 μM nokodazol (NOC) eller 5 μM nokodazol + 0,5 μM reversin (NOC + REV). Den röda fyrkanten anger tidsramen för polarkroppsextrudering. Två oberoende experiment analyserades. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Nedbrytningsmönster för securin-gfp. (A) Schematisk bild av nedbrytningskurvan för Securin-gfp med tre parametrar som kan undersökas. (B) Representativa bilder från en tidsfördröjning av oocyter som mikroinjicerats med securin-gfp cRNA och mognat i närvaro av DMSO (kontroll), 5 μM nokodazol eller 0,5 μM reversin. Den röda fyrkanten anger tidsramen för polarkroppsextrudering. Skalstapel = 50 μm. (C) Representativ Securin-gfp-nedbrytningskurva för oocyter mikroinjicerade med Securin-gfp cRNA och mognad i närvaro av DMSO (blå cirklar), 5 μM nokodazol (rosa rutor) eller 0,5 μM reversin (svarta trianglar). Felstaplar = standardfel. # av oocyter per behandling: DMSO = 10; NOC = 15; REV = 5. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: MAD2-rekrytering till kinetokorer under oocyt meiotisk mognad. (A) Representativa konfokala bilder av oocyter mogna till tidig prometafas I, sen prometafas I och metafas I, immunfärgade för att detektera MAD2 (grå) och kinetokorer (ACA) (röd). Skalstapel = 10 μm; infälld: 2 μm. (B) Kvantifiering av den relativa intensiteten av MAD2 från bilder i (A). Felstaplar = standardfel. c) En skiss över en fri aktiveringsväg för kinetochore och SAC. # av oocyter per tidpunkt: Tidig prometafas I = 23; Sen prometafas I = 13; Metafas I = 18. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spindelmonteringskontrollpunkten är en kritisk kontrollmekanism under celldelning utformad för att förhindra kromosomsegregeringsfel. Det gör att cellen får tillräckligt med tid för att korrigera felaktiga KT-MT-bilagor. Meios i oocyter är en felbenägen process, där det mesta av kromosomfelsegregeringen sker under meios I, vilket leder till generering av aneuploida ägg som är den främsta orsaken till tidiga missfall och infertilitet hos människor 1,24. Flera hypoteser testas för att reda ut varför kvinnlig meios har fel. En potentiell orsak är att SAC är mindre effektivt än i somatiska celler och tillåter anafasdebut med en eller flera felkopplade KT 9,10,25. Därför behövs en omfattande studie av SAC-mekanismer i oocyter och identifiering av viktiga regulatorer för att förstå processen att generera ett euploida ägg.

Detta protokoll beskriver tre tekniker för att utvärdera olika aspekter av SAC-integritet: aktivering och ljuddämpning. Eftersom var och en av dessa analyser har vissa begränsningar i tolkningen är det inte tillräckligt att utföra endast en för att karakterisera SAC-funktionen i oocyter. Av denna anledning föreslås att man utför en kombination av dessa metoder för att utvärdera SAC-integriteten i en studie.

Utvärdering av SAC-aktivering med nocodazol är enkel eftersom den är enkel och snabb. Det finns dock några viktiga punkter att tänka på när man tolkar resultaten. Först måste utredaren fastställa koncentrationen av nokodazol för att fullständigt depolymerisera spindelns mikrotubuli för att generera obundna kinetokorer och aktivera SAC. Framgångsrik förlust av mikrotubuli kan bestämmas genom fixering av oocyter och detektering av tubulin via immunofluorescensbaserad mikroskopi20. En annan kritisk begränsning av denna teknik är avläsningen av denna analys: extruderingen av den första polära kroppen (PBE). PBE-misslyckande behöver inte nödvändigtvis vara tillräckligt bevis på SAC-funktion, för om proteinet i studien påverkar senare stadier som cytokinese och abscission, kommer resultaten också att vara misslyckandet av PBE. Använd därför nokodazolbehandling som ett första steg för att utvärdera SAC-defekter, men samarbeta sedan med de andra beskrivna teknikerna.

När KT är stabilt fäst vid MT och kromosomerna är inriktade vid metafasplattan tystas SAC och APC / C aktiveras, vilket leder till nedbrytning av Securin och Cyclin B. Därför är spårning av mönstret för Securin eller Cyclin B-nedbrytning vanliga indikatorer på SAC-tystnad25,26,27. Förändring av nedbrytningsmönstret ger information om cellcykelns acceleration eller fördröjning. En acceleration tyder på en svag SAC, medan en fördröjning tyder på defekter i uppfyllandet av SAC. En begränsning med detta experiment är att det kräver en mikroinjektionsrigg och en specialiserad färdighetsuppsättning. Observera att titrering av rätt koncentration av Securin-gfp cRNA som används för mikroinjektion är kritisk, eftersom för mycket kommer att stoppa cellcykeln28.

Slutligen är utvärdering av rekryteringen av MAD2 till kinetokorer en indikator och ett mått på SAC-aktivering. Mönstret för MAD2-rekrytering under meios I, med maximala nivåer av MAD2 vid kinetokorer vid tidig prometafas I och minskade nivåer när KT fastnar. Liksom Securins nedbrytningsmönster kan varje förändring av rekryteringen av MAD2 till kinetokorer indikera acceleration eller fördröjning av SAC-tystnad. Defekter i MAD2-rekrytering vid tidig prometafas kan indikera fel i mekanismen för aktivering eller rekrytering29 eller minskade mängder MAD2 i cell17. För att skilja mellan dessa två möjligheter rekommenderas starkt att utvärdera nivåerna av MAD2-proteinuttryck av Western blot 17. När man jämför två eller flera behandlingar är det viktigt att tänka på att tidpunkten för meiotisk mognad och kromosomjustering kan variera mellan behandlingarna. Definiera därför först cellcykeltiden för varje behandling för att korrekt jämföra MAD2-nivåer och korrekt tolka resultaten. En begränsning med denna metod är att MAD2 är en av de sista effektorerna av SAC-svaret3. Bedömningen av MAD2 gör det därför inte möjligt att fastställa vilken del av SAC-mekanismen som störs. För att utvärdera SAC-mekanismer kan man bestämma rekryteringen av en annan SAC-komponent såsom MPS1, BUB1 och/eller RZZ-komplexet (figur 3C). En annan punkt att tänka på är att fixeringssteget är kritiskt. Dessa analyser använde 2% PFA i 1x PHEM-buffert, en fixering som fungerar för detektion av kinetokorproteiner i hela mount oocyter. Andra laboratorier använder dock en kromosomspridningsteknik som beskrevs utförligt före30.

Sammanfattningsvis beskrivs tre analyser som ger kritisk information om en cells förmåga att övervaka kinetochore-spindelmikrotubuli bindningsstatus för att kontrollera kromosomsegregering exakt i denna artikel. Denna information är viktig för att undersöka cellulära situationer där SAC kan äventyras för att få insikt i vilket steg i kontrollpunkten som störs. Eftersom aneuploidi är ett vanligt inslag i gameter och cancer gäller dessa verktyg för många biologiska system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konflikter att avslöja.

Acknowledgments

Finansiering för detta projekt tillhandahölls av National Institutes of Health (R35GM136340 till KS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A4503
DAPI Life Technologies D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) Sigma D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 Life Technologies A10042
EVOS FL Auto Imaging System Life Technologies Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator Life Technologies Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated MatTek Corporation P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633 Life Technologies A21091
HEPES Sigma H3537
Human anti-ACA Antibodies Incorporated 15-234 Dilution 1/30
ImageJ NIH
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective Leica
MgSO4·7H20 Sigma M7774
Milrinone Sigma M4659
Na2HPO4 Sigma S2429
NaCl Sigma S5886
NaN3 Sigma S2002
Nocodazole Sigma M1404
Paraformaldhyde (PFA) Sigma P6148
PIPES Sigma P6757
Rabbit anti- MAD2 Biolegend 924601 Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine Cayman Chemical 10004412
Triton-X Sigma 274348
Tween-20 Sigma X100
Vectashield Vector laboratories H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
  3. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  4. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
  5. London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
  6. Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
  7. Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  8. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  9. Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
  10. Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
  11. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  12. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
  13. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
  14. Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
  15. Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
  16. Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
  17. Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
  18. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  19. Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
  20. Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
  21. Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  22. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  23. Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
  24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
  25. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  26. Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
  27. Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
  28. Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
  29. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  30. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).

Tags

Utvecklingsbiologi nummer 187
Utvärdering av spindelaggregatets kontrollpunktsintegritet i musoocyter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aboelenain, M., Schindler, K.,… More

Aboelenain, M., Schindler, K., Blengini, C. S. Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (187), e64459, doi:10.3791/64459 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter