Summary
Denne protokol beskriver en robust podningsmetode til frøplanter, der ikke kræver nogen forudgående erfaring eller træning og kan udføres til en meget lav pris ved hjælp af materialer, der er let tilgængelige i de fleste molekylærbiologiske laboratorier.
Abstract
Tidlig fase podning af frøplanter er blevet et populært værktøj inden for molekylær genetik til at studere rodskudsforhold inden for planter. Podning af tidlige frøplanter fra den lille modelplante, Arabidopsis thaliana, er teknisk udfordrende og tidskrævende på grund af plantens størrelse og skrøbelighed. En voksende samling af offentliggjorte metoder beskriver denne teknik med varierende succesrater, vanskeligheder og tilknyttede omkostninger. Dette papir beskriver en simpel procedure til fremstilling af en intern genanvendelig podningsanordning ved hjælp af silikoneelastomerblanding, og hvordan man bruger denne enhed til podning af frøplanter. På tidspunktet for denne publikation koster hver genanvendelig podningsenhed kun $ 0.47 i forbrugsmaterialer at producere. Ved hjælp af denne metode kan begyndere få deres første vellykkede podede frøplanter på mindre end 3 uger fra start til slut. Denne meget tilgængelige procedure vil gøre det muligt for plantemolekylærgenetiske laboratorier at etablere podning af frøplanter som en normal del af deres eksperimentelle proces. På grund af den fulde kontrol, brugerne har i oprettelsen og designet af disse podningsanordninger, kan denne teknik let justeres til brug i større planter, såsom tomat eller tobak, hvis det ønskes.
Introduction
Podning er en gammel havebrugsteknik, der blev en etableret landbrugspraksis i 500 fvt1. Podning af forskellige sorter af afgrødeplanter for at forbedre udbyttet var den første anvendelse af denne teknik og bruges fortsat til dette formål i dag. I det sidste årti har podning tiltrukket sig en stigende mængde opmærksomhed som et værktøj for molekylærbiologer til at studere langdistancesignalering i planter 2,3,4,5. Mens podning af voksne planter er relativt let, er podning af planter kort efter spiring udfordrende. På trods af dette er det undertiden nødvendigt at vurdere virkningerne af langdistancesignalering i processer som planteudvikling, miljøresponser og blomstring 6,7,8.
Arabidopsis thaliana er blevet etableret som modelorganismen i plantebiologi af mange grunde, herunder dens relativt lille størrelse, hvilket gør den let at dyrke inde i et laboratorium. Den lille størrelse og skrøbelighed af Arabidopsis-frøplanter gør imidlertid podning af unge frøplanter meget udfordrende. I mange tilfælde kræves omfattende praktisk træning for at opnå frøplantetransplantater. Der har været mange metodologiske forbedringer gennem årene, der har identificeret ideelle vækstbetingelser og nye teknikker til at øge succesraten for podning af frøplanter 9,10,11. Det seneste værktøj, der blev introduceret, var en Arabidopsis-podningschip, der gør det muligt for selv uerfarne brugere at opnå acceptable niveauer af podningssucces12. Mens dette fremskridt har sænket den tekniske barriere for podning af frøplanter betydeligt, er chipenheden dyr, og antallet af transplantater, der kan udføres parallelt, bliver hurtigt uoverkommeligt.
Derudover kan denne enhed kun bruges til Arabidopsis-frøplanter, der har hypocotyldimensioner, der ligner vildtypeplanter. Mens Arabidopsis er nøglestensarten i verden af plantemolekylær genetik, er der for nylig udført arbejde i andre arter ved hjælp af podning af frøplanter. Eksempler inkluderer podning af sojabønner og den almindelige bønne, tobak til tomat og raps til Arabidopsis, og efterfølgende prøveudtagning af begge væv til små RNA'er13,14. Derfor er en podningsmetode, der er tilgængelig for de fleste laboratorier og let kan tilpasses en lang række plantearter uden større tekniske ændringer, meget ønskelig.
Denne protokol beskriver en metode, der anvender intern produktion af en simpel podningsenhed, der giver mulighed for fuld tilpasning af podningskanalens diameter og længde for at imødekomme enhver frøplantemorfologi på tværs af de fleste plantearter. Produktionen af disse enheder er meget overkommelig og meget skalerbar, da de eneste nødvendige komponenter er silikoneelastomer, ledninger eller slanger i den korrekte størrelse, et højpræcisionsblad og en beholder til at fungere som form. Efter podningsprotokollen, der er beskrevet her, kan brugerne opnå vellykkede podningshastigheder på 45% (n = 105), sammenlignelig med tidligere rapporterede podningsresultater10,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af enhed
- Lav silikonetransplantationsanordningen ved at støbe silikoneelastomeropløsning i en firkantet petriskål (100 mm x 100 mm). Forbered 15 ml af elastomeropløsningen efter producentens anvisninger.
BEMÆRK: Silikone elastomersæt indeholder typisk en silikonebaseret væske og et hærdningsmiddel, der, når det blandes sammen, tillader silikonen at størkne. - Forbered den firkantede petriskål ved at lægge fire lige stykker 29 G tråd i den firkantede petriskål, lige langt fra hinanden (figur 1A). Sørg for, at ledningen ligger i plan med bunden af formen. For at rette ledningen helt ud skal du rulle den på en hård ensartet overflade med en tung og flad genstand (f.eks. Et metalrørstativ).
BEMÆRK: Twist slips indeholder ofte 29 G ledning og kan bruges efter fjernelse af den ydre papirbelægning med acetone. - Hæld den blandede silikone elastomeropløsning oven på ledningerne og dæk med toppen af petriskålen. Lad silikonen hærde i 24-48 timer ved stuetemperatur.
- Fjern silikonepladen fra petriskålen med rene tang og flyt til en ren flad overflade.
- Fjern ledningerne fra silikonepladen. Fjern det tynde lag silikone, der er tilbage på ydersiden af kanalen, med finspidstang, så kanalen kan være åben på den ene side (figur 1A).
- Skær silikonepladen vinkelret på kanalerne i 3 mm strimler ved hjælp af en ren saks. Flyt hver strimmel til en aluminiumsfoliekuvert og forsegl med autoklavetape.
- Autoklave strimlerne ved 121 °C i mindst 30 minutter og opbevar dem, indtil de er klar til brug.
2. Forberedelse af frøplanter
- Steriliser og vernaliser frø.
- Suspender op til 100 Arabidopsis-frø i 1 ml 50% blegemiddelopløsning indeholdende 0,1% Tween 20 i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og inkuber i 5-10 minutter. Blegemiddelopløsningen fjernes ved pipettering eller aspiration under sterile forhold. Skyl frøene med 1 ml steriliseret dH2O. Sørg for at vende rørene for at skylle frøene tilstrækkeligt og fjerne enhver blegemiddelopløsning, der er tilbage øverst på røret. Gentag skylningen 4x.
- Lad ca. 0,25 ml vand stå i rørene med frøene og opbevar ved 4 °C i 3 dage i mørke.
- Plade frøene som forberedelse til podning.
- Forbered en 1% agar MS-plade som følger: Bland 4,4 g MS-salt, 5 g saccharose og 10 g agar i 800 ml vand til 1 liter MS (0,5% saccharose) fast medium, bland 4,4 g MS-salt, 5 g saccharose og 10 g agar i 800 ml vand, juster pH til 5,7 med KOH, og bring derefter det samlede volumen til 1 liter med yderligere vand. Autoklave i mindst 20, min før du hælder ~ 25 ml i de firkantede petriskåle.
- Under sterile forhold flyttes det passende antal tilberedte frø til pladen ved hjælp af en 20 μL pipettespids til at aspirere og overføre frøene.
- Placer en steril strimmel på pladens overflade for at styre frøplaceringen, så frøene er justeret med kanalerne på strimlen. Fjern strimlen, når frøene er belagt.
BEMÆRK: En 100 mm x 100 mm firkantet plade kan rumme to rækker frøplanter (figur 1B). - Når pladerne står op, skal du lade væsken fordampe ud af det faste medium og samle sig i bunden af pladen. Når frøene er anbragt på pladen, skal du lægge pladedækslet på og forsegle den ene side af pladen, der er parallel med de to rækker frø (angivet med det blå fremhævede område i figur 1B) med parafilm. Sæt åndbar tape oven på parafilmen og rundt om alle de andre kanter af pladen.
- Stil forsigtigt to plader op med den parafilmforseglede side nedad. Adskil de to plader i bunden ved at placere et vandret 15 ml centrifugerør mellem dem og fastgør med et gummibånd. Sørg for, at pladeoverfladerne danner en vinkel på 100°-110° med bordpladens overflade (figur 1C).
- Opbevar pladerne i denne retning i 72 timer i totalt mørke ved 21 ° C, så frøplantehypocotyls kan vokse ~ 5 mm i længden. Efter 72 timer fjernes pladerne fra mørket og vokser under 16 timers lys (intensitet på 100 μE m-2 sek-1) og 8 timers mørke cyklusser i 2-4 dage mere ved samme temperatur før podning.
- Pod frøplanterne mellem 5 og 7 dage efter belægning. Placer en podningsstrimmel over frøplanterne og monter deres hypocotyler i kanalerne. Placer forsigtigt frøplanten, så rodhypocotylkrydset er placeret i bunden af silikonestrimlen for at forberede frøplanten til skæring (figur 1D).
3. Podningsprocedure
- Forbered et sterilt arbejdsmiljø ved at desinficere et dissektionskikkert med 70% ethanol og autoklavere to par pincet med fine spidser og et skalpelhåndtag. Udfør alle podningsprocedurer i en steril hætte og ved hjælp af et dissektionsomfang efter behov. Udfør det meste af podningen ved hjælp af en forstørrelse på 10,5x.
- Forbered scions. Brug et frisk skalpelblad til at skære hypocotyl vinkelret for at skabe et lige rent snit. Skub bladet fremad i stedet for at trykke ned i planten for at forhindre, at frøplanten skubbes ind i agaren (video 1).
- Fjern skuddet. Sørg for at holde den afskårne del af skuddet hydreret ved at sikre kontakt med medieoverfladen. Alternativt kan du flytte skuddet til et udpeget holdeområde, såsom toppen af en petriskål fyldt med steril dH2O, indtil den er klar til brug.
- Forbered grundstammerne. Træk forsigtigt i roden ved at fange roden i mellemrummet mellem den lukkede tang og dreje dem, så den afskårne del af grundstammerne efterlades midt på strimlen (video 2).
BEMÆRK: Den skrøbelige rod vil blive beskadiget, hvis den knuses direkte mellem de lukkede pincet, hvilket nødvendiggør at kile roden i den skarpe vinkel på pincettenderne for at manipulere vævet. - Tag forsigtigt det ønskede skud op med de fine spidsede tang og indsæt i toppen af kanalen.
BEMÆRK: Det er vigtigt visuelt at bekræfte kontakt mellem scions og grundstammer for at opnå et vellykket transplantat (Video 3). - Når alle transplantater er lavet, skal du pakke pladerne med parafilm og åndbart tape og sætte pladerne op på samme måde som før uden at forstyrre frøplanterne eller silikonestrimlerne. Pladerne flyttes forsigtigt til et vækstkammer indstillet til 26 °C med 16 timers lys/8 timers mørke cyklusser.
- Evaluer de podede frøplanter under sterile forhold efter 7-10 dage. Fjern forsigtigt silikonestrimlen ved hjælp af tang ved at skrælle den ene side op, så kanalerne kan frigøre frøplanterne. Fjern eventuelle utilsigtede rødder, der vokser fra scion ved at skære dem fra scion med et frisk skalpelblad eller knuse dem ved hjælp af fint spidsede tang. Evaluer visuelt, om grundstammen er blevet fast fastgjort til scion for at danne et vellykket transplantat (figur 2).
- Flyt vellykkede transplantater til frøplanteformeringsjord for at vokse så længe som nødvendigt. Dæk jorden med gennemsigtig plast i et par dage, når frøplanterne bliver etableret. Efter overførsel af planterne til jorden vokser under de tidligere nævnte lyse og mørke cyklusser ved 21 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forskellige aspekter af podningsstrimlens design blev testet for at identificere de optimale podningsforhold, der krævede mindst teknisk dygtighed (tabel 1). Alle podningsforsøg blev afsluttet på 0,5% saccharose MS-medium, som tidligere er blevet rapporteret at være et ideelt podningsmedium11,12.
Optimal frøplantevækst kan ikke opnås med spiring på strimlen
I den første iteration af silikonestrimlen blev der lavet lukkede kanaler ved at forlade det tynde lag silikone, der forbliver på bagsiden af strimlingskanalerne, efter at ledningerne er fjernet fra silikonepladerne. I stedet for at spire frøplanterne direkte på pladen og senere placere podningsstrimlen over frøplantehypocotyls, blev frøene spiret direkte på strimlen efter indsættelse af frøene i kanalen fyldt med en lille mængde MS-medium. Ved hjælp af denne teknik sad halvdelen af kimplanterne fast i kanalerne under spiring og undlod at forlænge. Inklusive de ikke-spirede og de ikke-aflange frøplanter blev der opnået vellykkede podningshastigheder på 25% (n = 16) (tabel 1). For at imødegå den observerede forlængelsesfejl blev frøene orienteret, så embryoets cotyledoner og radikaler pegede nedad under spiring. Ved hjælp af denne metode spirede 75% af frøene og forlængede med succes, hvilket resulterede i en lille stigning i podningseffektiviteten (33% succes, n = 12) (tabel 1). For at øge den vellykkede frøplanteudvikling blev det tynde lag silikone, der lukkede kanalen, fjernet fra den midterste side af podningsstrimlen for at tillade kontakt mellem frøet og vækstmediet (figur 1A). Ved hjælp af denne metode spirede 85% af kimplanterne og langstrakte med succes, og 31% (n = 16) blev podet med succes (tabel 1). På trods af at hastigheden af korrekt frøudvikling på strimlen øges betydeligt, kan tab af selv et lille antal frøplanter betydeligt påvirke den eksperimentelle populationsstørrelse, når der udføres gensidige transplantater mellem forskellige eksperimentelle grupper. Af denne grund blev spirende frøplanter direkte på mellemoverfladen bestemt til at være ideelle.
Opretholdelse af overlevelsesrate for frøplanter og minimering af behandlingstid og indsats
Frøplanter blev først dyrket til podning på MS-plader (1% saccharose), overført til en fast overflade (såsom låget på en petriskål fyldt med vand) til skæring og derefter samlet på en plade med strimlen til podning. Ved hjælp af denne teknik blev der observeret en succesrate på 50% (n = 8) (tabel 1). Mens denne metode opnåede den højeste succesrate, var den tidskrævende og indsatskrævende og krævede 2,5 minutter for hvert transplantat, hvilket begrænsede antallet af transplantater, der kunne samles på én gang. For at sænke den nødvendige tid og kræfter blev frøplanter dyrket lodret på podningspladen (0,5% saccharose) og derefter indsat i strimlen direkte før podning, som beskrevet i denne protokol. For yderligere at teste denne metode blev der udført tre forsøg af forskellig størrelse. De første to forsøg havde begge en succesrate på 48% (n = 25 og 64), og det tredje forsøg havde en succesrate på 25% (n = 16) (tabel 1). Tilsammen indikerer disse forsøg en succesrate på 45% (n = 105). Denne succesrate kan sammenlignes med den mere tidskrævende metode og kræver ca. 1 minut pr. transplantat for at placere podningsstrimlen over frøplanterne og for at fuldføre podningen (protokoltrin 3.2-3.5).
Graden af podningssucces er stærkt afhængig af kvaliteten af podningsstrimlens konstruktion. Mens de to første forsøg har en succesrate på 48%, har det tredje forsøg en lavere succesrate. Den håndlavede kvalitet af podningsstrimlen resulterer i sagens natur i lille variation mellem podningssteder. Hvis ledningerne, der bruges til strimmelkonstruktion, ikke er helt lige, flugter kanalerne i strimlerne ikke med bunden af formen og resulterer i kanaler med lidt variable dybder. I alt fremstilles 25 strimler i hver strimmelstøbning, hvilket resulterer i 100 unikke podningssteder (tabel 2). Mens effekten af let variation i podningsstederne udlignes i de to større forsøg, ser det i det mindre forsøg med lavere succesrater ud til, at podningssteder med mere variation på grund af let buede ledninger kan påvirke transplantatdannelsen negativt. For at minimere denne type variation er en trådretningsteknik beskrevet i protokoltrin 1.2.
Figur 1: Illustration af trin til forberedelse af podning . (A) Model af silikonestrimmelformens design. Dette panel demonstrerer den firkantede pladeform, der bruges til støbning af silikonestrimlerne. Fire sektioner af 29 G ledninger af samme længde lægges i bunden af pladen, og silikone elastomerblanding hældes oven på dem (ovenfor). Når silikonen er hærdet helt, fjernes silikonefirkanten fra pladen, og ledningerne fjernes for at skabe podningskanalerne. Et tyndt lag silikone forbliver på bunden af kanalerne, efter at ledningerne er fjernet (angivet med *). Dette lag skal fjernes for at lade kanalerne være åbne i bunden (nedenfor). Firkanten skæres derefter vinkelret på trådkanalerne i 3 mm strimler, som vist med de stiplede linjer (ovenfor). B) Frøplacering på podepladen. Ved hjælp af en steril strimmel placeres to rækker frø på pladen på linje med strimlingskanalerne. Efter placering af frøene skal denne strimmel fjernes for at forhindre spiringshindring. For at forberede MS-plader til lodret vækst skal parafilm pakkes langs pladens nederste (rodside) kant, markeret her med blå fremhævning. C) Lodret pladeplacering for frøspiring. Efter plettering spires frøene lodret på vinklede plader. Et 15 ml konisk rør placeres i bunden af to plader for at skabe en let stump vinkel mellem pladeoverfladen og bordpladen. Pladens parafilmede kant (markeret med blåt) er orienteret mod bordpladens overflade. Et elastik vikles rundt om toppen af de to plader for at holde dem på plads. (D) Placering af frøplanter i strimlen umiddelbart før podning. Sterile podningsstrimler placeres oven på frøplanterne med hypocotyler inde i strimlingskanalerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billede taget på et dissektionsomfang, der viser et helet podningssted. Den sorte pil angiver podningsstedet, og de røde pile angiver utilsigtede rødder, der blev fjernet under transplantatevalueringsprocessen. Skalabjælke = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Demonstration af aktiv podning ved hjælp af levende plantebilleddannelse. Placeringen og bevægelsen af skalpelbladet for at skabe et rent snit. Frøplantehypocotyl skæres direkte over podningsstrimlen ved at skubbe skalpelbladet fremad. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Placering af den skårne grundstammehypocotyl til podning i strimlen. Grundstammen trækkes forsigtigt ved hjælp af tang for at placere podningsstedet midt på strimlen. Klik her for at downloade denne video.
Video 3: Placering af scion og færdiggørelse af transplantatet. Scionen udskiftes og skubbes ind i strimlen, indtil den forbinder med grundstammen. Korrekt justering og kontakt evalueres ved at se hypocotyl reagere, når scion skubbes let. Klik her for at downloade denne video.
Tabel 1: Podningsforsøgsvariabler og succesrater. Denne tabel opsummerer resultaterne af podningsforsøgene, der bruges til at bestemme den optimale podningsprotokol for de højeste succesrater. De variabler, der undersøges i disse forsøg, inkluderer spiringsbetingelser for frøplanter, silikonestrimmelkonstruktion, og når frøplanter blev indsat i silikonestrimmelkanalerne under podning. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Antallet af podningssteder, der kan genereres fra en 250 ml flaske silikoneelastomer. Prisen for hver produktionsenhed vises også her (på tidspunktet for offentliggørelsen) og kan let justeres ved udsving i markedsværdien af silikoneelastomerreagenserne. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Resumé og betydning
Dannelse af en transplantatforening er afgørende for vellykket podning, hvilket kræver direkte og uforstyrret kontakt mellem grundstammen og scion. Ministørrelsen og skrøbeligheden af frøplanter af små planter som Arabidopsis gør det teknisk udfordrende at opfylde dette krav. En teknik udviklet i tidlige Arabidopsis-frøplantepodningsmetoder var at indsætte både scion og grundstammen i en kort silikone slangekrave for at understøtte transplantatkrydset10. Selvom denne metode er yderst effektiv til at beskytte de to transplantatdele mod adskillelse, er det ikke en let opgave at indsætte den skrøbelige scion og grundstamme i et smalboret rør. Desuden gør fortykkelsen ved krydset fra vækst det ofte vanskeligt at fjerne de smalle silikonerør uden at beskadige de podede frøplanter. Andre metoder anvendte alternative teknikker for at undgå brug af en podningskrave og samtidig forhindre frøplanter i at bevæge sig under vækst, herunder fjernelse af både kimblade fra scions og dyrkning af podede frøplanter på en skrå overflade 9,11. Selvom disse metoder kræver få ressourcer at gennemføre, resulterede disse metoder, når de blev afprøvet, i høje niveauer af scionmigration væk fra grundstammen, hvilket resulterede i lavere podningssucces end rapporteret (80% i gennemsnit for de anbefalede betingelser i begge undersøgelser) ved hjælp af disse teknikker. Derudover kræver de begge, at brugeren justerer grænsefladen mellem transplantatplantedelene uden hjælpemidler, en opgave, der kræver et højt færdighedsniveau. En mikropodningschip designet specielt til podning af Arabidopsis-frøplanter er for nylig blevet rapporteret12. Hver chip indeholder fire mikrokamre, der tillader fire frøplanter at vokse, med det specielle design af kammerrummet, der gør det muligt for hypocotyl at vokse inde i en mikrokanal. Grundstammerne genereres på stedet på chippen, og scions indsættes i mikrokanalerne. Dette eliminerer behovet for at håndtere både grundstammer og scions til podning, og mikrokanalen begrænser podningen på plads uden at ofre letheden ved at fjerne frøplanter, når transplantatforeningen er dannet. Mens denne nye metode i høj grad reducerer den tekniske barriere ved podning af frøplanter, kræver fremstillingen af mikropodningschippen mikroelektromekaniske systemer (MEMS), en teknologi, der ikke er let tilgængelig for de fleste biologilaboratorier. Dimensionerne af mikrokammeret på mikropodningschippen blev optimeret til Arabidopsis Col-012. Dette forhindrer brug af chipsene til andre arter eller forskellige Arabidopsis-tiltrædelser/mutanter, der har hypocotyler, der varierer i højde eller tykkelse15,16,17.
Den billige, fleksible og nemme at følge metode, der er beskrevet her, blev inspireret af tidligere mikropodningschiparbejde for at lette podning af unge frøplanter. I denne metode er manipulationen af sarte frøplanter minimal, hvilket letter brugen for nye brugere. Kanalerne i strimlerne hjælper nye brugere med at justere de podede frøplanter og holde roden og skyde i god kontakt under dannelse af transplantatsteder, samtidig med at de sikrer let fjernelse, efter at transplantatet er dannet. På grund af den høje gennemstrømningsproduktion af silikonestrimlerne og relativt lave omkostninger ved udgangsmaterialerne kan podning af et stort antal frøplanter opnås til en brøkdel af prisen på mikropodningschips. Denne hjemmelavede enhed anslås at koste $ 0,12 pr. Podningssted, hvilket gør dette til en økonomisk mulighed for laboratorier, der arbejder med en række plantearter eller frøplantefænotyper (tabel 2). Mens det håndlavede aspekt af podningsstrimlerne reducerer omkostningerne forbundet med denne metode, introducerer det også chancen for variabilitet mellem forskellige strimler. Som tidligere understreget er kvaliteten af podningsstrimlerne nøglen til succesen med denne metode. Stigningen i brugen af podning af frøplanter i tidlig fase i molekylær genetik har givet plantegenetikområdet et kraftfuldt værktøj til at studere langdistancesignalering i planter. Denne enkle, billige og let tilgængelige metode vil give et andet værktøj til at hjælpe med at lette en vellykket vedtagelse af podningsteknikken til frøplanter af laboratorier med minimal forudgående træning og erfaring.
Kritiske overvejelser
Processer såsom initiering af et sårreparationsrespons, etablering af celle-til-celle-kommunikation mellem scion og grundstamme og i sidste ende vaskulaturdannelse er nødvendige for dannelsen af et vellykket transplantat9. Under podningsprocessen er det vigtigt at holde frøplanterne hydreret og ubeskadiget ud over nødvendigheden. Ved hjælp af denne metode skal de afskårne ender af rødderne og scions være rene og vinkelrette for at sikre en flush forbindelse mellem scion og grundstamme. Hvis podningsstedet er beskadiget under skæring, eller podningsstykkerne ikke skæres i samme vinkel, er vellykket podning usandsynligt på grund af manglende tæt kontakt mellem cellelag på tværs af podningskrydset. Hvis nogen af podningsdelene af planten får lov til at tørre eller beskadiges, hæmmes de tidligere nævnte processer, og podning vil ikke lykkes. Unge frøplanter er skrøbelige og knuses let af tang. Hvis brugerne finder det nødvendigt, kan tangen bruges til at holde fast i en af de to cotyledoner for at manøvrere scionen. Sammenlignet med den tidligere rapporterede podningschipmetode øges chancen for at beskadige grundstammen, mens hypocotylen trækkes ned i silikonestrimlen. Håndteringsteknikker til minimering af denne risiko er beskrevet i protokoltrin 3.4.
I alt fire podningssteder pr. strimmel er det anbefalede antal positioner for at sikre, at frøplanterne ikke rører hinanden under podningsforbindelsesdannelsesfasen. For at opskalere det samlede antal transplantater, der udføres på én gang, anbefales det, at brugerne øger antallet af anvendte plader i stedet for at reducere mængden af plads, der bruges pr. transplantat.
Det er muligt at ændre protokollen for at tage højde for divergerende hypocotylvækst eller ikke-arabidopsisarter
Nogle mutanter ætser i forskellige hastigheder til vildtypeplanter. Phytohormoner såsom gibberelliner, brassinosteroider, ethylen og auxin spiller en omfattende rolle i frøplantevækstregulering18,19,20. Mutantlinjer, der er defekte i disse hormonveje, kan opleve atypiske ætioleringshastigheder16,17. Podestrimlens brugerstyrede design giver mulighed for at tage højde for disse fænotypiske forskelle, men der kræves tilstrækkelig prøvning i disse tilfælde. Hvis der anvendes en genetisk linje, der oplever ætiolering med signifikant forskellige hastigheder fra vildtypen, bør brugerne afgøre, om den 3-dages etiolationsperiode, der er beskrevet her, er passende for deres linjer, før de begynder. Utilstrækkeligt etiolerede frøplanter vil resultere i vanskelig podning på grund af en forkortet eller overdrevent udvidet (og tyndere) hypocotyl. Brugere, der er interesseret i podning af kimplanter af andre arter end Arabidopsi, kan tilpasse denne protokol, så den passer til deres behov ved at ændre podningskanalens diameter. Tomat- og tobaksplanter, der dyrkes til passende podningsalder, synes at kræve henholdsvis 0,8 og 0,4 mm diameterpodningskanaler 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Tak til Javier Brumos for indledende træning og vejledning i podning af Arabidopsis-frøplanter .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E.
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y.
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
