Summary
Dit protocol beschrijft een robuuste zaailingenbestrijdingsmethode die geen voorafgaande ervaring of training vereist en tegen zeer lage kosten kan worden uitgevoerd met behulp van materialen die gemakkelijk toegankelijk zijn in de meeste laboratoria voor moleculaire biologie.
Abstract
Zaailingentransplantatie in een vroeg stadium is een populair hulpmiddel geworden in de moleculaire genetica om wortel-scheutrelaties binnen planten te bestuderen. Het enten van zaailingen in een vroeg stadium van de kleine modelplant, Arabidopsis thaliana, is technisch uitdagend en tijdrovend vanwege de grootte en kwetsbaarheid van de zaailingen. Een groeiende verzameling gepubliceerde methoden beschrijft deze techniek met verschillende slagingspercentages, moeilijkheidsgraad en bijbehorende kosten. Dit artikel beschrijft een eenvoudige procedure om een intern herbruikbaar entapparaat te maken met behulp van siliconenelastomeermix en hoe dit apparaat te gebruiken voor zaailingen. Op het moment van deze publicatie kost elk herbruikbaar entapparaat slechts $ 0,47 aan verbruiksmaterialen om te produceren. Met behulp van deze methode kunnen beginners hun eerste succesvol geënte zaailingen hebben in minder dan 3 weken van begin tot eind. Deze zeer toegankelijke procedure zal laboratoria voor moleculaire genetica van planten in staat stellen om zaailingentransplantatie als een normaal onderdeel van hun experimentele proces vast te stellen. Vanwege de volledige controle die gebruikers hebben bij het maken en ontwerpen van deze entapparaten, kan deze techniek indien gewenst eenvoudig worden aangepast voor gebruik in grotere planten, zoals tomaat of tabak.
Introduction
Enten is een oude tuinbouwtechniek die rond 500 v.Chr. een gevestigde landbouwpraktijk werd1. Het enten van verschillende soorten gewasplanten om de opbrengsten te verbeteren was het eerste gebruik van deze techniek en wordt nog steeds voor dit doel gebruikt. In het afgelopen decennium heeft enten steeds meer aandacht getrokken als een hulpmiddel voor moleculair biologen om langeafstandssignalering in planten 2,3,4,5 te bestuderen. Hoewel het enten van volwassen planten relatief eenvoudig is, is het enten van planten kort na het ontkiemen een uitdaging. Desondanks is het soms nodig om de effecten van langeafstandssignalering te beoordelen in processen zoals plantenontwikkeling, omgevingsreacties en bloei 6,7,8.
Arabidopsis thaliana is om vele redenen vastgesteld als het modelorganisme in de plantenbiologie, waaronder de relatief kleine omvang, waardoor het gemakkelijk in een laboratorium kan groeien. De kleine omvang en kwetsbaarheid van Arabidopsis-zaailingen maakt het enten van jonge zaailingen echter zeer uitdagend. In veel gevallen is uitgebreide hands-on training vereist om met succes zaailingengraften te verkrijgen. Er zijn in de loop der jaren veel methodologische verbeteringen geweest die ideale groeiomstandigheden en nieuwe technieken hebben geïdentificeerd om het slagingspercentage van zaailingenen 9,10,11 te verhogen. De meest recente tool die werd geïntroduceerd, was een Arabidopsis-zaailingenchip, waarmee zelfs onervaren gebruikers aanvaardbare niveaus van entsucces kunnen bereiken12. Hoewel deze vooruitgang de technische barrière van zaailingenenten aanzienlijk heeft verlaagd, is het chipapparaat duur en wordt het aantal grafts dat parallel kan worden uitgevoerd snel onbetaalbaar.
Bovendien kan dit apparaat alleen worden gebruikt voor Arabidopsis-zaailingen met hypocotylafmetingen die vergelijkbaar zijn met zaailingen van het wilde type. Hoewel Arabidopsis de hoeksteensoort is in de wereld van de moleculaire genetica van planten, is recent werk gedaan bij andere soorten met behulp van zaailingen. Voorbeelden hiervan zijn het enten van sojabonen en de gewone boon, tabak tot tomaat en koolzaad tot Arabidopsis, en vervolgens het bemonsteren van beide weefsels op kleine RNA's13,14. Daarom is een entmethode die voor de meeste laboratoria toegankelijk is en gemakkelijk kan worden aangepast aan een breed scala aan plantensoorten zonder grote technische veranderingen, zeer wenselijk.
Dit protocol beschrijft een methode die gebruik maakt van interne productie van een eenvoudig entapparaat dat de volledige aanpassing van de diameter en lengte van het entkanaal mogelijk maakt om elke morfologie van zaailingen voor de meeste plantensoorten mogelijk te maken. De productie van deze apparaten is zeer betaalbaar en zeer schaalbaar, omdat de enige componenten die nodig zijn siliconenelastomeer, bedrading of slangen van de juiste grootte, een zeer nauwkeurig mes en een container zijn om als mal te dienen. Volgens het hier beschreven entprotocol kunnen gebruikers succesvolle entpercentages van 45% (n = 105) bereiken, vergelijkbaar met eerder gerapporteerde entresultaten10,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van het apparaat
- Maak het siliconentransplantatieapparaat door siliconenelastomeeroplossing in een vierkante petrischaal (100 mm x 100 mm) te gieten. Bereid 15 ml van de elastomeeroplossing volgens de richtlijnen van de fabrikant.
OPMERKING: Siliconenelastomeerkits bevatten meestal een vloeistof op siliconenbasis en een uithardingsmiddel, dat wanneer het samen wordt gemengd, de siliconen laat stollen. - Bereid de vierkante petrischaal door vier rechte stukken van 29 G-draad in de vierkante petrischaal te leggen, op gelijke afstand van elkaar (figuur 1A). Zorg ervoor dat de draad gelijk ligt met de bodem van de mal. Om de draad volledig recht te trekken, rolt u deze op een hard uniform oppervlak met een zwaar en plat voorwerp (bijvoorbeeld een metalen buizenrek).
OPMERKING: Twist ties bevatten vaak 29 G draad en kunnen worden gebruikt na het verwijderen van de buitenste papiercoating met aceton. - Giet de gemengde siliconenelastomeeroplossing op de draden en dek af met de bovenkant van de petrischaal. Laat de siliconen 24-48 uur uitharden bij kamertemperatuur.
- Verwijder de siliconenplaat van de petrischaal met een schone tang en ga naar een schoon vlak oppervlak.
- Verwijder de draden van het siliconenvel. Verwijder de dunne laag siliconen die aan de buitenkant van het kanaal achterblijft met een fijne punttang, zodat het kanaal aan één kant open is (figuur 1A).
- Knip de siliconenplaat loodrecht op de kanalen in stroken van 3 mm met een schone schaar. Verplaats elke strip naar een aluminiumfolie envelop en sluit af met autoclaaftape.
- Autoclaaf de strips bij 121 °C gedurende ten minste 30 minuten en bewaar ze tot ze klaar zijn voor gebruik.
2. Voorbereiding van zaailingen
- Steriliseer en vernaliseer zaden.
- Suspensie tot 100 Arabidopsis-zaden in 1 ml 50% bleekoplossing met 0,1% Tween 20 in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en incubeer gedurende 5-10 minuten. Verwijder de bleekoplossing door pipetteren of aspiratie onder steriele omstandigheden. Spoel de zaden met 1 ml gesteriliseerd dH2O. Zorg ervoor dat u de buizen omkeert om de zaden voldoende te spoelen en verwijder eventuele bleekoplossing die aan de bovenkant van de buis achterblijft. Herhaal het spoelen 4x.
- Laat ongeveer 0,25 ml water in de buisjes met de zaden en bewaar bij 4 °C gedurende 3 dagen in het donker.
- Plaat de zaden ter voorbereiding op het enten.
- Bereid een 1% agar MS-plaat als volgt: voor 1 L MS (0,5% sucrose) vast medium, meng 4,4 g MS-zout, 5 g sucrose en 10 g agar in 800 ml water, pas de pH aan op 5,7 met KOH en breng vervolgens het totale volume op 1 L met extra water. Autoclaaf gedurende ten minste 20, minuten voordat ~ 25 ml in de vierkante petrischaaltjes wordt gegoten.
- Verplaats onder steriele omstandigheden het juiste aantal bereide zaden naar de plaat, gebruik een pipetpunt van 20 μL om de zaden te aspirateren en over te brengen.
- Plaats een steriele strip op het plaatoppervlak om de plaatsing van het zaad te begeleiden, zodat de zaden zijn uitgelijnd met de kanalen op de strip. Verwijder de strip zodra de zaden zijn geplateerd.
OPMERKING: Een vierkante plaat van 100 mm x 100 mm biedt plaats aan twee rijen zaailingen (figuur 1B). - Zodra de platen rechtop staan, laat u de vloeistof uit het vaste medium verdampen en verzamelt u zich op de bodem van de plaat. Nadat de zaden op de plaat zijn geplaatst, plaatst u deze op de plaatafdekking en sluit u een kant van de plaat af die evenwijdig is aan de twee rijen zaden (aangegeven door het blauw gemarkeerde gebied in figuur 1B) met parafilm. Wikkel ademende tape bovenop de parafilm en rond alle andere randen van de plaat.
- Sta voorzichtig twee platen omhoog met de parafilm-verzegelde kant naar beneden gericht. Scheid de twee platen aan de onderkant door er een horizontale centrifugebuis van 15 ml tussen te plaatsen en vast te zetten met een elastiekje. Zorg ervoor dat de plaatoppervlakken een hoek van 100°-110° vormen met het tafeloppervlak (figuur 1C).
- Bewaar de platen in deze richting gedurende 72 uur in totale duisternis bij 21 °C, zodat de hypocotylen van de zaailing ~ 5 mm lang kunnen worden. Verwijder na 72 uur de platen uit het donker en groei onder 16 uur licht (intensiteit van 100 μE m-2 sec-1) en 8 uur donkere cycli gedurende nog 2-4 dagen bij dezelfde temperatuur voordat u ent.
- Ent de zaailingen tussen 5 en 7 dagen nadat ze zijn verguld. Plaats een entstrook over de zaailingen en plaats hun hypocotylen in de kanalen. Plaats de zaailing voorzichtig zo dat de wortel-hypocotylverbinding aan de onderkant van de siliconenstrip wordt geplaatst om de zaailing voor te bereiden op het snijden (figuur 1D).
3. Entprocedure
- Bereid een steriele werkomgeving voor door een dissectiekijker te ontsmetten met 70% ethanol en twee paar tangen met fijne punt en een scalpelhandvat te autoclaveren. Voer alle entprocedures uit in een steriele kap en met behulp van een dissectiekijker indien nodig. Voer het grootste deel van de enting uit met een vergroting van 10,5x.
- Bereid de telgen voor. Gebruik een vers scalpelmesje om de hypocotyl loodrecht te snijden om een rechte schone snede te creëren. Duw het mes naar voren in plaats van in de plant te drukken om te voorkomen dat de zaailing in de agar wordt geduwd (Video 1).
- Verwijder de scheut. Zorg ervoor dat het gesneden deel van de shoot gehydrateerd blijft door contact met het mediaoppervlak te garanderen. U kunt de scheut ook verplaatsen naar een aangewezen opslaggebied, zoals de bovenkant van een petrischaal gevuld met steriele dH2O, totdat deze klaar is voor gebruik.
- Bereid de onderstammen voor. Trek voorzichtig aan de wortel door de wortel in de ruimte tussen de gesloten tang te vangen en ze te draaien, waarbij het afgesneden gedeelte van de onderstammen in het midden van de strip blijft (Video 2).
OPMERKING: De fragiele wortel zal worden beschadigd als deze direct tussen de gesloten tang wordt geplet, waardoor de wortel in de scherpe hoek van de pincetuiteinden moet worden gewied om het weefsel te manipuleren. - Pak voorzichtig de gewenste scheut op met behulp van de fijne tang en steek deze in de bovenkant van het kanaal.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om het contact tussen de telgen en onderstammen visueel te bevestigen om een succesvol transplantaat te verkrijgen (Video 3). - Nadat alle enten zijn gemaakt, wikkelt u de platen in met parafilm en ademende tape en plaatst u de platen op dezelfde manier als voorheen, zonder de zaailingen of siliconenstrips te verstoren. Verplaats de platen voorzichtig naar een groeikamer ingesteld op 26 °C met 16 h licht/8 h donkere cycli.
- Evalueer de geënte zaailingen onder steriele omstandigheden na 7-10 dagen. Verwijder voorzichtig de siliconenstrip met een tang door één kant te pellen, zodat de kanalen de zaailingen kunnen bevrijden. Verwijder alle onvoorziene wortels die van de telg groeien door ze met een vers scalpelmesje van de telg af te snijden of ze te verpletteren met een fijne tang. Evalueer visueel of de onderstam stevig aan de telg is gehecht om een succesvolle ent te vormen (figuur 2).
- Verplaats succesvolle enten naar zaailing vermeerderingsgrond om zo lang als nodig te groeien is. Bedek de grond een paar dagen met transparant plastic terwijl de zaailingen zich vestigen. Na het overbrengen van de planten naar de grond, groeien onder de eerder genoemde lichte en donkere cycli bij 21 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verschillende aspecten van het ontwerp van de entstrip werden getest om de optimale entomstandigheden te identificeren die de minste hoeveelheid technische vaardigheid vereisten (tabel 1). Alle entproeven werden voltooid op 0,5% sucrose MS-medium, waarvan eerder is gemeld dat het een ideaal entmediumis 11,12.
Optimale zaailinggroei kan niet worden bereikt met ontkieming op de strip
In de eerste iteratie van de siliconenstrip werden ingesloten kanalen gemaakt door de dunne laag siliconen die achterblijft op de achterkant van de stripkanalen te laten nadat de draden van de siliconenvellen zijn verwijderd. In plaats van de zaailingen direct op de plaat te laten ontkiemen en later de entstrook over de zaailing hypocotylen te plaatsen, werden de zaden direct op de strip ontkiemd na het inbrengen van de zaden in het kanaal gevuld met een kleine hoeveelheid MS-medium. Met behulp van deze techniek kwam de helft van de zaailingen vast te zitten in de kanalen tijdens het ontkiemen en slaagde er niet in om zich uit te rekken. Met inbegrip van de niet-gekiemde en de niet-langwerpige zaailingen werden succesvolle entpercentages van 25% (n = 16) bereikt (tabel 1). Om het waargenomen rekfalen aan te pakken, werden zaden zo georiënteerd dat de zaadlobben en het radicaal van het embryo tijdens het ontkiemen naar beneden wezen. Met behulp van deze methode ontkiemde en verlengde 75% van de zaden met succes, wat resulteerde in een lichte toename van de entefficiëntie (33% succes, n = 12) (tabel 1). Om de succesvolle ontwikkeling van zaailingen te bevorderen, werd de dunne laag siliconen die het kanaal sluit verwijderd van de mediumzijde van de entstrook om contact tussen het zaad en het groeimedium mogelijk te maken (figuur 1A). Met behulp van deze methode ontkiemde en langwerpige 85% van de zaailingen met succes en 31% (n = 16) werd met succes geënt (tabel 1). Ondanks het aanzienlijk verhogen van de snelheid van goede zaadontwikkeling op de strip, kan het verliezen van zelfs een klein aantal zaailingen de experimentele populatiegrootte aanzienlijk beïnvloeden bij het uitvoeren van wederzijdse enten tussen verschillende experimentele groepen. Om deze reden werd vastgesteld dat het ontkiemen van zaailingen direct op het medium ideaal was.
Het handhaven van de overlevingskans van zaailingen en het minimaliseren van verwerkingstijd en inspanningen
Zaailingen werden eerst gekweekt voor enting op MS-platen (1% sucrose), overgebracht naar een vast oppervlak (zoals het deksel van een petrischaal gevuld met water) om te snijden, vervolgens geassembleerd op een plaat met de strip voor enten. Met behulp van deze techniek werd een slagingspercentage van 50% (n = 8) waargenomen (tabel 1). Hoewel deze methode het hoogste succespercentage behaalde, was het tijdrovend en inspanningsintensief en vereiste het 2,5 minuten voor elk transplantaat, waardoor het aantal grafts dat tegelijkertijd kon worden geassembleerd, werd beperkt. Om de benodigde tijd en inspanning te verminderen, werden zaailingen verticaal op de entplaat gekweekt (0,5% sucrose) en vervolgens direct voor het enten in de strip ingebracht, zoals beschreven in dit protocol. Om deze methode verder te testen, werden drie proeven van verschillende grootte uitgevoerd. De eerste twee onderzoeken hadden beide een slagingspercentage van 48% (n = 25 en 64) en de derde studie had een slagingspercentage van 25% (n = 16) (tabel 1). Samen wijzen deze onderzoeken op een slagingspercentage van 45% (n = 105). Dit slagingspercentage is vergelijkbaar met de meer tijdrovende methode en vereist ongeveer 1 minuut per ent om de entstrook over de zaailingen te plaatsen en de enting te voltooien (protocolstappen 3.2-3.5).
De mate van entsucces is sterk afhankelijk van de kwaliteit van de entstrookconstructie. Terwijl de eerste twee onderzoeken een slagingspercentage van 48% hebben, heeft de derde studie een lager slagingspercentage. De handgemaakte kwaliteit van de entstrip resulteert inherent in een kleine variabiliteit tussen entplaatsen. Als de draden die worden gebruikt voor de stripconstructie niet volledig recht zijn, zullen de kanalen in de strips niet gelijk zijn met de bodem van de mal en resulteren in kanalen met enigszins variabele diepten. In totaal worden in elk stripgietstuk 25 stroken gemaakt, wat resulteert in 100 unieke entplaatsen (tabel 2). Hoewel het effect van lichte variatie in de entplaatsen in evenwicht wordt gebracht in de twee grotere onderzoeken, lijkt het er in de kleinere studie met lagere succespercentages op dat entplaatsen met meer variatie als gevolg van licht gebogen draden de vorming van transplantaten negatief kunnen beïnvloeden. Om dit type variatie te minimaliseren, wordt een draadrechtrichttechniek beschreven in protocolstap 1.2.
Figuur 1: Illustratie van de stappen van de entvoorbereiding . (A) Model van het ontwerp van de siliconenstrip. Dit paneel demonstreert de vierkante plaatvorm die wordt gebruikt voor het gieten van de siliconenstroken. Vier secties van 29 G-draden van gelijke lengte worden aan de onderkant van de plaat gelegd en siliconenelastomeermengsel wordt erop gegoten (hierboven). Nadat de siliconen volledig zijn uitgehard, wordt het siliconenvierkant van de plaat verwijderd en worden de draden verwijderd om de entkanalen te creëren. Een dun laagje siliconen blijft achter op de bodem van de kanalen nadat de draden zijn verwijderd (aangegeven met *). Deze laag moet worden verwijderd om de kanalen aan de onderkant (hieronder) open te laten. Het vierkant wordt vervolgens loodrecht op de draadkanalen in stroken van 3 mm gesneden, zoals aangegeven door de stippellijnen (hierboven). B) Plaatsing van het zaad op de entplaat. Met behulp van een steriele strip worden twee rijen zaden op de plaat geplaatst in lijn met de stripkanalen. Na het plaatsen van de zaden moet deze strip worden verwijderd om kiemhinder te voorkomen. Om MS-platen voor te bereiden op verticale groei, moet parafilm langs de onderste (wortelzijde) rand van de plaat worden gewikkeld, hier gemarkeerd met blauwe markering. (C) Verticale plaatpositie voor zaadkieming. Na het plateren worden de zaden verticaal ontkiemd op schuine platen. Een conische buis van 15 ml wordt aan de basis van twee platen geplaatst om een enigszins stompe hoek tussen het plaatoppervlak en het tafelblad te creëren. De geparafilmeerde rand (gemarkeerd met blauw) van de plaat is gericht op het tafeloppervlak. Een elastiekje is om de bovenkant van de twee platen gewikkeld om ze op hun plaats te houden. (D) Plaatsing van de zaailing in de strip direct vóór het enten. Steriele entstrips worden bovenop de zaailingen geplaatst met hypocotylen in de stripkanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afbeelding vastgelegd op een dissectiekijker met een genezen entplaats. De zwarte pijl geeft de entverbindingsplaats aan en de rode pijlen geven onvoorziene wortels aan die tijdens het entevaluatieproces zijn verwijderd. Schaalbalk = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Demonstratie van actief enten met behulp van levende plantenbeeldvorming. De plaatsing en beweging van het scalpelmes om een schone snede te creëren. De zaailing hypocotyl wordt direct boven de entstrook gesneden door het scalpelblad naar voren te duwen. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Het plaatsen van de gesneden onderstam hypocotyl voor enting in de strip. De onderstam wordt voorzichtig getrokken met behulp van een tang om de entverbindingsplaats in het midden van de strip te plaatsen. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 3: Het plaatsen van de telg en het voltooien van de enting. De telg wordt vervangen en in de strip geduwd totdat deze aansluit op de onderstam. De juiste uitlijning en contact wordt geëvalueerd door de hypocotyl te zien reageren wanneer de telg licht wordt geduwd. Klik hier om deze video te downloaden.
Tabel 1: Enten studievariabelen en slagingspercentages. Deze tabel geeft een overzicht van de resultaten van de entproeven die zijn gebruikt om het optimale entprotocol voor de hoogste slagingspercentages te bepalen. De variabelen die in deze onderzoeken zijn onderzocht, zijn onder meer kiemomstandigheden voor zaailingen, siliconenstripconstructie en wanneer zaailingen tijdens het enten in de siliconenstripkanalen werden ingebracht. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Het aantal entplaatsen dat kan worden gegenereerd uit een fles siliconenelastomeer van 250 ml. De prijs voor elke productie-eenheid wordt ook hier weergegeven (op het moment van publicatie) en kan eenvoudig worden aangepast aan schommelingen in de marktwaarde van de siliconenelastomeerreagentia. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samenvatting en betekenis
Vorming van een entunie is cruciaal voor een succesvolle enting, die direct en ongestoord contact tussen de onderstam en de telg vereist. De miniatuurgrootte en kwetsbaarheid van zaailingen van kleine planten zoals Arabidopsis maakt het technisch uitdagend om aan deze eis te voldoen. Een techniek die werd ontwikkeld in vroege Arabidopsis-zaailingenentmethoden was om zowel de telg als de onderstam in een korte siliconenbuiskraag te steken om de entverbinding10 te ondersteunen. Hoewel deze methode zeer effectief is in het beschermen van de twee entdelen tegen scheiding, is het geen gemakkelijke taak om de fragiele telg en onderstam in een buis met smalle boring te plaatsen. Bovendien maakt de verdikking op de kruising van de groei het vaak moeilijk om de siliconenbuizen met smalle boring te verwijderen zonder de geënte zaailingen te beschadigen. Andere methoden gebruikten alternatieve technieken om het gebruik van een entkraag te vermijden en tegelijkertijd te voorkomen dat zaailingen tijdens de groei bewegen, waaronder het verwijderen van beide zaadlobben van de telgen en het kweken van geënte zaailingen op een schuin oppervlak 9,11. Hoewel deze methoden weinig middelen vereisen om te voltooien, resulteerden deze methoden bij het testen in hoge niveaus van telg-migratie weg van de onderstam, wat resulteerde in een lager entsucces dan gerapporteerd (gemiddeld 80% voor de aanbevolen omstandigheden in beide onderzoeken) met behulp van deze technieken. Bovendien vereisen ze beide dat de gebruiker de interface tussen de entzaailingdelen zonder hulpmiddelen uitlijnt, een taak die een hoog niveau van vaardigheid vereist. Een micrografting-chip die speciaal is ontworpen voor Arabidopsis-zaailingentransplantatie is onlangs gemeld12. Elke chip bevat vier microkamers om vier zaailingen te laten groeien, met het speciale ontwerp van de kamerruimte waardoor de hypocotyl in een microkanaal kan groeien. De onderstammen worden ter plaatse op de chip gegenereerd en de telgen worden in de microkanalen gestoken. Dit elimineert de noodzaak om zowel onderstammen als telgen te hanteren voor enten, en het microkanaal beperkt de enting op zijn plaats zonder het gemak van het verwijderen van zaailingen op te offeren zodra de entunie is gevormd. Hoewel deze nieuwe methode de technische barrière van zaailingentransplantatie aanzienlijk vermindert, vereist de fabricage van de micrografting-chip Micro-Electro Mechanical Systems (MEMS), een technologie die niet gemakkelijk toegankelijk is voor de meeste biologielaboratoria. De afmetingen van de microkamer op de micrograftingchip werden geoptimaliseerd voor Arabidopsis Col-012. Dit voorkomt het gebruik van de chips voor andere soorten of verschillende Arabidopsis toetredingen/mutanten met hypocotylen die variëren in hoogte of dikte15,16,17.
De goedkope, flexibele en gemakkelijk te volgen methode die hier wordt beschreven, is geïnspireerd op eerder microenting-chipwerk om het enten van jonge zaailingen te vergemakkelijken. Bij deze methode is de manipulatie van delicate zaailingen minimaal, waardoor het gebruik voor nieuwe gebruikers wordt vergemakkelijkt. De kanalen in de stroken helpen nieuwe gebruikers bij het uitlijnen van de geënte zaailingen en houden de wortel en de scheut in goed contact tijdens de vorming van de entplaats, terwijl ze ook zorgen voor eenvoudige verwijdering nadat de ent is gevormd. Vanwege de hoge doorvoerproductie van de siliconenstrips en de relatief lage kosten van de uitgangsmaterialen, kan het enten van grote aantallen zaailingen worden bereikt tegen een fractie van de kosten van de microentchips. Dit zelfgemaakte apparaat kost naar schatting $ 0,12 per entplaats, waardoor dit een economische optie is voor laboratoria die werken met een verscheidenheid aan plantensoorten of zaailingfenotypen (tabel 2). Hoewel het handgemaakte aspect van de entstrips de kosten van deze methode verlaagt, introduceert het ook de kans op variabiliteit tussen verschillende strips. Zoals eerder benadrukt, is de kwaliteit van de entstroken de sleutel tot het succes van deze methode. De toename van het gebruik van zaailingentransplantatie in een vroeg stadium in de moleculaire genetica heeft het gebied van plantengenetica een krachtig hulpmiddel gegeven voor het bestuderen van langeafstandssignalering in planten. Deze eenvoudige, goedkope en gemakkelijk toegankelijke methode biedt een ander hulpmiddel om een succesvolle adoptie van de zaailingeningstechniek door laboratoria met minimale voorafgaande training en ervaring te vergemakkelijken.
Kritische overwegingen
Processen zoals het initiëren van een wondherstelreactie, het tot stand brengen van cel-tot-cel communicatie tussen de telg en onderstam, en uiteindelijk vaatvorming, zijn noodzakelijk voor de vorming van een succesvol transplantaat9. Tijdens het entproces is het belangrijk om de zaailingen gehydrateerd en onbeschadigd te houden buiten de noodzaak. Bij deze methode moeten de afgesneden uiteinden van de wortels en telgen schoon en loodrecht zijn om een vlakke verbinding tussen de telg en de onderstam te garanderen. Als de entplaats tijdens het snijden wordt beschadigd of als de entstukken niet onder dezelfde hoek worden gesneden, is succesvol enten onwaarschijnlijk vanwege een gebrek aan nauw contact tussen cellagen over de entverbinding. Als een van de entdelen van de plant mag drogen of beschadigd is, worden de eerder genoemde processen geremd en zal enten niet succesvol zijn. Jonge zaailingen zijn kwetsbaar en gemakkelijk te verpletteren door een tang. Als gebruikers het nodig vinden, kan de tang worden gebruikt om een van de twee zaadlobben vast te houden om de telg te manoeuvreren. In vergelijking met de eerder gemelde entchipmethode is de kans om de onderstam te beschadigen terwijl het hypocotyl in de siliconenstrip wordt getrokken, vergroot. Behandelingstechnieken om dit risico te minimaliseren worden beschreven in protocolstap 3.4.
Een totaal van vier entplaatsen per strook is het aanbevolen aantal posities om ervoor te zorgen dat de zaailingen elkaar niet raken tijdens de fase van ent-junctievorming. Om het totale aantal grafts dat in één keer wordt uitgevoerd op te schalen, wordt aanbevolen dat gebruikers het aantal gebruikte platen verhogen in plaats van de hoeveelheid ruimte die per graft wordt gebruikt.
Wijziging van het protocol is mogelijk om afwijkende hypocotylgroei of niet-Arabidopsis-soorten te accommoderen
Sommige mutanten etioleren met verschillende snelheden dan wilde planten. Fytohormonen zoals gibberellines, brassinosteroïden, ethyleen en auxine spelen een uitgebreide rol bij de regulering van de groei van zaailingen18,19,20. Mutante lijnen die defect zijn in deze hormoonroutes kunnen atypische etiolatiesnelheden ervaren16,17. Het door de gebruiker gecontroleerde ontwerp van de entstrip maakt het mogelijk om deze fenotypische verschillen op te vangen, maar in deze gevallen is voldoende testen vereist. Als een genetische lijn wordt gebruikt die etiolatie ervaart met aanzienlijk andere snelheden dan het wilde type, moeten gebruikers bepalen of de hier beschreven etiolatieperiode van 3 dagen geschikt is voor hun lijnen voordat ze beginnen. Onvoldoende geëtioleerde zaailingen zullen resulteren in moeilijk enten als gevolg van een verkorte of te verlengde (en dunnere) hypocotyl. Gebruikers die geïnteresseerd zijn in het enten van zaailingen van andere soorten dan Arabidopsi'skunnen dit protocol aanpassen aan hun behoeften door de diameter van het entkanaal te wijzigen. Tomaten- en tabakszaailingen die tot de juiste entleeftijd zijn gekweekt, lijken respectievelijk entingkanalen met een diameter van 0,8 en 0,4 mm nodig te hebben9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Met dank aan Javier Brumos voor de initiële training en begeleiding bij het enten van Arabidopsis zaailingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E.
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y.
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
