Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64459
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

Summary

Kromozom ayrışmasında hata, oositlerde yaygın bir özelliktir. Bu nedenle, iş mili montaj kontrol noktasının incelenmesi, sağlıklı yumurta üretmek için gereken mekanizmalar hakkında önemli ipuçları verir. Mevcut protokol, fare oositlerinde iş mili montaj kontrol noktası bütünlüğünü değerlendirmek için üç tamamlayıcı tahlil tanımlamaktadır.

Abstract

Anöploidi, insanlarda erken düşüklere ve gebelik başarısızlığına neden olan önde gelen genetik anormalliktir. Anöploidiye yol açan kromozom ayrışmasındaki hataların çoğu, oositlerde mayoz sırasında meydana gelir, ancak oosit mayozunun neden hataya eğilimli olduğu hala tam olarak anlaşılamamıştır. Hücre bölünmesi sırasında, hücreler iş mili montaj kontrol noktasını (SAC) etkinleştirerek kromozom ayrışmasındaki hataları önler. Bu kontrol mekanizması, kinetochore (KT)-mikrotübül (MT) ataşmanlarını algılamaya ve iğ lifleri tarafından üretilen gerilimi algılamaya dayanır. KT'ler takılı olmadığında, SAC etkinleştirilir ve hücre döngüsünün ilerlemesini önler. SAC ilk olarak MPS1 kinaz tarafından aktive edilir ve bu da MAD1, MAD2, BUB3 ve BUBR1'den oluşan mitotik kontrol noktası kompleksinin (MCC) işe alınmasını ve oluşumunu tetikler. Daha sonra, MCC sitoplazmaya yayılır ve anafazı teşvik eden karmaşık / siklozom (APC / C) aktivatörü olan CDC20'yi ayırır. KT'ler mikrotübüllere bağlandığında ve kromozomlar metafaz plakasında hizalandığında, SAC susturulur, CDC20 serbest bırakılır ve APC / C aktive edilir, Siklin B ve Sekürin'in bozulmasını tetikler, böylece anafaz başlangıcına izin verir. Somatik hücrelerle karşılaştırıldığında, oositlerdeki SAC o kadar etkili değildir, çünkü hücreler bağlanmamış KT'lere sahip olmalarına rağmen anafaza maruz kalabilirler. SAC'nin neden daha izin verici olduğunu ve bu izin vermenin oositlerde kromozom ayrışma hatalarının nedenlerinden biri olup olmadığını anlamak hala daha fazla araştırmaya ihtiyaç duymaktadır. Mevcut protokol, fare oositlerinde SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için üç tekniği açıklamaktadır. Bu teknikler arasında SAC yanıtını değerlendirmek için MT'leri depolimerize etmek için nokodazol kullanılması, Securin yıkımının kinetiğini takip ederek SAC susturulmasının izlenmesi ve MAD2'nin immünofloresan yoluyla KIT'lere alımının değerlendirilmesi yer almaktadır. Bu teknikler birlikte, SAC bütünlüğünün tam bir değerlendirmesini sağlayarak sağlıklı yumurta üretmek için gerekli mekanizmaları araştırır.

Introduction

Kromozom ayrışmasındaki hatalardan kaynaklanan anöploidi, erken düşüklerin önde gelen nedenidir ve mayoz1'deki hatalarla oldukça bağlantılıdır. Mayoz, mitozdan farklıdır, çünkü araya giren bir DNA replikasyon adımı olmadan iki tur hücre bölünmesinden oluşur. Mayoz I'de, homolog kromozomlar ayrılırken, kardeş kromatitler birlikte kalır. Oositlerde, bu adım hataya eğilimlidir ve anöploid yumurta üretimineyol açar 2.

Kromozom ayrışma hatalarını önlemek için, çoğu hücre tipi, iş mili montaj kontrol noktası (SAC) adı verilen hücre döngüsünü duraklatan bir gözetim mekanizmasını etkinleştirir. Bu mekanizma kinetochore (KT)-mikrotübül (MT) ataşmanlarını algılar ve kromozomlar bipolar bir şekilde yönlendirildiğinde gerilim oluşur3. Bağlanmamış kinetochores, SAC'nin ana regülatörü MPS1'in kinetochores 3,4'e işe alınmasıyla başlayan bir SAC yanıtını tetikler. MPS1, mitotik kontrol noktası kompleksini (MCC) oluşturmak için bir platform görevi gören diğer SAC bileşenlerinin işe alımını başlatır. MAD1, MAD2, BUB3 ve BUBR1'den oluşan MCC, sitoplazmaya yayılır ve aktivatörü CDC20'yi ayırarak APC / C aktivasyonunu inhibe eder. Tüm kinetochores MT'lere kararlı bir şekilde bağlandıktan ve kromozomlar metafaz plakasında hizalandıktan sonra, SAC susturulur ve MCC CDC20'yi söker ve serbest bırakır, böylece APC / C aktivasyonuna izin verir. Aktif APC / C, anafaz başlangıcı 5,6'yı tetiklemede iki önemli adım olan Sekürin ve Siklin B'yi bozar. Somatik hücrelerde, SAC sıkıdır, çünkü tek bir bağlanmamış kinetochore tarafından aktive edilir ve hücre döngüsü tutuklamasını indüklemek içinyeterlidir 6. Bununla birlikte, oosit mayozu sırasında, SAC daha izin verir ve oositler bir veya daha fazla bağlanmamış kinetochores 6,7,8,9,10 ile anafaz I'e girebilir. SAC'nin oositlerde neden daha izin verici olduğunu anlamak, bu alanda devam eden bir odak alanıdır. SAC aktivasyonunda veya SAC susturmasında kusurlara neden olan mekanizmalar, kromozom ayrışmasında hatalara veya uzun süreli hücre döngüsü durmasına ve hücre ölümüne neden olabilir. Bu nedenle, oositlerde SAC bütünlüğünü koruyan mekanizmaların değerlendirilmesi, sağlıklı, öploid yumurtaların oluşma sürecini anlamak için önemlidir.

Bu protokol, kontrol noktasının farklı kritik adımlarını inceleyerek fare oosit mayozunda SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için teknikleri açıklar. İlk olarak, SAC aktivasyonunu indükledikten sonra SAC yanıtının değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Bu aktivasyon, MTs11'i depolimerize eden bir ilaç olan nocodazole kullanılarak bağlanmamış kinetochores üretilerek elde edilir. İkincisi, SAC'nin susturulmasını izlemek için bir yöntem, oosit olgunlaşması sırasında Sekürin yıkımının dinamiklerini izleyerek açıklanmaktadır. Son olarak, MCC bileşenlerinden biri olan MAD2'nin kinetochores'e alımını ölçmek için immünofloresan tabanlı bir tahlil kullanılır. Birlikte, bu testler oosit mayotik olgunlaşması sırasında SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokollerde kullanılan tüm fareler, Rutgers Üniversitesi Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakım Komitesi (Protokol 201702497) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına göre barındırılmış ve yetiştirilmiştir. Bu düzenleyici kurumlar, hayvan çalışmalarını içeren tüm deneysel prosedürleri onayladı. Bu çalışmada kullanılan tüm fareler 6-8 haftalık CF-1 dişileriydi.

1. Deneysel hazırlık

  1. SAC değerlendirmelerine başlamadan önce, daha önce yayınlanan rapor12'yi takiben fare oositlerini toplayın. Toplanan yumurtaları eşit büyüklükte üç gruba bölün ve mayotikyeniden başlamayı önlemek için 2.5 μM milrinon içeren Chatot, Ziomek ve Bavister (CZB) kültür ortamlarında saklayın (bkz.
    NOT: CZB bileşimi: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH2PO4; 1.2 mM MgSO,4-7H 2O; 0.27 mM Piruvat; 1,7 mM CaCl2; 30,8 mM DL-Laktik Asit; 7 mM Taurin; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO3; Gentamisin; ve% 0.3 BSA.
  2. Daha önce tarif edildiği gibi mikroenjeksiyon için cRNA'yı hazırlayın 12,14. Fare Securin genini fare germinal vezikül oositlerinden klonlanan cDNA'dan yükseltin, ardından Gfp dizisi15,16'yı içeren pMDL2 vektörüne alt klonlama yapın.
    1. Securin-Gfp cRNA'yı hazırlamak için, plazmidi Nde I sindirimi ile doğrusallaştırın. T3 RNA polimeraz kullanarak ve cRNA16'yı saflaştırarak in vitro transkripsiyon gerçekleştirin.
      NOT: cRNA'yı kullanana kadar -80 °C'de 2-3 μL'lik alikotlarda saklayın.

2. Nokodazol tedavisi ve canlı görüntüleme

  1. Kontrol olarak 5 μM nokodazol (NOC), 5 μM NOC artı 0,5 μM reversin (NOC + REV) içeren 1 mL kültür ortamı ve Dimetil sülfoksit (DMSO) (1:2000) içeren 1 mL kültür ortamı (CZB) hazırlayın (bkz.
  2. Yumurta olgunlaşması ve canlı görüntüleme için, inkübatörde 37 ° C,% 5 CO2 ve% 80 nemde önceden ısıtılmış 96 delikli bir plaka kullanın. İlk kuyuda, kontrol DMSO tedavisinin 150 μL'sini yükleyin; ikinci kuyuda, 150 μL NOC tedavisi yükleyin; ve üçüncü kuyuda, 150 μL NOC + REV tedavisi yükleyin. Plakayı inkübatörde ihtiyaç duyulana kadar yukarıdakiyle aynı koşullar altında tutun.
    NOT: 96 delikli plakada, kenarlığın gölgesi görüntülerin kalitesini bozduğundan, ilk satırı ve ilk sütunu kullanmaktan kaçının.
  3. Mayotik olgunlaşmayı başlatmak için milrinonu çıkarın. Yumurtaları 30x-64x arasında büyütme kullanarak bir stereomikroskop altında görüntülerken, oositleri DMSO içeren altı damla 100 μL milrinon içermeyen kültür ortamından sırayla aktararak milrinonu ortamdan yıkayın ve elle veya ağızla çalışan bir pipet kullanarak 96 delikli plakanın ilgili kuyucuğuna yerleştirin.
    1. Oositleri, elle veya ağızdan çalıştırılan bir pipet kullanarak toplayarak ve herhangi bir kaybetmemek için bir sonraki damlaya teslim ederek sayın. Yumurtalar tek, büyük (~ 80 μm çapında) ve yuvarlak hücrelerdir. Çekirdek, hücrenin merkezinde bir düğme gibi görünecek ve zar ve zona pellucida oositi çevreleyecektir.
      NOT: Mümkün olan en az miktarda sıvıyı hareket ettirirken yumurtaları damlalar arasında aktarın. Bu, milrinonun kültür ortamından en uygun şekilde çıkarılmasını sağlar. Oositler mayoza devam edemezse, milrinonun etkili bir şekilde çıkarılmamış olması muhtemeldir.
  4. NOC ve NOC + REV tedavisi için aynı işlemi tekrarlayın (adım 2.3).
  5. Oositleri, şu koşullar altında kontrollü bir ortama sahip bir inkübatör odasıyla donatılmış parlak bir mikroskop kullanarak görüntüleyin: 37 ° C,% 5 CO2 ve% 80 nem. Oositlerin orta düzleminde 24 saat boyunca 20 dakikalık aralıklarla görüntü yakalayın.
  6. Asimetrik sitokinezden geçen hücreleri tanımlayarak polar bir cismi (PB) ekstrüzyon yapan oositlerin sayısını ölçün. Sonuç, yumurtanın yanında ve paylaşılan zona pellucida içinde küçük bir hücre (PB) olacaktır. Görüntüleri görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüleyin (ImageJ, bkz.
  7. Görüntü dizisini görüntü analiz yazılımına aktarın ve bir veya daha fazla hücre asimetrik sitokinezden geçene kadar çerçeveleri ilerletin. Toplam oosit17'nin PB'sini ekstrüzyon yapan oositlerin yüzdesini hesaplayın.

3. Mayotik olgunlaşma sırasında Securin-gfp bozunma paterninin izlenmesi

  1. 4 °C 18'de 30 dakika boyunca 19.283 x g'de 3 μL Securin-Gfp cRNA(adım1.2) santrifüj.
    NOT: Mikroenjeksiyon sırasında iğne tıkanmasına neden olabilecek yükleme safsızlıklarını önlemek için süpernatantı kullanın.
  2. Referans12'de kapsamlı bir şekilde açıklanan adım adım oosit mikroenjeksiyonunu takip edin. Adım 1.2'de hazırlanan 100 ng/μL Securin-gfp cRNA ile mikroenjekte edilen faz I-arrested oositler.
  3. Mikroenjeksiyondan sonra, oositlerin CO2 inkübatöründe RNA'yı en az 3 saat boyunca iyileşmesine ve çevirmesine izin verin. GFP sinyalini görüntülemek için oositleri otomatik çok kanallı floresan görüntüleme sisteminde gözlemleyerek ifadeyi kontrol edin (bkz.
  4. Adım 2.2'de açıklandığı gibi, 96 kuyucuklu bir plakanın üç farklı kuyucuğuna 5 μM nokodazol içeren veya olmayan 150 μL kültür ortamı ve 0,5 μM reversin içeren 150 μL kültür ortamı yükleyin.
  5. Mikroenjekte edilen oositleri altı damla milrinon içermeyen kültür ortamından yıkayın ve yumurtaların 1 / 3'ünü her tedaviye aktarın.
  6. Plakayı inkübatörde 37 ° C'de, oositler mayoza devam edene kadar% 5 CO2 ve% 80 nem ile, milrinon yıkamadan yaklaşık 3 saat sonra tutun.
    NOT: Nükleer zarf parçalanmasını mayotik yeniden başlatmanın bir işareti olarak değerlendirmek için 30x-64x arasında büyütmeli bir stereomikroskop kullanın.
  7. Adım 2.6'da açıklandığı gibi bir inkübatör odası ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak oosit olgunlaşmasının görüntülerini kaydedin. Kuyudaki yumurtaları bulmak için parlak alan ayarlarını kullanın. Securin-gfp sinyalini algılamak için bir 488 filtresi kullanın ve hücrelerin aşırı pozlanmasını önlemek için floresan yoğunluğunu ayarlayın.
    1. Görüntüleme sistemi otomatikse, oositlerin konumlarını her bir kuyucukta kaydedin. Securin-gfp sitoplazmaya eşit olarak dağıldığından, oositlerin orta düzleminde 24 saat boyunca 20 dakikalık aralıklarla görüntüler yakalayın. Bir resimdeki yumurta gruplarını yakalamak için, 10x gibi daha düşük büyütmeli bir objektif lens kullanın.
  8. Securin-gfp yıkımını ölçmek için görüntü analiz yazılımı kullanın. GFP kanalının görüntülerini açın. 1. zaman noktasından başlayın. Tercih edilen analiz yazılımında, her oositi işaretlemek ve her hücre için bir ilgi alanı (ROI) oluşturmak için bir seçim veya şekil aracı kullanın.
    1. Daha sonra çıkarılacak bir arka plan alanı seçmek için aynı YG'yi kullanın. Her YG'deki GFP piksel yoğunluğunu ölçün.
  9. Adım 3.8'de üretilen her oosit için ROI'leri kullanarak, GFP yoğunluğunu tüm zaman noktalarında ölçün.
    NOT: Bazı yazılım programlarında, "Analiz" sekmesi Ölçüm işlevinin seçilmesine izin verir.
    1. Ardından, bir sonraki zaman dilimine ilerleyin ve GFP'nin yoğunluğunu her zaman diliminde ölçmek için bu işlemi tekrarlayın. Son olarak, her GFP değerine, adım 3.8'de seçilen arka planda YG ölçümünü çıkarın. Bu analiz, her zaman noktasında her oosit için Securin-gfp yoğunluğu için bir değer verecektir.
  10. Securin yıkımı modelinden farklı parametreler çıkarın: (a) Securin-gfp bozunmasının başladığı zaman. Bu, SAC susturmanın ne zaman başladığını söyler; (b) Securin-gfp minimum sinyalinin zamanı. Bu, SAC susturmalarının yüksek APC / C aktivasyonuna ve tam Securin-GFP bozulmasına izin vermek için bir eşik seviyesinin altına ne zaman düştüğünü söyler; (c) Securin-gfp yıkım oranı19. Bu, SAC aktivitesinin APC / C aktivasyonu ve Securin-GFP bozunması için bir eşik seviyesinin altına ne kadar hızlı düştüğünü gösterir.

4. Mayotik olgunlaşma sırasında immünofloresan ile kinetochores'te MAD2 alımı

NOT: Yumurta toplanması ve olgunlaşması için, daha önce yayınlanmış rapor12'ye bakınız.

  1. Yumurtaları üç gruba ayırın. Her bir oosit grubunu 100 μL damla milrinon içermeyen kültür ortamına aktarın. Damlaları mineral yağ ile örtün ve sırasıyla erken prometafaz I, geç prometafaz I ve metafaz I aşamasına ulaşmak için 3 saat, 5 saat ve 7 saat boyunca inkübatöre (37 ° C,% 5 CO2 ve% 80 nem) yerleştirin.
    NOT: Aynı kabın inkübatörden birkaç kez çıkarılmasını önlemek için her zaman noktasını farklı bir kaba yerleştirin, bu da mayotik olgunlaşmanın düzenli zamanlamasını etkiler.
  2. Belirlenen zaman noktalarında, oositleri, daha önce tarif edildiği gibi 9 delikli bir cam tabak kullanarak, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1x PHEM tamponunda% 2 PFA'nın500 μL damlasına aktararak sabitleyin. Daha sonra, hücreleri 500 μL'lik bir blokaj çözeltisi damlası içeren temiz bir kuyuya aktarın (PBS +% 0.3 BSA +% 0.01 Ara-20 +% 0.02 NaN3).
    NOT: PHEM bileşimi: 60 mM BORULAR; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; ve 2 mM MgCl2.
    NOT: Bu noktada durabilir ve oositleri, immünofloresansı tamamlamak için uygun zamana kadar 4 ° C'de 9 delikli plakada bloke edici çözeltide saklayabilir.
  3. MAD2 tespitine devam etmek için, yumurtaları 500 μL'lik bir permeabilizasyon çözeltisi damlası içeren temiz bir kuyuya aktarın (PBS +% 0.3 BSA +% 0.1 TritonX-100 +% 0.02 NaN3). Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra hücreleri yeni bir bloke çözeltisi kuyusuna aktarın ve 10 dakika boyunca inkübe edin.
  4. İmmünofloresan adımlarının geri kalanı için, daha önce tarif edildiği gibi girintili 96 kuyucuklu bir bulaşık kapağı kullanın20. Işığa maruz kalmayı ve buharlaşmayı önlemek için nemlendirilmiş karanlık bir oda kullanın. Oositleri, anti-MAD2 antikoru (1:1000, tavşan) ve anti-sentromerik antikor (ACA) (1:30, insan) (bakınız Malzeme Tablosu) ile 30 μL'lik bir bloke edici çözeltiye aktarın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: 96 delikli çanak kapağı, aynı anda birkaç protein ve grubun işlenmesi için yer sağlar.
  5. Fazla birincil antikorları yıkamak için, hücreleri% 0.5 Triton ile desteklenmiş 30 μL'lik bir damla 1x PHEM tamponuna aktarın ve nemlendirilmiş odada 10 dakika boyunca inkübe edin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
  6. Dördüncü yıkamayı gerçekleştirin, hücreleri% 0.5 1x Triton olmadan 30 μL'lik bir damla 1x PHEM tamponuna aktarın ve 10 dakika boyunca inkübe edin.
  7. Hücreleri, anti-insan-633 (1:200) ve anti-tavşan-568 (1:200) gibi ikincil antikorlar içeren 30 μL'lik bir bloke çözeltisi damlasına aktarın (bkz.
    NOT: Mikroskop lazerlerinize veya filtrelerinize bağlı olarak florofor kombinasyonunu seçin.
  8. Fazla ikincil antikorları yıkamak için, 4.5-4.6 adımlarını tekrarlayın.
  9. Hücreleri mikroskop slaydına monte etmek için, hücreleri DAPI (0.1 mg / mL) içeren 10 μL'lik bir montaj ortamı damlasına aktarın (bkz. Kapak kapağının her köşesine küçük petrol jölesi noktaları ekleyin, bunları dikkatlice montaj ortamı damlasının üzerine yerleştirin ve dağıtmak için yavaşça bastırın. Kapak kapağını slayta kapatmak için şeffaf oje kullanın. Montaj işleminin daha ayrıntılı bir açıklaması için, referans20'ye bakın.
  10. 40x veya 63x objektifle donatılmış bir konfokal mikroskop (bakınız Malzeme Tablosu) kullanan görüntü kinetochorları. ACA sinyalini kullanarak, tüm kromozom alanının görüntülenmesini sağlayan z-aralığını belirleyin.
    NOT: Bazı görüntüleme sistemlerinde 4,0 optik yakınlaştırma ve 0,5 μm z adım boyutu kullanılabilir. Bu parametreler sistemden sisteme değişebilir ve optimizasyon gerekli olacaktır.
  11. Görüntü analiz yazılımını kullanarak kinetochores'teki MAD2 yoğunluğunu analiz edin. Bir z-stack maksimum projeksiyonu yapın ve ardından kanalları bölün.
  12. İlk olarak, tüm kinetochore sinyallerini tanımlayan bir eşik oluşturmak için ACA kanalını seçerek ACA kanalını kullanarak bir maske oluşturun. Düzenle sekmesine gidin ve bir seçim oluşturun. Ardından, bu seçimle bir yatırım getirisi oluşturun.
  13. MAD2 kanalını seçin ve adım 4.12'de oluşturulan seçimi getirin. MAD2 sinyaline daha iyi uyum sağlayan bir eşik yöntemi seçin. Yoğunluğu ölçün.
    NOT: Kontrol tedavisinde eşik yöntemini seçin ve farklı tedavileri analiz ederken sabit tutun.
  14. Göreceli piksel yoğunluğu hesaplamaları yapmak için, her hücrenin yoğunluğunu deneydeki WT oositlerinin ortalama yoğunluğuna bölün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NOKODAZOL tedavisi ile SAC yanıtının değerlendirilmesi
Bu deneyin amacı SAC aktivasyonunu ve gücünü değerlendirmektir. İş mili mikrotübüllerini depolimerize etmek için nokodazol kullanılarak, tüm kinetochores bağlanmamış olacak ve bu da SAC aracılı hücre döngüsü durmasına neden olacaktır. Mevcut görüntüleme sisteminde, DMSO ile tedavi edilen kontrol oositleri, milrinondan salındıktan yaklaşık 14 saat sonra polar bir gövdeyi ekstrüde etti (Şekil 1, üst paneller). SAC aktivasyonu ile tutarlı olarak, nokodazol ile tedavi edilen oositler metafaz I'de tutuklandı ve polar bir cisim ekstrüzyon yapmadı (Şekil 1, orta paneller). Bu tahlilin SAC aktivitesinin güvenilir bir göstergesi olduğunu göstermek için, SAC aktivasyonunu önlemek için bir MPS1 inhibitörü olan reversine21 kullanılmıştır. SAC aktive edemediğinde, oositler KT-MT ekleri olmamasına rağmen polar bir gövdeyi ekstrüde etmişlerdir (Şekil 1, alt paneller). Zayıflamış bir SAC'ye sahip oositler, sonuçların bir karışımına sahip olacaktır - bazı oositlerin tutuklanması ve bazıları polar cisimleri ekstrüzyonyapar 17. Nokodazollü ve nokodazolsüz fare oositlerini olgunlaştırmak için bu yöntem, SAC aktivasyonuna meydan okumak için ilk ve kolay bir adım olarak kullanılabilir.

Mayotik olgunlaşma sırasında Securin-gfp bozunma paterni
SAC memnuniyeti ve susturulmasını takip eden aşağı akış olaylarından biri, APC / C'nin etkinleştirilmesidir ve Securin bozulmasına yol açar22. Bu nedenle, Sekürin bozunma paterninin değerlendirilmesi, SAC fonksiyonunun doğrudan okunmasıdır ve nokodazol sonucunun SAC'ye bağımlı bir pertürbasyon olup olmadığını belirlemek için yapılmalıdır. Bu test, Securin-gfp'nin oositlere ektopik ekspresyonunu ve ardından canlı hücre görüntülemesini içerir. Securin bozunmasını takip eden bir eğri yapıldıktan sonra, üç parametre belirlenebilir: (a) Bozunmanın başlangıç zamanı (susturma); (b) Minimum Securin seviyesine ulaşmak için gereken süre; ve (c) bozulma oranı (Şekil 2A). DMSO ile tedavi edilen oositlerin kontrolünde, Sekürin-gfp yoğunluğu, milrinon yıkandıktan sonra ~10 saatte azalmaya başlar (Şekil 2B,C). SAC-aktive edici ajan nokodazol varlığında oositler olgunlaştığında, Securin-gfp seviyeleri tüm mayotik olgunlaşma döneminde stabildi. Buna karşılık, reversin tedavisi ile SAC aktivasyonunu önlerken, Securin-gfp paterni hızlandı; Bozunma, milrinon yıkamasından sonra SAC inhibisyonu ile tutarlı olarak ~ 4 saatte başladı (Şekil 2B, C).

Mayotik olgunlaşma sırasında immünofloresan ile MAD2'nin kinetochores'e alınması
Veriler SAC işlevindeki bir kusuru destekliyorsa, bir sonraki adım kilit SAC arabulucularının işe alımını değerlendirmektir. SAC, bağlanmamış kinetochorlara yanıt olarak etkinleştirilir. Kinetochores, iş mili inşa edildiğinden erken prometafazda genellikle bağlanmaz ve uygun olmayan ataşmanlar düzeltme için dengesizleştirilir. Kinetochours mikrotübüllere kararlı bir şekilde bağlandığında, SAC anafaz başlangıcı22'ye izin vermek için susturulur. SAC yanıtındaki erken bir adım, MCC oluşumu22,23 için bir platform görevi gören kinetochorlara bir dizi proteinin işe alınmasıdır. Bu SAC bileşenlerinin kinetochores'e lokalizasyonunun değerlendirilmesi, SAC yanıtını değerlendirmek için başka bir stratejidir. Örneğin, bir MM bileşeni olan MAD2'nin değerlendirilmesi yaygın bir yaklaşımdır. Erken prometafaz I, geç prometafaz I ve metafaz I'e olgunlaşan oositlerin sentromerleri (ACA) ve MAD2'sini tespit eden konfokal mikroskop görüntüleri kullanılabilir (Şekil 3A). SAC sinyalinin gücünü değerlendirmek için, KT lokalize MAD2 piksel yoğunluğunu ölçün (Şekil 3B). KT'lere MAD2 işe alımının önemli seviyeleri, çoğu KT'nin MTs'ye bağlı olmadığı erken prometafaz I'de meydana gelir. MAD2 seviyeleri daha sonraki prometafazda azaldı ve tüm KT'ler MT'lere kararlı bir şekilde bağlandığında metafaz I'de neredeyse yoktu (Şekil 3A, B). Bu nedenle, bu yöntem diğer iki tahlille birleştirildiğinde SAC yanıtını değerlendirebilir.

Figure 1
Şekil 1: Nokodazol ile SAC aktivasyonunun değerlendirilmesi. DMSO (kontrol), 5 μM nokodazol (NOC) veya 5 μM nokodazol + 0.5 μM reversin (NOC + REV) varlığında olgunlaşan oositlerin hızlandırılmış görüntülemesinden elde edilen temsili görüntüler. Kırmızı kare, kutupsal gövde ekstrüzyonunun zaman dilimini gösterir. İki bağımsız deney analiz edildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Securin-gfp bozunma paterni. (A) İncelenebilecek üç parametreli Securin-gfp bozunma eğrisinin şeması. (B) Securin-gfp cRNA ile mikroenjekte edilen ve DMSO (kontrol), 5 μM nokodazol veya 0.5 μM reversin varlığında olgunlaşan oositlerin hızlandırılmış görüntülerinden temsili görüntüler. Kırmızı kare, kutupsal gövde ekstrüzyonunun zaman dilimini gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Securin-gfp cRNA ile mikroenjekte edilen ve DMSO (mavi daireler), 5 μM nokodazol (pembe kareler) veya 0.5 μM reversin (siyah üçgenler) varlığında olgunlaşan oositlerin temsili Sekürin-gfp bozunma eğrisi. Hata çubukları = standart hata. Tedavi başına oosit sayısı: DMSO = 10; NOC = 15; REV = 5. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Oosit mayotik olgunlaşması sırasında kinetochorlara MAD2 alımı . (A) MAD2 (gri) ve kinetochores (ACA) (kırmızı) tespit etmek için immünoboyalı, erken prometafaz I, geç prometafaz I ve metafaz I'e olgunlaşan oositlerin temsili konfokal görüntüleri. Ölçek çubuğu = 10 μm; giriş: 2 μm. (B) (A) içindeki görüntülerden MAD2'nin göreceli yoğunluğunun ölçülmesi. Hata çubukları = standart hata. (C) Bağlanmamış bir kinetochore ve SAC aktivasyon yolunun şeması. Zaman noktası başına oosit sayısı: Erken prometafaz I = 23; Geç prometafaz I = 13; Metafaz I = 18. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İş mili montaj kontrol noktası, kromozom ayrışma hatalarını önlemek için tasarlanmış hücre bölünmesi sırasında kritik bir kontrol mekanizmasıdır. Hücrenin yanlış KT-MT eklerini düzeltmek için yeterli zamana sahip olmasını sağlar. Oositlerde mayoz, kromozom yanlış ayrışmasının çoğunun mayoz I sırasında meydana geldiği ve insanlarda erken düşüklerin ve kısırlığın ana nedeni olan anöploid yumurtaların üretilmesine yol açan hataya eğilimli bir süreçtir 1,24. Kadın mayozunun neden hataları olduğunu çözmek için çeşitli hipotezler test edilmektedir. Bunun potansiyel bir nedeni, SAC'nin somatik hücrelerden daha az verimli olması ve bir veya daha fazla yanlış bağlanmış KT 9,10,25 ile anafaz başlangıcına izin vermesidir. Bu nedenle, öploid yumurta üretme sürecini anlamak için oositlerdeki SAC mekanizmalarının kapsamlı bir çalışmasına ve anahtar düzenleyicilerin tanımlanmasına ihtiyaç vardır.

Mevcut protokol, SAC bütünlüğünün farklı yönlerini değerlendirmek için üç teknik tanımlamaktadır: aktivasyon ve susturma. Bu testlerin her birinin yorumlamada bazı sınırlamaları olduğundan, sadece bir tanesinin yapılması oositlerde SAC fonksiyonunu karakterize etmek için yetersizdir. Bu nedenle, bir çalışmada SAC bütünlüğünü değerlendirmek için bu yöntemlerin bir kombinasyonunu uygulamak önerilmektedir.

NOKODAZOL kullanılarak SAC aktivasyonunun değerlendirilmesi basittir çünkü basit ve hızlıdır. Bununla birlikte, sonuçları yorumlarken göz önünde bulundurulması gereken bazı önemli noktalar vardır. İlk olarak, araştırmacı, bağlanmamış kinetochores üretmek ve SAC'yi aktive etmek için iş milinin mikrotübüllerini tamamen depolimerize etmek için nokodazol konsantrasyonunu belirlemelidir. Mikrotübüllerin başarılı kaybı, oositlerin sabitlenmesi ve immünofloresan bazlı mikroskopi20 ile tübülinin tespit edilmesiyle belirlenebilir. Bu tekniğin bir diğer kritik sınırlaması, bu tahlilin okunmasıdır: ilk kutupsal cismin (PBE) ekstrüzyonu. PBE başarısızlığı mutlaka SAC fonksiyonunun yeterli kanıtı olmayabilir, çünkü çalışmanın proteini sitokinezi ve apsisleme gibi daha sonraki aşamaları etkilerse, sonuçlar PBE'nin başarısızlığı olacaktır. Bu nedenle, SAC defektlerini değerlendirmek için ilk adım olarak nokodatol tedavisini kullanın, ancak daha sonra tarif edilen diğer tekniklerle ilişkilendirin.

KT'ler MT'lere istikrarlı bir şekilde bağlandıktan ve kromozomlar metafaz plakasına hizalandıktan sonra, SAC susturulur ve APC / C aktive edilerek Sekürin ve Siklin B bozulmasına yol açar. Bu nedenle, Securin veya Siklin B bozunma paterninin izlenmesi, SAC susturma 25,26,27'nin yaygın olarak kullanılan göstergeleridir. Bozulma paterninin değişmesi, hücre döngüsünün hızlanması veya gecikmesi hakkında bilgi verir. Bir hızlanma zayıf bir SAC'yi gösterirken, bir gecikme SAC'yi tatmin etmede kusurları gösterir. Bu deneyin bir sınırlaması, bir mikroenjeksiyon teçhizatı ve özel bir beceri seti gerektirmesidir. Mikroenjeksiyon için kullanılan Securin-gfp cRNA'nın uygun konsantrasyonunun titrasyonunun kritik öneme sahip olduğunu unutmayın, çünkü çok fazla hücre döngüsü28'i durduracaktır.

Son olarak, MAD2'nin kinetochores'e alımının değerlendirilmesi, SAC aktivasyonunun bir göstergesi ve ölçüsüdür. Mayoz I sırasında MAD2 işe alım paterni, erken prometafaz I'de kinetochores'te maksimum MAD2 seviyeleri ve KT'ler bağlandıkça azalan seviyeler. Securin bozunma paterni gibi, MAD2'nin kinetochores'e alımının herhangi bir şekilde değiştirilmesi, SAC susturulmasının hızlanmasını veya gecikmesini gösterebilir. Erken prometafazda MAD2 işe alımındaki kusurlar, aktivasyon veya işe alım mekanizmasındaki başarısızlıkları gösterebilir29 veya hücre17'de MAD2 miktarlarının azaldığını gösterebilir. Bu iki olasılık arasında ayrım yapmak için, MAD2 protein ekspresyon seviyelerinin Western blot ile değerlendirilmesi şiddetle tavsiye edilir 17. İki veya daha fazla tedaviyi karşılaştırırken, mayotik olgunlaşma ve kromozom hizalamasının zamanlamasının tedaviler arasında değişebileceğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu nedenle, ilk olarak, MAD2 seviyelerini doğru bir şekilde karşılaştırmak ve sonuçları doğru bir şekilde yorumlamak için her tedavi için hücre döngüsü zamanlamasını tanımlayın. Bu yöntemin bir sınırlaması, MAD2'nin SAC yanıtı3'ün son efektörlerinden biri olmasıdır. Bu nedenle, MAD2'nin değerlendirilmesi, SAC mekanizmasının hangi kısmının bozulduğunu belirlemeye izin vermez. SAC mekanizmalarını değerlendirmek için, MPS1, BUB1 ve/veya RZZ kompleksi gibi başka bir SAC bileşeninin işe alımı belirlenebilir (Şekil 3C). Dikkate alınması gereken bir diğer nokta, sabitleme adımının kritik olmasıdır. Bu testler, 1x PHEM tamponunda% 2 PFA kullandı, bu da tüm mount oositlerinde kinetochore proteinlerinin tespiti için çalışan bir fiksasyondu. Bununla birlikte, diğer laboratuvarlar30'dan önce kapsamlı bir şekilde tanımlanmış bir kromozom yayılma tekniği kullanmaktadır.

Özetle, bir hücrenin kromozom ayrışmasını doğru bir şekilde kontrol etmek için kinetochore-iğ mikrotübül bağlanma durumunu izleme yeteneği hakkında kritik bilgiler sağlayan üç tahlil bu makalede açıklanmaktadır. Bu bilgi, kontrol noktasının hangi adımının bozulduğu konusunda fikir edinmek için SAC'nin tehlikeye girebileceği hücresel durumları araştırmak için önemlidir. Anöploidi gametlerde ve kanserlerde ortak bir özellik olduğundan, bu araçlar birçok biyolojik sistem için geçerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklanacak herhangi bir çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu projenin finansmanı Ulusal Sağlık Enstitüleri (R35GM136340 - KS) tarafından sağlanmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A4503
DAPI Life Technologies D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) Sigma D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 Life Technologies A10042
EVOS FL Auto Imaging System Life Technologies Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator Life Technologies Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated MatTek Corporation P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633 Life Technologies A21091
HEPES Sigma H3537
Human anti-ACA Antibodies Incorporated 15-234 Dilution 1/30
ImageJ NIH
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective Leica
MgSO4·7H20 Sigma M7774
Milrinone Sigma M4659
Na2HPO4 Sigma S2429
NaCl Sigma S5886
NaN3 Sigma S2002
Nocodazole Sigma M1404
Paraformaldhyde (PFA) Sigma P6148
PIPES Sigma P6757
Rabbit anti- MAD2 Biolegend 924601 Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine Cayman Chemical 10004412
Triton-X Sigma 274348
Tween-20 Sigma X100
Vectashield Vector laboratories H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
  3. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  4. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
  5. London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
  6. Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
  7. Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  8. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  9. Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
  10. Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
  11. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  12. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
  13. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
  14. Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
  15. Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
  16. Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
  17. Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
  18. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  19. Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
  20. Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
  21. Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  22. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  23. Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
  24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
  25. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  26. Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
  27. Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
  28. Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
  29. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  30. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).

Tags

Gelişim Biyolojisi Sayı 187
Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aboelenain, M., Schindler, K.,… More

Aboelenain, M., Schindler, K., Blengini, C. S. Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (187), e64459, doi:10.3791/64459 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter