Atomkraftmikroskopi Cantilever-baserad nanoindentation: Mekaniska egenskapsmätningar på nanoskala i luft och vätska

Summary

Kvantifiering av kontaktytan och kraften som appliceras av ett atomkraftmikroskop (AFM) sondspets på en provyta möjliggör mekanisk egenskapsbestämning i nanoskala. Bästa praxis för att implementera AFM cantilever-baserad nanoindentation i luft eller vätska på mjuka och hårda prover för att mäta elastisk modul eller andra nanomekaniska egenskaper diskuteras.

Abstract

Ett atomkraftmikroskop (AFM) mäter i grunden interaktionen mellan en nanoskala AFM-sondspets och provytan. Om kraften som anbringas av sondspetsen och dess kontaktyta med provet kan kvantifieras är det möjligt att bestämma de mekaniska egenskaperna i nanoskala (t.ex. elastisk eller Youngs modul) hos ytan som undersöks. En detaljerad procedur för att utföra kvantitativa AFM cantilever-baserade nanoindentationsexperiment tillhandahålls här, med representativa exempel på hur tekniken kan tillämpas för att bestämma den elastiska modulen för en mängd olika provtyper, allt från kPa till GPa. Dessa inkluderar levande mesenkymala stamceller (MSC) och kärnor i fysiologisk buffert, hartsinbäddade dehydrerade loblolly talltvärsnitt och Bakken-skiffer med varierande sammansättning.

Dessutom används AFM cantilever-baserad nanoindentation för att undersöka brottstyrkan (dvs genombrottskraften) av fosfolipid-dubbelskikt. Viktiga praktiska överväganden som metodval och utveckling, val och kalibrering av prober, identifiering av intresseområde, provheterogenitet, egenskapsstorlek och bildförhållande, spetsslitage, ytjämnhet och dataanalys och mätstatistik diskuteras för att underlätta korrekt implementering av tekniken. Slutligen demonstreras samlokalisering av AFM-härledda nanomekaniska kartor med elektronmikroskopitekniker som ger ytterligare information om elementär sammansättning.

Introduction

Att förstå de mekaniska egenskaperna hos material är en av de mest grundläggande och väsentliga uppgifterna inom teknik. För analys av bulkmaterialegenskaper finns det många metoder tillgängliga för att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos materialsystem, inklusive dragprov¹, kompressionstester² och tre- eller fyrpunktsböjningstester (böjningstester)³. Även om dessa tester i mikroskala kan ge ovärderlig information om bulkmaterialegenskaper, utförs de i allmänhet till misslyckande och är därför destruktiva. Dessutom saknar de den rumsliga upplösning som krävs för att noggrant undersöka mikro- och nanoskalans egenskaper hos många materialsystem som är av intresse idag, såsom tunna filmer, biologiska material och nanokompositer. För att börja ta itu med några av problemen med storskalig mekanisk testning, främst dess destruktiva natur, antogs mikrohårdhetstester från mineralogi. Hårdhet är ett mått på ett materials motstånd mot plastisk deformation under specifika förhållanden. I allmänhet använder mikrohårdhetstester en styv sond, vanligtvis tillverkad av härdat stål eller diamant, för att dra in i ett material. Det resulterande fördjupningsdjupet och / eller arean kan sedan användas för att bestämma hårdheten. Flera metoder har utvecklats, inklusive Vickers⁴, Knoop⁵ och Brinell⁶ hårdhet; Var och en ger ett mått på materialhårdhet i mikroskala, men under olika förhållanden och definitioner, och producerar därför endast data som kan jämföras med tester som utförs under samma förhållanden.

Instrumenterad nanoindentation utvecklades för att förbättra de relativa värdena som erhållits via de olika testmetoderna för mikrohårdhet, förbättra den rumsliga upplösningen som är möjlig för analys av mekaniska egenskaper och möjliggöra analys av tunna filmer. Viktigt, genom att använda metoden som först utvecklades av Oliver och Pharr⁷, kan den elastiska eller Youngs modul, E, av ett provmaterial bestämmas via instrumenterad nanoindentation. Genom att använda en Berkovich tresidig pyramidal nanoindentersond (vars ideala spetsområdesfunktion matchar Vickers fyrsidiga pyramidala sond)⁸, kan direkt jämförelse mellan nanoskala och mer traditionella hårdhetsmätningar i mikroskala göras. Med AFM: s ökade popularitet började AFM-cantilever-baserad nanoindentation också få uppmärksamhet, särskilt för att mäta de mekaniska egenskaperna hos mjukare material. Som ett resultat, som visas schematiskt i figur 1, är de två vanligaste teknikerna idag för att undersöka och kvantifiera mekaniska egenskaper i nanoskala instrumenterad nanoindentation (figur 1A) och AFM cantilever-baserad nanoindentation (figur 1B)⁹, varav den senare är fokus för detta arbete.

Figur 1: Jämförelse av instrumenterade och AFM-fribärande baserade nanoindentationssystem. Schematiska diagram som visar typiska system för att genomföra (A) instrumenterad nanoindentation och (B) AFM cantilever-baserad nanoindentation. Denna siffra modifierades från Qian et ^al.51. Förkortning: AFM = atomkraftmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Både instrumenterad och AFM cantilever-baserad nanoindentation använder en styv sond för att deformera en provyta av intresse och övervaka den resulterande kraften och förskjutningen som en funktion av tiden. Vanligtvis specificeras antingen den önskade belastningen (dvs. kraft) eller (Z-piezo) förskjutningsprofilen av användaren via programvarugränssnittet och styrs direkt av instrumentet, medan den andra parametern mäts. Den mekaniska egenskapen som oftast erhålls från nanoindentationsexperiment är den elastiska modulen (E), även kallad Youngs modul, som har tryckenheter. Den elastiska modulen för ett material är en grundläggande egenskap relaterad till bindningsstyvheten och definieras som förhållandet mellan drag- eller tryckspänning (σ, den applicerade kraften per ytenhet) och axiell töjning (ε, den proportionella deformationen längs indragningsaxeln) under elastisk (dvs. reversibel eller tillfällig) deformation före början av plastisk deformation (ekvation [1]):

(1)

Det bör noteras att eftersom många material (särskilt biologiska vävnader) faktiskt är viskoelastiska, består den (dynamiska eller komplexa) modulen i själva verket av både elastiska (lagring, i fas) och viskösa (förlust, ur fas) komponenter. I praktiken är det som mäts i ett nanoindentationsexperiment den reducerade modulen, E *, som är relaterad till den sanna provmodulen av intresse, E, som visas i ekvation (2):

(2)

Där E-spetsen och_ν-spetsen är den elastiska modulen respektive Poissons förhållande för nanoindenterspetsen, och ν är det uppskattade Poissons förhållande för provet. Poissons förhållande är det negativa förhållandet mellan den tvärgående och axiella töjningen och indikerar därmed graden av tvärgående töjning av ett prov när det utsätts för axiell töjning (t.ex. under nanoindentationsbelastning), som visas i ekvation (3):

(3)

Omvandlingen från reducerad till faktisk modul är nödvändig eftersom a) en del av den axiella töjning som ges av indenterspetsen kan omvandlas till tvärgående töjning (dvs. provet kan deformeras via expansion eller sammandragning vinkelrätt mot belastningsriktningen), och b) indenterspetsen är inte oändligt hård, och därmed resulterar handlingen att dra in provet i någon (liten) mängd deformation av spetsen. Observera att i de fall där E-spetsen >> E (dvs. indenterspetsen är mycket hårdare än provet, vilket ofta är sant när man använder en diamantsond), förenklar förhållandet mellan den reducerade och faktiska provmodulen kraftigt till E ≈ E * (1 - v²). Medan instrumenterad nanoindentation är överlägsen när det gäller exakt kraftkarakterisering och dynamiskt omfång, är AFM-cantileverbaserad nanoindentation snabbare, ger storleksordningar större kraft och förskjutningskänslighet, möjliggör avbildning med högre upplösning och förbättrad indragningslokalisering och kan samtidigt undersöka magnetiska och elektriska egenskaper i nanoskala⁹. I synnerhet är AFM-fribärande baserad nanoindentation överlägsen för kvantifiering av mekaniska egenskaper på nanoskala av mjuka material (t.ex. polymerer, geler, lipid-dubbellager och celler eller andra biologiska material), extremt tunna (sub-μm) filmer (där substrateffekter kan spela in beroende på intrycksdjup)10,11 och suspenderade tvådimensionella (2D) material 12,13,14 såsom grafen^15,16, glimmer¹⁷, hexagonal bornitrid (h-BN)18 eller övergångsmetalldikalkogenider (TMDC; t.ex. MoS₂)¹⁹. Detta beror på dess utsökta kraft (sub-nN) och förskjutningskänslighet (sub-nm), vilket är viktigt för att exakt bestämma den ursprungliga kontaktpunkten och förbli inom det elastiska deformationsområdet.

Vid AFM-fribärande nanoindentation påverkas förskjutningen av en AFM-sond mot provytan av ett kalibrerat piezoelektriskt element (figur 1B), med den flexibla utskjutaren så småningom böjd på grund av den resistiva kraften som upplevs vid kontakt med provytan. Denna böjning eller avböjning av utskjutaren övervakas vanligtvis genom att reflektera en laser från baksidan av utskjutaren och in i en fotodetektor (positionskänslig detektor [PSD]). Tillsammans med kunskapen om utskjutande styvhet (i nN/nm) och avböjningskänslighet (i nm/V) är det möjligt att omvandla denna uppmätta fribärande avböjning (i V) till den kraft (i nN) som appliceras på provet. Efter kontakt ger skillnaden mellan Z-piezorörelsen och den utskjutande avböjningen provets intrycksdjup. I kombination med kunskapen om spetsområdets funktion möjliggör detta beräkning av kontaktytan för spetsprovet. Lutningen på kontaktdelarna av de resulterande kraftavstånds- eller kraftförskjutningskurvorna (F-D) kan sedan anpassas med hjälp av en lämplig kontaktmekanikmodell (se avsnittet Dataanalys i diskussionen) för att bestämma provets nanomekaniska egenskaper. Medan AFM cantilever-baserad nanoindentation har några distinkta fördelar jämfört med instrumenterad nanoindentation som beskrivits ovan, presenterar den också flera praktiska implementeringsutmaningar, såsom kalibrering, spetsslitage och dataanalys, som kommer att diskuteras här. En annan potentiell nackdel med AFM cantilever-baserad nanoindentation är antagandet om linjär elasticitet, eftersom kontaktradien och indragningsdjupet måste vara mycket mindre än indenterradien, vilket kan vara svårt att uppnå när man arbetar med AFM-sonder i nanoskala och / eller prover som uppvisar betydande ytjämnhet.

Traditionellt har nanoindentation begränsats till enskilda platser eller små rutnätindragningsexperiment, där en önskad plats (dvs. intresseområde [ROI]) väljs och ett enda kontrollerat indrag, flera indrag på en enda plats åtskilda av viss väntetid och / eller ett grovt rutnät av indrag utförs med en hastighet i storleksordningen Hz. De senaste framstegen inom AFM möjliggör emellertid samtidig förvärv av mekaniska egenskaper och topografi genom användning av höghastighetskraftkurvbaserade bildlägen (refererade till av olika handelsnamn beroende på systemtillverkaren), där kraftkurvor utförs med en kHz-hastighet under belastningskontroll, med den maximala spetsprovkraften som används som bildbörvärde. Point-and-shoot-metoder har också utvecklats, vilket möjliggör förvärv av en AFM-topografibild följt av efterföljande selektiv nanoindentation vid intressanta platser i bilden, vilket ger nanoskala rumslig kontroll över nanoindentationsplatsen. Även om det inte är det primära fokuset för detta arbete, presenteras specifika utvalda applikationsexempel på både kraftkurvbaserad avbildning och point-and-shoot cantilever-baserad nanoindentation i de representativa resultaten och kan användas tillsammans med protokollet som beskrivs nedan om det finns tillgängligt på den specifika AFM-plattformen som används. Specifikt beskriver detta arbete ett generaliserat protokoll för den praktiska implementeringen av AFM cantilever-baserad nanoindentation på alla kapabla AFM-system och ger fyra användningsfallsexempel (två i luft, två i vätska) av tekniken, inklusive representativa resultat och en djupgående diskussion om nyanser, utmaningar och viktiga överväganden för att framgångsrikt använda tekniken.

Protocol

OBS: På grund av det stora utbudet av kommersiellt tillgängliga AFM och mångfalden av provtyper och applikationer som finns för cantilever-baserad nanoindentation, är protokollet som följer avsiktligt utformat för att vara relativt allmänt till sin natur, med fokus på de gemensamma steg som är nödvändiga för alla cantilever-baserade nanoindentationsexperiment oavsett instrument eller tillverkare. På grund av detta antar författarna att läsaren har åtminstone grundläggande förtrogenhet med att använda det specifika instrumentet som valts för att utföra cantilever-baserad nanoindentation. Förutom det allmänna protokollet som beskrivs nedan ingår emellertid en detaljerad steg-för-steg-standardprocedur (SOP) som är specifik för AFM och programvara som används här (se materialförteckning), fokuserad på cantilever-baserad nanoindentation av prover i vätska, som ett kompletterande material.

1. Provberedning och instrumentinställning

1. Bered provet på ett sätt som minimerar både ytjämnhet (helst nanometerskala, ~ 10x mindre än det avsedda fördjupningsdjupet) och kontaminering utan att ändra de mekaniska egenskaperna hos området / områdena av intresse.
2. Välj en lämplig AFM-sond för nanoindentering av det avsedda provet baserat på mediet (dvs. luft eller vätska), förväntad modul, provtopografi och relevanta funktionsstorlekar (se övervägandena för sondval i diskussionen). Fyll på sonden på sondhållaren (se Materialförteckning) och fäst probhållaren på AFM-skannerhuvudet.
3. Välj ett lämpligt nanoindenteringsläge i AFM-programvaran som ger användaren kontroll över enskilda ramper (dvs. kraftförskjutningskurvor).
   OBS: Det specifika läget kommer att skilja sig åt mellan olika AFM-tillverkare och enskilda instrument (se SOP som tillhandahålls i tilläggsmaterialet för mer information och ett specifikt exempel).
4. Rikta in lasern på baksidan av sondutskjutaren, mittemot sondspetsens placering och in i PSD.
   OBS: Se exemplet på mesenkymal stamcellsapplikation för mer information om viktiga överväganden vid inriktning av lasern och genomförande av nanoindentation i vätska, i synnerhet för att undvika flytande skräp och / eller luftbubblor, som kan sprida eller bryta strålen. AFM-optiken kan också behöva justeras för att kompensera för vätskans brytningsindex och för att undvika att sonden kraschar när den griper in i ytan.
   1. Centrera laserstrålens fläck på baksidan av utskjutaren genom att maximera totalspänningen (figur 2A).
   2. Centrera den reflekterade laserstrålepunkten på PSD genom att justera X och Y (dvs. horisontella och vertikala) avböjningssignaler så att de är så nära noll som möjligt (figur 2A), vilket ger det maximala detekterbara avböjningsområdet för att producera en utgångsspänning som är proportionell mot utskjutande avböjning.
5. Om du är osäker på provets topografi, ytjämnhet och/eller ytdensitet (när det gäller flingor eller partiklar), utför en AFM-topografiundersökning före några nanoindentationsexperiment för att bekräfta provets lämplighet, enligt beskrivningen i steg 1.1 och provberedningsdelen av diskussionen.

Figur 2: Positionskänslig detektormonitor. (A) PSD-display som indikerar en korrekt inriktad laser som reflekteras från sondutskjutarens baksida och på mitten av PSD (vilket framgår av den stora totalspänningen och avsaknaden av vertikal eller horisontell avböjning) innan den aktiveras på provytan (dvs. sonden utan kontakt med provet). (B) Den vertikala avböjningsspänningen ökar när utskjutaren böjs (t.ex. när sonden kommer i kontakt med provet). Förkortningar: PSD = positionskänslig detektor; VERT = vertikal; HORIZ = horisontell; AMPL = amplitud; Ej tillämpligt = ej tillämpligt. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Kalibrering av sond

Anmärkning: Tre värden är nödvändiga för att kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos ett prov med hjälp av F-D-kurvdata som samlats in under fribärande baserad nanoindentation: utskjutningskänsligheten (DS) för utskjutande / PSD-systemet (nm / V eller V / nm), den utskjutande fjäderkonstanten (nN / nm) och sondens kontaktyta, ofta uttryckt som den effektiva sondspetsradien (nm) vid ett givet intrycksdjup mindre än sondradien i fallet med en sfärisk sond dricks.

1. Kalibrera sondens/AFM-systemets DS genom rampning på ett extremt hårt material (t.ex. safir, E = 345 GPa) så att deformationen av provet minimeras och därmed den uppmätta Z-rörelsen hos piezoet efter initiering av kontakten mellan spets och prov omvandlas enbart till fribärande avböjning.
   DS-kalibreringen måste utföras under samma förhållanden som de planerade nanoindentationsexperimenten (dvs. temperatur, medium etc.) för att korrekt återspegla systemets DS under experimenten. En lång (30 min) laseruppvärmningsperiod kan vara nödvändig för maximal noggrannhet för att ge tid för termisk jämvikt att uppnås och stabil laseruteffekt och pekstabilitet upprättas. DS måste mätas om varje gång lasern justeras, även om samma sond används, eftersom DS beror på laserintensiteten och positionen på utskjutaren, liksom kvaliteten på reflektionen från sonden (dvs. nedbrytning av sondens bakre beläggning kommer att påverka DS) och känsligheten hos PSD²⁰.
   1. Ställ in och utför DS-kalibreringsindragen på safiren för att uppnå ungefär samma sondböjning (i V eller nm) som de planerade provindragen , eftersom den uppmätta förskjutningen är en funktion av spetsens böjningsvinkel och blir olinjär för stora avböjningar.
   2. Bestäm DS (i nm/V), eller alternativt den omvända optiska hävarmens känslighet (i V/nm), från lutningen på den linjära delen av kontaktregimen efter den initiala kontaktpunkten i den resulterande F-D-kurvan, såsom visas i figur 3A.
   3. Upprepa rampen minst 5x och registrera varje DS-värde. Använd medelvärdet av värdena för maximal noggrannhet. Om den relativa standardavvikelsen (RSD) för mätningarna överstiger ~ 1%, mät DS igen, eftersom ibland de första F-D-kurvorna inte är idealiska på grund av den initiala införandet av adhesiva krafter.
   4. Om sondgrenens fjäderkonstant, k, inte är fabrikskalibrerad (t.ex. via laserdopplervibrametri [LDV]), kalibrera fjäderkonstanten.
      OBS: Den termiska inställningsmetoden är optimal för relativt mjuka konsoler med k < 10 N / m (se fjäderkonstantavsnittet i diskussionen för en lista och beskrivning av alternativa metoder, särskilt för styva konsoler med k > 10 N / m). Som visas i figur 3B, C är termisk inställning vanligtvis integrerad i AFM-kontrollprogramvaran.
2. Om sonden inte levereras med en fabrikskalibrerad spetsradiemätning (t.ex. via svepelektronmikroskop [SEM] -avbildning), mät den effektiva spetsradien, R.
   OBS: Det finns två vanliga metoder för att mäta spetsradien (se motsvarande diskussionsavsnitt), men den vanligaste för sondspetsar i nanometerskala är BTR-metoden (blind tip reconstruction ), som använder en grovhetsstandard (se materialtabell) som innehåller många extremt skarpa (sub-nm) funktioner som tjänar till att effektivt avbilda spetsen, snarare än spetsen som avbildar provet.
   1. Om du använder BTR-metoden kan du avbilda grovhetsprovet (tipskarakterisering) med en långsam skanningshastighet (<0,5 Hz) och höga återkopplingsvinster för att optimera spårningen av de mycket skarpa funktionerna. Välj en bildstorlek och pixeldensitet (upplösning) baserat på den förväntade spetsradien (t.ex. en bild på 1024 x 1024 pixlar av ett område på 3 μm x 3 μm har ~ 3 nm sidoupplösning).
   2. Använd programvara för AFM-bildanalys (se materialtabell) för att modellera sondspetsen och uppskatta dess ändradie och effektiva spetsdiameter vid det förväntade provfördjupningsdjupet, som visas i figur 3D-F.
3. När kalibreringen av proben är klar anger du DS-, k- och R-värdena i instrumentprogramvaran, som visas i figur 4A.
   1. Ange en uppskattning av provets Poissons förhållande, ν, för att möjliggöra omvandling av den uppmätta reducerade modulen till den faktiska provmodulen⁹. Om man använder en konisk eller konissfärisk kontaktmekanisk modell baserad på spetsformen och fördjupningsdjupet, är det också nödvändigt att ange spetsens halvvinkel (figur 4C).
      OBS: Modulen är relativt okänslig för små fel eller osäkerheter i den uppskattade Poissons kvot. En uppskattning av ν = 0,2-0,3 är en bra utgångspunkt för många material²¹.

Figur 3: Kalibrering av sond. a) Bestämning av avböjningskänslighet. Resultat av en representativ mätning av avböjningskänslighet utförd på ett safirsubstrat (E = 345 GPa) för en standardsond för tappningsläge (nominell k = 42 N/m, se materialtabell) med reflekterande aluminiumbeläggning på baksidan. Här visas den uppmätta inflygningen (blå spårning) och kurvorna för tillbakadragande eller tillbakadragande (röd spårning). Den uppmätta böjningskänsligheten på 59,16 nm/V bestämdes genom anpassning av inflygningskurvan mellan fäst-till-kontakt- och vändpunkterna, vilket indikeras av området mellan de vertikala prickade röda linjerna. Det område med negativ nedböjning som framgår av indragnings-/uttagskurvan innan ytan dras av tyder på adhesion mellan spetsoch provet. (B,C) Termisk inställning. Representativa fribärande termiska brusspektra (blå spår) med motsvarande passformer (röda spår) för två olika sonder. (B) Termiska inställnings- och passningsparametrar för en standardkraftkurvbaserad AFM-bildsond (se materialtabell) med dess nominella fjäderkonstant k = 0,4 N / m som används som en första gissning. Anpassningen av det utskjutande termiska brusspektrumet ger en grundläggande resonansfrekvens på f 0 = 79,8 kHz, vilket är i ganska god överensstämmelse med det nominella värdet f₀ = 70 kHz. Den uppmätta Q-faktorn är 58,1. Godheten i passformen (R² = 0,99) baseras på överensstämmelse mellan passformen och data mellan de två vertikala streckade röda linjerna. Observera att det är viktigt att känna till och ange både omgivningstemperatur och avböjningskänslighet för exakta resultat. (C) Cantilever termiskt brusspektrum och motsvarande passform (dvs. termisk melodi) med resulterande beräknad fjäderkonstant k = 0,105 N / m för en extremt mjuk utskjutare som används för att utföra nanomekaniska mätningar på levande celler och isolerade kärnor. Observera den betydligt lägre naturliga resonansfrekvensen på ~ 2-3 kHz. (D-F) Rekonstruktion av blindspets. Representativt arbetsflöde för rekonstruktion av blindspetsar för en sond med diamantspets (nominell R = 40 nm, se materialförteckning). d) En bild på 5 μm x 5 μm av ett spetskarakteriseringsprov bestående av en serie extremt skarpa (sub-nm) titanspikar som tjänar till att avbilda AFM-sondspetsen. (E) Resulterande rekonstruerad modell (bild med inverterad höjd) av sondspetsen. F) Resultat för återkoppling av blindspetsen, inklusive en uppskattad ändradie på R = 29 nm och en effektiv spetsdiameter på 40 nm vid en höjd av användaren vald höjd på 8 nm (dvs. intrycksdjup << R) från spetsspetsens spets, beräknad genom att omvandla kontaktytan för spetsen på den höjden till en effektiv diameter som antar en cirkulär profil (dvs. A = πr 2 = π(d/2)²) för användning med sfäriska kontaktmekaniska modeller. Förkortningar: AFM = atomkraftmikroskopi; ETD = effektiv spetsdiameter. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 4: Indata för programvarugränssnitt. (A) Sondens kalibreringskonstanter. Programvarans användargränssnitt (se Materialförteckning) för att ange uppmätt böjningskänslighet, fjäderkonstant och spetsradie för att möjliggöra kvantitativa nanomekaniska mätningar. Poissons förhållande mellan både sonden och provet är nödvändigt för att beräkna den elastiska eller Youngs modul av provet från de utskjutande baserade nanoindentationskraftkurvorna. (B) Rampens kontrollfönster. Programvarans användargränssnitt (se materialförteckning) för att ställa in utskjutande baserade nanoindentationsexperiment, organiserade i parametrarna som beskriver själva rampen (dvs. indragningsprofil), instrumentutlösning (t.ex. kraft kontra förskjutningskontroll), efterföljande kraftanalys och rörelsegränser (för att förbättra mätkänsligheten genom att begränsa det område över vilket A / D-omvandlaren måste fungera för att styra Z-piezo och läsa PSD-avböjningen). (C) Spetsens halvvinkel (baserat på sondgeometrin eller direkt mätning) är viktig om en konisk, pyramidal eller konisfärisk kontaktmekanikmodell (t.ex. Sneddon) används. Klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Samla in data om kraftförskjutning (FD)

Anmärkning: De parametervärden som presenteras här (se figur 4B) kan variera beroende på kraften och intrycksområdet för ett givet prov.

1. Navigera i exemplet under AFM-huvudet och engagera dig i önskad intresseregion.
   1. Övervaka den vertikala avböjningssignalen (figur 2B) eller utför en liten (~50–200 nm) inledande ramp (figur 4B) för att kontrollera att spetsen och provet är i kontakt (se figur 5A).
   2. Justera AFM-huvudpositionen något uppåt (i steg som motsvarar ~ 50% av hela rampstorleken) och ramp igen. Upprepa tills spetsen och provet är precis ur kontakt, vilket framgår av en nästan plan ramp (figur 5B) och minimal vertikal böjning av utskjutaren (figur 2A).
   3. När det inte finns någon uppenbar interaktion mellan spets och prov (jämför figur 2A och figur 2B), sänk AFM-huvudet med en mängd som motsvarar ~ 50% -100% av rampstorleken för att säkerställa att sondspetsen inte kraschar in i provet medan du manuellt flyttar AFM-huvudet. Ramp igen, upprepa tills antingen en bra kurva (figur 5D) eller en kurva liknande figur 5C observeras. I det senare fallet utför du ytterligare en liten AFM-huvudsänkningsjustering som motsvarar ~ 20% -50% av rampstorleken för att uppnå god kontakt och en kraftkurva som liknar den som visas i figur 5D.
2. Justera rampparametrar (enligt beskrivningen nedan och visas i Figur 4B) för att optimera för instrumentet, sonden och provet och erhålla ramper liknande dem som visas i Figur 5D.
   1. Välj en lämplig rampstorlek (dvs. total Z-piezorörelse genom en rampcykel) beroende på provet (t.ex. tjocklek, förväntad modul, ytjämnhet) och önskat indragningsdjup.
      OBS: För styvare prover kommer sannolikt mindre provdeformation (och därmed mer sondböjning för en given Z-piezorörelse) att inträffa, så rampstorleken kan i allmänhet vara mindre än för mjukare prover. Typiska rampstorlekar för styva prover och utskjutande kan vara tiotals nm, medan för mjuka prover och utskjutande ramper kan vara hundratals nm till några μm stora; Specifika utvalda applikationsexempel presenteras i avsnittet Representativa resultat. Observera att minsta och högsta möjliga rampstorlekar är instrumentberoende.
   2. Välj en lämplig ramphastighet (1 Hz är en bra utgångspunkt för de flesta prover).
      OBS: Ramphastigheten kan begränsas av elektroniska styr- och/eller detekteringshastigheter/bandbredder. I kombination med rampstorleken bestämmer ramphastigheten spetshastigheten. Spetshastigheten är särskilt viktig att tänka på vid indragning av mjuka material där viskoelastiska effekter kan orsaka hysteresartefakter ^9,22.
   3. Välj om du vill använda en utlöst (lastkontrollerad) eller outlöst (förskjutningskontrollerad) ramp.
      OBS: I en utlöst ramp kommer systemet att närma sig provet i användardefinierade steg (baserat på rampens storlek och upplösning eller antal datapunkter) tills den önskade tröskeln (dvs. börvärdeskraft eller utskjutande avböjning) detekteras, vid vilken tidpunkt systemet kommer att dra sig tillbaka till sitt ursprungliga läge och visa F-D-kurvan. I en outlöst ramp förlänger systemet helt enkelt Z-piezoen det avstånd som anges av den användardefinierade rampstorleken och visar den uppmätta F-D-kurvan. Utlösta ramper föredras för de flesta användningsfall, men outlösta ramper kan vara användbara när man undersöker mjuka material som inte uppvisar en skarp, lätt identifierbar kontaktpunkt.
      1. Om en utlöst ramp väljs, ställ in tröskeln (användardefinierad maximal tillåten kraft eller avböjning av rampen) för att resultera i önskad indragning i provet.
         OBS: Användning av en tröskel innebär att en ramp kan avslutas (dvs. sonden kan börja dras tillbaka) innan den når hela rampstorleken (Z-piezoförlängning) som anges. Värdena kan variera från några nN till några μN, beroende på spetsprovsystemet.
      2. Ställ in ramppositionen för att bestämma den del av Z-piezos maximala räckvidd som ska användas för att utföra rampen. Se till att rampstorlekens totala räckvidd inte börjar eller slutar utanför det maximala Z-piezoområdet (se representativa exempel i figur 6), annars kommer en del av F-D-kurvan inte att representera någon fysisk mätning (dvs. Z-piezoet kommer att förlängas helt eller dras in, inte röra sig).
   4. Ställ in antalet prover/ramp (t.ex. 512 prover/ramp ) för att uppnå önskad upplösning av mätningen (dvs. punkttätheten för F-D-kurvan).
      OBS: De maximala proverna/rampen kan begränsas av programvaru- (filstorlek) eller hårdvarubegränsningar (t.ex. analog till digital [A/D] omvandlingshastighet, beroende på ramphastigheten). Det är också möjligt att begränsa det tillåtna Z-piezo- eller avböjningsområdet (se gränsvärdena i figur 4B) för att öka den effektiva upplösningen för systemets A/D-omvandlare.
   5. Ställ in X-roteringen för att minska skjuvkrafterna på provet och spetsen genom att samtidigt flytta sonden något i X-riktningen (parallellt med utskjutaren) medan den dras in i Z-riktningen (vinkelrätt mot utskjutande). Använd ett värde för X-roteringen som är lika med probhållarens förskjutningsvinkel i förhållande till ytnormalen (12° är normalt).
      OBS: X-roteringen är nödvändig eftersom utskjutaren är monterad i sondhållaren i en liten vinkel relativt ytan för att tillåta den infallande laserstrålen att reflektera in i PSD. Dessutom kan probspetsens främre och bakre vinklar skilja sig från varandra (dvs. sondspetsen kan vara asymmetrisk). Mer specifik information kan erhållas från enskilda sond- och AFM-tillverkare.

Figur 5: Optimering av separation mellan spets och prov efter ingrepp för att få bra kraftkurvor. Sekventiella exempel på representativa kraftförskjutningskurvor erhållna vid indragning i vätska (fosfatbuffrad saltlösning) på en levande mesenkymal stamcellskärna med en kalibrerad mjuk kiselnitridutskjutare (nominell k = 0,04 N/m) som avslutas i en halvsfärisk spets med 5 μm radie (se materialtabell). Kurvor erhölls i processen att engagera cellytan och optimera indragningsparametrarna, med sondmetod som visas i blått och dra tillbaka / dra tillbaka i rött. (A) Spetsen är redan inkopplad och i kontakt med provexemplaret innan rampen påbörjas, vilket leder till stor utskjutande avböjning och krafter, utan platt baslinje före kontakt. (B) Efter att spetsen manuellt flyttats tillräckligt långt bort från provexemplaret resulterar en icke utlöst ramp på 2 μm i en F-D-kurva som är nästan plan (dvs. praktiskt taget ingen kraftförändring). Under omgivande förhållanden skulle kurvan vara plattare, men i vätska kan mediets viskositet orsaka små avböjningar av sondens utskjutande under en ramp som ses här, även utan ytkontakt. (C) Efter att ha närmat sig något närmare ytan innan rampen påbörjas visar inflygnings- och infällningskurvorna en liten kraftökning (ökad lutning) nära rampens vändpunkt (dvs. övergång från inflygning till tillbakadragande). Det avslöjande tecknet att leta efter är att kurvorna (blå) och dra tillbaka (röda) börjar överlappa varandra (regionen indikeras av den svarta cirkeln), vilket indikerar en fysisk interaktion med ytan. (D) En idealisk F-D-kurva som erhålls efter optimering av rampparametrarna och närmar sig något (~ 1 μm) närmare cellytan än i C så att sonden tillbringar ungefär halva rampen i kontakt med cellen, vilket möjliggör tillräcklig deformation för att passa kontaktdelen av inflygningskurvan och bestämma den elastiska modulen. Den relativt långa, plana baslinjen med låg ljudnivå gör det lättare för anpassningsalgoritmen att bestämma kontaktpunkten. Förkortning: F-D = kraftförskjutning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Rampens storlek och placering. Z-piezo-monitor som visar rampens utsträckning (blå stapel) i förhållande till det totala tillgängliga Z-piezo-rörelseområdet (grön stapel). (A) Z-piezopositionen är nära mitten av sitt rörelseområde, vilket indikeras både av att den blå stapeln är placerad ungefär i mitten av den gröna stapeln och den aktuella Z-piezospänningen (-78,0 V) är ungefär mellan dess helt indragna (-212,2 V) och utökade (+102,2 V) värden. (B) Z-piezo förlängs i förhållande till A, utan någon förspänningsspänning. (C) Z-piezo dras tillbaka i förhållande till A och B. (D) Z-piezopositionen är densamma som i C vid -156,0 V, men rampstorleken har ökats i förhållande till A-C för att dra nytta av mer av Z-piezos hela rörelseomfång. € Rampstorleken är för stor för den aktuella ramppositionen, vilket resulterar i att Z-piezo förlängs till slutet av sitt sortiment. Detta kommer att leda till att F-D-kurvan planar ut eftersom systemet inte kan förlänga Z-piezoen ytterligare. Förkortning: F-D = kraftförskjutning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

4. F-D-kurvanalys

1. Välj ett lämpligt programvarupaket för dataanalys. Välj och ladda data som ska analyseras.
   OBS: Många AFM-tillverkare och AFM-bildbehandlingsprogram har inbyggt stöd för F-D-kurvanalys. Alternativt kan den ökade flexibiliteten och funktionerna i ett dedikerat F-D-kurvanalyspaket, såsom AtomicJ-programvarupaketet med öppen källkod, vara fördelaktigt²³, särskilt för batchbearbetning och statistisk analys av stora dataset eller implementering av komplexa kontaktmekanikmodeller.
2. Ingångskalibrerade värden för fjäderkonstanten, DS och sondspetsradie, tillsammans med uppskattningar av Youngs modul och Poissons förhållande för sondspetsen (baserat på dess materialsammansättning) och Poissons förhållande för provet.
   OBS: Om du använder en diamantspetsindenter kan värdena E-spets = 1140 GPa och _ν-spets = 0,07 användas ^21,24,25,26. För en vanlig kiselsond kan E-spets = 170 GPa och _ν-spets = 0,27 vanligtvis användas, även om Youngs kiselmodul varierar beroende på den kristallografiska orienteringen²⁷.
3. Välj en nanoindentationskontaktmekanikmodell som är lämplig för spetsen och provet.
   OBS: För de många vanliga sfäriska spetsmodellerna (t.ex. Hertz, Maugis, DMT, JKR) är det absolut nödvändigt att intrycksdjupet i provet är mindre än spetsradien; I annat fall ger sondspetsens sfäriska geometri vika för en konisk eller pyramidform (figur 4C). För koniska (t.ex. Sneddon²⁸) och pyramidala modeller, spetsens halvvinkel (dvs. vinkeln mellan spetsens sidovägg och en halverande linje vinkelrätt mot spetsänden; Figur 4C) måste vara känd och är vanligtvis tillgänglig från sondtillverkaren. För mer information om kontaktmekanikmodeller, se avsnittet Dataanalys i thedDiscussion.
4. Kör anpassningsalgoritmen. Kontrollera att F-D-kurvorna är korrekt anpassade; Ett lågt restfel som motsvarar ett medelvärde R 2 nära enhet (t.ex. R² > 0,9) indikerar vanligtvis en god passform för den valda modellen^29,30. Stickprovskontrollera enskilda kurvor för att visuellt inspektera kurvan, modellens anpassning och beräknade kontaktpunkter om så önskas (se t.ex. figur 7 och avsnittet Dataanalys i diskussionen).

Representative Results

Kurvor för kraftförskjutning
Figur 7 visar representativa, nästan idealiska F-D-kurvor erhållna från nanoindentationsexperiment utförda i luft på hartsinbäddade loblolly tallprover (figur 7A) och i vätska (fosfatbuffrad saltlösning [PBS]) på mesenkymala stamcellskärnor (MSC) (figur 7B). Användningen av alla kontaktmekaniska modeller bygger på noggrann och tillförlitlig bestämning av den ursprungliga kontaktpunkten för spetsprovet. Således gör den relativt plana, tysta baslinjen före den initiala kontaktpunkten och den jämna lutningen på kontaktdelen av F-D-kurvorna som visas i figur 7 dem idealiska för analys för att extrahera mekaniska egenskaper, vilket framgår av den utmärkta överensstämmelsen mellan inflygningskurvorna (blå spår) och motsvarande passningar (gröna spår) i insatserna.

Omvänt finns det flera vanliga problem som en användare kan stöta på när han utför cantilever-baserad nanoindentation som leder till icke-idealiska F-D-kurvor. Ett av de vanligaste problemen, särskilt omedelbart efter inkoppling, är att sondspetsen redan är i kontakt med provet innan en ramp inleds (figur 5A), vilket förhindrar förvärv av den nödvändiga baslinjen utan kontakt för att bestämma den ursprungliga kontaktpunkten. Detta kan också leda till alltför stora krafter vid outlösta (dvs. kontrollerad förskjutning) ramper. Detta är särskilt oroande när du utför en stor ramp med en styv utskjutare, eftersom de resulterande krafterna kan bryta utskjutaren och / eller skada provet eller spetsen. För att undvika detta, övervaka den vertikala avböjningsspänningen under och efter den första inkopplingen. Om den uppmätta vertikala böjspänningen är positiv (förutsatt korrekt initial inriktning) som visas i figur 2B, avböjs utskjutaren och spetsen är i kontakt med provet. Större positiva spänningar motsvarar större utskjutande avböjningar, men oavsett storleken på avböjningen bör användaren manuellt höja AFM-huvudet (t.ex. genom att använda en stegmotor) bort från provet. Den vertikala avböjningsspänningen bör långsamt minska och kan till och med tillfälligt sjunka under noll vid starka vidhäftningskrafter med spetsprov, men kommer så småningom att nå 0 V (eller nära 0 V) när spetsen inte längre är i kontakt med provet (figur 2A). Från denna punkt kan användaren återuppta optimeringen av rampparametrarna och utföra indrag.

Ett annat vanligt problem (särskilt för outlösta ramper) är att hela F-D-kurvan ser nästan platt ut, utan några uppenbara tecken på spets-provinteraktion, som tidigare visats i figur 5B. Om det finns tillgängligt på instrumentet är lösningen på detta att manuellt sänka SPM-huvudet med ~ 10% mindre än rampstorleken (för att undvika att krascha sondspetsen) och rampa igen, upprepa tills en uppenbar ökning av kraften observeras på grund av spets-provinteraktion (figur 5C, D) innan du fortsätter att optimera andra rampparametrar.

Tips slitage
Figur 8 visar ett exempel på spetsslitage i en experimentell miljö. En enda, styv, kiseltappningsläge AFM-sond (se materialförteckning) användes för att avbilda flera stora områden av ett Bakken-skifferprov (se motsvarande applikationsexempel för mer information) med hjälp av en snabb (kHz-hastighet) kraftkurvbaserad avbildningsmetod, och BTR-metoden användes för att modellera spetsgeometrin och uppskatta spetsändradien före och efter var och en av tre på varandra följande bilder. De undersökta skifferproverna bestod av en matris av lera och organiskt material (E ~ 5 GPa) med mycket hårdare oorganiska mineralinneslutningar spridda över hela (E > 30 GPa). Eftersom provet innehöll betydande variationer i yttopografi (±2 μm) över de stora skanningsområdena (85 μm x 85 μm) som avbildades, sattes skanningshastigheten till det minsta tillåtna på det använda instrumentet, 0,1 Hz. Med en kraftkurvförvärvshastighet på 2 kHz och en skanningshastighet på 0,1 Hz fanns det över 20 miljoner spetsprovinteraktioner under en enda bild på 1024 x 1024 pixlar. Som ett resultat upplevde sondspetsen betydande slitage i förhållande till dess orörda tillstånd (figur 8A) under avbildningen av provet, vilket ökade med över en storleksordning från en effektiv ändradie på ~ 11 nm som mottagen till ~ 129 nm vid slutet av de tre bilderna (figur 8D). Under den första bilden verkar spetsen ha brutits, vilket resulterar i den stora morfologiska förändringen som ses i figur 8B. I varje efterföljande bild blir spetsen gradvis mer rundad, ett utmärkt exempel på det vanligare fenomenet gradvis slitage (se diskussion). De uppskattade spetsradierna från BTR-modellerna ingår i figur 8.

Däremot presenterar figur 8E, F BTR-modeller av en diamantspetssond (se materialtabell) förvärvad med 6 månaders mellanrum, med tusentals nanoindenter och hundratals miljoner kraftkurvbildningsbaserade spetsprovinteraktioner som förekommer däremellan. Som framgår av de uppskattade spetsradierna på 29 nm (figur 8E) och 28 nm (figur 8F) ändrades inte sondspetsradien inom gränserna för BTR-metoden, vilket belyser diamantens extrema slitstyrka. Det bör dock noteras att diamantspetsprober (liksom alla AFM-sonder) är känsliga för kontaminering från löst vidhäftat skräp som kan påverka spetsområdets funktion och effektiva hårdhet. Följaktligen är provrenhet fortfarande avgörande för bevarande av spetsar och noggranna nanomekaniska mätningar.

Exempel på tillämpningar
Genom det förnuftiga valet av sondmaterialsammansättning, utskjutande fjäderkonstant och spetsgeometri och radie kan cantilever-baserad nanoindentation användas för att kvantifiera de nanoskala mekaniska egenskaperna hos material med elastiska moduler som sträcker sig från kPa till GPa, både i vätska och under omgivande förhållanden. Utvalda applikationsexempel följer för att belysa några av de många användningsfall som är möjliga för cantilever-baserad nanoindentation.

Undersökning av loblolly furu mekaniska egenskaper för biobränsleapplikationer
Loblolly tallar (Pinus taeda) är en snabbväxande barrträdslag som är mycket riklig i södra USA och upptar över 13 miljoner hektar³¹. På grund av deras överflöd är loblolly tallar en kritisk kommersiell gröda i södra USA, som vanligtvis används för både timmer och massaved. Dessutom är de en viktig resurs för andra generationens produktion av cellulosabaserade biobränslen³². Det är viktigt att efterfrågan har ökat på cellulosa biobränsleråvara på grund av Energy Independence and Security Act (EISA) från 2007, som föreskriver att den totala användningen av förnybart bränsle i den amerikanska transportindustrin år 2022 ska vara 36 miljarder gallon, varav 16 miljarder liter härrör från cellulosabiomassa. På grund av loblolly tallens snabba tillväxttakt och användbarhet för agroforestry-projekt har det därför blivit en råvara för biobränsle av stort intresse de senaste åren³³. Kunskap om de mekaniska egenskaperna hos loblolly tall, inklusive variation mellan enskilda träd, anatomiska fraktioner (t.ex. gran, bark, nålar) och cellområden (t.ex. cellvägg kontra inre), kan möjliggöra målinriktad separation av biomassaströmmar för att optimera mekanisk bearbetning och termokemisk omvandling³⁴.

Figur 9 visar en representativ AFM-topografibild (höjdsensor) (figur 9A) och motsvarande elastisk modulkarta (figur 9B) av ett tvärsnittsprov av gran erhållet från en gren på en 23-årig loblolly furu med en ~ 30 nm krökningsradie diamantspetssond monterad på en fribärande rostfritt stål (k = 256 N/m). Topografi- och modulkartorna genererades samtidigt med hjälp av snabb kHz-hastighetskraftkurvbaserad AFM-avbildning, där modulkartan presenterade semikvantitativa resultat baserade på nominella värden för sondkalibreringskonstanterna (dvs. fjäderkonstant, avböjningskänslighet och spetsradie) och anpassade kraftkurvorna i realtid till DMT (Derjaguin, Müller och Toporov) kontaktmekanik modell³⁵. Tvärsnittsprover trimmade till <3 mm i alla tre dimensionerna (längd x bredd x höjd) förbereddes för avbildning genom seriell uttorkning med ökande koncentrationer av etanol (33%, 55%, 70%, 90% och 100%)³⁶, innan de infiltrerades med harts (se materialtabell) och polymerisering vid 60 °C över natten. Helt härdade hartsinbäddade prover slipades först, sedan ultramikrotomed med ett diamantblad som arbetar med en skärhastighet på ~ 1 mm / s med en matningstjocklek som minskar från 1 μm ner till 50-70 nm per skiva för att producera en plan yta som är mottaglig för AFM-avbildning. Men som framgår av färgskalan i figur 9A är den resulterande ytan i detta fall fortfarande relativt grov, kanske på grund av närvaron av kvarvarande skräp på provytan och / eller ultramikrotombladet, vilket leder till bladets "prat" under sektionering, medan andra prover uppvisade mycket jämnare yttopografi.

Figur 9C återger AFM-topografibilden från figur 9A, men med vita hårkors som indikerar platserna för åtta matriser med 50 nanostrecksatser per styck som ska utföras längs utvalda cellväggar inom ROI, eftersom målet med projektet i fråga var att förstå hur de nanomekaniska egenskaperna hos loblolly tall skiljer sig åt mellan olika vävnadstyper och trädålder. En tröskel på 1 μN användes vanligtvis för ramperna (60 nm nominell rampstorlek utförd med en ramphastighet på 1 Hz), vilket ledde till ett indragningsdjup på ~ 10 nm längs cellväggarna (8 ± 2 nm över alla studerade prover) eller något djupare (14 ± 4 nm) i cellinteriörerna, som är något mjukare än cellväggarna. Indrag inom varje linje var placerade ≥100 nm från varandra för att säkerställa att de var väl separerade och 1 024 datapunkter samlades in per ramp för att producera väl karakteriserade inflygnings- och indragskurvor. Genom att kombinera snabb kraftkurvbaserad avbildning med point-and-shoot cantilever-baserad nanoindentation var det möjligt att generera statistik och bestämma skillnader i moduler mellan cellstrukturer. Till exempel, som visas i tabell 1, fann man att den genomsnittliga elastiska modulen i cellens inre var ungefär hälften av cellväggen över granprover härrörande från flera grenar av träd i varierande åldrar.

Prov	Plats	E* (GPa)	E (GPa)	Deformation (nm)	Antal (n)
1	Interiör	1.5 ± 0.4	1.4 ± 0.4	14 ± 2	199
	Vägg	4.7 ± 1.3	4.3 ± 1.3	7 ± 2	202
2	Interiör	1.3 ± 0.3	1.2 ± 0.3	16 ± 3	198
	Vägg	3.2 ± 0.9	2.9 ± 0.9	9 ± 2	199
3	Interiör	1.9 ± 0.6	1,7 ± 0,6	12 ± 3	198
	Vägg	5.7 ± 1.2	5.2 ± 1.2	6 ± 1	199
4	Interiör	2.4 ± 0.8	2.2 ± 0.8	11 ± 3	202
	Vägg	4.2 ± 2.1	3.8 ± 2.1	9 ± 4	193
5	Interiör	2.6 ± 0.8	2.3 ± 0.8	10 ± 2	198
	Vägg	4.3 ± 1.6	3.9 ± 1.6	7 ± 2	199
Genomsnitt	Interiör	1.9 ± 0.6	1.8 ± 0.6	13 ± 3
	Vägg	4.4 ± 1.4	4.0 ± 1.4	8 ± 2

Tabell 1: Loblolly furu elastisk modulstatistik: cellväggar kontra cellinteriör. Uppmätt elastisk modul av cellväggarna kontra cellinteriörer för fem loblolly pine whitewood grenprover samlade från två träd av olika åldrar. Alla modulvärden beräknades genom att anpassa inflygningsdelen av kraftförskjutningskurvan till DMT-modellen och anta ett Poissons förhållande på 0,3 för provet. Modulerna rapporteras som medelvärde ± standardavvikelse för varje provplats, med antalet kraftkurvor (antal, n) analyserade för att ge det rapporterade resultatet angivna. Uppmätta reducerade moduler (E *) omvandlades till faktiska provmoduler (E), förutsatt en Youngs modul på 1 140 GPa och Poissons förhållande på 0,07 för diamantspetsindentern som användes. Dessutom visas den genomsnittliga provdeformationen för den applicerade belastningen på 1 μN.

Korrelerad nanomekanik och elektronmikrospektroskopi på Bakken-skiffer
Bakken-skifferfyndigheter finns i Williston Basin i Montana och North Dakota i USA och delar av Saskatchewan i Kanada. De är den näst största kolvätereservoaren i USA, men studien av insättningarna är fortfarande i sin linda³⁷. En undersökning av de nanomekaniska egenskaperna hos Bakken-skiffer som en funktion av sammansättning och termisk mognad genomfördes genom samlokalisering av AFM-cantilever-baserad nanoindentation med skanningselektronmikroskop (SEM) avbildning och karakterisering av elementär komposition för energidispersiv spektroskopi (EDS), som visas i figur 10. Specifikt användes SEM-EDS-kartläggning för att karakterisera elementfördelningen (figur 10C) och därigenom bestämma närvaron och placeringen av olika mineralinneslutningar i skiffermatrisen. Snabb (kHz-hastighet) kraftkurvbaserad AFM-avbildning (figur 10B) samlokaliserades med SEM-EDS-kartorna genom att definiera ett optiskt identifierbart ursprung i den sekundära elektronen (SE) SEM-bilden (figur 10A) och spåra scenrörelsen för både AFM och SEM³⁸. Genom att återigen använda en diamantspetssond monterad på en styv fribärande i rostfritt stål var kartläggning av variationer i den elastiska modulen möjlig för stora regioner (85 μm x 85 μm) innehållande inneslutningar av intresse (figur 10D). Observera att modulkartan som presenteras i figur 10D är kvalitativ snarare än kvantitativ till sin natur, eftersom de korrekta sondkalibreringskonstanterna inte matades in i programvaran före avbildning och datainsamling.

AFM-bilderna i figur 10B och figur 10D belyser också en av nackdelarna med den använda diamantspetssonden, nämligen dess oförmåga att exakt spåra funktioner med högt bildförhållande (se det svarta ovala området i figur 10B) på grund av dess kubhörnspetsgeometri. Den minskade upplösningen och oförmågan att exakt spåra branta objekt kan ses tydligare i figur 11, där samma allmänna område av ett Bakken-skifferprov har avbildats av kubhörnets diamantspets (figur 11A) och en betydligt skarpare, högre bildförhållande styv tappningsläge kisel AFM-sond (figur 11B). Mer specifikt förvärvades bilden som visas i figur 11B med sonden som karakteriseras i figur 8A-D, mellan BTR-modellerna i figur 8A (R = 11 nm) och figur 8B (R = 43 nm). För direkt jämförelse presenterar bildparen Figur 11C,D, tillsammans med figur 11E,F, inzoomade bilder av samma provyteegenskaper som erhållits med diamantspetsen respektive kiselsonden, som visar effekten av spetsgeometri och radie på bildupplösning och återgivning. Figur 11G visar en sammansatt 3D-bild som kombinerar yttopografin som förvärvats med den skarpa kiselsonden med hög bildfärg (figur 8A, B) och modulvärdena som förvärvats med diamantspetssonden (figur 8E, F) kodad som det överlagrade färgade skalet.

Förutom de stora bilderna som visas i figur 10 och figur 11 togs mindre (10 μm x 10 μm) snabba kraftkurvbaserade bilder med hjälp av den fullständigt kalibrerade diamantspetssonden. Dessa bilder fokuserade på områden utan optiskt synliga oorganiska mineralinneslutningar för att undersöka egenskaperna hos den omgivande organiska matrisen mer detaljerat. Genom att använda en pixelupplösning på 512 x 512 (dvs. ~ 20 nm x 20 nm samplingspixlar) fångades > 262 000 individuella F-D-kurvor och sparades med varje 10 μm x 10 μm bild, vilket möjliggjorde utmärkt statistik. FD-data batchbearbetades och analyserades med hjälp av AtomicJ-programvarupaketet²³ för att implementera Derjaguin-Muller-Toporov (DMT) 35-kontaktmekanikmodellen. Efter anpassning rensades data för att ta bort kurvor som resulterade i en beräknad elastisk modul <0 (icke-fysisk) eller >30 GPa (eftersom studien var inriktad på den icke-mineraliska delen av skiffer, E << 30 GPa) liknande andra studier^39,40, samt data med en modell som passar R² < ^0,7. Medan R^{2-avstängningen} är något godtycklig, valdes den för att bara ta bort data som modellen uppenbarligen inte kunde passa exakt. Med undantag för en avvikare som inkluderade en stor mineralinkludering i bildområdet stod de borttagna kurvorna för mindre än 0,5% av de totala uppgifterna för varje bild. En sammanfattning av de statistiska resultaten finns i tabell 2. De beräknade elastiska modulerna varierar från 3,5 till 6,1 GPa, inom intervallet för vad liknande studier också har funnit^39,40.

Prov	E (GPa)	Utbyte efter datarengöring	Antal (n)
1	6.1 ± 3.8	93.70%	7,36,874
2	5.1 ± 2.6	99.70%	7,84,267
3	3.5 ± 1.9	99.60%	7,83,427

Tabell 2: Bakkenskiffers statistik över elastiska moduler. Uppmätt elastiska moduler av de organiska matriserna i tre Bakken-skifferprover med olika sammansättning och termisk mognad. Prov 1 är en kontroll, medan prov 2 och 3 glödgades i 12 timmar respektive 48 timmar för att artificiellt simulera termisk mognad. Elastiska moduler rapporteras som medelvärde ± standardavvikelse för varje provplats, med antalet kraftkurvor (antal, n) som ingår i analysen efter användning av datarengöringsproceduren som beskrivs i den angivna texten. Den beräknade genomsnittliga modulen (3,5-6,1 GPa) faller inom det intervall som rapporterats i andra liknande studier som Li et ^al.40, som fann ett modulintervall på 2,9-11,8 GPa.

Mesenkymal stamcellskärnstyvhet förändras på grund av yttre stimuli
Mesenkymala stamceller (MSC) är stamceller som kan bli kondrocyter, adipocyter, osteoblaster och myocyter⁴¹. MSC-differentieringen i dessa olika vävnadstyper påverkas av yttre mekaniska stimuli på cellen via Linker of the Cytoskeleton and Nucleoskeleton (LINC) -komplexet, som fysiskt länkar det yttre cellmembranet till kärnmembranet⁴¹. LINC-komplexet består av SUN- och Nestrin-proteiner som interagerar med cellcytoskelettet för att detektera fysiska krafter på cellen och underlätta kärnimport av de mekanokänsliga faktorerna β-catenin och YAP för att initiera differentieringsprocessen^42,43,44. Tillsammans med kärnimporten av β-catenin och YAP efter mekanostimulering av celler genomgår cytoskeletten också omläggning, inklusive bildandet av F-aktinfilament runt kärnan samt kärntranslokationen av aktin^44,45,46. Eftersom mekanostimulering initierar förändringar i cellcytoskelettet och kärninträde av aktin, påverkas den totala styvheten (modulen) hos celler och kärnor och kan mätas med AFM cantilever-baserad nanoindentation. Tidigare studier har bekräftat detta genom att detektera en minskning av cell- och kärnmodul efter störning av LINC-komplexet, och omvänt en ökning av cell- och kärnmodul efter mekanostimulering av MSC⁴⁷. Aktuell forskning undersöker fortfarande mekanismerna för aktinimport till kärnan och hur aktinpolymerisation påverkar cell- och kärnmodul efter mekanostimulering.

För att undersöka de mekaniska egenskaperna hos levande celler måste experimenten utföras i en buffertlösning, typiskt PBS. Att genomföra fribärande baserad nanoindentation i vätska innebär unika problem, speciellt för mätning av mycket mjuka prover som MSC (E≈ 2 kPa). I synnerhet kräver den låga elastiska modulen hos levande celler användningen av en stor sondradie för att minska spänningen som ges på cellstrukturen och undvika punktering av membranet. Dessutom är mycket låga fjäderkonstanta konsoler (k = 0,04 N / m) nödvändiga för att mäta sådana låga elastiska moduler, men detta ökar sannolikheten för falsk inkoppling på grund av vätskans viskösa drag, vilket leder till avböjning av den mjuka utskjutaren under det första snabba sänkningssteget i AFM-inkopplingsprocessen. För att motverka den högre benägenheten för falska ingrepp kan det vara nödvändigt att använda ett större börvärde (dvs. tröskeln för utlösande av avböjningsspänning för att avsluta inkopplingsprocessen). Eftersom mjukare konsoler i allmänhet kan deformeras elastiskt i större utsträckning än styva cantilevers, är den större böjning som upplevs med ett högre börvärde i vätska i allmänhet inte skadlig för sådana mjuka sonder. Dessutom är det absolut nödvändigt att lösningarna som används i en flytande miljö är fria från skräp och bubblor, eftersom flytande skräp eller bubblor tillfälligt kan störa överföringen av lasern genom vätskan till PSD eller fästa vid utskjutaren och blockera lasern. Interferens med laserstrålen kommer att påverka de resulterande F-D-kurvorna negativt och resulterar ofta i falsk kraschdetektering eller falsk inkoppling. Slutligen kräver nanoindentering på levande celler också mer användarinmatning än på hårdare, livlösa material. I synnerhet, eftersom cellerna och deras vätskemiljö är mycket mer dynamiska, kan det vara nödvändigt att aktivt justera sondens höjd för varje ramp för att säkerställa att en bra F-D-kurva erhålls.

Vid nanoindentering av levande celler behövs ofta mycket större provdeformation för att resultera i samma fribärande avböjning i förhållande till styvare prover. Denna större deformation kan resultera i experimentella resultat som avviker från Hertz-modellens antagande om linjär elasticitet, och därför kan en korrigeringsfaktor behöva tillämpas för att ta hänsyn till det hyperelastiska beteendet för noggrann F-D-analys⁴⁸. Det har visat sig att det geometriska storleksförhållandet, där R ₂ är indenterns radie och R₁ är cellens radie (se figur 12A), kan användas för att förutsäga de resulterande datas anslutning till hertzmekanik. Det ideala geometriska storleksförhållandet har visat sig vara β = 0,3, med β värden <0,3 vilket leder till att den elastiska modulen underskattas och β värden > 0,3 vilket leder till överskattning av den elastiska modulen när den analyseras med Hertz kontaktteori⁴⁸. Ett vanligt sätt att undvika olinjära effekter är att hålla deformationerna små. I denna studie begränsades intrycksdjupet till 500 nm-1 μm.

En representativ datauppsättning som visar resultaten av en enda uppsättning nanoindentationsexperiment på MSC och isolerade kärnor visas i figur 12B. I de data som presenteras i figur 12B, förkalibrerade (fjäderkonstant via LDV och spetsradie via SEM), användes halvsfäriska sonder med 5 μm radie med en nominell fjäderkonstant på k = 0,04 N/m för att undersöka skillnader i modul mellan intakta levande MSC och isolerade MSC-kärnor, som fungerade som kontroller för att testa effekterna av statiska och dynamiska töjningar på cell- och kärnmekaniska egenskaper⁴⁶ . På grund av skillnader mellan och utmaningar i att engagera sig i cellerna och kärnorna tenderar de extraherade moduldata att uppvisa en stor variation (dvs. fördelning av värden). Följaktligen visar datasetet i figur 12B en 75^:e percentil av de insamlade uppgifterna. På grund av denna medfödda variation bland levande celler och resulterande mätspridning rekommenderas det att utföra replikatexperiment med nanoindentation på ett stort antal prover med minst tre biologiska replikat för att generera robust statistik för dataanalys och tolkning³⁰.

Mekaniska egenskaper hos kolesterolhaltiga lipidskikt
Stödda lipidmembran med mycket högt (>50 mol%) kolesterol (Chol) innehåll, typiskt för kompositionen som finns i ögonlinsmembran, bereddes och inkuberades på nyligen klyvd muskovit glimmer⁴⁹. En representativ AFM-topografibild av ett sådant understött lipidmembran (SLM) framställt vid ett blandningsförhållande på 1 för Chol/POPC (POPC = 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin) visas i figur 13A, med höjdprofilen längs den lila linjen i bilden nedanför figuren. SLM i figur 13A täckte helt den exponerade glimmerytan med tillräcklig inkubationstid (~ 25 min) och en tillräcklig lipidkoncentration (0,3 mg / ml), vilket framgår av bristen på urskiljbara egenskaper i topografibilden. På samma sätt ger höjdprofilen över bilden strukturella detaljer om membranytans grovhet, med SLM jämn som förväntat.

Figur 13B visar en samling inflygningssektioner av kraftkurvor som fångats på SLM som visas i figur 13A. För att få bättre statistik över SLM:s mekaniska egenskaper samlades kraftkurvor in vid ekvidistanta punkter med minst 100 nm mellanrum och täckte nästan hela SLM:s bredd. Avståndet mellan punkterna (≥10x indragningsdjupet) valdes för att förhindra att indrag inträffar för nära varandra. Kraftkurvorna visar en tydlig genombrottshändelse, vilket framgår av diskontinuiteten eller det plötsliga hoppet mellan separationsavstånden ~0 och ~5 nm i inflygningsdelen av kraftkurvorna där kraften sjunker brant från ~10 nN till ~5 nN. Den genomsnittliga genombrottskraften för membranet som visas i figur 13A (kol/POPC-blandningsförhållande på 1) baserat på inflygningskurvorna i figur 13B beräknas vara 9,25 ± 0,27 nN.

Däremot visar figur 13C en AFM-topografibild av de partiella membran- eller membranplåster som bildas genom att återigen inkubera membran vid ett Chol/POPC-blandningsförhållande på 1, men vid en mycket lägre koncentration av lipider (~ 15 μg / ml) och med en kortare inkubationstid (~ 5-6 min)⁴⁹. Höjdprofilen längs den röda linjen över membranplåstret i mitten av bilden visas under figuren. Mätningen över det partiella dubbelskiktet ger tjockleken på SLM, vilket visas av de svarta streckade linjerna i figur 13C för att vara ~ 7 nm. Denna uppmätta tjocklek innehåller emellertid också ett 1-2 nm vattenskikt mellan membranet och glimmerskivan⁵⁰. Det bör noteras att det partiella membranet ofta endast är svagt fäst vid glimmerytan, vilket kan orsaka att lipidpartiklar avlägsnas från kanten av de partiella membranfläckarna under skanning, men en något längre inkubationstid eller sänkning av bildkraften kan eliminera denna svårighet.

Kalibrering av AFM-sonden är avgörande för att noggrant kvantifiera SLM:s mekaniska egenskaper. Även om spetsfjäderkonstanten förblir konstant i luft eller vätskemedium, måste avböjningskänsligheten kalibreras i samma medium där experiment utförs. Det är viktigt att kalibrera avböjningskänsligheten omedelbart före varje uppsättning kraftkurvförvärv för att säkerställa reproducerbara resultat, eftersom laserinriktningen och/eller reflektiviteten hos baksidesbeläggningen kan förändras över tid, särskilt i vätska. Mycket skarpa prober avråds från att fånga membrankraftkurvor, eftersom de lätt punkterar SLM och kan leda till mätning av en felaktigt låg genombrottskraft eller inget genombrott alls. Upprepad användning av samma spets utan ordentlig rengöring ökar dock risken för att skräp samlas på spetsen och därmed dämpar spetsen eller påverkar spetsprovets vidhäftningskrafter. En brist på genombrottshändelser som är uppenbara i inflygningskraftkurvorna kan också motsvara att man bara trycker på glimmer snarare än det faktiska membranet; Således är visuell bekräftelse av membranbildning före infångning av kraftkurvor nödvändig.

Figur 7: Kurvor för representativ kraftförskjutning (F-D) i luft och vätska. Representativa kraftkurvor erhållna på (A) en loblolly furu i luft med tillhörande DMT-modellpassning och (B) en levande MSC-kärna i PBS med en medföljande Hertz-modellpassning. Infällningar i panelerna A och B visar en zoomning av kontaktområdet för motsvarande inflygningskurvor (blå spår) med tillhörande passform (gröna spår). I varje panel indikeras den initiala kontaktpunkten för spetsen (som bestäms av anpassningsalgoritmen) med en grön diamant, medan vändpunkten (dvs. övergången från tillvägagångssätt till indragning eller uttag) indikeras med en cyancirkel. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 8: Jämförelse av slitage på kisel och diamantsondspets. (A-D) Sondspets av kisel. Serie modeller skapade med rekonstruktionsmetoden för blindspetsar efter avbildning av ett spetskarakteriseringsprov, som visar utvecklingen i radie av en styv utskjutande kiselspetssond (se materialförteckning) på grund av progressivt spetsslitage som upplevs under tre sekventiella 85 μm x 85 μm (1024 x 1024 pixlar) kraftkurvbaserade bilder av ett Bakken-skifferprov, utförs med en linjeskanningshastighet på 0,1 Hz och kraftkurvans samplingsfrekvens på 2 kHz (dvs. ~ 20 miljoner spets-provinteraktioner / bild). (A) Spets mottagen (ur förpackningen), före användning. R = 11 nm. (B) Tippa efter en bild (R = 43 nm). (C) Tipp efter två bilder (R = 94 nm). (D) Tips efter tre bilder (R = 129 nm). (E,F) Diamantsondspets. BTR-modeller av samma diamantspetssond (se materialtabell) erhållna med ~ 6 månaders mellanrum. Mellan förvärvet av spetsbilderna som användes för att generera modellerna som visas i E och F utfördes tusentals nanoindenter med sonden och hundratals miljoner spetsprovinteraktioner under kraftkurvbaserad avbildning inträffade. På grund av diamantens hårdhet förändrades dock inte den uppskattade spetsändradien på ~ 30 nm inom osäkerhetsgränserna för BTR-tekniken mellan förvärv av de ursprungliga (E) och uppföljningsbilderna (F) av spetsen. Den asperitet som observerats i den tidigare modellen (indikerad av den svarta cirkeln i panel E) är troligen antingen en artefakt av BTR-metoden eller på grund av närvaron av en förorening i nanoskala (t.ex. dammpartikel) på sidan av spetsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 9: AFM-topografi och modulkartor över ett loblolly tallprov. Representativa AFM-data som samlats in i luft på ett tvärsnittsprov av loblolly furu inbäddat i harts för att möjliggöra utskjutande baserade nanoindentationsmätningar på cellväggar. (A) AFM-topografibild som täcker flera celler förvärvade via ett snabbt kraftkurvbaserat bildläge, presenterat som en pseudo-3D-avbildning. (B) Elastic eller Youngs modulkarta genererad i realtid av AFM-programvaran genom att analysera kraftkurvan som förvärvats vid varje pixel och anpassa data till DMT-modellen, vilket visar att cellväggarna är styvare än cellinteriören. Observera att de nominella, snarare än uppmätta, sondkalibreringsparametrarna användes, så modulvärdena bör behandlas som kvalitativa eller endast semikvantitativa. (C) Översikt över avkastningen på investeringen som anger de platser (åtta linjer bestående av 50 hårkors per styck med ≥100 nm mellanrum) där 400 nanoindent (60 nm nominell rampstorlek, med en tröskel på 1 μN som motsvarar ett genomsnittligt indragningsdjup på ~ 10 nm) utfördes längs utvalda cellväggar efter insamling av AFM-bilden för att möjliggöra lokalisering av indrag med nanoprecision. Skalstänger = 20 μm (A,B). Förkortningar: AFM = atomkraftmikroskopi; DMT = Derjaguin-Müller-Toporov. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 10: Samlokaliserad AFM och SEM/EDS för ett Bakken-skifferprov. (A) Sekundär elektron-SEM-bild av en del av ett Bakken-skifferprov. (B) AFM-topografibild av det område som indikeras av den svarta rutan i A. Svart oval indikerar ett område där sondens låga bildförhållande leder till avbildning av sondens sidovägg snarare än den branta yttopografifunktionen med högt bildförhållande. (C) EDS-elementkompositionskarta erhållen för SEM-bilden som visas i A. (D) AFM-härledd elastisk eller Youngs modulkarta genererad under erhållandet av AFM-topografibilden i B, som visar att mineralinkluderingen i mitten av bilderna A-D är betydligt hårdare än den omgivande organiska matrisen. Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: AFM = atomkraftmikroskopi; SEM = svepelektronmikroskopi; EDS = energidispersiv spektroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 11: Inverkan av sondspetsradie och form på utseendet på funktioner med högt bildförhållande. Jämförelse av egenskapsupplösning erhållen med antingen (A) en R≈ 30 nm lågt bildförhållande (spetshalvvinkel = 47°) diamantspetssond (se materialtabell) eller (B) en R≈ 10 nm hög bildförhållande (spetshalvvinkel ≈ 19°) styv kiselsond (nominell k = 200 N/m; se materialförteckning) för att avbilda samma plats på ett Bakken-skifferprov. (C-F) Inzoomade bilder av de blå (C,D) och orange (E,F) boxade områdena i A och B erhållna med antingen den större krökningsradien med lågt bildförhållande diamantspetssond (C,E) eller den skarpare, styva kiselgängningslägessonden (D,F) med högre bildförhållande, vilket belyser den minskade funktionsupplösningen och införandet av sidoväggsartefakter med spets i AFM-topografibilden som erhållits med diamantspetssonden på grund av dess större spetsradie och halv vinkel. De områden som markeras i C-F innehåller branta, djupa välliknande funktioner som visar avvägningarna när det gäller lateral upplösning, exakt spårning och bildåtergivning mellan en lättare matt, initialt skarp kiselsond eller en trubbigare, slitstark diamantspetssond. (G) Sammansatt 3D-bild genererad genom att kombinera AFM-topografi som förvärvats med den skarpa, styva kiselsonden med högre bildförhållande med moduldata (överlagrad färgad hud) härledd från snabb kraftkurvavbildning av samma område av provet med diamantspetssonden. De funktioner som markeras av de blå och vita rutorna i A och B anges också i G. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 12: Cantilever-baserad nanoindentation på celler eller kärnor. A) En cell med radien R ₁ belägen på ett plant, styvt substrat är indragen till ett djup d av en sfärisk indenter med radien R₂. Denna siffra reproducerades från Ding et ^al.48. (B) Individuella värdediagram över representativa modulmätningar erhållna från AFM-utskjutarbaserade nanoindentationsexperiment på MSC-muser och isolerade kärnor extraherade från MSC-mus. Totalt mättes 10 celler och 10 kärnor fem gånger vardera vid ett intrycksdjup på 500-600 nm (valt för att tillåta användning av Hertz kontaktmekanikmodell). De resulterande råa F-D-kurvdata bearbetades med användning av Atomic J²³ för att beräkna de elastiska modulerna. På grund av cellernas stora medfödda variabilitet plottas en 75^{: e} percentil av data. Cellkärnor och isolerade kärnor uppvisade ingen statistisk skillnad i elastisk modul, med en uppmätt genomsnittlig modul på 0,75 ± 0,22 kPa respektive 0,73 ± 0,22 kPa. Liknande data har samlats in och analyserats för att bestämma skillnader i kärnstyvhet på grund av mekanisk stimulering, proteinknockouts och kemiska behandlingar. Förkortningar: MSC = mesenkymal stamcell; AFM = atomkraftmikroskopi; F-D = kraftförskjutning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 13: Morfologi och nanomekaniska egenskaper hos lipiddubbellager. (A) AFM-topografibild som visar den minimala höjdvariationen för ett komplett lipidmembran (SLM) bestående av Chol/POPC vid ett blandningsförhållande på 1 som bildades över hela den exponerade glimmerytan med en lång inkubationstid (~ 25 min) och hög lipidkoncentration (0,3 mg / ml). Höjdprofilen längs den lila linjen över mitten av bilden visas under figuren, vilket ger strukturella detaljer om membranytan. Som förväntat är SLM extremt smidig. (B) Samling av inflygningssektioner av kraftkurvor som fångats på SLM som visas i A. Kraftkurvor samlades in vid ekvidistanta punkter ≥100 nm från varandra och täckte nästan hela SLM. Kraftkurvorna visar en tydlig genombrottshändelse, vilket framgår av diskontinuiteten eller det plötsliga hoppet i kraftkurvornas inflygningsdel. Den genomsnittliga genombrottskraften är 9, 25 ± 0, 27 nN. (C) Partiella membran- eller membranplåster som bildas genom inkubation av membran med ett Chol/POPC-blandningsförhållande på 1 med kortare inkubationstid (~5-6 min) och lägre lipidkoncentration (~15 μg/ml) i förhållande till A⁴⁹. Höjdprofilen längs den röda linjen på lappen visas under bilden. Det partiella dubbelskiktet möjliggör mätning av SLM:ens tjocklek, vilket visas av de svarta streckade linjerna i höjdprofilen. Observera att den uppmätta tjockleken också innehåller ett 1-2 nm vattenskikt mellan membranet och glimmerskivan⁵⁰. Denna siffra anpassades från Khadka et ^al.49 med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Provberedning
För nanoindentering i luft inkluderar vanliga beredningsmetoder kryosektion (t.ex. vävnadsprover), slipning och/eller polering följt av ultramikrotomering (t.ex. hartsinbäddade biologiska prover), jonfräsning eller fokuserad jonstrålberedning (t.ex. halvledar-, porösa eller blandade hårdhetsprover som inte är mottagliga för polering), mekanisk eller elektrokemisk polering (t.ex. metalllegeringar) eller tunnfilmsavsättning (t.ex. atomskikt eller kemisk ångavsättning, molekylär strålepitaxi). Målet är att skapa ett prov med minimal ytjämnhet (helst nm-skala, ≤0,1x det avsedda fördjupningsdjupet). Med många av de föregående metoderna kan provet därefter behöva sköljas med och / eller sonicated i hög renhet filtrerad (t.ex. HPLC-kvalitet) lösningsmedel och torkas med ultrahög renhet (99,999%) kväve (_N2) gas för att avlägsna partikelformiga skräp. Alternativt kan flingor (t.ex. 2D-material) eller partiklar (t.ex. nanopartiklar eller mikrokapslar) spinnbeläggas eller släppas ut ur lösningar som framställts med filtrerade lösningsmedel med hög renhet. I detta fall är målet att uppnå en ytdensitet som ger flera icke-överlappande flingor eller partiklar inom synfältet i ett slumpmässigt valt område på provet. För nanoindentation i vätska (används ofta för biologiska prover som kräver buffertlösning för att förbli livskraftig) krävs deponering eller beredning av prover på ett jämnt substrat (nanometerskala ytjämnhet) (t.ex. mikroskopglas, petriskål eller nyklyvd muskovitglimmer)^46,47,49.

Överväganden för val av avsökning
Valet av en lämplig sond är av yttersta vikt för kvantitativ analys av F-D-kurvor, eftersom spets-provinteraktionen är den grundläggande egenskapen som mäts i cantilever-baserad nanoindentation. Följande frågor är av särskild betydelse när man väljer en sond för ett givet experiment. Vad är provets förväntade (eller uppmätta) ytjämnhet och elastiska modulområde? Prover med hög ojämnhet kan orsaka accelererat slitage jämfört med mjukare prover på grund av de ökade sidokrafterna som finns på spetsen vid spårning av branta funktioner, samt öka sannolikheten för spetsbrott⁵³. På samma sätt, ju hårdare provet är, desto snabbare kommer det att bära sondspetsen. Dessutom, hur många bilder och/eller nanoinslag behövs? Med mindre bildbehandling och indragning kan mindre spetsslitage förväntas. Som beskrivs mer detaljerat nedan kan spetsslitaget minskas genom att använda diamantliknande kolbeläggningar (DLC) eller praktiskt taget elimineras genom att använda diamantspetsprober (med den höga anskaffningskostnaden kompenserad över tiden av den nästan oändliga problivslängden).

Ett annat övervägande vid val av lämplig sond är storleken på funktionerna av intresse. För nanoindentering är det ofta bäst att använda största möjliga spetsstorlek samtidigt som den rumsliga upplösningen som behövs för provet/proverna i fråga och önskat informationsinnehåll bibehålls, eftersom större spetsar är mindre benägna att uppleva plötsliga förändringar i spetsgeometrin på grund av brott och kommer också att uppvisa lägre slitagehastigheter⁵⁴. Det är också viktigt att överväga om det finns andra AFM-metoder som ska samlokaliseras med nanoindentation, såsom ledande AFM⁵⁵, Kelvin probe force microscopy (KPFM)56 eller magnetic force microscopy (MFM)⁵⁷. Om ytterligare metrologier som dessa ska användas kan sondspetsen behöva vara elektriskt ledande eller magnetisk, vilket kommer att påverka materialsammansättningen och därmed en mängd egenskaper, inklusive hårdhet, slitstyrka och spetsradie. På samma sätt, om indragning kommer att utföras i vätska, är sammansättningen av sondens reflekterande baksidesbeläggning (om sådan finns) en annan viktig faktor, eftersom den måste vara korrosionsbeständig (t.ex. är en Au-baksida beläggning vanlig för vätskeprober). Slutligen, och kanske viktigast av allt, måste sondutskjutarens fjäderkonstant matchas med det förväntade intervallet av elastiska moduler som ska mätas. Om fjäderkonstanten inte matchar väl med provmodulen kan ett av två fall uppstå. Om utskjutaren är för styv kommer liten eller ingen avböjning att mätas och karakterisering blir omöjlig; Omvänt, om utskjutaren är för mjuk, kommer den inte att kunna deformera provet tillräckligt för att mäta dess mekaniska egenskaper.

Tips slitage
Slitage kan definieras på många sätt; för diskussionen om slitage på AFM-sondspetsen här kommer det att definieras som varje förändring i yttopografin hos sondspetsen på grund av plastisk deformation utan förlust av material, liksom avlägsnande av material från ytan på grund av fysiska interaktioner⁵⁸. I en bredare mening kan slitage också innebära kemiska reaktioner som oxidation och hydrering. I normala AFM-tillämpningar begränsas den laterala rumsliga upplösningen vanligtvis av spetsradien⁵⁹, och spets-provinteraktionen är den primära uppmätta egenskapen. Eftersom spetsradien är en nyckelparameter vid modellering av kontaktmekaniken i spetsprovsystemet och därefter bestämning av de mekaniska egenskaperna, är spetsslitage särskilt oroande vid utförande av nanoindentationsexperiment och är en viktig begränsning för korrekt tolkning av nanoindentationsresultat⁵³. På grund av spetsslitagets normala gradvisa karaktär (bortsett från spetsbrott) är det inte möjligt att kvantifiera spetsslitage på grund av en enda nanoindentationscykel (dvs. ramp). Dessutom lämpar sig sondspetsens vinkelräta rörelse i förhållande till provet vid nanoindentation (diskontering av snabb kraftkurvbaserad avbildning) för att minska slitagehastigheten, eftersom det primära läget för spetsslitage vanligtvis är skjuvkrafter som utvecklas under skanningslägen⁶⁰. Som sådan är den primära källan till spetsslitage i nanoindentationsexperiment varje avbildning som utförs efter den initiala sondkalibreringen (i synnerhet avböjningskänslighet och spetsradiemätningar) men före nanoindentation. Det rekommenderas därför att om kisel- eller kiselnitridprober används, bör spetsradien kontrolleras både före och efter varje experiment för att övervaka och ta hänsyn till eventuellt spetsslitage med hjälp av en av de metoder som beskrivs ovan (t.ex. SEM-analys eller BTR).

Sond material
Diamantliknande kol (DLC)
Genom användning av DLC-belagda sondspetsar eller diamantspetsar kan spetsslitage minskas avsevärt eller negeras helt⁵³. Den förbättrade slitstyrkan hos dessa alternativa spetsmaterial är mycket lockande för mätning av mekaniska egenskaper, särskilt av mycket styva material. Det har visats att DLC-sondspetsar kan visa en 1 600-faldig ökning av slitstyrkan jämfört med normala kiselsondspetsar⁵⁴. Denna dramatiska ökning av slitstyrkan kan hänföras till flera faktorer. För det första är bindningarna som finns i DLC (C-C och C = C) och dess gränssnitt med kisel (Si-O, Si-C) några av de starkaste bindningarna i alla elementära par och mycket starkare än Si-Si-bindningarna som finns i kiselspetsar. DLC har också effekten att minska friktionen, vilket i sin tur sänker skjuvspänningarna i spetsen och därmed minskar slitaget. Dessutom skiljer sig DLC-ytkemin från en kiselspets, eftersom kiselspetsar kan uppleva tribokemisk etsning under omgivande fuktighetsförhållanden, medan DLC-spetsar inte gör det (eller åtminstone inte på något meningsfullt sätt jämfört med det primära slitageläget)⁵⁴. Den primära nackdelen med DLC-belagda spetsar (utöver ökat pris i förhållande till vanliga obelagda kiselspetsar) är den ökade spetsradien på grund av själva beläggningen. De flesta DLC-sondspetsradier är ≥30 nm, medan icke-DLC-belagda spetsar på ett tillförlitligt sätt kan nå 1-2 nm i radie⁶¹. En större spetsradie kan dock ofta vara önskvärd för nanoindentationsexperiment för att minska fel i egenskapsmätningar, eftersom skillnader i nanoskala mellan den ideala områdesdjupfunktionen och den faktiska områdesdjupfunktionen, på grund av sonddefekter eller asperiteter, oproportionerligt påverkar mätningar som görs med mindre radieprober på grund av det större relativa felet. Dessutom, trots sin överlägsna slitstyrka, kan DLC-beläggningen så småningom slitas igenom i fläckar, vilket leder till differentiellt slitage mellan den exponerade kiselkärnan och den återstående DLC-beläggningen. Tyvärr kan DLC-beläggningens slitstyrka också begränsas av beläggningens vidhäftning till kiselspetsen snarare än beläggningens faktiska hårdhet ensam.

Diamant
Diamant är välkänt som ett av de hårdaste och mest slitstarka materialen på jorden. Ändå har det visat sig att betydande slitage fortfarande kan uppstå i diamantspetsar när man använder stora (60 μN) krafter i ett avsiktligt försök att utforska spetsslitage⁶². Omvänt, i normala nanoindentations- och avbildningsscenarier där krafterna som utövas på spetsen är mycket mindre, har det inte gjorts några rigorösa studier av diamantspetsslitage. Som framgår av figur 8E,F genererade BTR-modellering av samma diamantprobspets under identiska förhållanden på samma spetskarakteriseringsprov med 6 månaders mellanrum praktiskt taget oskiljbara spetsformmodeller (dvs. inga märkbara tecken på slitage). Mellan den första och andra BTR-bilden användes sonden för att utföra tusentals nanoindenter och genomgick hundratals miljoner spetsprovinteraktioner medan man avbildade en mängd olika styva material (E > 15 GPa), inklusive trä (loblolly tall), skiffer, högordnad pyrolytisk grafit (HOPG) och olika grafentunna filmer. Betecknande nog ändrades den uppskattade spetsradien med ~1 nm mellan de två bilderna i figur 8E,F, vilket ligger väl inom BTR-metodens fel⁶³. Även om det inte är en fullständig studie, visar denna jämförelse den utmärkta hållbarheten hos en diamantsond under normala experimentella nanoindentationsförhållanden (och till och med bildbehandling). De största nackdelarna med användning av diamantspetsar (utöver dyra initialkostnader) är den ökade spetsradien och, på vissa sätt mer oroande, det låga bildförhållandet för kubhörngeometrin hos de flesta kommersiellt tillgängliga diamantspetsar. Figur 11A,B visar sida vid sida, jämförande AFM-bilder av samma område i ett Bakken-skifferprov som förvärvats med en skarp kiselsond med en nominell spetsradie på 8 nm och en genomsnittlig halvvinkel på ~19° jämfört med en diamantspetssond med en nominell spetsradie på 40 nm och en genomsnittlig sidovinkel på 47°. När de förstorade områdena jämförs (figur 11C, D och figur 11E, F) är det uppenbart att diamantspetssonden inte kan lösa och exakt spåra de brantare (högre bildförhållande) funktionerna i bilden. Istället, där branta funktioner finns, kommer spetsens sidovägg i kontakt med den övre kanten och AFM-systemet spårar i huvudsak sondens sidovägg tills spetsänden kommer i kontakt med ytan igen och normal spårning återupptas.

Matchning av fjäderkonstant/modul
Som nämnts ovan måste sondutskjutarens fjäderkonstant matchas med det förväntade intervallet av elastiska moduler som ska mätas. För att underlätta valet av en lämplig sond presenterar tabell 3 föreslagna ungefärliga nominella utskjutande fjäderkonstanter lämpliga för utvalda breda intervall av förväntade provelastiska moduler som sträcker sig från få MPa till 100 GPa i fallet med ~ 30-40 nm radie sondspetsar som ofta används för nanoindentation⁵². Lägre fjäderkonstantprober (k < 0,1 N/m) finns tillgängliga för ännu mjukare material (kPa-intervall) såsom celler.

Fjäderkonstant (N/m)	Förväntat provmodulområde
0.25	≤ 15 MPa
5	5 – 500 MPa
40	200 – 8 000 (0,2 – 8 GPa)
200	1,000 - 50,000 (1 - 50 GPa)
450	10 000 – 100 000 (10 – 100 GPa)

Tabell 3: Idealiska sondfjäderkonstanter för mätning av olika modulområden. Ungefärliga nominella sondfjäderkonstanter för optimal mätning av elastiska moduler över varierande områden från få MPa till 100 GPa, förutsatt en typisk sondradie på ~ 30-40 nm⁵².

Förutom fjäderkonstanten, i det speciella fallet med biologiska material, måste spetsradien och krafterna som appliceras under avbildning och nanoindentation noggrant övervägas för att undvika skador. I applikationsexemplet med mätning av de mekaniska egenskaperna hos kolesterolinnehållande lipiddubbellager, som presenterades i avsnittet representativa resultat, användes en relativt skarp (10 nm) spets specifikt för analys av genombrottskraften i lipidbilager. Däremot, om materialets ROI är tillräckligt stor (t.ex. som är fallet för celler och cellkärnor) och det finns oro för potentialen för punktering, är större halvsfäriska spetsar på mikronskala, som de som används i styvhetsmätningarna på MSC-kärnor som beskrivs i ett av applikationsexemplen i avsnittet representativa resultat, idealiska och ger utmärkta resultat för mjuka, bräckliga prover såsom levande celler och isolerade kärnor. Kain et al. presenterar en fördjupad diskussion om hur man väljer den optimala kombinationen av sondradie och fjäderkonstant för att uppnå högsta möjliga mätkänslighet för sådana prover⁶⁴.

Kalibrering av sond
Avböjningskänslighet
Avböjningskänsligheten relaterar Z-piezos rörelse (och därmed utskjutarens avböjning vid indragning på ett oändligt styvt substrat, förutsatt drift i gränsen för små avböjningar) till en uppmätt spänningsförändring på PSD⁶⁵. Böjningskänsligheten (även kallad invers optisk spakkänslighet [InvOLS]) kan rapporteras i nm/V eller V/nm. En översikt över de vanligaste kalibreringsmetoderna för böjningskänslighet ges nedan.

Hård ytkontakt
Den enklaste och mest populära metoden för att bestämma avböjningskänsligheten för strålstudslasern / AFM-sonden / PSD-systemet är den passande namnet "hård ytkontakt" -metod⁶⁵. Dess enkelhet, enkla integrering i arbetsflöden för AFM-styrprogramvara och in situ-natur bidrar alla till den hårda ytkontaktmetodens överklagande och utbredda användning. För att implementera denna metod rampas AFM-sondspetsen mot ett material som är mycket styvare än utskjutaren. Lutningen på den kontaktade delen av kraftförskjutningskurvan (visas som volt vertikal avböjningsfelsignal på PSD som en funktion av Z-piezorörelsen i nm eller applicerad spänning) ger sedan avböjningskänsligheten (figur 3A). Användningen av ett styvt substrat säkerställer att all uppmätt avböjning uppstår från utskjutande böjning snarare än en faltning av provdeformation och utskjutarens förskjutning. När det gäller mjuka konsoler (t.ex. k < 10 N/m), kisel (E ≈ 170 GPa)²⁷ eller glimmer¹⁷ är lättåtkomliga och lättanvända material (eller alternativt glas, E≈ 70 GPa, eller lämpligt hårdplast när det gäller celler som immobiliserats på ett objektglas eller petriskål), medan för styvare kantiler, såsom de som används för vissa nanoindentationsexperiment (t.ex. k > 200 N/m; Tabell 3) kan safir (E≈ 345 GPa)^26,66 behöva användas för att säkerställa att ingen provdeformation uppstår. Eftersom denna metod är beroende av kraftförskjutningsmätningen måste AFM-skannerns Z-piezo antingen använda en höjdsensor med sluten slinga eller vara väl kalibrerad (om den arbetar i öppet slingläge) med olika höjdstandarder. Den största bidragsgivaren till fel i kontaktmetoden för hårda ytor är rörelse av laserfläcken på utskjutaren på grund av termiska fluktuationer. Förändringar i utskjutarens temperatur orsakas oftast av detekteringslasern, även om Joule-uppvärmning i den omgivande elektroniken också kan bidra. Totala temperaturskillnader på 6 °C mellan utskjutande och omgivande luft har rapporterats, vilket kan leda till laserpunktförskjutningar på flera mikron⁶⁷. För att ta hänsyn till eventuell uppvärmning är det lämpligt att vänta ≥30 minuter efter den första laserpunktinriktningen för att tillåta utskjutaren att komma i termisk jämvikt med omgivningen för bästa och mest exakta resultat. Medelvärdet av inflygnings- och uttagskurvorna för varje känslighetsmätning tar hänsyn till eventuella spetsfriktions- eller glideffekter och bör om möjligt införas⁶⁸. Dessutom hjälper medelvärdet över flera känslighetsmätningar att mäta mätningens tillförlitlighet och reproducerbarhet. Bra känslighetsmätningar bör resultera i avvikelser på ≤1% och utföras vid ungefär samma böjning som de förväntade experimentella nanostrecksatserna för att maximera kalibreringens effektivitet⁶⁹. Den största nackdelen med kontaktmetoden för hårda ytor är att den fysiska kontakten som krävs för kalibreringen potentiellt kan orsaka skador på ömtåliga kiselspetsar (t.ex. mattning eller skapande av spetsartefakter som en dubbelspets).

Termisk brusmetod
Metoden för termiskt brus för att bestämma avböjningskänsligheten kräver föregående kalibrering av den fribärande fjäderkonstanten och förmågan att mäta det termiska brusspektrumet för cantilever⁶⁷. Termisk brusmetod är ofta integrerad i modern AFM-styrprogramvara och kan användas tillsammans med Sader-metoden (se nedan) för snabb analys och beräkning av både fjäderkonstant- och avböjningskänslighet. Det kan dock vara svårt eller omöjligt att använda termisk brusmetod på styvare (k > 10 N / m) cantilevers på grund av minskad vibrationsamplitud. Dessutom är den rapporterade relativa osäkerheten för termisk brusmetod betydligt större, ~ 20% jämfört med den hårda ytkontaktmetoden som beskrivs ovan⁷⁰. Denna teknik kan inte användas om den termiska inställningsmetoden för bestämning av fjäderkonstanten som beskrivs nedan används⁶⁷.

Fjäder konstant
Guldstandarden för mätning av utskjutande fjäderkonstanter är laser Doppler vibrametri (LDV), och det finns nu många kommersiellt tillgängliga sonder som levereras med LDV-härledd fjäderkonstant kalibreringsinformation från tillverkaren för varje enskild sond (se materialtabell). Men medan noggrann mätning av den utskjutande fjäderkonstanten är en absolut nödvändighet för kvantitativa nanomekaniska mätningar, är de praktiska metoderna för att göra det i det typiska laboratoriet för icke-kalibrerade sonder mycket varierande och kan vara något komplexa. Som sådan tillhandahålls endast en kort översikt över de två vanligaste kalibreringsmetoderna på plats här, med en lista över ytterligare metoder och lämpliga litteraturcitat att konsultera för mer information.

Termisk inställningsmetod
Sannolikt den vanligaste metoden som finns i dagens kommersiella AFM, är den termiska inställningsmetoden för att bestämma utskjutande fjäderkonstanter inbyggd i styrprogramvaran för många system. Även om den inte är idealisk för styvare konsoler (k > 10 N / m) på grund av minskad utskjutande avböjningsdetektering och begränsad elektronikbandbredd, är den termiska inställningsmetoden relativt enkel att implementera och är giltig för ett brett spektrum av spetsgeometrier⁷¹. Den termiska inställningsmetoden använder mätning och anpassning av utskjutarens termiska brusspektrum, följt av tillämpning av ekvipartitionssatsen för att beräkna utskjutarens potentiella energi, med utskjutaren generellt modellerad som en enkel harmonisk oscillator⁷². Den termiska inställningsmetoden har ett fel på ~ 5% -10% för mjuka sonder och är tillämplig för alla fribärande former^73,74. Mer detaljerad information finns i referenserna som citeras i det här avsnittet.

Sader-metoden
Sader-metoden är en annan metod som ofta integreras i styrprogramvaran i många moderna AFM^75,76,77. Sader-metoden använder den hydrodynamiska belastningen som upplevs av en utskjutare när den vibrerar i ett vätskemedium (vanligtvis luft eller vatten) tillsammans med utskjutarens planvisningsdimensioner och kvalitetsfaktor för att beräkna den fribärande fjäderkonstanten. Sader-metoden leder till ett fel på ~ 10% -15% för den fribärande fjäderkonstanten⁷⁴. Motsvarande artiklar om den "ursprungliga metoden"76,78, "allmän metod"^79, en utvidgning av den allmänna metoden ⁷⁷ och instrumentspecifik dokumentation kan ge ytterligare detaljer.

Andra sätt
Det finns flera andra metoder som har utvecklats och implementerats för att bestämma fjäderkonstanten för AFM-utskjutare som ligger utanför ramen för detta dokument. Även om ingen av dessa metoder är lika enkla att implementera eller lika utbredda som Sader- eller termiska inställningskalibreringsmetoder, har de alla unika fördelar och nackdelar; Den citerade litteraturen innehåller detaljer om deras tillämpning och genomförande. I synnerhet Sikora ger en utmärkt genomgång av många fjäderkonstantkalibreringsmetoder och är en utmärkt resurs i ämnet⁷². En icke-uttömmande lista över andra metoder för att bestämma fjäderkonstanter inkluderar laser Doppler vibrametri (LDV) 73,74,80, mikroelektriska-mekaniska system (MEMS) baserade enheter⁸¹, referens cantilever 82,83, tillsatt massa (både dynamisk ⁷⁵ och statisk ⁸⁴), precisionsbalans^85,86, elektromagnetisk aktivering ⁸⁷ och finit elementanalys (FEA) ^88,89.

Spetsradie
Vanliga metoder för att bestämma spetsradien inkluderar både sekundär elektron SEM-avbildning och blindspetsrekonstruktionsmetoden (BTR).

SEM-analys
Sekundär elektron SEM-avbildning kan ge upplösning ner till 1 nm, vilket gör att progressiva bilder av slitage kan jämföras direkt och enkelt. En nackdel med SEM-avbildning är att eftersom det bara finns mycket experimentella kombinerade AFM-SEM-verktyg⁹⁰, måste AFM-sonden vanligtvis demonteras och transporteras till SEM för analys, vilket kan vara både tidskrävande och potentiellt utsätta sonden för kontaminering. En annan nackdel med SEM är att den resulterande bilden i sig är en 2D-projektion av spetsen, utan kvantitativ 3D-information tillgänglig. Försiktighet måste iakttas för att rikta in sonden i exakt samma orientering varje gång för att jämförande resultat ska vara meningsfulla, eftersom även små förändringar i elektronstrålens infallsvinkel kan ändra den uppenbara storleken och formen på sondspetsen. Slutligen kan SEM-avbildning plågas av laddningseffekter och kolförorening, vilket kan suddiga bilden eller orsaka fysiska förändringar i sondspetsen.

Rekonstruktion av blindspets
I motsats till SEM är BTR-metoden en in situ-teknik där 3D-spetsgeometrin modelleras baserat på avbildning av ett prov med många skarpa (högt bildförhållande) funktioner som är mycket mindre än sondens radie. Den här metoden fungerar eftersom den observerade bilden i AFM alltid är en faltning av sondspetsformen och provgeoobjektets form, så genom att modellera extremt skarpa geoobjekt som oändligt skarpa kan spetsformen uppskattas. Tyvärr, förutom antagandet om oändligt skarpa spikar (dvs ytfunktioner som är mycket mindre än spetsradien), kan BTR-tekniken påverkas av bildbrus och skanningsparametrar, så jämförande bilder bör erhållas med mycket liknande bildparametrar. Dessutom, eftersom flera "bilder" av spetsen används för att rekonstruera dess geometri, är en direkt en-till-en omvänd beräkning av spetsformen omöjlig. På grund av sin natur kan BTR-metoden endast praktiskt informera användaren om den övre gränsen för spetsformen⁶³, och avbildning av sonden för att implementera BTR-metoden kan leda till spetsslitage (t.ex. mattning eller flisning av sondspetsen).

Relativ kalibrering
Ibland kan en viss sondegenskap inte lätt och noggrant mätas. Till exempel är fjäderkonstanten hos styvare konsoler svår eller omöjlig att mäta med termisk inställningsmetod på grund av bandbredd och avböjningsbegränsningar⁹¹. Som diskuterats ovan finns det andra metoder för att bestämma fjäderkonstanten, men eftersom den termiska inställningsmetoden är integrerad i många moderna AFM, implementeras den ofta för enkel daglig användning. På samma sätt måste avböjningskänsligheten alltid kalibreras före experiment för omvandling av laserrörelse på PSD till den fysiska avböjningen av sondutskjutaren. I praktiken är dock mätning av spetsradien det mest tidskrävande kalibreringssteget, och det som mest sannolikt kommer att skada sondspetsen. Om det inte är möjligt att direkt mäta spetsradien via SEM eller BTR, kan ett relativt kalibreringsförfarande användas som ett alternativ för att bestämma den effektiva spetsradien, förutsatt att ett standardreferensprov med minimal ytjämnhet (helst atomiskt platt) och en välkänd modul nära den förväntade experimentella modulen finns tillgänglig. Exempel på sådana ideala referensstandarder för relativ kalibrering inkluderar muskovitglimmer 17,92,93,94,95 och HOPG ^96, men tjänar också till att belysa svårigheten att identifiera lämpliga referensstandarder för mjukare prover med moduler i kPa till MPa-intervallet. För att utföra en relativ kalibrering bör först avböjningskänsligheten kalibreras enligt beskrivningen i huvudprotokollet. För det andra bör sondens nominella fjäderkonstant matas in (vanligtvis levereras med sonden) eller mätas med en av de metoder som beskrivs ovan. Det tredje steget är indragning på modulens referensstandardprovyta med lämpliga parametrar. Slutligen bör insamlade F-D-kurvdata analyseras och spetsradieparametern justeras tills den experimentellt uppmätta reducerade modulen matchar den förväntade reducerade modulen. Hänsyn bör tas till det genomsnittliga deformationsdjup som uppnåtts på referensprovet, eftersom detta djup måste bibehållas vid fördjupning på det experimentprov som är av intresse för att kalibreringen ska vara relevant. Nu kan indragning på provet av intresse inträffa, justera rampparametrarna för att matcha deformationsdjupet som uppnåtts på modulstandardreferensmaterialet.

En fördel med den relativa kalibreringsmetoden är att den undviker potentiella ackumulerade fel orsakade av felaktig kalibrering av avböjningskänsligheten, fjäderkonstanten och spetsradien⁵². Dessutom är det kanske något snabbare och mindre sannolikt att skada sonden än BTR-metoden. De största nackdelarna med den relativa kalibreringsmetoden är: 1) behovet av ett högkvalitativt referensprov med nm- till ångströmskalig ytjämnhet och välkända mekaniska egenskaper liknande dem hos provet av intresse som kan analyseras med samma sond som experimentprovet, och 2) kravet på att uppnå samma eller mycket liknande deformationsdjup på både referens- och experimentproverna för att kalibreringen ska vara giltig. Följaktligen är det att föredra att direkt mäta spetsradien om det är möjligt.

Analys av data
Analysmetoden som används för att bestämma provets mekaniska egenskaper från de uppmätta F-D-kurvorna är lika viktig som kvaliteten på själva nanoindentationsdata. Det finns flera vanliga kontaktmekaniska teorier som modellerar kraftförskjutningsrelationer baserat på olika underliggande antaganden (och därmed tillämpliga i olika scenarier). Dessa kontaktmekanikmodeller inkluderar Hertz 97, Sneddon²⁸, JKR (Johnson, Kendall och Roberts) 98, DMT (Derjaguin, Muller och Toporov) ^35,99, MD (Maugis-Dugdale) 100 och MYD (Muller^, Yushchenko och Derjaguin) ^{101 102}. En fördjupad analys och jämförelse av olika kontaktmekanikmodeller och deras tillämpning för analys har presenterats på annat håll: 29,30,103,104. Även om det ligger utanför ramen för detta dokument, ger tabell 4 en kort översikt över några av de vanligaste kontaktmekanikmodellerna. Av särskilt intresse är att mer komplexa modeller som JKR, DMT och andra innehåller effekterna av vidhäftning vid spetsprov 30,35,98,99,100,101,102,103,104^, vilket kan vara signifikant och ofta lätt identifierbart genom uppkomsten av negativ avböjning i kraftkurvan (se figur 3). I praktiken används den valda analysmodellen för att passa de insamlade F-D-data och bestämma de mekaniska egenskaperna, såsom den elastiska modulen. För att korrekt passa in i data krävs en platt baslinje för att bestämma den initiala kontaktpunkten eller en effektiv kontaktpunkt som passar den del av experimentella data som har den största korrelationen till modellen.

Teori	Tillämplighet	Antaganden	Begränsningar
Hertz	Enkel; Används ofta för prover i vätska.	Ingen vidhäftning.	Ogiltigt för system som har vidhäftningskrafter.
Derjaguin-Müller-Toporov (DMT)	Styv med små deformationer.	Vidhäftning på kort avstånd i kontaktområdet plus vidhäftning på lång sträcka utanför kontaktområdet.	Begränsad geometri kan orsaka en underskattning av kontaktytan.
Johnson-Kendall-Roberts (JKR)	Mjuk med stora deformationer.	Vidhäftningskrafter med kort räckvidd endast i kontaktområdet.	Kan underskatta belastning på grund av vidhäftning.
Maugis – Dugdale (läkare)	Denna allmänna lösning täcker de andra limmodellerna.	Tips-exempelgränssnitt modellerat som en spricka.	Analytisk lösning med parametriska ekvationer.

Tabell 4: Vanliga kontaktmekaniska modeller. Utvalda vanliga kontaktmekanikmodeller med tillämplighet, antaganden och begränsningar noterade.

Den praktiska tillämpningen av modellerna som nämns ovan för att analysera F-D-kurvor kräver användning av datorprogramvara för att möjliggöra storskalig batchbearbetning av tusentals eller miljoner kurvor på kort tid och utföra statistisk analys av resultaten. Intern skriftlig kod används ofta vid analys av FD-data, och olika AFM-tillverkare tillhandahåller också mjukvarupaket. På grund av dess öppen källkod, användarvänlighet och detaljerad kompletterande information rekommenderar författarna dock användning av AtomicJ²³. Programmet möjliggör enkel och noggrann analys av FD-data med hjälp av någon av de teorier som beskrivs ovan samt flera andra. Eftersom koden är öppen källkod är det enkelt att manipulera och anpassa för specifika användningsfall utan att behöva bygga komplex kod från grunden. Se Hermanowicz et ^al.23 för fördjupad information om programvarupaketet AtomicJ.

Sammanfattningsvis kan kontaktytan och kraften som appliceras av en AFM-sondspets kvantifieras genom noggrann kalibrering av sonden på en provyta för att möjliggöra bestämning av mekaniska egenskaper i nanoskala, särskilt den elastiska modulen. Ett generaliserat protokoll som belyser bästa praxis för att framgångsrikt implementera AFM cantilever-baserad nanoindentation i luft eller vätska på både mjuka och hårda prover, med elastiska moduler som sträcker sig från kPa till GPa, har presenterats med representativa exempel som tillhandahålls. Viktiga överväganden som val av prob (inklusive ytjämnhet på provytan, funktionsstorlekar, probbildförhållande och spetsslitage), probkalibrering och dataanalys (inklusive kontaktmekanikmodeller och mätstatistik) har diskuterats. Slutligen har samlokalisering av AFM-härledda nanomekaniska kartor med andra karakteriseringstekniker som tillhandahåller kompositionsinformation såsom SEM / EDS demonstrerats, liksom ett exempel på mätning av en annan nanomekanisk egenskap än elastisk modul (dvs. lipid bilayer rupture force) via AFM cantilever-baserad nanoindentation för att ge exempel på ytterligare synergistiska tillämpningar av tekniken. Sammantaget bör exemplen och diskussionen här ge en ingångspunkt för forskare som vill använda AFM cantilever-baserad nanoindentation för att mäta de mekaniska egenskaperna hos praktiskt taget vilken provtyp som helst.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI - T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.