Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة تطعيم الشتلات القوية التي لا تتطلب خبرة أو تدريبا مسبقا ويمكن تنفيذها بتكلفة منخفضة للغاية باستخدام مواد يسهل الوصول إليها في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية.
Abstract
أصبح تطعيم الشتلات في المراحل المبكرة أداة شائعة في علم الوراثة الجزيئية لدراسة علاقات الجذور داخل النباتات. يعد تطعيم شتلات المرحلة المبكرة من النبات النموذجي الصغير ، Arabidopsis thaliana ، تحديا تقنيا ويستغرق وقتا طويلا بسبب حجم وهشاشة شتلاته. تصف مجموعة متزايدة من الأساليب المنشورة هذه التقنية بمعدلات نجاح متفاوتة وصعوبة وتكاليف مرتبطة بها. تصف هذه الورقة إجراء بسيطا لصنع جهاز تطعيم داخلي قابل لإعادة الاستخدام باستخدام مزيج المطاط الصناعي السيليكوني ، وكيفية استخدام هذا الجهاز لتطعيم الشتلات. في وقت هذا المنشور ، كان كل جهاز تطعيم قابل لإعادة الاستخدام يكلف 0.47 دولارا فقط من المواد الاستهلاكية لإنتاجه. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمبتدئين الحصول على أول شتلة مطعمة بنجاح في أقل من 3 أسابيع من البداية إلى النهاية. سيسمح هذا الإجراء الذي يمكن الوصول إليه بشكل كبير لمختبرات علم الوراثة الجزيئية النباتية بإنشاء تطعيم الشتلات كجزء طبيعي من عمليتها التجريبية. نظرا للتحكم الكامل الذي يتمتع به المستخدمون في إنشاء وتصميم أجهزة التطعيم هذه ، يمكن تعديل هذه التقنية بسهولة للاستخدام في النباتات الكبيرة ، مثل الطماطم أو التبغ ، إذا رغبت في ذلك.
Introduction
التطعيم هو تقنية بستانية قديمة أصبحت ممارسة زراعية راسخة بحلول عام 500 قبل الميلاد1. كان تطعيم أنواع مختلفة من نباتات المحاصيل لتحسين الغلة أول استخدام لهذه التقنية ، ولا يزال يستخدم لهذا الغرض اليوم. في العقد الماضي ، اجتذب التطعيم قدرا متزايدا من الاهتمام كأداة لعلماء الأحياء الجزيئية لدراسة الإشارات بعيدة المدى في النباتات2،3،4،5. في حين أن تطعيم النباتات البالغة أمر سهل نسبيا ، فإن تطعيم النباتات بعد فترة وجيزة من الإنبات يمثل تحديا. على الرغم من ذلك ، يلزم أحيانا تقييم آثار الإشارات بعيدة المدى في عمليات مثل تطوير النبات ، والاستجابات البيئية ، والإزهار6،7،8.
تم تأسيس Arabidopsis thaliana ككائن نموذجي في بيولوجيا النبات لأسباب عديدة ، بما في ذلك صغر حجمه نسبيا ، مما يجعل من السهل نموه داخل المختبر. ومع ذلك ، فإن صغر حجم وهشاشة شتلات Arabidopsis يجعل تطعيم الشتلات الصغيرة أمرا صعبا للغاية. في كثير من الحالات ، يلزم تدريب عملي مكثف للحصول على ترقيع الشتلات بنجاح. كانت هناك العديد من التحسينات المنهجية على مر السنين التي حددت ظروف النمو المثالية والتقنيات الجديدة لزيادة معدل نجاح تطعيم الشتلات9،10،11. كانت أحدث أداة تم تقديمها هي رقاقة تطعيم الشتلات Arabidopsis ، والتي تسمح حتى للمستخدمين عديمي الخبرة بتحقيق مستويات مقبولة من نجاح التطعيم12. في حين أن هذا التقدم قد قلل بشكل كبير من الحاجز التقني لتطعيم الشتلات ، فإن جهاز الرقاقة مكلف ، وسرعان ما يصبح عدد الطعوم التي يمكن إجراؤها بالتوازي باهظ التكلفة.
بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن استخدام هذا الجهاز إلا لشتلات Arabidopsis التي لها أبعاد hypocotyl التي تشبه الشتلات البرية. في حين أن Arabidopsis هو النوع الرئيسي في عالم علم الوراثة الجزيئية النباتية ، فقد تم القيام بعمل حديث في أنواع أخرى باستخدام تطعيم الشتلات. ومن الأمثلة على ذلك تطعيم فول الصويا والفاصوليا الشائعة ، والتبغ إلى الطماطم ، والكانولا إلى أرابيدوبسيس ، وبعد ذلك أخذ عينات من كلا الأنسجة للحمض النووي الريبي الصغير13،14. لذلك ، فإن طريقة التطعيم التي يمكن الوصول إليها من قبل معظم المختبرات ويمكن تكييفها بسهولة مع مجموعة واسعة من الأنواع النباتية دون أي تغييرات تقنية كبيرة أمر مرغوب فيه للغاية.
يفصل هذا البروتوكول طريقة تستخدم الإنتاج الداخلي لجهاز تطعيم بسيط يسمح بالتخصيص الكامل لقطر قناة التطعيم وطولها لاستيعاب أي مورفولوجيا للشتلات عبر معظم الأنواع النباتية. إن إنتاج هذه الأجهزة ميسور التكلفة للغاية وقابل للتطوير بدرجة كبيرة ، حيث أن المكونات الوحيدة المطلوبة هي المطاط الصناعي السيليكوني ، والأسلاك أو الأنابيب بالحجم الصحيح ، وشفرة عالية الدقة ، وحاوية لتكون بمثابة قالب. باتباع بروتوكول التطعيم المفصل هنا ، يمكن للمستخدمين تحقيق معدلات تطعيم ناجحة تبلغ 45٪ (ن = 105) ، مقارنة بنتائج التطعيم المبلغ عنها سابقا10,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الجهاز
- اصنع جهاز تطعيم السيليكون عن طريق صب محلول المطاط الصناعي السيليكوني في طبق بتري مربع (100 مم × 100 مم). تحضير 15 مل من محلول المطاط الصناعي ، باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: تشتمل مجموعات المطاط الصناعي السيليكوني عادة على سائل قائم على السيليكون وعامل معالجة ، والذي عند مزجه معا يسمح للسيليكون بالتصلب. - تحضير طبق بتري مربع عن طريق وضع أربع قطع مستقيمة من سلك 29 G في طبق بتري مربع ، على مسافة متساوية من بعضها البعض (الشكل 1A). تأكد من أن السلك يتدفق مع الجزء السفلي من القالب. لتصويب السلك بالكامل ، لفه على سطح موحد صلب بجسم ثقيل ومسطح (على سبيل المثال ، رف أنبوب معدني).
ملاحظة: غالبا ما تحتوي الروابط الملتوية على سلك 29 G ويمكن استخدامها بعد إزالة طلاء الورق الخارجي بالأسيتون. - يسكب محلول المطاط الصناعي السيليكوني المختلط فوق الأسلاك ويغطى بالجزء العلوي من طبق بتري. اترك السيليكون يعالج لمدة 24-48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة ورقة السيليكون من طبق بتري باستخدام ملقط نظيف وانتقل إلى سطح مستو نظيف.
- قم بإزالة الأسلاك من ورقة السيليكون. قم بإزالة الطبقة الرقيقة من السيليكون المتبقية على السطح الخارجي للقناة باستخدام ملقط نقطي رفيع ، للسماح للقناة بالانفتاح على جانب واحد (الشكل 1 أ).
- قطع ورقة السيليكون بشكل عمودي على القنوات إلى شرائح 3 مم باستخدام مقص نظيف. انقل كل شريط إلى مظروف من رقائق الألومنيوم وختمه بشريط الأوتوكلاف.
- الأوتوكلاف على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل وتخزينها حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
2. إعداد الشتلات
- تعقيم البذور وتبرئها.
- ما يصل إلى 100 بذرة أرابيدوبسيس في 1 مل من محلول التبييض 50٪ يحتوي على 0.1٪ توين 20 في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، واحتضانه لمدة 5-10 دقائق. قم بإزالة محلول التبييض من خلال السحب أو الشفط في ظروف معقمة. شطف البذور مع 1 مل من dH2O. تأكد من عكس الأنابيب لشطف البذور بشكل كاف وإزالة أي محلول مبيض متبقي في الجزء العلوي من الأنبوب. كرر الشطف 4x.
- اترك حوالي 0.25 مل من الماء في الأنابيب مع البذور واحفظه في 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام في الظلام.
- طبق البذور استعدادا للتطعيم.
- قم بإعداد لوحة أجار MS بنسبة 1٪ على النحو التالي: ل 1 لتر من الوسط الصلب MS (0.5٪ سكروز) ، امزج 4.4 جم من ملح MS ، و 5 جم من السكروز ، و 10 جم من أجار في 800 مل من الماء ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 5.7 باستخدام KOH ، ثم ارفع الحجم الإجمالي إلى 1 لتر مع ماء إضافي. الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل صب ~ 25 مل في أطباق بتري المربعة.
- في ظل ظروف معقمة ، انقل العدد المناسب من البذور المحضرة إلى الطبق ، باستخدام طرف ماصة سعة 20 ميكرولتر لشفط البذور ونقلها.
- ضع شريطا معقما على سطح اللوحة لتوجيه وضع البذور ، بحيث يتم محاذاة البذور مع القنوات الموجودة على الشريط. قم بإزالة الشريط بمجرد طلاء البذور.
ملاحظة: يمكن أن تستوعب صفيحة مربعة واحدة مقاس 100 مم × 100 مم صفين من الشتلات (الشكل 1 ب). - بمجرد أن تقف الألواح ، اترك السائل يتبخر من الوسط الصلب وتجمع في أسفل اللوحة. بعد وضع البذور على الطبق ، ضع على غطاء اللوحة وأغلق جانبا واحدا من اللوحة الموازية لصفي البذور (المشار إليه بالمنطقة المميزة باللون الأزرق في الشكل 1 ب) باستخدام parafilm. لف الشريط القابل للتنفس أعلى البارافيلم وحول جميع الحواف الأخرى للوحة.
- قف بعناية لوحين مع توجيه الجانب المختوم للبارافيلم لأسفل. افصل اللوحين في الأسفل عن طريق وضع أنبوب طرد مركزي أفقي سعة 15 مل بينهما وآمن بشريط مطاطي. تأكد من أن أسطح الألواح تشكل زاوية 100 درجة -110 درجة مع سطح الطاولة (الشكل 1C).
- قم بتخزين الألواح في هذا الاتجاه لمدة 72 ساعة في ظلام دامس عند 21 درجة مئوية ، للسماح ل hypocotyls الشتلات بالنمو ~ 5 مم في الطول. بعد 72 ساعة ، قم بإزالة الألواح من الظلام وتنمو تحت ضوء 16 ساعة (شدة 100 μE m-2 sec-1) ودورات مظلمة لمدة 8 ساعات لمدة 2-4 أيام أخرى في نفس درجة الحرارة قبل التطعيم.
- تطعيم الشتلات بين 5 و 7 أيام بعد طلائها. ضع شريط تطعيم فوق الشتلات ، وقم بتركيب hypocotyls في القنوات. ضع الشتلات برفق بحيث يتم وضع تقاطع الجذر hypocotyl في الجزء السفلي من شريط السيليكون لتحضير الشتلات للقطع (الشكل 1 د).
3. إجراء التطعيم
- قم بإعداد بيئة عمل معقمة عن طريق تعقيم منظار التشريح بنسبة 70٪ من الإيثانول والتعقيم بزوجين من الملقط ذي الرؤوس الدقيقة ومقبض مشرط. قم بإجراء جميع إجراءات التطعيم في غطاء معقم وبمساعدة منظار تشريح حسب الحاجة. قم بإجراء معظم التطعيم باستخدام تكبير 10.5x.
- تحضير السليل. استخدم شفرة مشرط جديدة لقطع hypocotyl بشكل عمودي لإنشاء قطع نظيف مستقيم. ادفع الشفرة للأمام بدلا من الضغط لأسفل في النبات لمنع دفع الشتلات إلى الآجار (فيديو 1).
- قم بإزالة اللقطة. احرص على الحفاظ على رطوبة الجزء المقطوع من اللقطة من خلال ضمان ملامسة سطح الوسائط. بدلا من ذلك ، انقل اللقطة إلى منطقة احتجاز مخصصة ، مثل الجزء العلوي من طبق بتري مملوء ب dH2O المعقم ، حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
- تحضير الجذر. اسحب الجذر برفق عن طريق التقاط الجذر في الفراغ المتبقي بين الملقط المغلق وقلبه ، مع ترك الجزء المقطوع من الجذور في منتصف الشريط (الفيديو 2).
ملاحظة: سوف يتضرر الجذر الهش إذا تم سحقه بين الملقط المغلق مباشرة ، مما يستلزم ربط الجذر في الزاوية الحادة لنهايات الملقط لمعالجة الأنسجة. - التقط اللقطة المطلوبة برفق باستخدام الملقط ذي الرؤوس الدقيقة وأدخله في الجزء العلوي من القناة.
ملاحظة: من الأهمية بمكان تأكيد الاتصال بصريا بين السليل والجذور للحصول على طعم ناجح (فيديو 3). - بعد إجراء جميع الطعوم ، لف الألواح بشريط بارافيلم وشريط تنفس وقم بإعداد الألواح بنفس الطريقة كما كان من قبل ، دون إزعاج الشتلات أو شرائط السيليكون. انقل الألواح بعناية إلى غرفة نمو مضبوطة على 26 درجة مئوية مع دورات إضاءة 16 ساعة / 8 ساعات مظلمة.
- تقييم الشتلات المطعمة تحت ظروف معقمة بعد 7-10 أيام. قم بإزالة شريط السيليكون بعناية باستخدام الملقط عن طريق تقشير جانب واحد ، مما يسمح للقنوات بتحرير الشتلات. قم بإزالة أي جذور عرضية تنمو من السليل عن طريق قطعها من السليل بشفرة مشرط جديدة أو سحقها باستخدام ملقط رفيع الرأس. قم بتقييم بصريا ما إذا كان الجذر قد أصبح مرتبطا بقوة بالسليل لتشكيل طعم ناجح (الشكل 2).
- انقل الطعوم الناجحة إلى تربة تكاثر الشتلات لتنمو طالما لزم الأمر. قم بتغطية التربة بالبلاستيك الشفاف لبضعة أيام عند إنشاء الشتلات. بعد نقل النباتات إلى التربة ، تنمو تحت دورات الضوء والظلام المذكورة سابقا عند 21 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم اختبار جوانب مختلفة من تصميم شريط التطعيم لتحديد ظروف التطعيم المثلى التي تتطلب أقل قدر من المهارة الفنية (الجدول 1). تم الانتهاء من جميع تجارب التطعيم على وسط السكروز MS بنسبة 0.5٪ ، والذي تم الإبلاغ عنه سابقا ليكون وسط تطعيم مثالي11,12.
لا يمكن تحقيق النمو الأمثل للشتلات من خلال الإنبات على الشريط
في التكرار الأول لشريط السيليكون ، تم عمل قنوات مغلقة عن طريق ترك الطبقة الرقيقة من السيليكون التي تبقى على الجزء الخلفي من قنوات الشريط بعد إزالة الأسلاك من صفائح السيليكون. بدلا من إنبات الشتلات مباشرة على الطبق ووضع شريط التطعيم لاحقا فوق hypocotyls الشتلات ، تم إنبات البذور مباشرة على الشريط بعد إدخال البذور في القناة المملوءة بكمية صغيرة من وسط MS. باستخدام هذه التقنية ، كانت نصف الشتلات عالقة في القنوات أثناء الإنبات وفشلت في الاستطالة. بما في ذلك الشتلات غير النابتة وغير الممدودة ، تم تحقيق معدلات تطعيم ناجحة بنسبة 25٪ (ن = 16) (الجدول 1). لمعالجة فشل الاستطالة الملحوظ ، تم توجيه البذور بحيث كانت النبتات الجنينية والجذرية تشير إلى أسفل أثناء الإنبات. باستخدام هذه الطريقة ، نبتت 75٪ من البذور واستطالت بنجاح ، مما أدى إلى زيادة طفيفة في كفاءة التطعيم (نجاح 33٪ ، ن = 12) (الجدول 1). لزيادة نمو الشتلات الناجح ، تمت إزالة الطبقة الرقيقة من السيليكون التي تغلق القناة من الجانب المتوسط لشريط التطعيم للسماح بالتلامس بين البذور ووسط النمو (الشكل 1 أ). باستخدام هذه الطريقة ، تم تطعيم 85٪ من الشتلات واستطالة بنجاح ، وتم تطعيم 31٪ (ن = 16) بنجاح (الجدول 1). على الرغم من الارتفاع الكبير في معدل نمو البذور المناسب على الشريط ، فإن فقدان حتى عدد صغير من الشتلات يمكن أن يؤثر بشكل كبير على حجم السكان التجريبي عند إجراء الطعوم المتبادلة بين المجموعات التجريبية المختلفة. لهذا السبب ، تم تحديد أن إنبات الشتلات مباشرة على السطح المتوسط مثالي.
الحفاظ على معدل بقاء الشتلات وتقليل وقت وجهود المعالجة
تمت زراعة الشتلات أولا للتطعيم على ألواح MS (1٪ سكروز) ، ونقلها إلى سطح صلب (مثل غطاء طبق بتري مملوء بالماء) للتقطيع ، ثم تجميعها على طبق مع الشريط للتطعيم. باستخدام هذه التقنية ، لوحظ معدل نجاح 50٪ (ن = 8) (الجدول 1). في حين أن هذه الطريقة حصلت على أعلى معدل نجاح ، إلا أنها كانت تستغرق وقتا طويلا وتتطلب جهدا مكثفا ، وتتطلب 2.5 دقيقة لكل طعم ، مما يحد من عدد الطعوم التي يمكن تجميعها مرة واحدة. لتقليل الوقت والجهد المطلوبين ، تمت زراعة الشتلات عموديا على صفيحة التطعيم (0.5٪ سكروز) ثم إدخالها في الشريط مباشرة قبل التطعيم ، كما هو موضح في هذا البروتوكول. لمزيد من اختبار هذه الطريقة ، أجريت ثلاث تجارب بأحجام مختلفة. وحققت التجربتان الأوليان معدل نجاح قدره 48٪ (ن = 25 و64) وحققت التجربة الثالثة معدل نجاح قدره 25٪ (ن = 16) (الجدول 1). تشير هذه التجارب مجتمعة إلى معدل نجاح يبلغ 45٪ (ن = 105). معدل النجاح هذا مشابه للطريقة الأكثر استهلاكا للوقت ويتطلب حوالي 1 دقيقة لكل طعم لوضع شريط التطعيم فوق الشتلات وإكمال التطعيم (خطوات البروتوكول 3.2-3.5).
يعتمد معدل نجاح التطعيم بشكل كبير على جودة بناء شريط التطعيم. وفي حين بلغت نسبة نجاح التجربتين الأوليين 48٪، فإن معدل نجاح التجربة الثالثة أقل. تؤدي الجودة اليدوية لشريط التطعيم بطبيعتها إلى تباين طفيف بين مواقع التطعيم. إذا لم تكن الأسلاك المستخدمة في بناء الشريط مستقيمة تماما ، فلن تكون القنوات الموجودة في الشرائط متدفقة مع قاع القالب وستؤدي إلى قنوات ذات أعماق متغيرة قليلا. في المجموع ، يتم تصنيع 25 شريطا في كل صب شريطي ، مما ينتج عنه 100 موقع تطعيم فريد (الجدول 2). في حين أن تأثير الاختلاف الطفيف في مواقع التطعيم متوازن في التجربتين الأكبر ، في التجربة الأصغر ذات معدلات النجاح المنخفضة ، يبدو أن مواقع التطعيم ذات الاختلاف الأكبر بسبب الأسلاك المنحنية قليلا قد تؤثر سلبا على تكوين الكسب غير المشروع. لتقليل هذا النوع من الاختلاف ، يتم وصف تقنية تقويم الأسلاك في الخطوة 1.2 من البروتوكول.
الشكل 1: رسم توضيحي لخطوات تحضير التطعيم . (أ) نموذج لتصميم قالب شريط السيليكون. توضح هذه اللوحة قالب اللوحة المربعة المستخدم في صب شرائط السيليكون. يتم وضع أربعة أقسام من أسلاك 29 G متساوية الطول في الجزء السفلي من اللوحة ، ويتم سكب مزيج المطاط الصناعي السيليكوني فوقها (أعلاه). بعد الشفاء التام من السيليكون ، تتم إزالة مربع السيليكون من اللوحة وإزالة الأسلاك لإنشاء قنوات التطعيم. تبقى طبقة رقيقة من السيليكون في الجزء السفلي من القنوات بعد إزالة الأسلاك (يشار إليها ب *). يجب إزالة هذه الطبقة لترك القنوات مفتوحة في الأسفل (أدناه). ثم يتم قطع المربع بشكل عمودي على القنوات السلكية إلى شرائط 3 مم ، كما هو موضح في الخطوط المنقطة (أعلاه). ب: وضع البذور على صفيحة التطعيم. باستخدام شريط معقم ، يتم وضع صفين من البذور على اللوحة بما يتماشى مع قنوات الشريط. بعد وضع البذور ، يجب إزالة هذا الشريط لمنع أي عائق للإنبات. لتحضير ألواح MS للنمو الرأسي ، يجب لف parafilm على طول الحافة السفلية (جانب الجذر) للوحة ، مع تمييز هنا باللون الأزرق. (ج) موضع الصفيحة الرأسية لإنبات البذور. بعد الطلاء ، تنبت البذور عموديا على ألواح بزاوية. يوضع أنبوب مخروطي سعة 15 مل في قاعدة لوحين لإنشاء زاوية منفرجة قليلا بين سطح اللوحة وسطح الطاولة. يتم توجيه الحافة شبه المغطاة (المميزة باللون الأزرق) للوحة نحو سطح الطاولة. يتم لف شريط مطاطي حول الجزء العلوي من اللوحين لإبقائهما في مكانهما. (د) وضع الشتلات في الشريط مباشرة قبل التطعيم. توضع شرائط التطعيم المعقمة فوق الشتلات مع hypocotyls داخل قنوات الشريط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صورة تم التقاطها على نطاق تشريح توضح موقع تطعيم ملتئم. يشير السهم الأسود إلى موقع تقاطع الكسب غير المشروع ، وتشير الأسهم الحمراء إلى الجذور العرضية التي تمت إزالتها أثناء عملية تقييم الكسب غير المشروع. شريط المقياس = 0.5 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
فيديو 1: عرض توضيحي للتطعيم النشط باستخدام التصوير الحي للنباتات. وضع وحركة شفرة المشرط لإنشاء قطع نظيف. يتم قطع hypocotyl الشتلات مباشرة فوق شريط التطعيم عن طريق دفع شفرة المشرط للأمام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 2: وضع hypocotyl الجذر المقطوع للتطعيم داخل الشريط. يتم سحب الجذر برفق باستخدام الملقط لوضع موقع تقاطع الكسب غير المشروع في منتصف الشريط. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 3: وضع السليل وإكمال الكسب غير المشروع. يتم استبدال السليل ودفعه إلى الشريط حتى يتصل بالجذر. يتم تقييم المحاذاة الصحيحة والاتصال من خلال رؤية استجابة hypocotyl عندما يتم دفع السليل برفق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
الجدول 1: تطعيم المتغيرات التجريبية ومعدلات النجاح. يلخص هذا الجدول نتائج تجارب التطعيم المستخدمة لتحديد بروتوكول التطعيم الأمثل لأعلى معدلات النجاح. تشمل المتغيرات التي تم فحصها في هذه التجارب ظروف إنبات الشتلات ، وبناء شريط السيليكون ، ومتى تم إدخال الشتلات في قنوات شريط السيليكون أثناء التطعيم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: عدد مواقع التطعيم التي يمكن توليدها من زجاجة 250 مل من مطاط السيليكون. يظهر هنا أيضا سعر كل وحدة إنتاج (في وقت النشر) ، ويمكن تعديله بسهولة بناء على التقلبات في القيمة السوقية لكواشف المطاط الصناعي السيليكوني. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ملخص وأهمية
يعد تكوين اتحاد الكسب غير المشروع أمرا بالغ الأهمية لنجاح التطعيم ، الأمر الذي يتطلب اتصالا مباشرا ودون عائق بين الجذر والسليل. إن الحجم المصغر وهشاشة شتلات النباتات الصغيرة مثل Arabidopsis يجعل من الصعب تقنيا تلبية هذا المطلب. كانت إحدى التقنيات التي تم تطويرها في طرق تطعيم شتلات Arabidopsis المبكرة هي إدخال كل من السليل والطعم الجذري في طوق أنبوب سيليكون قصير لدعم تقاطع الكسب غير المشروع10. في حين أن هذه الطريقة فعالة للغاية في حماية جزأين من الكسب غير المشروع من الانفصال ، إلا أنه ليس من السهل إدخال السليل الهش والطعم الجذري في أنبوب ضيق التجويف. علاوة على ذلك ، فإن السماكة عند التقاطع من النمو غالبا ما تجعل من الصعب إزالة أنابيب السيليكون ذات التجويف الضيق دون إتلاف الشتلات المطعمة. استخدمت طرق أخرى تقنيات بديلة لتجنب استخدام طوق التطعيم مع منع الشتلات من التحرك أثناء النمو ، بما في ذلك إزالة كل من النبتات من السليل وزراعة الشتلات المطعمة على سطح مائل 9,11. في حين أن هذه الطرق تتطلب القليل من الموارد لإكمالها ، عند تجربتها ، أدت هذه الطرق إلى مستويات عالية من هجرة السليل بعيدا عن الجذر ، مما أدى إلى نجاح تطعيم أقل مما تم الإبلاغ عنه (80٪ في المتوسط للظروف الموصى بها في كلتا الدراستين باستخدام هذه التقنيات. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب كلاهما من المستخدم محاذاة الواجهة بين أجزاء شتلة الكسب غير المشروع دون أي مساعدات ، وهي مهمة تتطلب مستوى عال من المهارة. تم الإبلاغ مؤخرا عن رقاقة تطعيم دقيقة مصممة خصيصا لتطعيم شتلات Arabidopsis 12. تحتوي كل شريحة على أربع غرف صغيرة للسماح لأربع شتلات بالنمو ، مع تصميم خاص لمساحة الغرفة يمكن hypocotyl من النمو داخل قناة صغيرة. يتم إنشاء الجذور في مكانها على الشريحة ، ويتم إدخال السليل في القنوات الدقيقة. هذا يلغي الحاجة إلى التعامل مع كل من الجذور والسليل للتطعيم ، وتحصر القناة الدقيقة التطعيم في مكانه دون التضحية بسهولة إزالة الشتلات بمجرد تشكيل اتحاد الكسب غير المشروع. في حين أن هذه الطريقة الجديدة تقلل بشكل كبير من الحاجز التقني لتطعيم الشتلات ، فإن تصنيع رقاقة التطعيم الدقيق يتطلب أنظمة ميكانيكية كهربائية دقيقة (MEMS) ، وهي تقنية لا يمكن الوصول إليها بسهولة لمعظم مختبرات البيولوجيا. تم تحسين أبعاد الغرفة الدقيقة على رقاقة التطعيم الدقيق ل Arabidopsis Col-012. هذا يمنع استخدام الرقائق لأنواع أخرى أو مدخلات / طفرات أرابيدوبسيس المختلفة التي تحتوي على hypocotyls التي تختلف في الارتفاع أو السمك15،16،17.
الطريقة منخفضة التكلفة والمرنة وسهلة المتابعة الموصوفة هنا مستوحاة من أعمال رقائق التطعيم الدقيق السابقة لتسهيل تطعيم الشتلات الصغيرة. في هذه الطريقة ، يكون التلاعب بالشتلات الحساسة ضئيلا ، مما يسهل الاستخدام للمستخدمين الجدد. تساعد القنوات الموجودة في الشرائط المستخدمين الجدد في محاذاة الشتلات المطعمة والحفاظ على الجذر وإطلاق النار على اتصال جيد أثناء تكوين موقع الكسب غير المشروع ، مع ضمان سهولة الإزالة بعد تكوين الكسب غير المشروع. نظرا للإنتاج عالي الإنتاجية لشرائط السيليكون والتكلفة المنخفضة نسبيا للمواد الأولية ، يمكن تحقيق تطعيم أعداد كبيرة من الشتلات بجزء بسيط من تكلفة رقائق التطعيم الدقيق. يقدر هذا الجهاز محلي الصنع بتكلفة 0.12 دولار لكل موقع تطعيم ، مما يجعل هذا خيارا اقتصاديا للمختبرات التي تعمل مع مجموعة متنوعة من الأنواع النباتية أو الأنماط الظاهرية للشتلات (الجدول 2). في حين أن الجانب اليدوي لشرائط التطعيم يقلل من التكاليف المرتبطة بهذه الطريقة ، فإنه يوفر أيضا فرصة للتباين بين الشرائط المختلفة. كما تم التأكيد عليه سابقا ، فإن جودة شرائط التطعيم هي مفتاح نجاح هذه الطريقة. أعطى الارتفاع في استخدام تطعيم الشتلات في المراحل المبكرة في علم الوراثة الجزيئية مجال علم الوراثة النباتية أداة قوية لدراسة الإشارات بعيدة المدى في النباتات. ستوفر هذه الطريقة البسيطة ومنخفضة التكلفة والتي يسهل الوصول إليها أداة أخرى للمساعدة في تسهيل التبني الناجح لتقنية تطعيم الشتلات من قبل المختبرات مع الحد الأدنى من التدريب والخبرة المسبقة.
اعتبارات حاسمة
تعتبر عمليات مثل بدء استجابة إصلاح الجروح ، وإنشاء اتصال من خلية إلى خلية بين السليل والطعم الجذري ، وفي النهاية تكوين الأوعية الدموية ، ضرورية لتشكيل طعم ناجح9. أثناء عملية التطعيم ، من المهم الحفاظ على رطوبة الشتلات وعدم تلفها بشكل لا يتجاوز الضرورة. باستخدام هذه الطريقة ، يجب أن تكون الأطراف المقطوعة للجذور والسليلات نظيفة ومتعامدة لضمان اتصال دافق بين السليل والجذر. في حالة تلف موقع التطعيم أثناء القطع ، أو لم يتم قطع قطع التطعيم بنفس الزاوية ، فمن غير المرجح أن ينجح التطعيم بسبب عدم وجود اتصال وثيق بين طبقات الخلايا عبر تقاطع التطعيم. إذا سمح لأي من أجزاء التطعيم في النبات بالجفاف أو التلف ، تثبيط العمليات المذكورة سابقا ، ولن ينجح التطعيم. الشتلات الصغيرة هشة ويمكن سحقها بسهولة بالملقط. إذا وجد المستخدمون ذلك ضروريا ، فيمكن استخدام الملقط للتمسك بأحد الفلقات لمناورة السليل. بالمقارنة مع طريقة رقاقة التطعيم التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، تزداد فرصة إتلاف الجذر أثناء سحب hypocotyl لأسفل في شريط السيليكون. يتم وصف تقنيات المناولة لتقليل هذا الخطر في الخطوة 3.4 من البروتوكول.
ما مجموعه أربعة مواقع تطعيم لكل شريط هو العدد الموصى به من المواضع لضمان عدم ملامسة الشتلات لبعضها البعض أثناء مرحلة تكوين تقاطع الكسب غير المشروع. لزيادة العدد الإجمالي للطعوم التي يتم إجراؤها في وقت واحد ، يوصى بأن يزيد المستخدمون من عدد اللوحات المستخدمة ، بدلا من تقليل مقدار المساحة المستخدمة لكل طعم.
يمكن تعديل البروتوكول لاستيعاب أنواع نقص الكوتيل المتباينة النمو أو الأنواع غير العربية
بعض الطفرات etiolate بمعدلات مختلفة للنباتات البرية. تلعب الهرمونات النباتية مثل الجبرلين والبراسينوستيرويدات والإيثيلين والأوكسين دورا كبيرا في تنظيم نمو الشتلات18،19،20. قد تواجه الخطوط الطافرة المعيبة في هذه المسارات الهرمونية معدلات إيتيول غير نمطية16,17. يسمح التصميم الذي يتحكم فيه المستخدم لشريط التطعيم باستيعاب هذه الاختلافات في النمط الظاهري ، ولكن يلزم إجراء اختبارات كافية في هذه الحالات. إذا تم استخدام خط جيني يعاني من etiolation بمعدلات مختلفة بشكل كبير عن النوع البري ، فيجب على المستخدمين تحديد ما إذا كانت فترة ال 3 أيام الموصوفة هنا مناسبة لخطوطهم قبل البدء. ستؤدي الشتلات غير المؤهلة بشكل كاف إلى صعوبة التطعيم بسبب نقص الكوتيل القصير أو الممتد بشكل مفرط (والأرق). يمكن للمستخدمين المهتمين بتطعيم شتلات الأنواع الأخرى غير Arabidopsiتكييف هذا البروتوكول ليناسب احتياجاتهم من خلال تغيير قطر قناة التطعيم. يبدو أن شتلات الطماطم والتبغ المزروعة إلى سن التطعيم المناسب تتطلب قنوات تطعيم قطرها 0.8 و 0.4 مم ،على التوالي 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
شكرا لخافيير بروموس على التدريب الأولي والتوجيه في تطعيم شتلات أرابيدوبسيس .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E.
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y.
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
