Summary
在这里，我们提出了一种在三维（3D）细胞外基质中培养IDG-SW3细胞的方案。
Abstract
骨细胞被认为是从成骨细胞终末分化的非增殖细胞。嵌入骨细胞外基质（类骨质）中的成骨细胞表达 Pdpn 基因形成细胞树突并转化为骨前细胞。后来，前骨细胞表达 Dmp1 基因以促进基质矿化，从而转化为成熟的骨细胞。这个过程称为骨细胞生成。IDG-SW3 是一种用于骨细胞生成 体外 研究的知名细胞系。以前的许多方法都使用胶原I作为培养基质的主要或唯一成分。然而，除了I.型胶原外，类骨质还含有一种基础物质，它是促进细胞生长、粘附和迁移的重要成分。此外，基质物质是透明的，这增加了胶原I形成的凝胶的透明度，从而有助于通过成像技术探索枝晶的形成。因此，本文详细介绍了使用细胞外基质和胶原 I 建立 3D 凝胶以用于 IDG-SW3 存活的方案。在这项工作中，分析了骨细胞发生过程中树突的形成和基因表达。成骨培养 7 天后，在荧光共聚焦显微镜下清晰地观察到广泛的树突网络。实时荧光定量PCR结果显示， Pdbn 和 Dmp1 的mRNA水平持续升高3周。在第 4 周，体视显微镜显示一种充满矿物颗粒的不透明凝胶，与 X 射线荧光 （XRF） 测定一致。这些结果表明，该培养基质成功地促进了从成骨细胞到成熟骨细胞的转变。
Introduction
骨细胞是来源于成骨细胞的终末分化细胞 1,2。一旦成骨细胞被类骨质掩埋，它就会发生骨细胞生成并表达 Pdpn 基因形成前骨细胞，表达 Dmp1 基因使类骨质矿化，并表达 Sost 和 Fgf23 基因在骨组织中作为成熟骨细胞发挥作用3.本文介绍了一种3D培养系统，用于鉴定骨细胞生成过程中的树突延伸和标记基因表达。
IDG-SW3 细胞是一种来源于转基因小鼠的永生化原代细胞系，在不同培养基中培养时，可以扩增或复制成骨细胞至晚期骨细胞分化4。与MLO-A5、MLO-Y4等细胞系相比，IDG-SW3细胞中功能蛋白的表达谱、进行钙盐沉积的能力以及对各种激素的反应更可能与骨组织中原代骨细胞相同4。
与 2D 系统相比，3D 培养系统更能模拟体内细胞生长环境，包括营养梯度、低机械刚度和周围机械范围（表 1）。以前在3D系统中培养成骨细胞的大多数方法都使用胶原I作为配方4,5,6中的独特成分，因为胶原I纤维是钙和磷沉积的位点。然而，类骨质中不可或缺的成分，即细胞外基质，含有一大类促进细胞生长、粘附和迁移的细胞因子7,8，并且是透明的，便于成像观察。因此，该协议使用基质胶（以下简称基底膜基质）作为骨细胞发生研究的次要组分。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
该方案适用于在24孔板的四个孔中培养细胞。如果制备多个样品或板，则应相应增加试剂的量。
1.胶原蛋白I混合物的制备
注：胶原蛋白I和基底膜基质凝胶在室温下快速。因此，胶原蛋白应在冰上处理（2°C至8°C）。除非另有说明，否则所有使用的吸头和管子都必须预冷。所有程序都应在安全罩中执行。
- 将所有试剂和离心管放在冰上。
- 缓慢移液 0.48 mL 胶原蛋白 I （5 mg/mL） 和 0.1 mL 10x 最低必需培养基 （MEM）（含酚红）放入保持冰的无菌 15 mL 离心管中。轻轻上下移液，充分混合。
- 根据酚红指示剂的调色板，用适当体积为7.5%（w/v）NaHCO 3（约0.2mL）的NaHCO3 （约0.2mL）将酚红指示剂调节为橙色，表示pH值在7.0-7.4范围内。
注：根据培养基的pH值，使用一定体积的NaHCO3 使pH值达到约7.0-7.4。此外，NaOH 还用于 pH 中和。 - 通过加入适当体积的ddH2O，使混合物的最终体积达到1 mL，轻轻上下移液，充分混合以准备使用。
注意：ddH2O 的最终体积将取决于步骤 1.3 中使用的 NaHCO3 或 NaOH 的量。
2. 细胞基质混合物的制备
- 缓慢移液将 0.9 mL 基底膜基质移液到冰上的新 15 mL 离心管中。
- 在33°C下用补充有50U / mL INF-γ的4mL完全培养基（含有10%胎牛血清[FBS]的α-MEM）在T25烧瓶中培养IDG-SW3细胞。
- 一旦IDG-SW3细胞达到90%汇合，取出培养基，并用移液管用磷酸盐缓冲盐水（PBS，整个方案中的pH 7.4）洗涤细胞。用0.5mL 0.25%胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA）在37°C下消化细胞30秒。
- 通过加入 3.5 mL 完全培养基（含有 10% 胎牛血清 [FBS]的 α-MEM）灭活胰蛋白酶。将 4 mL 细胞悬液转移到 15 mL 离心管中。
- 在4°C下以300× g 旋转细胞悬液5分钟。 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于冰上的 1 mL 完全培养基中。
- 使用血细胞计数器对细胞进行计数，并用完全培养基将最终细胞密度调节至 4 × 105 个细胞/mL。从步骤2.1开始，将0.1mL制备的细胞悬液加入0.9mL细胞外基质中。轻轻上下移液，充分混合。
注：如果需要无细胞对照，则将 0.1 mL 完全培养基加入 0.9 mL 细胞外基质中作为阴性对照。
3. 电镀细胞-凝胶混合物
- 轻轻地将步骤2.6和步骤1.4中的两种混合物充分混合至2mL，方法是在冰上上下移液。将 0.5 mL 最终混合物移液到每个孔中（24 孔板的四个孔）。在37°C孵育1小时以形成细胞 - 凝胶混合物。
- 向每个孔中的细胞 - 凝胶混合物中加入0.5mL成骨培养基（含有50μg/ mL抗坏血酸和4mM β-甘油磷酸的完全培养基，也称为成骨诱导培养基）4 ，以在37°C下开始成骨分化。 将此视为第 0 天。
- 每2天，用维持在37°C的新鲜成骨培养基替换一半的培养基。 继续培养 35 天。
4. 使用共聚焦显微镜鉴定细胞活力和细胞树突
- 细胞染色
注：钙黄绿素乙酰氧基甲酯（钙黄绿素AM）是一种细胞渗透性染料，可用于测定细胞活力。乙锭同源二聚体-I （EthD-1） 不穿过完整/活细胞的膜9。因此，钙黄绿素 AM/EthD-1 可用于鉴定细胞活力和细胞树突。- 在培养的第 1 天和第 7 天，从冰箱中取出钙黄绿素 AM 储备溶液（DMSO 中 4 mM）和 EthD-1 储备溶液（DMSO/ H2 O 1：4 [v/v] 中 2 mM），并让它们加热至室温。
注：矿化基质具有较强的自发荧光信号，因此培养后7天内无 Dmp1 表达的前骨细胞阶段4更适合观察 细胞染色。 - 将 4 μL 的 2 mM EthD-1 储备溶液和 5 μL 的 4 mM 钙黄绿素 AM 储备溶液加入 2 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （D-PBS） 中，并充分混合。这得到大约 2 μM 钙黄绿素 AM 和 4 μM EthD-1 作为工作溶液。
- 将 0.5 mL 工作溶液移液到 24 孔板中的孔中。在室温下孵育 30-45 分钟以染色细胞凝胶基质。
- 孵育后，将约 0.5 mL 新鲜 D-PBS 加入新的 35 mm 玻璃底培养皿中。盖上培养皿以防止污染或干燥样品。
- 使用肘尖镊子，小心地将步骤4.1.3中染色的细胞 - 凝胶基质转移到步骤4.1.4中的35mm培养皿中。避免损坏或剪切细胞凝胶基质。
- 在激光共聚焦荧光显微镜下观察标记的细胞。
- 在培养的第 1 天和第 7 天，从冰箱中取出钙黄绿素 AM 储备溶液（DMSO 中 4 mM）和 EthD-1 储备溶液（DMSO/ H2 O 1：4 [v/v] 中 2 mM），并让它们加热至室温。
- 显微镜扫描装置
- 将 35 毫米的培养皿放在载物台上。使用 10 倍物镜选择要通过目镜扫描的细胞凝胶基质区域。由于扩展枝晶的尺寸，不建议使用更高放大倍率的物镜。
- 选择滤光片。使用标准荧光素带通滤光片可将钙黄绿素视为绿色，使用碘化丙啶或德克萨斯红染料滤光片可将 EthD-1 视为红色。选择“线模式”进行扫描，并将“针孔”设置为 2 μm。
- 选择 8 位数据深度和 1,024 像素 x 1,024 像素的图像分辨率。
- 使用具有最佳激光和探测器设置的顺序线扫描进行图像（保持最小的激光能量以避免潜在的光漂白）。
注意：最佳检测器设置取决于最终的荧光信号。
- 收集图像的“z-stack”
- 根据绿色通道信号，通过聚焦样品，同时连续扫描，定义要扫描的细胞凝胶基质的顶部和底部位置。
- 指定样品的顶部和底部后，选择所需的扫描框。开始扫描。将使用步骤 4.2 中的选定设置从上到下扫描样品，生成图像库。
- 细胞活力鉴定。
- 从步骤 4.3 中选择一个切片。绿色和红色通道分别表示活细胞和死细胞。
- 细胞树突鉴定。
- 选择单个绿色通道，使用图像采集软件生成 3D 重建。深度信息显示为一系列彩虹伪彩色图像。位于凝胶底部的树突显示为红色，而顶部的树突显示为蓝色。
5. 使用体视显微镜识别外观
- 在培养的第1天，第7天，第21天和第35天，除去培养基，并用D-PBS洗涤板中的凝胶两次。向孔中加入0.5mL 4%（v / v）多聚甲醛的D-PBS溶液，以在室温下将细胞凝胶基质固定在板中10分钟。
- 除去孔中的多聚甲醛，并在板中用D-PBS再洗涤细胞凝胶基质两次。在每个孔中留下 0.5 mL 的 D-PBS 用于成像。
- 将板放在载物台上，并使用 0.5 倍物镜通过目镜选择最佳位置。在明场下使用“自动曝光”分别对板中细胞凝胶基质的全视野视图进行成像。
6. 使用XRF分析法识别矿物沉积
- 培养第35天，检查液氮是否充足。启动XRF系统。打开样品室，用肘尖镊子将凝胶从板转移到仪器样品台的中间。关闭样品室并等待 30 分钟，让仪器冷却后再使用。
- 将“曝光时间”设置为 35 ms，将“频谱范围”设置为 0-40 keV，将“电流”设置为 770 μA，以进行采集设置。
- 通过移动样品台选择三到五个扫描位点进行分析。
- 选择要检测的元素（Ca 和 P）。开始检测并导出结果。
注： Ca 和 P 是羟基磷灰石中最丰富的元素。
7. 鉴定功能性基因表达
- 在培养的第1天，第7天，第21天，第28天和第35天，去除培养基，并在板中用冰冷的D-PBS洗涤细胞凝胶基质两次。
- 用肘尖镊子将凝胶从板转移到 2.0 mL 管中（根据培养时间，细胞 - 凝胶基质将在第 35 天 逐渐缩小至约 0.1 mL）。确保将一块凝胶放入一个试管中。向每个试管中加入 1 mL 苯酚氯仿和两个无菌不锈钢打浆珠（4 mm，作为裂解基质）。将试管对称地放入机械打浆均质机的预冷样品槽中。
- 每 1 分钟的机械跳动将跳动频率设置为 55 Hz，振幅为 1 cm，暂停 10 秒，总共 6 个周期。开始打珠子。
- 使用苯酚 - 氯仿 - 异戊基萘酚方法从细胞 - 凝胶基质中提取总RNA。使用随机六聚体引物将 2 μg 总 RNA 逆转录为 cDNA。
- 设计靶向 β-肌动蛋白、Pdpn、Dmp1、Sost 和 Fgf23 的引物，用于实时荧光定量 PCR（表 2）。β-肌动蛋白是用于正常化的管家基因。Pdpn10 和 Dmp1 11 基因主要在前骨细胞和矿化骨细胞中表达，而 Sost12 和 Fgf23 13 主要在成熟骨细胞中表达。
- 将试管放在热循环仪上，加热盖设置为105°C，并使用以下PCR循环设置进行PCR扩增：95°C5秒，60°C30秒，持续35个循环，初始变性步骤在95°C下5分钟，最后延伸步骤在60°C下30秒。使用ΔΔCt方法分析倍数变化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
活细胞/死细胞染色后，使用共聚焦激光显微镜观察细胞。所有细胞均为钙黄绿素AM阳性（绿色），现场几乎没有EthD-1阳性细胞（红色），表明该方法制备的凝胶系统非常适合骨细胞生成（图1A，左）。为了更好地确定细胞的空间分布，选择伪彩色图像来显示凝胶不同深度的细胞树突;红色表示凝胶底部的树突，蓝色表示顶部的树突。结果表明，IDG-SW3细胞在该细胞凝胶基质中生长良好，第7天，细胞树突逐渐在成骨培养基中延伸成网络（图1A，右，图1B）。
在立体显微镜下，凝胶基质的透明度继续下降，直到在第35天变得不透明，这与无细胞凝胶基质不同（图2A）。第35天不透明凝胶的XRF光谱表明，凝胶完全充满钙和磷沉积物（图2B）。
培养第1天、第7天、第21天、第28天、第35天，实时荧光定量PCR分析多个标记基因的表达。结果显示，从第1天到第21天，Pdbn和Dmp1的mRNA水平持续升高，而Pdpn的mRNA水平在第21天后下降（图3）。Fgf23 和 Sost 的 mRNA 水平在所有阶段持续增加（图 3）。
图 1：通过共聚焦显微镜可视化的 IDG-SW3 的细胞枝晶 网络。 （A）凝胶中广泛枝晶网络部分区域的代表性图像。绿色表示活细胞和扩展的细胞树突网络。（B） A 中图像的伪彩色（右图，第 7 天）。红色（蓝色）表示位于凝胶底部（顶部）的树突。比例尺 = 200 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：成骨培养后 IDG-SW3 细胞的矿物沉积 。 （A） 在指定时间在 24 孔板中具有（顶部）和不具有（底部）细胞的凝胶的代表性全视野图像，如立体显微镜所示。（B） 第 35 天细胞凝胶基质中的钙和磷含量，通过 XRF 测定法分析。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：成骨培养后IDG-SW3细胞的功能基因表达。 在指定时间用成骨培养基培养的 IDG-SW3 细胞中功能基因的变化。缩写：D = day;W = 周。数据表示为SEM±平均值。 使用Ct方法分析折叠变化，参考 β-肌动蛋白 基因。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 二 维和 | .3D | |
| 准备困难 | 容易 | 中等 |
| 养分梯度 | 缺席 | 目前 |
| 胶原蛋白的排列 | 单层 | 多轴离散 |
| ECM的机械刚度 | 高 | 低 |
| ECM的机械范围 | 单方面 | 环绕 |
| 细胞运动 | 平面 | 自由 |
| 细胞间通讯 | 不足 | 足够 |
表 1：IDG-SW3 细胞的 2D 和 3D 培养系统之间的比较。
| 名字 | 序列 （5'- 3'） |
| Pdpn-用于 | GGAGGGCTTAATGAATCTACTGG |
| Pdpn-rev | GGTTGTACTCTCGTGTTCTCTG |
| DMP1-用于 | CCCAGTTGCCAGATACCAC |
| DMP1-转速 | CACTATTTGCCTGTCCCTCTG |
| 索斯特-福 | ACAACCAGACCATGAACCG |
| Sost-rev | CAGGAAGCGGGTGTAGTG |
| FGF23-用于 | GGTGATAACAGGAGCCATGAC |
| FGF23-转速 | TGCTTCTGCGACAAGTAGAC |
| β-肌动蛋白 | ACCTTCTACAATGAGCTGCG |
| β-肌动蛋白转速 | CTGGATGGCTACGTACATGG |
表2：实时荧光定量PCR检测中使用的引物。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议的一个关键点是步骤1和步骤2必须在冰上进行，以防止自发凝血。在该方法中，胶原蛋白I的最终浓度为1.2 mg/mL。因此，应计算出最佳的 ddH2O 体积，以匹配来自不同制造商的不同胶原蛋白。
在体内，成骨细胞涉及成骨细胞从小梁骨表面到内部的极性运动14。该协议使细胞免于在没有定向极性的基质中生长。当然，在无细胞凝胶基质表面接种IDG-SW3细胞是可选的。然而，该协议中提供的胶原蛋白浓度不足以形成理论上用于成骨细胞浸润的平坦表面。为此，应测试不同比例的I型胶原蛋白和细胞外基质。
与类骨质相比，这种凝胶的硬度远远不够。一些文章报道通过添加几种化学材料来更好地模拟体内类骨质的硬度来增加凝胶的强度6,15。这种方法的优点是，形成的凝胶可以提供具有良好透明度的培养基，用于原位成像和示踪细胞，而不是使用组织学方法15。然而，在满足材料成像透明度的同时，还难以保证体外理化性质可以模拟类骨质。因此，需要探索更多的文化模型来解决任何特定的科学问题。
此外，该 IDG-SW3 矿化凝胶的理化性质，包括流变特性，已在先前的研究16 中介绍。因此，通过这种方法形成的这种生物矿化凝胶可以用作未来骨科研究的生物医学材料。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Lynda F. Bonewald 博士赠送 IDG-SW3 细胞系。这项工作得到了国家自然科学基金（82070902、82100935和81700778）和上海市“科技创新”扬帆工程（21YF1442000）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
References
- Bonewald, L. F.
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell ... and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- Bonewald, L. F. The role of the osteocyte in bone and nonbone disease. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Wang, J. S., et al. Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin. Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).
- Chicatun, F., et al. Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels. Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).
- Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Papadopoulos, N. G., et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).
- Staines, K. A., et al. Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Winkler, D. G., et al. Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).
- Riminucci, M., et al. FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting. Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).
- Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
- Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).
