Summary
We presenteren een stapsgewijs protocol voor de isolatie van lange termijn hematopoëtische stamcellen (LT-HSCs) en korte termijn HSC's (ST-HSCs) met behulp van het Hoxb5 reporter systeem.
Abstract
Zelfvernieuwingscapaciteit en multi-lineage differentiatiepotentiaal worden over het algemeen beschouwd als de bepalende kenmerken van hematopoietische stamcellen (HSC's). Talrijke studies hebben echter gesuggereerd dat functionele heterogeniteit bestaat in het HSC-compartiment. Recente eencellige analyses hebben HSC-klonen gemeld met verschillende celloten binnen het HSC-compartiment, die bevooroordeelde HSC-klonen worden genoemd. De mechanismen die ten grondslag liggen aan heterogene of slecht reproduceerbare resultaten zijn weinig begrepen, vooral met betrekking tot de lengte van zelfvernieuwing wanneer gezuiverde HSC-fracties worden getransplanteerd door conventionele immunostaining. Daarom is het van cruciaal belang om dit probleem op te lossen door een reproduceerbare isolatiemethode vast te stellen voor HSC's op lange termijn (LT-HSC's) en HSC's op korte termijn (ST-HSC's), gedefinieerd door de lengte van hun zelfvernieuwing. Met behulp van onbevooroordeelde meerstapsscreening identificeerden we een transcriptiefactor, Hoxb5, die een exclusieve marker van LT-HSC's in het hematopoietische systeem van de muis kan zijn. Op basis van deze bevinding hebben we een Hoxb5-reportermuislijn opgezet en met succes LT-HSC's en ST-HSC's geïsoleerd. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van LT-HSC's en ST-HSC's met behulp van het Hoxb5-reportersysteem . Deze isolatiemethode zal onderzoekers helpen de mechanismen van zelfvernieuwing en de biologische basis voor dergelijke heterogeniteit in het HSC-compartiment beter te begrijpen.
Introduction
Hematopoietische stamcellen (HSC's), die zelfvernieuwingsvermogen en multipotentie bezitten, bevinden zich aan de top van de hematopoietische hiërarchie 1,2. In 1988 toonden Weissman en collega's voor het eerst aan dat de isolatie van HSC's van muizen kon worden bereikt met behulp van flowcytometrie3. Vervolgens werd gemeld dat een fractie gedefinieerd door een combinatie van celoppervlakmarkers, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, alle HSC's in muizen 4,5,6,7,8 bevatte.
Immunofenotypisch gedefinieerde (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC's (hierna pHSC's) werden voorheen als functioneel homogeen beschouwd. Recente eencellige analyses hebben echter aangetoond dat pHSC's nog steeds heterogeniteit vertonen met betrekking tot hun zelfvernieuwingscapaciteit9,10 en multipotentie11,12. In het bijzonder lijken er twee populaties te bestaan in de pHSC-fractie met betrekking tot hun zelfvernieuwingscapaciteit: hematopoëtische stamcellen op lange termijn (LT-HSC's), die een continu zelfvernieuwingsvermogen hebben, en kortdurende hematopoëtische stamcellen (ST-HSC's), die een tijdelijk zelfvernieuwingsvermogen hebben 9,10.
Tot op heden blijven de moleculaire mechanismen van zelfvernieuwingscapaciteit die LT-HSC's en ST-HSC's onderscheiden slecht begrepen. Het is cruciaal om beide celpopulaties te isoleren op basis van hun zelfvernieuwingscapaciteiten en om onderliggende moleculaire mechanismen te ontdekken. Er zijn ook verschillende reportersystemen geïntroduceerd om LT-HSC's13,14,15 te zuiveren; de LT-HSC-zuiverheid die door elk reportersysteem wordt gedefinieerd, is echter variabel en exclusieve LT-HSC-zuivering is tot op heden niet bereikt.
Daarom zal de ontwikkeling van een isolatiesysteem voor LT-HSC's en ST-HSC's het onderzoek naar zelfvernieuwingscapaciteit in de pHSC-fractie versnellen. In de isolatie van LT-HSC's en ST-HSC's identificeerde een studie met behulp van meerstaps, onbevooroordeelde screening een enkel gen, Hoxb5, dat heterogeen tot expressie komt in de pHSC-fractie16. Bovendien bleek uit beenmerganalyse van de Hoxb5-reportermuizen dat ongeveer 20% -25% van de pHSC-fractie bestaat uit Hoxb5-pos-cellen. Een competitieve transplantatietest met Hoxb5pos pHSCs en Hoxb5 neg pHSCs toonde aan dat alleen Hoxb5pos pHSCs over zelfvernieuwingscapaciteit op lange termijn beschikken, terwijl Hoxb5neg pHSCs hun zelfvernieuwingscapaciteit binnen een korte periode verliezen, wat aangeeft dat Hoxb5 LT-HSC's identificeert in de pHSC-fractie16.
Hier demonstreren we een stapsgewijs protocol om LT-HSC's en ST-HSC's te isoleren met behulp van het Hoxb5-reportersysteem . Daarnaast presenteren we een competitieve transplantatietest om de zelfvernieuwingscapaciteit van Hoxb5pos/neg pHSCs te beoordelen (figuur 1). Dit Hoxb5 reporter systeem stelt ons in staat om LT-HSC's en ST-HSCs prospectief te isoleren en draagt bij aan het begrip van LT-HSC-specifieke kenmerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven dierproeven zijn goedgekeurd door het RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.
1. Voorconditionering van de ontvangende muizen
- Bereid mannelijke C57BL / 6 congene muizen van 8-10 weken oud voor als ontvangende muizen. Het aantal ontvangende muizen is afhankelijk van het experimentele protocol. We bereiden meestal 10-20 muizen voor elke aandoening.
- Voed de muizen met gesteriliseerd water aangevuld met enrofloxacine (170 mg / L). Aangezien bestraalde ontvangende muizen zeer vatbaar zijn voor infecties, moet u de kooien zo schoon mogelijk houden.
OPMERKING: Suppletie met antibiotica begint 24 uur voorafgaand aan de bestraling en gaat door tot 3 weken na transplantatie om infecties te voorkomen.
- Voed de muizen met gesteriliseerd water aangevuld met enrofloxacine (170 mg / L). Aangezien bestraalde ontvangende muizen zeer vatbaar zijn voor infecties, moet u de kooien zo schoon mogelijk houden.
- Totale lichaamsbestraling
- Totale lichaamsbestraling vernietigt de ontvangende beenmergcellen om de transplantatie van de donorcellen te garanderen. Breng de ontvangende muizen over in een bestralingskooi. Lethally bestralen van de ontvangende muizen met een enkele dosis van 8,7 Gy op 12-16 uur vóór transplantatie.
OPMERKING: De stralingsdosis en -tijd kunnen variëren, afhankelijk van de apparatuur. De dodelijke stralingsdosis moet worden bevestigd met de bestralings- en muizenstam van de onderzoeker. - Breng ze terug naar hun kooien na de totale lichaamsbestraling.
- Totale lichaamsbestraling vernietigt de ontvangende beenmergcellen om de transplantatie van de donorcellen te garanderen. Breng de ontvangende muizen over in een bestralingskooi. Lethally bestralen van de ontvangende muizen met een enkele dosis van 8,7 Gy op 12-16 uur vóór transplantatie.
2. Verzameling van de beenmergcellen van de donor
- Bereid een mannelijke Hoxb5-tri-mCherry-muis van 12 weken oud voor en euthanaseer de muis door CO2-blootstelling gevolgd door cervicale dislocatie of met behulp van methoden die zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dieren.
OPMERKING: Het reagensvolume per muis wordt in de volgende stappen beschreven. - Verwijder onder steriele omstandigheden de huid en stel de botten bloot (dijbeen, scheenbeen, bekken, opperarmbeen). Snijd de belangrijkste spieren en neem de botten (dijbeen, scheenbeen, bekken, opperarmbeen) van de muis. Leg ze in steriele celkweekschaaltjes met Ca 2+- en Mg2+-vrije, ijskoude PBS.
- Knip de spieren en vezelige weefsels van de botten met een pincet, een kleine schaar en doekjes om besmetting te voorkomen. Pas op dat u de botten tijdens deze stap niet breekt. Gooi gebroken botten weg om de steriliteit te behouden.
- Steriliseer een vijzel en stamper met 70% ethanol (EtOH) en laat ze volledig drogen. Evenwicht met celkleuringsbuffer (Ca 2+- en Mg2+-vrije PBS aangevuld met 2% warmte-geïnactiveerde FBS, 2 mM EDTA, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine).
- Doe de botten in de mortel en voeg 3 ml celkleuringsbuffer toe. Plet de botten open met de stamper. Splits de celklonters door voorzichtig pipetteren en breng de celsuspensie door een celzeef van 100 μm over in een buis van 50 ml.
- Herhaal stap 2.5 totdat de oplossing duidelijk wordt. Meestal is drie keer voldoende.
3. Scheiding van de c-kit+ cellen door magnetische sortering
- Antilichaamkleuring voor magnetische sortering
- Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 1 ml celkleuringsbuffer. Voeg 10 μL rat-IgG (5 mg/ml) toe om de niet-specifieke antilichaambinding te verminderen en pipetteer voorzichtig op en neer met een P1.000-pipet. Incubeer op ijs gedurende 15 min.
- Voeg het c-Kit-antilichaam (kloon 2B8) toe in een concentratie van 4 μg/ml en meng met een P1.000-pipet. Incubeer op ijs gedurende 15 min.
- Voeg 5 ml celkleuringsbuffer toe en meng goed. Centrifugeer de monsters bij 400 x g, 4 °C, 5 min. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 500 μL celkleuringsbuffer.
- Voeg 35 μL anti-APC microbeads toe om de c-Kit+ cellen te verrijken en meng met een P1.000 pipet. Incubeer op ijs gedurende 15 min.
- Voeg 4-5 ml celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 1 ml celkleuringsbuffer.
- De c-Kit+ cellen magnetisch sorteren
- Volg de instructies van de fabrikant om de cellen te sorteren. Kortom, prime een magnetische sorteerkolom met 3 ml celkleuringsbuffer. Filter het monster (1 ml) door een celzeef van 40 μm en laad het monster op de magnetische sorteerkolom.
- Was door drie keer 3 ml celkleuringsbuffer toe te voegen. Voeg de celkleuringsbuffer alleen toe als het kolomreservoir leeg is.
- Plaats de magnetische sorteerkolom bovenop een ijskoude buis van 15 ml en voeg 5 ml celkleuringsbuffer toe. Spoel de cellen weg door de zuiger stevig in de kolom te duwen. Houd de doorstroming op ijs.
OPMERKING: In geval van accidenteel monsterverlies houden we de doorstroming tot het einde van het experiment.
4. Hematopoëtische stamcelkleuring
- Centrifugeer het in stap 3.2.3 bereide monster gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op.
- Voeg het CD34-antilichaam (kloon RAM34) in een concentratie van 50 μg/ml toe aan de pellet en incubeer gedurende 60 minuten op ijs.
OPMERKING: Voorbereiding van de ondersteunende cellen tijdens het eerste uur van incubatie met CD34 wordt aanbevolen om de verwerkingstijd te verkorten. - Bereid de antilichaammastermix volgens tabel 1. Voeg 100 μL van het hoofdmengsel toe aan het monster en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Het antilichaam voor het CD34-antigeen (kloon; RAM34) heeft 90 minuten nodig voor voldoende kleuring.
- Voeg 4-5 ml celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op. Voeg streptavidin-BUV737 in een concentratie van 3 μg/ml toe aan de pellet en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Voeg 4-5 ml celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 400 μL celkleuringsbuffer. Bewaar het monster op ijs.
5. Ondersteuning van celvoorbereiding
- Bereid een CD45.1+ CD45.2+ congene muis van 12 weken oud; Idealiter zou dit dezelfde leeftijd moeten hebben als de donormuis. Euthanaseer de muis door CO2-blootstelling gevolgd door cervicale dislocatie of met behulp van methoden die zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dieren.
OPMERKING: In het gegeven voorbeeld werden CD45.1+ CD45.2+ congene muizen in eigen huis gefokt door B6 te kruisen. CD45.1 congene muizen met C57BL/6J muizen16. - Neem onder steriele omstandigheden zowel dijbenen als scheenbeen en plaats ze in steriele celkweekschalen met Ca 2+- en Mg2+-vrije, ijskoude PBS. Knip de spieren en vezelige weefsels van de botten met een pincet en een kleine schaar.
- Knip beide uiteinden van de botten met een scherpe, steriele schaar. Gebruik een naald van 23 G en een spuit van 5 ml gevuld met ijskoude celsuspensiebuffer (Ca 2+- en Mg2+-vrije PBS aangevuld met 2% warmte-geïnactiveerde FBS, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine) om het beenmerg uit te spoelen in een steriele celkweekschaal met celsuspensiebuffer. Splits de celklonten uit elkaar door voorzichtig pipetteren.
- Filter de celsuspensie door een celzeef van 40 μm met behulp van een P1.000-pipet. Tel het celnummer van de celsuspensie met behulp van een hemocytometer en bereid een beenmergcelsuspensie met 1 x 106 cellen/ml.
- Breng 200 μL van de beenmergcelsuspensie (2 x 105 cellen) over op een 96-well, ronde bodemplaat. Op ijs bewaren tot gebruik.
OPMERKING: Platen met ronde bodem worden aanbevolen voor eenvoudige celverzameling.
6. Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSC sortering
- Gating instellen
- Breng 400 μL van het in stap 4.5 bereide monster over in een polystyreenreageerbuis met ronde bodem met een 35 μm celzeefdop. Bereid dode celkleuringsreagens voor en voeg het vóór de analyse toe aan het monster volgens de instructies van de fabrikant.
- Schakel een flowcytometer in en start de analysesoftware volgens de instructies van de fabrikant. Druk vervolgens op Laden en haal de gegevens op.
OPMERKING: Een flowcytometer uitgerust met vijf lasers en een mondstuk van 70 μm wordt aanbevolen om de zuiverheid van de gesorteerde cellen te verbeteren. - Na het uitsluiten van doubletten, dode cellen en afstammingspositieve cellen, gaat u naar de Lineage-c-Kit+Sca-1+ fractie. Sluit vervolgens de Flk2+ fractie af. Vervolgens gate Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs in de CD150+CD34−/lage fractie (Figuur 2). Voer compensatie uit voor de spectrale overlap in het eerste experiment.
OPMERKING: Hoxb5-positieve cellen vertegenwoordigen naar verwachting 20% -25% van de Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 − / lageFlk2-fractie.
- Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSC sortering
- Bereid een 1,5 ml eiwitarme bindingsbuis met 600 μL Ca 2+- en Mg2+ -vrije PBS aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS.
- Stel de 1,5 ml lage eiwitbindingsbuis in op een sorteerapparaat en sorteer de Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs in de buis van 1,5 ml met behulp van de gatingstrategie die is ingesteld in stap 6.1.3. Gebruik bij de eerste sortering de opbrengst van de sorteerprecisiemodus.
- Plaats de 96-putplaat met de ondersteunende cellen voorbereid in stap 5.5 op de automatische celdepositie-eenheid (ACDU) -fase. Zet de in stap 6.2.2 bereide 1,5 ml lage eiwitbindingsbuis op de laadpoort van een flowcytometer.
- Sorteer de Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs in een 96-well plaat met de ondersteunende cellen met behulp van de gating-strategie die is ingesteld in stap 6.1.3. Sorteer 10 Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs om hun zelfvernieuwingscapaciteiten te testen.
OPMERKING: Dubbelsorteren wordt aanbevolen om de zuiverheid te verbeteren. Gebruik bij de tweede sortering zuiverheid als de aanbevolen sorteernauwkeurigheidsmodus. - Doorgaans worden 500-1.000 Hoxb5pos pHSC's en 1.500-4.000 Hoxb5neg pHSCs geoogst na dubbele sortering. Ga zo snel mogelijk na de HSC-sortering verder met de transplantatieprocedures om de levensvatbaarheid van de cel te verbeteren (idealiter binnen 1-2 uur).
7. Transplantatie
- Plaats de in stap 6.2.4 voorbereide HSC-gesorteerde plaat met 96 putten op ijs. Behandel de HSC-gesorteerde, 96-well plaat in steriele omstandigheden, idealiter in een celkap.
- Verdoof een ontvangende muis met 2% isofluraan in een gasanesthesie-inductiekamer. Zodra het dier volledig is verdoofd, verwijdert u het en plaatst u het op zijn zij. Om voldoende anesthesie te garanderen, bevestigt u geen beweging als reactie op een schadelijke stimulus.
- Na de bevestiging van de juiste anesthesie, voer zo snel mogelijk een retro-orbitale injectie uit om te voorkomen dat de muis weer bij bewustzijn komt. De retro-orbitale injectie duurt minder dan 30 s.
OPMERKING: Omdat de injectietijd kort is, voltooien we de procedure zonder oogzalf in de ogen aan te brengen. Als de procedure echter langer duurt, raden we het gebruik van oogzalf aan. - Pipetteer de cellen voorzichtig in de HSC-gesorteerde 96-well plaat om ze te mengen. Verzamel de donorcellen in de sorteerplaat met behulp van een insulinespuit van 30 G en injecteer ze in de retroorbitale veneuze plexus van de ontvangende muizen. Het aanbevolen injecteerbare volume is ≤200 μL.
- Observeer totdat de muizen bij bewustzijn zijn en zich verplaatsen in een schone kooi. Breng ze terug naar hun kooien nadat ze hun herstel hebben bevestigd.
8. Perifere bloedanalyse
- Verzamel 50 μL perifeer bloed uit de staartader en resuspensie met 100 μL Ca 2+- en Mg2+-vrije PBS met 2 mM EDTA. Breng alle monsters over op een plaat met 96 putten. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Voeg 200 μL rode bloedcellysisbuffer toe en incubeer gedurende 3 minuten op ijs. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg. Herhaal dit nog een keer.
- Voeg 200 μL celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Bereid antilichaammastermix volgens tabel 2. Voeg 50 μL antilichaammastermix toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Voeg 150 μL celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Voeg 200 μL celkleuringsbuffer toe. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 400 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg. Resuspendeer in 200 μL celkleuringsbuffer en voeg dode celkleuringsreagens toe vóór de analyse volgens de instructies van de fabrikant.
- Analyseer perifeer bloed chimerisme met behulp van een flowcytometer zoals eerder beschreven16. Verzamel bloed na 4 weken, 8 weken, 12 weken en 16 weken na transplantatie om multi-lineage reconstitutie te volgen. Representatieve flowcytometrieplots zijn weergegeven in figuur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eerder werd de zelfvernieuwingscapaciteit gemeten met behulp van competitieve transplantatietests, waarbij wordt aangenomen dat donor-HSC's hun zelfvernieuwingscapaciteit alleen behouden als multi-lineage donorcellen in het perifere bloed van de ontvanger worden waargenomen17. Bovendien definiëren verschillende rapporten LT-HSC's als cellen die enkele maanden na de tweede beenmergtransplantatie perifere bloedcellen blijven produceren10,18. Daarom, om hun zelfvernieuwingsvermogen te vergelijken, werden 10 Hoxb5pos of Hoxb5neg pHSCs geïsoleerd uit Hoxb5 reporter muizen getransplanteerd in dodelijk bestraalde primaire ontvangende muizen met 2 x 105 hele beenmergcellen. Vervolgens werden 16 weken na de primaire transplantatie 1 x 107 beenmergcellen geïsoleerd uit de primaire ontvangende muizen getransplanteerd in dodelijk bestraalde secundaire ontvangende muizen om het zelfvernieuwingsvermogen op lange termijn te beoordelen (figuur 1). Figuur 2 toont representatieve flowcytometrieplots van de beenmerganalyse van de Hoxb5-tri-mCherry-muizen. Ongeveer 20%-25% van de cellen in de pHSC-fractie gedefinieerd door Lineage-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2− waren Hoxb5 pos pHSCs, die slechts 0,001%-0,00125% van het beenmerg van de muis vertegenwoordigen. Figuur 3 toont representatieve flowcytometrieplots van de perifere bloedanalyse bij de ontvangende muizen. De CD45.2-donormuizen (Hoxb5-tri-mCherry-muizen), CD45.1/CD45.2-ondersteunende cellen en CD45.1-ontvangermuizen werden respectievelijk voorbereid om de donor-, ondersteunende en ontvangende cellen afzonderlijk te analyseren.
Figuur 4 toont perifere bloedanalyses bij de ontvangende muizen na 4 weken, 8 weken, 12 weken en 16 weken na transplantatie om donorchimerisme te bevestigen. Uit deze analyses bleek dat hoewel Hoxb5 pos en Hoxb5neg pHSC's 4 weken na transplantatie vergelijkbaar donorchimerisme vertonen, continue hematopoëse alleen werd waargenomen bij de Hoxb5pos pHSC-ontvangers (figuur 4A,B). Aan de andere kant begonnen Hoxb5neg HSC's 8 weken na transplantatie het vermogen te verliezen om hematopoëtische cellen te produceren (figuur 4A, B). In de secundaire transplantatieanalyse vertoonden alleen de Hoxb5pos pHSC-ontvangers een robuuste hematopoiese (figuur 5A,B). Daarentegen werden donorcellen nauwelijks waargenomen in de Hoxb5 neg pHSC-ontvangende muizen, wat suggereert dat Hoxb5neg pHSC's hun zelfvernieuwingsvermogen verliezen binnen 16 weken na transplantatie bij primaire ontvangende muizen. Deze gegevens tonen aan dat Hoxb5-expressie kan worden gebruikt als een specifieke marker voor LT-HSC's.
Figuur 1: Experimenteel schema voor langdurige hematopoëtische reconstitutietests. De ontvangende muizen werden dodelijk bestraald en competitief getransplanteerd met 10 HSC's en 2 x 105 hele beenmergcellen (ondersteunende cellen). Voor secundaire transplantaties werden 1 x 107 hele beenmergcellen overgebracht van de primaire ontvangende muizen. Afkortingen: PB = perifeer bloed; WBM = heel beenmerg. Dit cijfer is aangepast van Chen et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gating-strategie voor het sorteren van Hoxb5pos en Hoxb5neg pHSCs. Representatieve flowcytometrie gating om LKS, Flk2−, pHSC, Hoxb5pos en Hoxb5neg pHSCs te isoleren na uitsluiting van doubletten en dode cellen. De waarden geven het percentage van elke breuk ± s.d. (n = 3) aan. De afstammingslijnen omvatten B220, CD3ε, CD4, CD8a, Gr-1 en Ter-119. Dit cijfer is aangepast van Chen et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve FACS-plots van perifeer bloed in een ontvangende muis. Gating schema om perifere bloedcellen (NK-cel, granulocyt, monocyt, T-cel en B-cel) in een ontvangende muis te identificeren na de uitsluiting van doubletten en dode cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Chimerisme bij ontvangende muizen na primaire transplantatie. (A) Percentage chimerisme na 4 weken, 8 weken, 12 weken en 16 weken bij primaire ontvangers die 10 Hoxb5neg (n = 9), Hoxb5lo (n = 13) of Hoxb5hi (n = 18) pHSCs kregen. Elke kolom vertegenwoordigt een individuele muis. De Hoxb5hi-fractie werd gedefinieerd als de top 5% van de Hoxb5-expressie en andere als de Hoxb5-lofractie. (B) De gemiddelde donorafstammingsbijdrage in 10 primaire celtransplantaties. De foutbalken geven de s.d. aan. Dit cijfer is aangepast van Chen et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Chimerisme bij de ontvangende muizen na de secundaire transplantatie. (A) Percentage chimerisme na 4 weken, 8 weken, 12 weken en 16 weken na de gehele secundaire transplantatie van het beenmerg. (B) Individueel donorchimerisme naar afstamming bij secundaire ontvangers van het hele beenmerg. Elke lijn vertegenwoordigt een individuele muis. Dit cijfer is aangepast van Chen et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antistof | Kloon | Concentratie | Fluorochromen |
| Flk-2 | A2-F10 | 4 μg/ml | PerCP/eFlour710 |
| CD150 | TC15-12F12,2 | 4 μg/ml | Bv421 |
| CD11b | M1/70 | 4 μg/ml | Bv711 |
| SCA-1 | D7 | 4 μg/ml | BUV395 |
| CD16/32 | 93 | 4 μg/ml | A-700 |
| CD127 | A7R34 | 4 μg/ml | A-700 |
| CD3ε | 145-2C11 | 10 μg/ml | Biotine |
| CD4 | GK1,5 | 10 μg/ml | Biotine |
| CD8a | 53-6.7 | 10 μg/ml | Biotine |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 10 μg/ml | Biotine |
| B220 | RA3-6B2 | 10 μg/ml | Biotine |
| Ter119 | TER119 | 10 μg/ml | Biotine |
Tabel 1: Antilichaam master mix voor hematopoëtische stamcelkleuring.
| Antistof | Kloon | Concentratie | Fluorochromen |
| CD45,1 | A20 | 1 μg/ml | Fitc |
| CD45,2 | 104 | 1 μg/ml | PE |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 2,5 μg/ml | A700 |
| NK1,1 | PK136 | 1 μg/ml | PerCP-Cyaan5,5 |
| CD11b | M1/70 | 1 μg/ml | BUV395 |
| CD3ε | 145-2C11 | 1 μg/ml | Bv421 |
| TCRβ | H57-597 | 1 μg/ml | Bv421 |
| B220 | RA3-6B2 | 1 μg/ml | Bv786 |
Tabel 2: Antilichaam master mix voor perifere bloedcel kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traditioneel zijn celoppervlakmarker-gedefinieerde HSC's voorbereid om de functies van HSC's te bestuderen, zoals zelfvernieuwingscapaciteit en multi-potentie 19,20,21. De immunofenotypisch gedefinieerde (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC-fractie bevat echter twee discrete HSC-populaties: LT-HSCs en ST-HSCs 9,10. Daarom is de specifieke analyse van bonafide HSC's, LT-HSC's, nog niet bereikt. Dienovereenkomstig zal een isolatiemethode voor LT-HSC's met behulp van het Hoxb5-reportersysteem de zoektocht naar de moleculaire mechanismen van zelfvernieuwingscapaciteit aanzienlijk ten goede komen.
Hier zullen we kritieke stappen in dit protocol bespreken. Eerst moet stap 1 tot stap 7 zonder onderbreking worden voltooid. Deze stappen duren meestal 9-12 uur en het is belangrijk om de monsters tijdens deze procedures zoveel mogelijk op 4 °C te houden om de levensvatbaarheid van het monster te behouden. Vervolgens worden ongeveer 1 x 108 beenmergcellen geoogst uit een muis. We moeten dus voldoende antilichamen gebruiken om de kleuringsprestaties te reproduceren. Daarnaast is het antilichaam voor het CD34-antigeen (kloon; RAM34) vereist 90 minuten voor voldoende kleuring, terwijl 30 minuten voldoende is voor andere antilichamen. Ten tweede veroorzaakt bestraling meestal pancytopenie bij de ontvangende muizen. Als van de ontvanger afgeleide neutrofielen in veel ontvangende muizen blijven bestaan, geeft dit aan dat de stralingsdosis onvoldoende was. In een dergelijk geval wordt optimalisatie van de stralingsdosis aanbevolen. Ten derde, als de meeste muizen kort na de transplantatie sterven, zijn er twee mogelijke verklaringen: een onvoldoende aantal ondersteunende cellen of een mislukte retro-orbitale injectie.
Al tientallen jaren is het controversieel of de bonafide HSC-fractie homogeen of heterogeen is22,23,24. In deze studie vertoonden de ontvangende muizen die de Hoxb5pos pHSC-transplantatie ontvingen verschillende donorchimaera's en differentiatiepatronen (figuur 4A), wat aangeeft dat deze fractie heterogeen kan zijn. Deze fluctuaties kunnen echter worden veroorzaakt door zowel het gebruik van ongezuiverde beenmergcellen als ondersteunende cellen als de verschillende radiogevoeligheden van individuele muizen25.
Samenvattend hebben we een stapsgewijs protocol gedemonstreerd voor de isolatie van LT-HSC's en ST-HSC's met behulp van het Hoxb5-reportersysteem . Tot op heden is de detectie van LT-HSC's afhankelijk van de competitieve transplantatietest, die meer dan 8 maanden duurt. Het Hoxb5-reportersysteem stelt ons daarentegen in staat om zowel LT-HSC's als ST-HSC's prospectief te identificeren en te gebruiken voor verschillende functionele analyses. Figuur 4 en figuur 5 laten ook zien dat het Hoxb5-expressieniveau gecorreleerd lijkt te zijn met de mate van donorchimerisme bij de tweede ontvangende muizen. Bovendien hebben we, gebruikmakend van het Hoxb5-reportersysteem , eerder onthuld dat LT-HSC's en ST-HSC's complementair werken voor continue hematopoëtische reconstitutie na hematopoëtische stamceltransplantatie26. Bovendien toonden we aan dat exogene Hoxb5-expressie het cellot van ST-HSC's gedeeltelijk kon omkeren naar dat van LT-HSC's, wat aangeeft dat de aan- of afwezigheid van Hoxb5 de heterogeniteit van zelfvernieuwingsvermogen in de celoppervlakmarker-gedefinieerde HSC-fractie27 verklaart.
Naast deze bevindingen stelt de prospectieve isolatie van LT-HSC's ons in staat om LT-HSC's te analyseren onder verschillende fysiologische omstandigheden, zoals veroudering, ontsteking, enzovoort. Deze analyses zullen het begrip van de functies van LT-HSC's aanzienlijk vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten in verband met deze studie.
Acknowledgments
We zijn Hiroshi Kiyonari dankbaar voor de dierenverzorging en voor het leveren van ontvangende muizen bij RIKEN BDR, evenals Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka en Masaki Miyahashi voor laboratoriumbeheer aan de Universiteit van Kobe. De auteurs waarderen ook de voortdurende steun voor dit werk enorm. Masanori Miyanishi werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 en JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders en AMED-PRIME, AMED onder Grant Number JP18gm6110020. Taro Sakamaki wordt ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Numbers JP21K20669 en JP22K16334 en werd ondersteund door het JSPS Core-to-Core Program en RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi werd ondersteund door JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
References
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
- Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
- Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
- Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075 (2016).
- Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
- Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
- Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
- Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
- Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
- Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
- Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
- Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).
