Summary
עבודה זו נועדה להעריך ולסקור את הליך הבדיקה הביולוגית של Artemia salina קטלניות, המזוהה גם כבדיקת קטלניות של שרימפס מלח. שיטה פשוטה וזולה זו נותנת מידע על הרעילות הכללית (הנחשבת להערכת רעילות ראשונית) של דגימות, כלומר, מוצרים טבעיים.
Abstract
מוצרים טבעיים שימשו מאז ימי קדם לייצור תרופות. כיום, יש שפע של תרופות כימותרפיות המתקבלות ממקורות טבעיים ומשמשות נגד שפע של מחלות. למרבה הצער, רוב התרכובות הללו מציגות לעתים קרובות רעילות מערכתית ותופעות לוואי. על מנת להעריך טוב יותר את הסבילות של דגימות נבחרות שעשויות להיות פעילות ביולוגית, שרימפס תמלחת (Artemia salina) משמש בדרך כלל כמודל במחקרי קטלניות. מבחן A. salina מבוסס על היכולת של התרכובות הביו-אקטיביות שנחקרו להרוג את המיקרו-סרטנים בשלב הזחל שלהם (nauplii). שיטה זו מהווה נקודת התחלה נוחה למחקרי ציטוטוקסיות, כמו גם לבדיקת רעילות כללית של מוצרים סינתטיים, סמי-סינתטיים וטבעיים. זה יכול להיחשב בדיקה פשוטה, מהירה, ובעלות נמוכה, בהשוואה למבחנים רבים אחרים (תאי מבחנה או זני שמרים, דגי זברה, מכרסמים) המתאימים בדרך כלל למטרות הנ"ל; יתר על כן, זה יכול להתבצע בקלות גם ללא כל הכשרה ספציפית. באופן כללי, בדיקת A. salina מייצגת כלי שימושי להערכת רעילות ראשונית של תרכובות נבחרות ולפיצול מונחה ביולוגית של תמציות מוצרים טבעיים.
Introduction
מוצרים טבעיים מצמחים, בעלי חיים או מיקרואורגניזמים היו תחום עניין הולך וגדל לאורך השנים בפיתוח מולקולות ביו-אקטיביות חדשות בגלל מגוון הפעילויות הביולוגיות והפרמקולוגיות שלהם1. עם זאת, תופעות הלוואי הקשורות, עמידות לתרופות או ספציפיות לא מספקת של הסוכנים, במיוחד כאשר הם משמשים כתרופות נגד סרטן, מייצגים את הגורמים העיקריים שיכולים להוביל לטיפול לא יעיל 1,2.
במהלך העשורים האחרונים התגלו מספר חומרים ציטוטוקסיים ממקור צמחי, חלקם משמשים כחומרים אנטי-סרטניים 1,2,3. בהקשר זה, פקליטקסל מדווחת כאחת התרופות הכימותרפיות הידועות והפעילות ביותר ממוצא טבעי 3,4. נכון לעכשיו, ההערכה היא כי יותר מ -35% מכלל התרופות בשוק נגזרות או שואבות השראה ממוצרים טבעיים5. הרעילות הגבוהה הפוטנציאלית של תרכובות אלה דורשת התחשבות במהלך כל שלבי המחקר, שכן סוגים שונים של מזהמים או אפילו רכיבים מטבוליים של הצמח עצמו יכולים לגרום להשפעות רעילות. מסיבה זו, פרופילים פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים צריכים להתבצע בשלב הראשוני, כדי להעריך את הפעילות הביולוגית והבטיחות של טיפולים פוטנציאליים חדשים מבוססי צמחים. כדי להעריך את הרעילות של דגימות ביו-אקטיביות חדשות, בעלי חיים חסרי חוליות יכולים להיחשב כמודלים הטובים ביותר לחקור. הם דורשים דרישות אתיות מינימליות ומאפשרים בדיקות מבחנה ראשוניות, כדי לתעדף את המוצרים המבטיחים ביותר לסבב הבדיקות הבא בבעלי חוליות 1,6.
A. salina, הידוע בכינויו שרימפס מלח, הוא חסר חוליות הלופילי קטן השייך לסוג ארטמיה (משפחה Artemiidae, סדר אנוסטרקה, תת-גוף סרטנאים; איור 1). במערכות אקולוגיות של מלחים ימיים ומימיים, חסילוני מלח ממלאים תפקיד תזונתי חשוב מכיוון שהם ניזונים ממיקרו-אצות והם מרכיבים של הזואופלנקטון המשמש להזנת דגים. יתר על כן, הזחלים שלהם (הידועים בשם nauplii) נמצאים בשימוש נרחב בהערכת רעילות כללית במהלך מחקרים ראשוניים 1,3,7.
Artemia spp. נמצאים בשימוש נרחב במחקרי קטלניות והם גם נקודת מוצא נוחה להערכות רעילות, על ידי מעקב אחר הרעילות של תרכובות בעלות פוטנציאל ביו-אקטיבי בהתבסס על יכולתן להרוג נאופליי שגדלו במעבדה 1,8. מסיבה זו, השימוש ב- A. salina צבר משיכה במחקרי רעילות כלליים, מכיוון שמדובר בשיטה יעילה מאוד וקלה לשימוש, בהשוואה לניסויים אחרים במודלים של בעלי חיים9.
הודות לאנטומיה הפשוטה שלהם, גודלם הזעיר ומחזור החיים הקצר שלהם, ניתן לחקור מספר עצום של חסרי חוליות בניסוי אחד. ככאלה, הם משלבים נוחות גנטית ותאימות בעלות נמוכה עם הקרנות בקנה מידה גדול1. בהקשר זה, השימוש בשרימפס תמלחת בבדיקת רעילות כללית מראה מספר יתרונות, כגון צמיחה מהירה (28-72 שעות נדרשות מהבקיעה ועד התוצאות הראשונות), עלות-תועלת וחיי מדף ארוכים של ביצים מסחריות, שניתן להשתמש בהן כל השנה 3,10. מאידך גיסא, מכיוון שלחסרי חוליות יש מערכת איברים פרימיטיבית ואין להם מערכת חיסון נרכשת, הם אינם מייצגים מודל מושלם ואמין לתאים אנושיים1.
עם זאת, הוא מספק שיטת הערכה ראשונית לרעילות הכללית של דגימות נבחרות. מאז זה נמצא בשימוש נרחב כמבחן קטלני, זה יכול לספק אינדיקציות זמניות על ההשפעות הרעילות של סוכנים אנטי סרטניים פוטנציאליים. זה משמש לעתים קרובות גם כדי לקבל משוב על הרעילות הכללית של תרכובות ניחן בכל פעילויות ביולוגיות אחרות שעבורן חיוני כדי להראות את שיעור התמותה הנמוך ביותר האפשרי בקרב שרימפס ארטמיה .
במחקר מתמשך מהקבוצה שלנו, תמציות שונות מזני Plectranthus הראו פעילות נוגדת חמצון ואנטי-בקטריאלית (תוצאות שלא פורסמו). במקביל, תרכובות מבודדות התקבלו על ידי טיהור של תמציות ולאחר מכן שונה כימית. התמציות, התרכובות הטהורות והנגזרות הסמי-סינתטיות נבדקו לאחר מכן במונחים של רעילות כללית. בהקשר זה, העבודה הנוכחית שואפת לתת סקירה כללית של השימוש ב- Artemia lethality bioassay להערכת רעילות כללית ופעילות ציטוטוקסית פוטנציאלית של תמציות ביו-אקטיביות ותרכובות מבודדות מצמחים שונים של הסוג Plectranthus11.
איור 1: ארטמיה סלינה מתחת למיקרוסקופ. נאופליי שזה עתה בקע של A. salina כפי שנראה מתחת למיקרוסקופ (הגדלה 12x). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ציוד
- רכשו ציוד בקיעה זמין מסחרית. בחר מקום מתאים להגדרת ציוד הבקיעה (איור 2A). הנח את המיכל בצורת משפך בתמיכה השחורה (הכלולה בסט) וסובב את המשפך בכיוון מתאים כדי לראות את סימן הרמה ואת הברז.
- כדי ליצור ציוד הגירה בעבודת יד, חתכו את החלק העליון של שני בקבוקי פלסטיק בקוטר 0.5 ליטר (5.8 ס"מ) כדי לקבל גובה סופי של 12 ס"מ. צרו חור בקוטר 1.5 ס"מ בצד אחד בגודל 7 ס"מ מתחתית כל בקבוק והכניסו צינור גומי בקוטר 13 ס"מ (1.3 ס"מ חיצוני ו-0.9 ס"מ קוטר פנימי) בין שני הפתחים. אוטמים את הפתחים בדבק חם (איור 2B) ומשאירים לייבוש למשך 15 דקות; שים את הבקבוקים על משטח שטוח ומלא אותם במים כדי לוודא שאין נזילה.
2. הכנת תמיסת מלח מלאכותית
- בכוס זכוכית מכינים תמיסת מלח מלאכותית (מלח שרימפס תמלחת) בריכוז של 35 גרם/ליטר. לשם כך, הוסף 28 גרם של מלח ל 800mL של מי ברז, על פי הוראות היצרן. מערבבים אותו עם מוט ערבוב עד שכל המלח מומס היטב.
הערה: התאם את עוצמת הקול של תמיסת המלח המוכנה בהתאם לגודל המיכלים הזמינים.
3. הכנת מדגם
- הכן את כל הדגימות בצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי המסת כמות מתאימה של תמציות (תמציות פלקטרנתוס , Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus ; ו- Pe- P. ecklonii) או תרכובות 1-5 (שתי תרכובות טבעיות [1 ו-2] המתקבלות מפלקטרנתוס spp. ושלוש נגזרות סינתטיות למחצה [3, 4, 5]; איור 3) בדימתיל סולפוקסיד (DMSO)12, כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל (אם הדגימה מסיסה במים, אין צורך להשתמש ב-DMSO).
- יש לדלל 10 μL מכל דגימה (ו-DMSO לבקרה שלילית) בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש באמצעות 990 μL של תמיסת מלח מלאכותית שהוכנה בשלב 2.1, כדי להשיג ריכוז סופי של 0.1 מ"ג/מ"ל.
- מתחת למכסה אדים, בבקבוק ארלנמאייר, הכינו תמיסה של אשלגן דיכרומט (K 2 Cr2O7) במיםמזוקקים בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל13,14,15.
4. ביו-אסאי קטלני של שרימפס מלח
הערה: בדיקה זו פותחה מעבודותיהם של מספר מחברים עם שינויים 1,16,17,18,19.
- מלאו את כלי הבקיעה במדיום שהוכן בשלב 2.1 עד לגובה (500 מ"ל) (איור 2C).
- מניחים כף אחת (כ 0.75 גרם) של ציסטות שרימפס מלח בתמיסת המלח, ולאחר מכן לסגור את המיכל. הניחו מנורה (מנורת שולחן, 40 ואט, 230 וולט, 50 הרץ, עם נורת לד של 8 ואט, 4,000 K, 830 לומן) שמצביעה ישירות לכיוון הציוד (איור 2A) והפעילו אותה.
- חבר את מערכת ספק האוויר (פלט 3 W, 50 Hz, 230 V) למחבר הממוקם בחלק העליון של הציוד והפעל את המשאבה.
- שמור על טמפרטורת החדר על 25 ± 3 מעלות צלזיוס. ציסטות שרימפס תמלחת בוקעות בתמיסת המלח המלאכותית, תחת אוורור נמרץ, תאורה רציפה וטמפרטורה יציבה, לאחר 24 שעות עד 48 שעות.
הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בחממה אנכית. - לאחר שהביצים בקעו, כבו את משאבת האוויר והמתינו עד שהנאופליי (הנע לכיוון תחתית המשפך) יופרד ממארזי הביצים הריקים (צפים בחלק העליון).
- על מנת להפריד בין הביצים שלא נקטפו לבין הנאופליי החי, פתחו את ברז היציאה בתחתית ופרקו את תוכן המשפך באחד המכלים של מיכל ציוד הנדידה בעבודת יד (המתואר בשלב 1.2). ודא כי התמיסה המכילה את nauplii ואת שאריות הביצים unhatched הוא מתחת לגובה של הצינור. במיכל השני, מוסיפים את תמיסת המלח השיורית משלב 2.1 מעל גובה הצינור.
- מכסים את המיכל עם nauplii ואת שאריות ביצים unhatched באמצעות רדיד אלומיניום. מניחים את המנורה על המיכל השני רק עם תמיסת המלח. חסילוני המלח יימשכו על ידי האור ויעברו ממיכל אחד למשנהו (מיכל קציר), מה שיוביל להפרדה יעילה בין ביצים (משקעים לאט לתחתית) לבין ארטמיה חיה.
- לאחר מכן, מקם את הציוד באינקובטור באותם תנאים המשמשים בשלב 4.4 במשך 4 שעות (איור 2E). ממיכל הקציר, לאסוף 900 μL של תמיסת מלח המכילה 10 עד 15 nauplii. הניחו את תמיסת המלח עם נאופליי בכל באר של צלחת בת 24 בארות (איור 2F); כל הדגימות נבדקות ברביעיות.
- הוסף 100 μL כל אחד מהבקרה השלילית (DMSO), הבקרה החיובית (K 2 Cr2O7, אשלגן דיכרומט), תמיסת המלח המלאכותית, וכל אחת מהדגימות לבאר המתאימה (איור 2F)13,14.
הערה: הדגימות בכל באר יהיו בריכוז של 0.01 מ"ג/מ"ל. הריכוז הסופי של הבקרה החיובית בתמיסת המלח יהיה 0.1 מ"ג/מ"ל, כדי להיות בטוחים שכל הנאופליי בבאר נחשפים להשפעה הרעילה של אשלגן דיכרומט ומתים. תמיסת המלח המלאכותית תפעל כריק. - דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 25 ± 3 מעלות צלזיוס תחת תאורה למשך 24 שעות (איור 2G). לאחר 24 שעות, רשמו את מספר הזחלים המתים (nauplii לא ניידים במשך 5 שניות) בכל באר תחת מיקרוסקופ דו-עיני (12x)20 (איור 2H). לחלופין, השתמש בעדשת יד.
- הוסף 100 μL של תמיסת אשלגן דיכרומט, כדי לגרום למוות של הזחלים החיים הנותרים, ולחכות 6 שעות. ספרו את סך הזחלים המתים בכל באר תחת מיקרוסקופ. קבע את שיעור התמותה על פי המשוואה הבאה.
- בצע את כל הבדיקה במשולש. חשב סטיות תקן (SD), ובטא את התוצאות כממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים, שלכל אחד מהם מרובעים פנימיים (n = 12), ± SD. כפי שצוין על ידי Meyer et al., לשקול תמציות גולמיות ותרכובות טהורות עם LC50< 1,000 מיקרוגרם / מ"ל כרעילים; כמו כן, יש לקחת בחשבון כי שיעור התמותה של שרימפס מלח הוא פרופורציונלי לריכוז של דגימות נבדק21.
איור 2: שיטת הבדיקה הביולוגית של ארטמיה סלינה קטלנית. (א) ציוד זמין מסחרית המשמש לבקיעה של ציסטות שרימפס תמלחת; (ב) ציוד הגירה בעבודת יד; (ג) כלי בקיעה מלא בתמיסת מלח; (ד) אוסף של ביצים ונאופליי שלא נקטעו; (E) ציוד בעבודת יד באינקובטור במהלך שלב הנדידה. המיכל רחוק מן המנורה צריך להיות מכוסה רדיד אלומיניום; עם זאת, לתצוגה טובה יותר של התקנת הסט כאן הוא הוסר; (ו) קצירת ארטמיה בבארות לפני ביצוע הבדיקה. יש למקם את התרכובות כפי שמוצג: - מתייחס לבקרה השלילית (DMSO), + לבקרה החיובית (K 2Cr2O7), מלח לתמיסת המלח המלאכותית, ו -1 עד 3 לדגימות לבדיקה (במקרה זה תרכובות 1-3); (ז) דגירה של לוחית 24 בארות המכילה ארטמיה והדגימות שנבחרו; (H) ספירת ארטמיה תחת מיקרוסקופ המשקפת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מבנים של תרכובות נבחרות. מבנה של תרכובות 1-2, מופק מינים Plectranthus ותרכובות 3-5, המתקבל על ידי חצי סינתזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הרעילות הכללית של כמה מוצרים טבעיים שנחקרו לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו הוערכה באמצעות bioassay קטלניות שרימפס תמלחת. ארבע תמציות (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; PC- P. cylindraceus; ו- Pe- P. ecklonii) מהסוג פלקטרנתוס , הידוע בפעילותו נוגדת החמצון (תוצאות שלא פורסמו), נבדקו. בנוסף, שתי תרכובות טבעיות (1 ו-2) המתקבלות מפלקטרנתוס spp., ושלוש נגזרות סינתטיות למחצה (3, 4, 5; איור 3), המתואר בעבודה אחרת3, נחקר גם הוא. כאן מדווחת ההערכה הראשונית שלהם במונחים של פעילות ציטוטוקסית פוטנציאלית.
כל התמציות שנבדקו הראו תוצאות מעודדות מאוד, עם שיעורי תמותה נמוכים מאוד, דומים לאלה שנרשמו עבור ריק (תמיסת מלח) ואת הבקרה השלילית (DMSO; איור 4). לעומת זאת, מבין התרכובות הטהורות 1-5, רק נגזרת 5 הציגה שיעור תמותה נמוך (2.30% בריכוז של 100 ppm) ללא רעילות כללית (איור 5).
איור 4: קטלניות של תמציות על ארטמיה סלינה. שיעור התמותה של A. salina (%) לאחר חשיפה של 24 שעות לארבע תמציות מתאנוליות של Plectranthus spp., במינון 0.1 מ"ג/מ"ל (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; PC- P. cylindraceus; Pe- P. ecklonii). כל התמציות היו מקובלות מבחינת רעילות כללית באמצעות בדיקה זו. מלח מתאים לתמיסת המלח (ריק); K2 Cr2O7 שימש כבקרה החיובית ו- DMSO כבקרה השלילית. התוצאות באו לידי ביטוי כממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים, שלכל אחד מהם רביעיות פנימיות (n = 12) ± SD. ההשוואות בוצעו בתוך קבוצות על ידי ניתוח השונות, תוך שימוש ב- ANOVA החד-כיווני עם המבחן שלאחר המבחן של דנט. הבדלים משמעותיים בין קבוצות הביקורת לקבוצות הניסוי הוערכו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי מסחרית. רמת הסתברות p < 0.01 נחשבה לציון מובהקות סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: קטלניות של תרכובות על ארטמיה סלינה. שיעור התמותה של A. salina (%) לאחר חשיפה של 24 שעות לחמש תרכובות טהורות במינון 0.1 מ"ג/מ"ל (1 ו-2 הם מוצרים טבעיים ו-3-5 הם נגזרות שהוכנו מ-1 ו-2). ניכר כי רק 5 מראה רעילות מוגבלת מאוד באמצעות בדיקה זו. מלח מתאים לתמיסת המלח (ריק); K2 Cr2O7 שימש כבקרה החיובית ו- DMSO כבקרה השלילית. התוצאות באו לידי ביטוי כממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים, שלכל אחד מהם רביעיות פנימיות (n = 12) ± SD. ההשוואות בוצעו בתוך קבוצות על ידי ניתוח השונות, תוך שימוש ב- ANOVA החד-כיווני עם המבחן שלאחר המבחן של דנט. הבדלים משמעותיים בין קבוצות הביקורת לקבוצות הניסוי הוערכו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי מסחרית. רמת הסתברות p < 0.01 נחשבה לציון מובהקות סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
מוצרים טבעיים 1 ו-2 הראו קטלניות מתונה (36.68% ו-30.95% ב-100 ppm, בהתאמה), בעוד שנגזרות סמי-סינתטיות 3 ו-4, שהתקבלו מ-1 ו-2, בהתאמה, היו רעילות יותר מהפיגום המקורי (64.02% ו-36.64% ב-100 ppm, בהתאמה; איור 5).
נתונים כלליים מצביעים על כך שכל התמציות שנבדקו, הידועות בפעילות נוגדת החמצון שלהן ואינן מראות רעילות כללית, יכולות להיחשב כמועמדות למחקרי פעילות חוץ גופית ורעילות נוספים על קווי תאים נבחרים. אם היעדר רעילות מודגם גם במודלים עוריים, ניתן לבצע פיתוח של מוצרים ביו-אקטיביים חדשים ליישום עורי. מצד שני, ההשפעות הרעילות שנצפו עבור תרכובות 1-4 יכולות להפוך אותם למועמדים מתאימים להערכות נוספות כסוכנים אנטי סרטניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך השנים האחרונות, הקהילה המדעית הגבירה את תשומת הלב שלה למודלים חלופיים לבדיקות רעילות21. לצד A. salina lethality bioassay, מתודולוגיות אחרות מבוצעות בדרך כלל להערכת סבילות הדגימה וכוללות בדיקות ביולוגיות של בעלי חוליות (כגון מכרסמים), חסרי חוליות (כגון דגי זברה), שיטות במבחנה באמצעות זני שמרים או תאים, ובשיטות סיליקו 22,23,24,25 . לכל השיטות הללו יש יתרונות וחסרונות ברורים, בהתחשב בכסף ובזמן שהוצאו, שכפול התוצאות וסוג המדגם שיש לנתח. לדוגמה, גישות in silico מייצגות מתודולוגיה סטנדרטית בעלות נמוכה, הדורשת ציוד מינימלי. עם זאת, כאשר מחקרים כאלה מתמקדים במטרה אחת, מתקבלות תוצאות באיכות ירודה, מה שהופך את החלופה הזו מחוץ לתחום הבדיקות הראשוניות, כפי שאנו מציגים במחקר זה25,26. כשמדובר מיקרואורגניזמים, Saccharomyces cerevisiae נחשב לאחד המודלים הנפוצים ביותר להערכת תרכובות רעילות23. למעשה, השימוש בשמרים במבחנה הוא בדרך כלל מהיר וקל לביצוע; עם זאת, זה יכול להיות יקר, שכן הוא דורש מוצרים כימיים ספציפיים וציוד, ומראה רגישות נמוכה למינונים מינימליים של תרכובות ציטוטוקסיות27. בגישה חלופית, ניתן להשתמש בתאים אנושיים, בצורה מהירה, פשוטה וזולה. אף על פי כן, אלה אינם יכולים לייצג אורגניזם שלם; לפיכך, אינטראקציות בין סוגי תאים שונים והפרעות מערכתיות המתרחשות בתנאים פיזיולוגיים אינן נלקחות בחשבון כראוי25,26. מאידך גיסא, לבדיקות in vivo יש יתרון גדול לקחת בחשבון את האורגניזם כולו, אך מודלים של בעלי חיים (כגון מכרסמים) דורשים זמן רב יותר לביצוע הבדיקה, הם יקרים יותר ומרמזים על שיקולים אתיים מורכבים25. לעומת זאת, מבחני in vivo המעסיקים אורגניזמים ימיים לבדיקת רעילות מקובלים בדרך כלל, בהתחשב גם בכך שהשימוש בחסרי חוליות ימיים עובר חששות פחות אתיים, והמתודולוגיה קלה לביצוע, מהירה וזולה21,24. בהקשר זה, השימוש בדגי זברה לחקר רעילות כללית מייצג לעתים קרובות את הבחירה הראשונה בתחום. למעשה, בהשוואה לניסויים אחרים בבעלי חיים, זה יכול להיחשב אופציה בעלות נמוכה, שכן דגי זברה מתפתחים במהירות ומגיעים לשלב הזחל המוקדם בסביבות 72 שעות עד 13 ימים לאחר ההפריה21,28. עם זאת, תחזוקה של דג זברה דורשת מפעילים מאומנים היטב ותנאים ספציפיים, כגון מיכל דגים עם מערכת מחזור, המסוגל לאוורר ולסנן את מי המערכת, כדי לשמור על האיכות הכוללת; יתר על כן, יש צורך במספר מכסים וכיסויי ניקוז, שכן דגי זברה יכולים לקפוץ, כמו גם תנאי תאורה ספציפיים (14 שעות אור, 10 שעות חושך), ורמות pH צריכים להיבדק מדי יום, בין היתר29,30. בסך הכל, שיקולים אלה הופכים את המודלים של דגי זברה לגוזלים זמן רב ויקרים יותר ממודל ארטמיה שדווח כאן, שכן מיקרו-סרטנים אלה קלים יותר לטיפול וברי קיימא לגידול באוכלוסיות גדולות באמצעות שיטות מעבדה. זה הופך את A. salina ללא ספק לאחד מכלי הסינון המועסקים ביותר, המשמשים בעיקר לבדיקת הרעילות הכללית של דגימות שונות, כגון תרופות ותמציות צמחי מרפא1.
בפרוטוקול, A. salina nauplii גודלו, נאספו והודגמו עם דגימות מתאימות במשך 24 שעות, כדי להעריך את שיעור התמותה של נאופליי המושרה על ידי כל דגימה. בשלב הראשון, בקיעת הביצים מתבצעת בכלי רבייה זמין מסחרית בצורת משפך, שבו הוכנסו מבעבעים נמרצים (איור 2A). אוורור מאולץ זה נחוץ מכיוון שהוא מאפשר לבקיעת שרימפס המלח להתרחש בהצלחה רבה ככל האפשר. הבקיעה מתרחשת בסביבות 24 שעות ב 25 ± 3 מעלות צלזיוס, בעוד עד 48 שעות יכול להיות נחוץ בטמפרטורות נמוכות יותר. ברגע שהביצים בוקעות, המשאבה נכבית כדי לאפשר לביצים הריקות לצוף בחלק העליון, בעוד שנאופליי וביצים לא מבוקעות נאספות בקלות על ידי פתיחת ברז המשפך בתחתית. במהלך הניסויים שלנו, בקיעת ביצים מלאה מעולם לא הושגה, עם נוכחות כתוצאה מכך של נאופליי וביציות לא בוגרות בתמיסה שנאספה. מסיבה זו, על מנת להפריד ביעילות בין שתי הצורות של ארטמיה, מוכן ציוד בעבודת יד לנדידת שרימפס תמלחת (שלב 1.2). מיכל אחד מתמלא באורגניזמים שנקטפו, ולאחר מכן מכוסה בנייר אלומיניום, ואילו המקבל השני נחשף לאור ישיר של מנורה. בתנאים אלה, הביצים שלא נקטעו נוטות להתיישב, בעוד שהנאופליי החי נמשך על ידי האור הפוגע במיכל הסמוך, ומעדיף את הנדידה מצד לצד דרך חיבור הגשר. לאחר 4 שעות, כמעט כל הנאופליי החי נמצא בתוך המיכל חשוף לאור ומוכן לאיסוף לביצוע הבדיקה. בשלב זה, חלקים מתמיסת המים המלוחים, המכילים עשרה עד חמישה עשר נאופליי, מוסרים ודוגרים עם כל אחת מהדגימות לבדיקה.
בעבודה זו הוכח כיצד השיטה יעילה, חסכונית וקלה לביצוע. עם זאת, יש להכיר בכמה נקודות קריטיות בעת ביצוע בדיקה זו.
הבדיקה מתבצעת בדרך כלל עם מי ברז. בהתאם לגורמים גיאוגרפיים ופיזיקליים-כימיים, מי ברז מפגינים התפלגות קשיות שונה, המשפיעה על יכולת השחזור של הבדיקה, ובמיוחד על שלב בקיעת הביצים. מאותה סיבה, השימוש במי ים יכול להשפיע על יכולת השחזור של הבדיקה. ריכוז המלח המשתנה, נוכחותם של מזהמים, מיקרופלסטיק וקורפוסים אחרים יאלצו את המפעיל לעבור שלבים נוספים, כגון סינון וסוגים אחרים של טיהור, שיהפכו את הניסוי למורכב יותר ופחות קל לטיפול. כל התנאים הנחשבים והאופטימליים צריכים להיות מיושבים על סמך המאפיינים והזמינות של מי ברז, במיוחד על ידי ויסות זהיר של כמות המלח המלאכותי שנוספה, היוצרת סביבה מתאימה ומשמשת כהזנה גם לנאופלי.
שינויים נרחבים בטמפרטורות יכולים לגרום לשיעורי בקיעה נמוכים יותר. כתוצאה מכך, ניתן היה לראות רמות נמוכות של ארטמיה חיה, מעורבב עם מספר גבוה של ביצים שלא נקטעו. ברור, תנאים כאלה אינם מתאימים לפיתוח של בדיקות אמין, ולכן אקלים מבוקר של החדר או שימוש אינקובטורים אנכיים מתאימים צריך להיחשב.
אוורור נמרץ של הפתרון בתוך כלי הבקיעה נדרש. נוכחות של מבעבע מתמשך מעדיף את המגע בין ביצים ומאיץ את תהליך הבקיעה.
איסוף הן ביצים שלא נקטפו והן נאופליי במהלך הקציר יכול להשפיע מאוד על אמינות הבדיקה. זאת בשל האפשרות של בקיעה במהלך הדגירה עם הדגימות. במקרה זה, לא כל הנאופליי ייחשפו במשך אותה כמות זמן, וכתוצאה מכך שיעורי תמותה שגויים. מכיוון שהביצים והנאופליי קטנים מכדי להיות מופרדים ביעילות, יש צורך בזמני דגירה גבוהים יותר בציוד הבקיעה או בשימוש בציוד הנדידה בעבודת יד.
כל באר צריכה להכיל 10-15 נאופליי לשלב הדגירה, שנספר בקפידה על ידי שימוש במיקרוסקופ דו-עיני (הגדלה של פי 12). נוכחותם של יותר מדי נאופליי באותה באר יכולה להפוך את הספירה הסופית לקשה, או אפילו שגויה, בגלל החפיפה. מצד שני, כמויות קטנות של שרימפס יובילו לתוצאות ללא מובהקות סטטיסטית.
כפי שניתן לראות, רוב הבעיות של שיטה זו קשורות לשלבי הבקיעה והצמיחה, שם נדרשת תשומת לב רבה יותר כדי למנוע בעיות אמינות. עם זאת, השיטה יכולה לסבול שינויים, במיוחד ביחס לנקודות הקריטיות ביותר שתוארו לעיל. כמובן, כאשר אחד הפרמטרים האלה משתנה, זה יכול להיות נחוץ כדי לבצע מספר ניסיונות כדי לייעל את השיטה המקורית. לדוגמה, שינוי הטמפרטורה יכול לעזור לשלוט בזמן הכולל של הבדיקה: הגדלת הטמפרטורה עד 28-29 מעלות צלזיוס גם תגדיל את קצב הבקיעה ותאיץ את התהליך כולו.
מגבלות מסוימות של A. salina bioassay קשורות גם ליציבות הדגימות לתנאי הבדיקה ולזמן. הבדיקה יכולה להתבצע רק באמצעות דגימות יציבות בטמפרטורת החדר ותחת אור נראה. יתר על כן, יש לקחת בחשבון כי ההליך כולו נמשך לפחות 4 ימים, ואם קצב הבקיעה נמוך, הבדיקה עשויה להזדקק ליום נוסף לשלב הבקיעה.
בסך הכל, במחקר זה, אנו מדגישים שתי דוגמאות ליישום הערכת הרעילות הכללית באמצעות שיטת A. salina. רעילות כללית נקבעה לכל הדגימות שנבדקו. תמציות מצמחי פלקטרנתוס ומתרכובת 5 לא הראו רעילות כללית, בעוד שתרכובות 1-4 הוכחו כרעילות במידה בינונית או אפילו גבוהה מאוד על שרימפס מלח. בפרט, ההשפעה השלילית של תרכובות 1 ו -2 על ארטמיה הודגמה בעבר על ידי Sitarek ו Matias על ידי MTT ו SRB / MTT מבחנים, בהתאמה31,32. יחד עם זאת, האנלוגים הבנזואילטים, תרכובות 3 ו -4, מראים ערכי רעילות גבוהים יותר מאשר מבשריהם 1 ו -2, ומדגישים כי פונקציונליזציה של אסטר יכול להיות תפקיד חשוב במונחים של ציטוטוקסיות, כפי שאושר עבור תרכובת 4 בקו התא הסרטני NSCLC MDR האנושי על ידי Garcia et al.33. עם זאת, יש צורך במבחנים אחרים כדי לאשר כי פעילות ציטוטוקסית כזו יכולה להיות מנוצלת בטיפול בסרטן. מצד שני, נגזרת 5, יחד עם כל התמציות שנבדקו, לא הראו רעילות ומופיעות כתרכובת הטהורה המבטיחה ביותר בסדרה. עם זאת, נדרשים מחקרים נוספים להערכת הפעילות הביולוגית הפוטנציאלית ליישום עורי.
כאן הדגמנו כיצד השימוש בשיטה מבוססת ארטמיה סלינה ככלי סינון יכול לאפשר חיסכון בזמן ובכסף, בהשוואה למתודולוגיות ידועות אחרות. הוא מייצג דרך יעילה ומועילה להיות מנוצל בהקשרי רעילות ראשוניים. זה יכול לשמש בנוכחות דגימות שונות ומורכבות, סמים סינתטיים, סינתטיים וחצי סינתטיים, כמו גם עבור פיצול מונחה ביולוגית של תמציות מוצרים טבעיים ודגימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים, כספי או אחר.
Acknowledgments
לזכרו של פרופסור אמילקר רוברטו.
עבודה זו נתמכה כספית על ידי Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, פורטוגל) תחת פרויקטים UIDB/04567/2020 ו- UIDP/04567/2020 המיוחסים ל- CBIOS ומענק דוקטורט SFRH / BD / 137671 / 2018 (ורה איסקה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H.
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
