Summary
Este trabalho tem como objetivo avaliar e revisar o procedimento de bioensaio de letalidade de Artemia salina , também identificado como ensaio de letalidade de camarão em salmoura. Este método simples e barato fornece informações sobre a toxicidade geral (considerada como uma avaliação preliminar de toxicidade) das amostras, ou seja, produtos naturais.
Abstract
Os produtos naturais têm sido usados desde os tempos antigos para produzir medicamentos. Hoje em dia, existem muitas drogas quimioterápicas obtidas de fontes naturais e usadas contra uma infinidade de doenças. Infelizmente, a maioria desses compostos geralmente exibe toxicidade sistêmica e efeitos adversos. A fim de melhor avaliar a tolerabilidade de amostras potencialmente bioativas selecionadas, o camarão de salmoura (Artemia salina) é geralmente utilizado como modelo em estudos de letalidade. O teste de A. salina baseia-se na capacidade dos compostos bioativos estudados de matar os microcrustáceos em seu estágio larval (náuplios). Este método representa um ponto de partida conveniente para estudos de citotoxicidade, bem como para a triagem de toxicidade geral de produtos sintéticos, semissintéticos e naturais. Pode ser considerado um ensaio simples, rápido e de baixo custo, em comparação com muitos outros ensaios (células in vitro ou cepas de levedura , peixe-zebra, roedores) geralmente adequados para os fins acima mencionados; além disso, pode ser facilmente realizado mesmo sem qualquer treinamento específico. No geral, o ensaio de A. salina representa uma ferramenta útil para a avaliação preliminar da toxicidade de compostos selecionados e o fracionamento bioguiado de extratos de produtos naturais.
Introduction
Os produtos naturais de plantas, animais ou microrganismos têm sido uma área de interesse crescente ao longo dos anos no desenvolvimento de novas moléculas bioativas devido à sua variada gama de atividades biológicas e farmacológicas1. No entanto, os efeitos colaterais associados, a resistência aos medicamentos ou a especificidade inadequada dos agentes, especialmente quando utilizados como drogas anticancerígenas, representam os principais fatores que podem levar a um tratamento ineficaz 1,2.
Nas últimas décadas, vários agentes citotóxicos derivados de plantas têm sido descobertos, alguns deles utilizados como agentes anticancerígenos 1,2,3. Nesse contexto, o paclitaxel é relatado como um dos quimioterápicos de origem natural mais conhecidos e ativos 3,4. Atualmente, estima-se que mais de 35% de todos os medicamentos no mercado são derivados ou são inspirados em produtos naturais5. A potencial alta toxicidade desses compostos requer consideração durante todas as fases do estudo, uma vez que diferentes tipos de contaminantes ou mesmo componentes metabólicos da própria planta podem causar efeitos tóxicos. Por esta razão, os perfis farmacológicos e toxicológicos devem ser realizados na fase preliminar, a fim de avaliar a atividade biológica e a segurança de novos potenciais tratamentos à base de plantas. Para avaliar a toxicidade de novas amostras bioativas, os animais invertebrados podem ser considerados como os melhores modelos a serem estudados. Exigem requisitos éticos mínimos e permitem ensaios preliminares in vitro, para priorizar os produtos mais promissores para a próxima rodada de testes em vertebrados 1,6.
A. salina é um pequeno invertebrado halofílico pertencente ao gênero Artemia (família Artemiidae, ordem Anostraca, subfilo Crustacea; Figura 1). Nos ecossistemas salinos marinhos e aquáticos, os camarões de salmoura desempenham um importante papel nutricional, pois se alimentam de microalgas e são constituintes do zooplâncton usado para alimentar peixes. Além disso, suas larvas (conhecidas como náuplios) são amplamente utilizadas na avaliação da toxicidade geral durante estudos preliminares 1,3,7.
Artemia spp. são amplamente utilizados em estudos de letalidade e também são um ponto de partida conveniente para avaliações de toxicidade, rastreando a toxicidade de compostos potencialmente bioativos com base em sua capacidade de matar náuplios cultivados em laboratório 1,8. Por esse motivo, o uso de A. salina ganhou atração em estudos gerais de toxicidade, por ser um método muito eficiente e de fácil utilização, em comparação com outros ensaios em modelos animais9.
Devido à sua anatomia simples, tamanho minúsculo e ciclo de vida curto, um grande número de invertebrados pode ser estudado em um único experimento. Como tal, combinam amenidade genética e compatibilidade de baixo custo com rastreios em larga escala1. Nesse contexto, o uso do camarão de salmoura em um ensaio geral de toxicidade apresenta diversas vantagens, como crescimento rápido (28-72 h é necessário desde a eclosão até os primeiros resultados), custo-efetividade e longa vida útil dos ovos comerciais, que podem ser utilizados durante todo o ano 3,10. Por outro lado, uma vez que os invertebrados possuem um sistema orgânico primitivo e carecem de um sistema imunológico adaptativo, eles não representam um modelo perfeito e confiável para as células humanas1.
No entanto, fornece um método de avaliação preliminar para a toxicidade geral de amostras selecionadas. Uma vez que é amplamente utilizado como um ensaio de letalidade, pode fornecer indicações provisórias sobre os efeitos tóxicos de potenciais agentes anticancerígenos. Muitas vezes também é usado para obter feedback sobre a toxicidade geral de compostos dotados de quaisquer outras atividades biológicas para as quais é essencial mostrar a menor taxa de mortalidade possível entre os camarões Artemia .
Em um estudo em andamento de nosso grupo, diferentes extratos de espécies de Plectranthus mostraram atividades antioxidantes e antimicrobianas (resultados não publicados). Paralelamente, compostos isolados foram obtidos por purificação dos extratos e então modificados quimicamente. Os extratos, compostos puros e derivados semissintéticos foram então testados em termos de toxicidade geral. Nesse contexto, o presente trabalho tem como objetivo dar uma visão geral do uso do bioensaio de letalidade Artemia para a avaliação da toxicidade geral e potencial atividade citotóxica de extratos bioativos e compostos isolados de diferentes plantas do gênero Plectranthus11.
Figura 1: Artemia salina ao microscópio. Náuplios recém-eclodidos de A. salina como visto ao microscópio (ampliação 12x). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. Preparação do equipamento
- Adquirir equipamentos de incubação comercialmente disponíveis. Selecione um local adequado para configurar o equipamento de eclosão (Figura 2A). Coloque o recipiente em forma de funil no suporte preto (incluído no conjunto) e gire o funil em uma direção adequada para ver a marca de nível e a torneira.
- Para fazer equipamentos de migração feitos à mão, corte a parte superior de duas garrafas plásticas de 0,5 L (5,8 cm de diâmetro) para obter uma altura final de 12 cm. Crie um orifício de 1,5 cm de diâmetro de um lado a 7 cm do fundo em cada garrafa e insira um tubo de borracha de 13 cm (1,3 cm de diâmetro externo e 0,9 cm de diâmetro interno) entre as duas aberturas. Selar as aberturas com cola quente (Figura 2B) e deixar secar por 15 min; Coloque as garrafas em uma superfície plana e encha-as com água para verificar se não há vazamento.
2. Preparação de solução salina artificial
- Num copo de vidro, preparar uma solução salina artificial (sal de camarão em salmoura) a uma concentração de 35 g/L. Para fazer isso, adicione 28 g de sal a 800mL de água da torneira, de acordo com as instruções do fabricante. Misture com uma haste de agitação até que todo o sal esteja completamente dissolvido.
NOTA: Ajustar o volume da solução salina preparada de acordo com o tamanho dos recipientes disponíveis.
3. Preparação da amostra
- Preparar todas as amostras em um tubo de microcentrífuga, dissolvendo uma quantidade adequada de extratos (extratos de Plectranthus , Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus ; e Pe- P. ecklonii) ou compostos 1-5 (dois compostos naturais [1 e 2] obtidos de Plectranthus spp. e três derivados semissintéticos [3, 4, 5]; Figura 3) em dimetilsulfóxido (DMSO)12, de modo a obter uma concentração final de 10 mg/mL (se a amostra for solúvel em água, não é necessário o uso de DMSO).
- Diluir 10 μL de cada amostra (e DMSO para o controlo negativo) num novo tubo de microcentrífuga utilizando 990 μL de solução salina artificial preparada no passo 2.1, para obter uma concentração final de 0,1 mg/ml.
- Sob um exaustor, num balão de Erlenmeyer, preparar uma solução de dicromato de potássio (K2 Cr2O7) em água destilada na concentração de 1 mg/ml13,14,15.
4. Bioensaio de letalidade de camarão em salmoura
NOTA: Este ensaio é desenvolvido a partir de trabalhos de diversos autores com modificações 1,16,17,18,19.
- Encher o recipiente de eclosão com o meio preparado na etapa 2.1 até a marca de nível (500 mL) (Figura 2C).
- Coloque uma colher (aproximadamente 0,75 g) de cistos de camarão de salmoura na solução salina e, em seguida, feche o recipiente. Coloque uma lâmpada (luminária de mesa, 40 W, 230 V, 50 Hz, com uma lâmpada LED de 8 W, 4.000 K, 830 lm) apontando diretamente para o equipamento (Figura 2A) e ligue-a.
- Conecte o sistema do fornecedor de ar (saída de 3 W, 50 Hz, 230 V) ao conector colocado na parte superior do equipamento e ligue a bomba.
- Manter a temperatura ambiente a 25 ± 3 °C. Os cistos de camarão de salmoura eclodem na solução salina artificial, sob aeração vigorosa, iluminação contínua e temperatura estável, após 24 h a 48 h.
NOTA: Alternativamente, uma incubadora vertical pode ser usada. - Uma vez que os ovos tenham eclodido, desligue a bomba de ar e espere até que os náuplios (movendo-se em direção ao fundo do funil) sejam separados das caixas de ovos vazias (flutuando no topo).
- Para separar os ovos não eclodidos dos náuplios vivos, abra a torneira de saída no fundo e descarregue o conteúdo do funil num dos recipientes do recipiente do equipamento de migração feito à mão (descrito na etapa 1.2). Certifique-se de que a solução que contém os náuplios e os ovos residuais não eclodidos está abaixo do nível do tubo. No segundo recipiente, adicionar a solução salina residual da etapa 2.1 acima da altura do tubo.
- Cubra o recipiente com os náuplios e os ovos residuais não eclodidos usando papel alumínio. Coloque a lâmpada no segundo recipiente apenas com a solução salina. O camarão de salmoura será atraído pela luz e migrará de um recipiente para o outro (recipiente de colheita), levando a uma separação eficiente entre ovos (sedimentados lentamente até o fundo) e Artemia viva.
- Em seguida, coloque o equipamento na incubadora nas mesmas condições utilizadas na etapa 4.4 por 4 h (Figura 2E). Do recipiente de colheita, coletar 900 μL de solução salina contendo 10 a 15 náuplios. Colocar a solução salina com náuplios em cada poço de uma placa de 24 poços (Figura 2F); todas as amostras são testadas em quadruplicados.
- Adicionar 100 μL cada um do controle negativo (DMSO), o controle positivo (K 2Cr2O7, dicromato de potássio), a solução salina artificial e cada uma das amostras ao respectivo poço (Figura 2F)13,14.
NOTA: As amostras em cada poço estarão na concentração de 0,01 mg/mL. A concentração final do controle positivo em solução salina será de 0,1 mg/mL, para garantir que todos os náuplios do poço sejam expostos ao efeito tóxico do dicromato de potássio e morram. A solução salina artificial atuará como em branco. - Incubar a placa a 25 ± 3 °C sob iluminação durante 24 h (figura 2G). Após 24 h, registrar o número de larvas mortas (náuplios não móveis por 5 s) em cada poço sob microscópio binocular (12x)20 (Figura 2H). Alternativamente, use uma lente de mão.
- Adicionar 100 μL de solução de dicromato de potássio, para induzir a morte das larvas vivas restantes, e aguardar 6 h. Conte o total de larvas mortas em cada poço sob um microscópio. Determine a taxa de mortalidade de acordo com a equação a seguir.
- Realize todo o ensaio em triplicado. Calcular desvios-padrão (DP) e expressar os resultados como a média de três experimentos independentes, cada um com quadruplicados internos (n = 12), ± DP. Como mencionado por Meyer et al., consideram extratos brutos e compostos puros com CL50< 1.000 μg/mL como tóxicos; além disso, levar em conta que a taxa de mortalidade do camarão de salmoura é proporcional à concentração das amostras testadas21.
Figura 2: Método de bioensaio de letalidade de Artemia salina. (A) Equipamento comercialmente disponível empregado para a eclosão de cistos de camarão de salmoura; (B) Equipamento de migração artesanal; (C) Recipiente para incubação cheio de solução salina; (D) Coleta de ovos não eclodidos e náuplios; (E) Equipamento artesanal na incubadora durante a etapa de migração. O recipiente longe da lâmpada deve ser coberto com papel alumínio; no entanto, para uma melhor visualização da instalação do conjunto aqui foi removido; (F) Colheita de artêmia em poços antes da realização do ensaio. Os compostos devem ser colocados como mostrado: - refere-se ao controle negativo (DMSO), + ao controle positivo (K2 Cr2O7), sal à solução salina artificial e 1 a 3 às amostras a serem testadas (neste caso, compostos 1-3); (G) Incubação da placa de 24 poços contendo Artemia e das amostras selecionadas; (H) Contagem de artemia ao microscópio binocular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Estruturas de compostos selecionados. Estrutura dos compostos 1-2, extraídos de espécies de Plectranthus , e compostos 3-5, obtidos por semi-síntese. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
A toxicidade geral de alguns produtos naturais recentemente estudados pelo nosso grupo foi avaliada através do bioensaio de letalidade de camarão em salmoura. Quatro extratos (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; e Pe- P. ecklonii) do gênero Plectranthus , conhecido por sua atividade antioxidante (resultados não publicados), foram testados. Além disso, dois compostos naturais (1 e 2) obtidos de Plectranthus spp., e três derivados semissintéticos (3, 4, 5; Figura 3), todos descritos em outro trabalho3, também foram investigados. Neste documento, sua avaliação preliminar em termos de potencial atividade citotóxica é relatada.
Todos os extratos testados apresentaram resultados muito animadores, com taxas de mortalidade muito baixas, comparáveis aos registrados para o blank (solução salina) e o controle negativo (DMSO; Figura 4). Por outro lado, entre os compostos puros 1-5, apenas o derivado 5 apresentou baixa taxa de mortalidade (2,30% na concentração de 100 ppm) sem toxicidade geral (Figura 5).
Figura 4: Letalidade dos extratos em Artemia salina. Taxa de mortalidade de A. salina (%) após 24 h de exposição a quatro extratos metanólicos de Plectranthus spp., a 0,1 mg/mL (Pa- P. ambigerus; Pb- P. barbatus; Pc- P. cylindraceus; Pe- P. ecklonii). Todos os extratos foram aceitáveis em termos de toxicidade geral utilizando este ensaio. O sal corresponde à solução salina (em branco); K2 Cr2O7 foi utilizado como controle positivo e DMSO como controle negativo. Os resultados foram expressos como a média de três experimentos independentes, cada um com quadruplicados internos (n = 12) ± DP. As comparações foram realizadas dentro dos grupos pela análise de variância, utilizando-se a ANOVA one-way com o pós-teste de Dunnett. Diferenças significativas entre os grupos controle e experimental foram avaliadas por meio de um software de análise estatística comercial. Considerou-se que o nível de probabilidade p < 0,01 indicava significância estatística. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Letalidade de compostos em Artemia salina. Taxa de mortalidade de A. salina (%) após 24 h de exposição a cinco compostos puros a 0,1 mg/mL (1 e 2 são produtos naturais e 3-5 são derivados preparados a partir de 1 e 2). É evidente que apenas 5 mostram toxicidade muito limitada usando este ensaio. O sal corresponde à solução salina (em branco); K2 Cr2O7 foi utilizado como controle positivo e DMSO como controle negativo. Os resultados foram expressos como a média de três experimentos independentes, cada um com quadruplicados internos (n = 12) ± DP. As comparações foram realizadas dentro dos grupos pela análise de variância, utilizando-se a ANOVA one-way com o pós-teste de Dunnett. Diferenças significativas entre os grupos controle e experimental foram avaliadas por meio de um software de análise estatística comercial. Considerou-se que o nível de probabilidade p < 0,01 indicava significância estatística. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os produtos naturais 1 e 2 apresentaram letalidade moderada (36,68% e 30,95% a 100 ppm, respectivamente), enquanto os derivados semissintéticos 3 e 4, obtidos de 1 e 2, respectivamente, foram mais tóxicos que o andaime original (64,02% e 36,64% a 100 ppm, respectivamente; Figura 5).
Os dados gerais sugeriram que todos os extractos testados, conhecidos pela sua actividade antioxidante e que não apresentam toxicidade geral, podem ser considerados candidatos a novos estudos de actividade e toxicidade in vitro em linhagens celulares seleccionadas. Se a ausência de toxicidade também for demonstrada em modelos cutâneos, o desenvolvimento de novos produtos bioativos para aplicação cutânea pode ser realizado. Por outro lado, os efeitos tóxicos observados para os compostos 1-4 podem torná-los candidatos adequados para avaliações adicionais como agentes anticancerígenos.
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Discussion
Nos últimos anos, a comunidade científica tem aumentado sua atenção para modelos alternativos para exames de toxicidade21. Além do bioensaio de letalidade de A. salina, outras metodologias são geralmente realizadas para a avaliação da tolerabilidade da amostra e incluem bioensaios de vertebrados (como roedores), invertebrados (como o peixe-zebra), métodos in vitro usando cepas ou células de levedura e métodos in silico 22,23,24,25 . Todos esses métodos têm claras vantagens e desvantagens, considerando o dinheiro e o tempo gastos, a reprodutibilidade dos resultados e o tipo de amostra a ser analisada. Por exemplo, as abordagens in silico representam uma metodologia padronizada de baixo custo, exigindo equipamentos mínimos. No entanto, quando tais estudos estão focados em um único alvo, obtêm-se resultados de baixa qualidade, tornando essa alternativa fora do escopo de exames preliminares, como apresentamos neste estudo25,26. Quando se trata de microrganismos, o Saccharomyces cerevisiae é considerado um dos modelos mais utilizados para a avaliação de compostos tóxicos23. De fato, o uso de levedura in vitro é geralmente rápido e fácil de realizar; no entanto, pode ser caro, pois requer produtos e equipamentos químicos específicos, e apresenta baixa sensibilidade a doses mínimas de compostos citotóxicos27. Em uma abordagem alternativa, as células humanas podem ser empregadas, de forma rápida, simples e barata. Mesmo assim, estes não podem representar um organismo inteiro; assim, as interações entre diferentes tipos celulares e as perturbações sistêmicas que ocorrem em condições fisiológicas não são adequadamente levadas em conta25,26. Por outro lado, os ensaios in vivo têm a grande vantagem de levar em consideração todo o organismo, mas os modelos animais (como os roedores) demandam mais tempo para a execução do ensaio, são mais caros e implicam considerações éticas complexas25. Por outro lado, ensaios in vivo que empregam organismos aquáticos para triagem de toxicidade são geralmente bem aceitos, considerando também que o uso de invertebrados marinhos sofre menos preocupações éticas, e a metodologia é de fácil execução, rápida e barata21,24. Neste contexto, o uso de peixe-zebra para o estudo da toxicidade geral muitas vezes representa a primeira escolha no campo. De fato, em comparação com outros testes em animais, pode ser considerada uma opção de baixo custo, pois o peixe-zebra se desenvolve rapidamente e atinge o estágio larval inicial em torno de 72 h a 13 dias após a fertilização21,28. No entanto, a manutenção de um peixe-zebra requer operadores bem treinados e condições específicas, como um tanque de peixes com um sistema circulante, capaz de arejar e filtrar a água do sistema, para manter a qualidade geral; além disso, várias tampas e tampas de drenagem são necessárias, pois o peixe-zebra pode saltar, bem como condições específicas de iluminação (14 h de luz, 10 h de escuridão), e os níveis de pH precisam ser verificados diariamente, entre outros29,30. Em conjunto, essas considerações tornam os modelos de peixe-zebra mais demorados e caros do que o modelo Artemia relatado aqui, uma vez que esses microcrustáceos são mais fáceis de manusear e viáveis para o cultivo em grandes populações usando métodos de laboratório. Isso faz de A. salina, sem dúvida, uma das ferramentas de triagem mais empregadas, utilizada principalmente para testar a toxicidade geral de diferentes amostras, como medicamentos e extratos de plantas medicinais1.
No protocolo, A. salina nauplii foi criada, coletada e incubada com amostras adequadas por 24 h, para estimar a taxa de mortalidade dos náuplios induzida por cada amostra. Na primeira etapa, a eclosão dos ovos é realizada em um vaso reprodutor em forma de funil comercialmente disponível, no qual foi introduzido o borbulhamento vigoroso (Figura 2A). Esta aeração forçada é necessária, uma vez que permite que a eclosão do camarão de salmoura ocorra com o maior sucesso possível. A eclosão ocorre por volta das 24 h a 25 ± 3 °C, enquanto até 48 h podem ser necessárias em temperaturas mais baixas. Uma vez que os ovos eclodem, a bomba é desligada para permitir que as caixas de ovos vazias flutuem no topo, enquanto os náuplios e os ovos não eclodidos são facilmente coletados abrindo a torneira do funil na parte inferior. Durante nossos experimentos, a eclosão completa dos ovos nunca foi alcançada, com a consequente presença de náuplios e ovos não maduros na solução coletada. Por esta razão, a fim de separar eficientemente as duas formas de Artemia, é preparado um equipamento artesanal para a migração de camarões de salmoura (etapa 1.2). Um recipiente é preenchido com os organismos colhidos e, em seguida, coberto com papel alumínio, enquanto o outro recipiente é exposto à luz direta de uma lâmpada. Nessas condições, os ovos não eclodidos tendem a se estabelecer, enquanto os náuplios vivos são atraídos pela luz que atinge o recipiente adjacente, favorecendo a migração de um lado para o outro através da conexão da ponte. Após 4 h, quase todos os náuplios vivos estão dentro do recipiente expostos à luz e prontos para serem coletados para a execução do ensaio. Nesta fase, porções da solução de água salgada, contendo dez a quinze náuplios, são removidas e incubadas com cada uma das amostras a serem testadas.
Neste trabalho, foi demonstrado como o método é eficiente, econômico e fácil de ser realizado. No entanto, alguns pontos críticos devem ser reconhecidos ao realizar este ensaio.
O ensaio é geralmente realizado com água da torneira. Dependendo de fatores geográficos e físico-químicos, a água da torneira apresenta diferentes distribuições de dureza, influenciando a reprodutibilidade do ensaio e, em particular, a etapa de eclosão do ovo. Pela mesma razão, o uso de água do mar poderia influenciar a reprodutibilidade do teste. A variação da concentração de sal, a presença de contaminantes, microplásticos e outros corpúsculos forçariam o operador a passar por etapas adicionais, como filtrações e outros tipos de purificação, que tornariam o experimento mais complexo e menos fácil de manusear. Tudo considerado, as condições ideais devem ser estabelecidas com base nas características e disponibilidade de água da torneira, especialmente por uma regulação cuidadosa da quantidade de sal artificial adicionado, que cria um ambiente adequado e atua como alimento para os náuplios também.
Grandes variações nas temperaturas podem resultar em taxas de eclosão mais baixas. Como consequência, baixos níveis de Artemia viva puderam ser observados, misturados com um alto número de ovos não eclodidos. Claramente, tais condições não são adequadas para o desenvolvimento de ensaios confiáveis, portanto, uma climatização controlada da sala ou o uso de incubadoras verticais apropriadas devem ser consideradas.
É necessária uma aeração vigorosa da solução dentro do recipiente de eclosão. A presença de borbulhamento contínuo favorece o contato entre os ovos e acelera o processo de eclosão.
A coleta de ovos não eclodidos e náuplios durante a colheita pode influenciar fortemente a confiabilidade do ensaio. Isto é devido à possibilidade de eclosão durante a incubação com as amostras. Nesse caso, nem todos os náuplios terão sido expostos pelo mesmo período de tempo, com consequentes taxas de mortalidade errôneas. Como os ovos e os náuplios são pequenos demais para serem separados de forma eficiente, são necessários tempos de incubação mais altos no equipamento de eclosão ou o uso do equipamento de migração artesanal.
Cada poço deve conter 10-15 náuplios para a etapa de incubação, cuidadosamente contados pelo uso de um microscópio binocular (ampliação de 12x). A presença de muitos náuplios no mesmo poço pode dificultar a contagem final, ou mesmo errônea, por causa da sobreposição. Por outro lado, pequenas quantidades de camarões levariam a resultados sem significância estatística.
Como é evidente, a maioria dos problemas deste método está relacionada com as fases de eclosão e crescimento, onde é necessária mais atenção para evitar problemas de fiabilidade. Mesmo assim, o método pode tolerar modificações, especialmente em relação aos pontos mais críticos descritos acima. É claro que, quando um desses parâmetros é alterado, pode ser necessário realizar várias tentativas de otimizar o método original. Por exemplo, alterar a temperatura pode ajudar a controlar o tempo total do ensaio: aumentar a temperatura até 28-29 °C também aumentará a taxa de eclosão e acelerará todo o processo.
Algumas limitações do bioensaio de A. salina também estão relacionadas à estabilidade das amostras às condições e ao tempo de teste. O ensaio só pode ser realizado utilizando amostras estáveis à temperatura ambiente e sob luz visível. Além disso, deve-se levar em conta que todo o procedimento dura pelo menos 4 dias e, se a taxa de eclosão for baixa, o ensaio pode precisar de um dia extra para a etapa de eclosão.
De modo geral, neste estudo, destacamos dois exemplos da aplicação da avaliação geral da toxicidade pelo método de A. salina. Foi estabelecida uma toxicidade geral para todas as amostras ensaiadas. Extratos de plantas de Plectranthus e do composto 5 não apresentaram toxicidade geral, enquanto os compostos 1-4 provaram ser moderadamente ou mesmo altamente tóxicos em camarões de salmoura. Em particular, o efeito negativo dos compostos 1 e 2 sobre a Artemia foi previamente demonstrado por Sitarek e Matias pelos ensaios de MTT e SRB/MTT, respectivamente31,32. Ao mesmo tempo, os análogos benzoilados, compostos 3 e 4, apresentam valores de toxicidade mais elevados do que seus precursores 1 e 2, destacando que a funcionalização do éster poderia ter um papel importante em termos de citotoxicidade, como confirmado para o composto 4 na linhagem celular de câncer MDR do CPNPC humano por Garcia et al.33. No entanto, outros ensaios são necessários para confirmar que tal atividade citotóxica poderia ser explorada na terapia do câncer. Por outro lado, o derivado 5, juntamente com todos os extratos ensaiados, não apresentou toxicidade e aparece como o composto puro mais promissor da série. No entanto, mais estudos para avaliar a potencial atividade biológica para aplicação cutânea são necessários.
Aqui demonstramos como o uso do método baseado em Artemia salina como uma ferramenta de triagem poderia permitir economizar tempo e dinheiro, em comparação com outras metodologias conhecidas. Representa uma forma eficiente e vantajosa de ser explorada em contextos preliminares de toxicidade. Pode ser usado na presença de amostras diferentes e complexas, drogas sintéticas e semissintéticas, bem como para o fracionamento bioguiado de extratos e amostras de produtos naturais.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse, financeiros ou não.
Acknowledgments
Em memória do professor Amílcar Roberto.
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal) no âmbito dos projetos UIDB/04567/2020 e UIDP/04567/2020 atribuídos ao CBIOS e à bolsa de doutoramento SFRH/BD/137671/2018 (Vera Isca).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | - | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | - | - | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | - |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | - | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 - 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | - | - | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 - 100 °C |
References
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