Summary
ここでは、IDG-SW3細胞を3次元(3D)細胞外マトリックスで培養するためのプロトコルを紹介します。
Abstract
骨細胞は、骨芽細胞から末端分化している非増殖性細胞であると考えられています。骨細胞外マトリックス(骨骨)に埋め込まれた骨芽細胞は、 Pdpn 遺伝子を発現して細胞樹状突起を形成し、骨前細胞に変化します。その後、骨前細胞は Dmp1 遺伝子を発現してマトリックスの石灰化を促進し、それによって成熟した骨細胞に変化します。このプロセスは骨細胞形成と呼ばれます。IDG-SW3は、骨細胞形成の in vitro 研究でよく知られている細胞株です。以前の多くの方法では、コラーゲンIを培養マトリックスの主成分または唯一の成分として使用していました。しかし、オステオイドには、コラーゲンIに加えて、細胞の成長、接着、移動を促進する重要な成分である粉砕物質も含まれています。さらに、マトリックス物質は透明であるため、I型コラーゲンゲルの透明性が高まり、イメージング技術による樹状突起形成の探索に役立ちます。したがって、この論文では、IDG-SW3の生存のためにコラーゲンIとともに細胞外マトリックスを使用して3Dゲルを確立するためのプロトコルを詳述します。この研究では、骨細胞形成中の樹状突起の形成と遺伝子発現を分析しました。7日間の骨形成培養後、蛍光共焦点顕微鏡下で広範囲の樹状突起ネットワークが明瞭に観察されました。リアルタイムPCRでは、 Pdpn と Dmp1 のmRNAレベルが3週間連続的に上昇していることが示されました。4週目に、実体顕微鏡で鉱物粒子を充填した不透明なゲルが発見され、蛍光X線(XRF)アッセイと一致しました。これらの結果は、この培養マトリックスが骨芽細胞から成熟骨細胞への移行をうまく促進することを示しています。
Introduction
骨細胞は、骨芽細胞に由来する末端分化細胞である1,2。骨芽細胞は、骨骨に埋もれると骨細胞形成を行い、骨前細胞を形成するPdpn遺伝子、骨を石灰化するDmp1遺伝子、骨組織において成熟骨細胞として機能するSost遺伝子とFgf23遺伝子を発現する3。ここでは、骨細胞形成プロセスにおける樹状突起の伸長とマーカー遺伝子発現を同定するために、3D培養システムを導入します。
IDG-SW3細胞は、トランスジェニックマウスに由来する不死化初代細胞株であり、異なる培地で培養すると、骨芽細胞を増殖または複製して骨細胞分化を遅らせることができます4。MLO-A5、MLO-Y4、および他の細胞株と比較して、IDG-SW3細胞における機能性タンパク質の発現プロファイル、カルシウム塩沈着を行う能力、および各種ホルモンに対する応答は、骨組織における初代骨細胞のそれと同じである可能性が高い4。
2Dシステムと比較して、3D培養システムは、栄養素の勾配、低い機械的剛性、周囲の機械的範囲など、in vivoの細胞増殖環境を模倣する能力が高くなります(表1)。3Dシステムで骨芽細胞を培養する以前の方法のほとんどは、コラーゲンI線維がカルシウムおよびリンの沈着部位として機能するため、製剤4,5,6の固有の成分としてコラーゲンIを使用していました。しかし、骨骨に不可欠な構成要素である細胞外マトリックスには、細胞の成長、接着、遊走を促進する細胞因子が多数含まれており7,8、透明で画像観察に便利です。従って、このプロトコルはosteocytogenesisの調査のための二次部品としてMatrigel (以下基底の膜のマトリックスと言われる)を使用する。
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Protocol
このプロトコルは、24ウェルプレートの4ウェルで細胞を培養するのに適しています。複数のサンプルまたはプレートを調製する場合は、それに応じて試薬の量を増やす必要があります。
1.コラーゲンI混合物の調製
注:コラーゲンIと基底膜マトリックスは室温で迅速にゲル化します。したがって、コラーゲンは氷上(2°C〜8°C)で取り扱う必要があります。使用するすべてのチップとチューブは、特に明記されていない限り、予冷する必要があります。すべての手順は安全フードで実行する必要があります。
- すべての試薬と遠心分離管を氷の上に置きます。
- 0.48 mL のコラーゲン I (5 mg/mL) と 0.1 mL の 10 倍ミニマム必須培地 (MEM) (フェノールレッドを含む) を、氷上に保管した滅菌済みの 15 mL 遠心チューブにゆっくりとピペットで移します。ピペッティングで静かに上下させてよく混ぜます。
- フェノールレッドインジケーターのカラーパレットに従って、適切な容量の7.5%(w / v)NaHCO3 (約0.2 mL)を使用して、フェノールレッドインジケーターをオレンジに調整し、pH値が7.0〜7.4の範囲にあることを示します。
注:培地のpHに応じて、pHを約7.0〜7.4にするためにNaHCO3 の量が使用されます。さらに、NaOHはpH中和に使用されます。 - 適切な量のddH2Oを添加して、混合物の最終容量を1 mLまで上げます。
注:ddH2Oの最終容量は、ステップ3で使用したNaHCO1.3またはNaOHの量によって異なります。
2. 細胞-マトリックス混合物の調製
- 0.9 mL の基底メンブレンマトリックスを、氷上の新しい 15 mL 遠心チューブにゆっくりとピペットで移します。
- IDG-SW3細胞を、4 mLの完全培地(10%ウシ胎児血清[FBS]を含むα-MEM)と50 U/mLのINF-γを添加したT25フラスコで33°Cで培養します。
- IDG-SW3細胞のコンフルエント度が90%に達したら、培地を除去し、ピペットでリン酸緩衝生理食塩水(PBS、プロトコル全体でpH 7.4)で細胞を洗浄します。0.5 mLの0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)で37°Cで30秒間細胞を消化します。
- 3.5 mLの完全な培地(10%ウシ胎児血清[FBS]を含むα-MEM)を添加してトリプシンを不活性化します。4 mLの細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移します。
- 細胞懸濁液を300 × g で4°Cで5分間スピンダウンします。 上清を廃棄し、細胞ペレットを1 mLの完全培地に氷上に再懸濁します。
- 血球計算盤を使用して細胞をカウントし、完全な培地での最終細胞密度を4〜10×5 細胞/ mLに調整します。調製した細胞懸濁液0.1 mLを、ステップ2.1の細胞外マトリックス0.9 mLに加えます。ピペッティングで静かに上下に動かしてよく混ぜます。
注:無細胞コントロールが必要な場合は、ネガティブコントロールとして、0.1 mLの完全培地を0.9 mLの細胞外マトリックスに加えます。
3. 細胞とゲルの混合物をプレーティングする
- ステップ2.6とステップ1.4の2つの混合物を、氷上でピペッティングして2 mLに穏やかに混合します。最終混合物 0.5 mL を各ウェル(24 ウェルプレートの 4 ウェル)にピペットで移します。37°Cで1時間インキュベートし、細胞-ゲル混合物を形成します。
- 0.5 mLの骨形成培地(50 μg/mLのアスコルビン酸と4 mMのβ-グリセロリン酸を含む完全培地、別名骨形成誘導培地)4 を各ウェルの細胞-ゲル混合物に添加し、37°Cで骨形成分化を開始します。 これを 0 日目と考えます。
- 2日ごとに、培地の半分を37°Cに維持された新鮮な骨形成培地と交換します。 35日間培養を続けます。
4. 共焦点顕微鏡を用いた細胞生存率と細胞樹状突起の同定
- 細胞染色
注:カルセインアセトキシメチルエステル(カルセインAM)は、細胞生存率の測定に使用できる細胞透過性色素です。エチジウムホモ二量体-I(EthD-1)は、無傷/生存細胞の膜を通過しません9。したがって、カルセインAM/EthD-1は、細胞生存率および細胞樹状突起の同定に使用できます。- 培養の1日目と7日目に、カルセインAMストック溶液(DMSO中4 mM)およびEthD-1ストック溶液(DMSO/H 2 O 1:4 [v/v]中2mM)を冷凍庫から取り出し、室温まで温めます。
注:石灰化マトリックスは強い自家蛍光シグナルを有するため、培養後7日以内に Dmp1 発現のない骨前細胞段階4 は、細胞染色の観察により適している。 - 2 mM EthD-1 原液 4 μL と 4 mM カルセイン AM 原液 5 μL を 2 mL のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)に加え、よく混合します。これにより、約 2 μM のカルセイン AM と 4 μM の EthD-1 がワーキング溶液として得られます。
- 0.5 mLの作業溶液を24ウェルプレートのウェルにピペットで移します。室温で30〜45分間インキュベートして、細胞ゲルマトリックスを染色します。
- インキュベーション後、約0.5 mLの新鮮なD-PBSを新しい35 mmガラス底培養皿に加えます。サンプルの汚染や乾燥を防ぐために、皿を覆います。
- 先端に肘を付けた鉗子を使用して、ステップ4.1.3で染色した細胞ゲルマトリックスをステップ4.1.4の35 mm培養皿に慎重に移します。細胞ゲルマトリックスを傷つけたり、せん断したりしないでください。
- レーザー共焦点蛍光顕微鏡で標識された細胞を観察します。
- 培養の1日目と7日目に、カルセインAMストック溶液(DMSO中4 mM)およびEthD-1ストック溶液(DMSO/H 2 O 1:4 [v/v]中2mM)を冷凍庫から取り出し、室温まで温めます。
- 顕微鏡スキャニングセット
- 35mmのディッシュをステージに置きます。10倍の対物レンズを使用して接眼レンズを通してスキャンする細胞ゲルマトリックスの領域を選択します。高倍率の対物レンズは、拡張樹状突起のサイズのため推奨されません。
- 光学フィルターを選択します。カルセインは、標準的なフルオレセインバンドパスフィルターでは緑色に、EthD-1はヨウ化プロピジウムまたはテキサスレッド色素のフィルターで赤色に表示できます。スキャンする「ラインモード」を選択し、「ピンホール」を2μmに設定します。
- データ深度は8ビット、画像解像度は1,024ピクセル×1,024ピクセルを選択します。
- 最適なレーザーと検出器の設定によるシーケンシャルラインスキャンを使用した画像化(潜在的な光退色を避けるために、レーザーエネルギーを最小限に抑えてください)。
注:最適な検出器設定は、最終的な蛍光シグナルによって異なります。
- 画像の「zスタック」の収集
- グリーンチャンネル信号に従って、連続的にスキャンしながらサンプルに焦点を合わせることにより、スキャンする細胞-ゲルマトリックスの上部と下部の位置を定義します。
- サンプルの上部と下部を指定したら、目的のスキャンフレームを選択します。スキャンを開始します。サンプルは、手順4.2で選択した設定で上から下にスキャンされ、画像のギャラリーが生成されます。
- 細胞生存率の同定。
- 手順 4.3 のスライスを 1 つ選択します。緑と赤のチャンネルは、それぞれ生細胞と死細胞を示します。
- 細胞樹状突起の同定。
- 単一の緑チャンネルを選択して、画像取得ソフトウェアで3D再構成を生成します。深度情報は、一連の虹色の疑似カラー画像として表示されます。ゲルの下部にある樹状突起は赤で表示され、上部の樹状突起は青で表示されます。
5. 実体顕微鏡による外観の識別
- 培養1日目、7日目、21日目、35日目に、培養培地を除去し、プレート内のゲルをD-PBSで2回洗浄する。0.5 mL の 4% (v/v) パラホルムアルデヒド D-PBS をウェルに添加し、細胞ゲルマトリックスをプレートに室温で 10 分間固定します。
- ウェル内のパラホルムアルデヒドを除去し、プレート内のD-PBSで細胞ゲルマトリックスをさらに2回洗浄します。イメージング用に各ウェルに 0.5 mL の D-PBS を残します。
- プレートをステージに置き、0.5倍の対物レンズを使用して接眼レンズを通して最適な位置を選択します。明視野下での「自動露光」を使用して、プレート内の細胞-ゲルマトリックスの全視野図を個別に画像化します。
6. XRFアッセイによる鉱物沈着の同定
- 培養35日目に、液体窒素が十分か確認する。XRF システムを始動します。サンプルルームを開き、肘の先端に鉗子を付けたゲルをプレートから装置のサンプルステージの中央に移します。サンプルルームを閉じ、30分間待ってから装置を冷ましてから使用してください。
- 「露光時間」を35ms、「スペクトル範囲」を0-40keV、「電流」を770μAに設定して取得します。
- サンプルステージを移動して、分析するスキャンサイトを3〜5つ選択します。
- 検出する要素(Ca と P)を選択します。検出を開始し、結果をエクスポートします。
注: Ca と P は、ハイドロキシアパタイトに最も豊富な元素です。
7. 機能的遺伝子発現の同定
- 培養の1日目、7日目、21日目、28日目、および35日目に、培養培地を除去し、プレート内の氷冷D-PBSで細胞ゲルマトリックスを2回洗浄します。
- 肘先端鉗子でゲルをプレートから2.0 mLチューブに移します(培養時間に応じて、細胞ゲルマトリックスは35日目に約0.1 mLまで 徐々に収縮します)。1つのチューブに1つのゲルが入っていることを確認してください。1 mL のフェノールクロロホルムと 2 つの滅菌ステンレス製ビーズ (溶解マトリックスとして 4 mm) を各チューブに加えます。チューブを機械式ビートホモジナイザーの予冷サンプルスロットに対称的に配置します。
- 10秒間の休止を挟んで、機械的に叩くごとに55Hzの周波数と1cmの振幅に設定し、合計6サイクル行います。ビーズビートを開始します。
- フェノール-クロロホルム-イソアミルアチョホール法を用いて、細胞ゲルマトリックスからトータルRNAを抽出します。2 μgのトータルRNAをランダム六量体プライマーでcDNAに逆転写します。
- リアルタイムPCR用のβ-アクチン、Pdpn、Dmp1、Sost、およびFgf23をターゲットとするプライマーを設計します(表2)。β-アクチンは、正常化に使用されるハウスキーピング遺伝子です。Pdpn10 および Dmp1 11 遺伝子は、主に前骨細胞および石灰化骨細胞で発現する一方、Sost12 および Fgf23 13 は、主に成熟骨細胞で発現する。
- 加熱蓋を105°Cに設定したサーモサイクラーにチューブを置き、95°Cで5秒、60°Cで30秒、35サイクル、95°Cで5分間の初期変性ステップ、60°Cで30秒間の最終伸長ステップを使用してPCR増幅を行います。ΔΔCt法で倍率変化を解析します。
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Representative Results
生細胞/死細胞染色後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞を可視化した。すべての細胞がカルセインAM陽性(緑色)であり、圃場にはEthD-1陽性細胞(赤色)がほとんど存在せず、この方法で作製されたゲル系が骨細胞形成に非常に適していることが示されました(図1A、左)。細胞の空間分布をより適切に決定するために、ゲルのさまざまな深さで細胞樹状突起を表示するために疑似カラー画像を選択しました。赤はゲルの底部の樹状突起を示し、青は上部の樹状突起を示します。その結果、IDG-SW3細胞はこの細胞ゲルマトリックスで良好に増殖し、細胞樹状突起は7日目に骨形成培地中のネットワークに徐々に拡張したことが示されました(図1A、右、および図1B)。
実体顕微鏡下では、ゲルマトリックスの透明度は低下し続け、無細胞ゲルマトリックスとは異なり、35日目に不透明になりました(図2A)。35日目の不透明ゲルのXRFスペクトルは、ゲルがカルシウムとリンの沈着物で完全に満たされていることを示しました(図2B)。
培養の1日目、7日目、21日目、28日目、および35日目に、いくつかのマーカー遺伝子の発現をリアルタイムPCRで分析しました。その結果、PdpnとDmp1のmRNAレベルは1日目から21日目まで継続的に上昇し、PdpnのmRNAレベルは21日目以降に低下することが示されました(図3)。Fgf23とSostのmRNAレベルは、すべての段階で継続的に増加しました(図3)。
図1:共焦点顕微鏡で可視化したIDG-SW3の細胞樹状突起ネットワーク 。 (A)ゲル中の広範な樹状突起ネットワークの部分領域の代表的な画像。緑色は、生細胞と拡張された細胞樹状突起ネットワークを示します。(B) A の画像の疑似カラー(右、7日目)。赤(青)色は、ゲルの底(上部)に位置する樹状突起を示します。スケールバー = 200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:骨形成培養後のIDG-SW3細胞のミネラル沈着 。 (A)24ウェルプレート中の細胞あり(上)となし(下)のゲルを実体顕微鏡で可視化した代表的なフルフィールド画像。(B)XRFアッセイで分析した、35日目の細胞ゲルマトリックス中のカルシウムおよびリン含有量。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:骨形成培養後のIDG-SW3細胞の機能的遺伝子発現。 指示された時間に骨形成培地で培養したIDG-SW3細胞の機能遺伝子の変化。略語:D =日;W = 週。データはSEM±平均値として表されます。 フォールドの変化は、 β-アクチン 遺伝子を参照しながら、Ct法で解析しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 2Dの | .3D | |
| 準備の難しさ | 易しい | 中程度 |
| 栄養素の勾配 | 欠席する | プレゼント |
| コラーゲンの配置 | 単層 | 多軸ディスクリート |
| ECMの力学剛性 | 高い | 低い |
| ECMの機械的範囲 | 片側 | 取り囲む |
| 細胞の運動性 | 平面 | 無料 |
| 細胞間コミュニケーション | 不十分 | 足りる |
表1:IDG-SW3細胞の2D培養システムと3D培養システムの比較。
| 名 | シーケンス (5'-3') |
| Pdpn-for | GGAGGGCTTAATGAATCTACTGG |
| Pdpn-rev (英語) | GGTTGTACTCTCTCTGTGTTCTCTG |
| dmp1-for | CCCAGTTGCカガタッカ |
| DMP1 - REVの | CACTATTTGCCTGTCCCTCTG |
| ソストフォー | ACAACCAGACCATGAACCG |
| Sost-rev (ソストレブ) | CAGGAAGCGGGTGTAGTG |
| Fgf23-for(英語) | GGTGATAACAGGAGCcatgac |
| FGF23-REVシリーズ | TGCTTCTGCGACAAGTAGAC |
| β-アクチン-フォア | ACCTTCTACAATGAGCTGCG |
| β-アクチン-レブ | CTGGATGGCTACGTACATGG |
表2:リアルタイムPCRアッセイで使用したプライマー。
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Discussion
このプロトコルの重要な点は、自然凝固を防ぐために、ステップ1とステップ2を氷上で実行する必要があることです。この方法では、コラーゲンIの最終濃度は1.2mg/mLであった。したがって、最適なddH2O体積は、さまざまなメーカーのさまざまなコラーゲンと一致するように計算する必要があります。
生体内では、骨細胞形成は、骨芽細胞の表面から海綿骨の内部への極性移動を伴う14。このプロトコルは方向極性なしでマトリックスの成長からセルを解放する。もちろん、IDG-SW3細胞を無細胞ゲルマトリックス表面に播種することはオプションです。但し、このプロトコルで提供されるコラーゲンの集中はosteoblastの浸潤のための理論的に平らな表面を形作るには十分ではない。この目的のために、コラーゲンIと細胞外マトリックスの異なる比率をテストする必要があります。
骨骨のそれと比較すると、このゲルの剛性は十分とはほど遠いです。いくつかの論文では、in vivoでオステオイドの剛性をよりよく模倣するために、いくつかの化学物質を添加することによりゲルの強度を高めることが報告されています6,15。この方法の利点は、形成されたゲルが、組織学的方法を使用するのではなく、in situで細胞をイメージングおよび追跡するための良好な透明性を有する培地を提供できることである15。それにもかかわらず、in vitroの物理的および化学的特性がオステオイドを模倣できることを保証しながら、イメージング用の材料の透明性を満たすことは困難です。したがって、特定の科学的疑問に対処するために、より多くの培養モデルを探求する必要があります。
さらに、レオロジー特性を含むこのIDG-SW3鉱化ゲルの物理化学的特性は、以前の研究16で紹介されました。したがって、この方法によって形成された生体石灰化ゲルは、将来の整形外科研究のための生物医学材料として有用である可能性があります。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
IDG-SW3細胞株を寄贈してくださったLynda F. Bonewald博士に感謝します。この研究は、中国国家自然科学基金会(82070902、82100935、81700778)と上海「科学技術革新」セーリングプロジェクト(21YF1442000)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
References
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