Summary
Ce protocole décrit une méthode de greffe de plantules robuste qui ne nécessite aucune expérience ou formation préalable et peut être exécutée à très faible coût en utilisant des matériaux facilement accessibles dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire.
Abstract
La greffe de semis à un stade précoce est devenue un outil populaire en génétique moléculaire pour étudier les relations racine-pousse au sein des plantes. La greffe de semis à un stade précoce de la petite plante modèle, Arabidopsis thaliana, est techniquement difficile et prend beaucoup de temps en raison de la taille et de la fragilité de ses semis. Une collection croissante de méthodes publiées décrivent cette technique avec des taux de réussite, des difficultés et des coûts associés variables. Cet article décrit une procédure simple pour fabriquer un dispositif de greffage réutilisable interne à l’aide d’un mélange d’élastomère de silicone, et comment utiliser ce dispositif pour la greffe de semis. Au moment de la présente publication, la production de chaque dispositif de greffe réutilisable ne coûte que 0,47 $ en matériaux consommables. En utilisant cette méthode, les débutants peuvent avoir leurs premiers plants greffés avec succès en moins de 3 semaines du début à la fin. Cette procédure hautement accessible permettra aux laboratoires de génétique moléculaire des plantes d’établir la greffe de semis comme une partie normale de leur processus expérimental. En raison du contrôle total que les utilisateurs ont dans la création et la conception de ces dispositifs de greffe, cette technique pourrait être facilement ajustée pour une utilisation dans des plantes plus grandes, telles que la tomate ou le tabac, si désiré.
Introduction
Le greffage est une technique horticole ancienne qui est devenue une pratique agricole établie en 500 avant notre ère1. La greffe de différentes variétés de plantes cultivées pour améliorer les rendements a été la première utilisation de cette technique et continue d’être utilisée à cette fin aujourd’hui. Au cours de la dernière décennie, la greffe a attiré de plus en plus l’attention en tant qu’outil permettant aux biologistes moléculaires d’étudier la signalisation à longue distance chez les plantes 2,3,4,5. Bien que la greffe de plantes adultes soit relativement facile, il est difficile de greffer des plantes peu de temps après la germination. Malgré cela, il est parfois nécessaire d’évaluer les effets de la signalisation à longue distance dans des processus tels que le développement des plantes, les réponses environnementales et la floraison 6,7,8.
Arabidopsis thaliana a été établi comme l’organisme modèle en biologie végétale pour de nombreuses raisons, y compris sa taille relativement petite, ce qui le rend facile à cultiver à l’intérieur d’un laboratoire. Cependant, la petite taille et la fragilité des plants d’Arabidopsis rendent la greffe de jeunes plants très difficile. Dans de nombreux cas, une formation pratique approfondie est nécessaire pour réussir à obtenir des greffes de semis. Il y a eu de nombreuses améliorations méthodologiques au fil des ans qui ont permis d’identifier des conditions de croissance idéales et de nouvelles techniques pour augmenter le taux de réussite de la greffe de semis 9,10,11. L’outil le plus récent introduit était une puce de greffe de plantules Arabidopsis, qui permet même aux utilisateurs inexpérimentés d’atteindre des niveaux acceptables de réussite de greffe12. Bien que cette avancée ait considérablement abaissé la barrière technique de la greffe de semis, le dispositif de puce est coûteux et le nombre de greffes pouvant être effectuées en parallèle devient rapidement prohibitif.
De plus, cet appareil ne peut être utilisé que pour les plantules d’Arabidopsis qui ont des dimensions hypocotyles similaires à celles des plantules de type sauvage. Bien qu’Arabidopsis soit l’espèce clé dans le monde de la génétique moléculaire des plantes, des travaux récents ont été effectués sur d’autres espèces en utilisant la greffe de semis. Les exemples incluent la greffe de soja et de haricot commun, le tabac à la tomate et le canola à Arabidopsis, puis l’échantillonnage des deux tissus pour les petits ARN13,14. Par conséquent, une méthode de greffage accessible à la plupart des laboratoires et pouvant être facilement adaptée à un large éventail d’espèces végétales sans modification majeure de la technique est hautement souhaitable.
Ce protocole détaille une méthode qui utilise la production interne d’un dispositif de greffage simple qui permet la personnalisation complète du diamètre et de la longueur du canal de greffage pour s’adapter à toute morphologie de semis chez la plupart des espèces végétales. La production de ces appareils est très abordable et hautement évolutive, car les seuls composants nécessaires sont un élastomère de silicone, un câblage ou un tube de la bonne taille, une lame de haute précision et un récipient pour servir de moule. En suivant le protocole de greffe détaillé ici, les utilisateurs peuvent obtenir des taux de greffe réussis de 45% (n = 105), comparables aux résultats de greffe précédemment rapportés10,12.
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Protocol
1. Préparation de l’appareil
- Fabriquer le dispositif de greffe de silicone en coulant une solution d’élastomère de silicone dans une boîte de Petri carrée (100 mm x 100 mm). Préparer 15 mL de la solution élastomère en suivant les directives du fabricant.
REMARQUE: Les kits d’élastomère de silicone comprennent généralement un liquide à base de silicone et un agent de durcissement qui, lorsqu’ils sont mélangés, permettent au silicone de se solidifier. - Préparez la boîte de Petri carrée en déposant quatre morceaux droits de fil de 29 G dans la boîte de Petri carrée, équidistants les uns des autres (Figure 1A). Assurez-vous que le fil affleure le fond du moule. Pour redresser complètement le fil, roulez-le sur une surface dure et uniforme avec un objet lourd et plat (par exemple, un support de tubes métalliques).
REMARQUE: Les attaches torsadées contiennent souvent un fil de 29 G et peuvent être utilisées après avoir retiré le revêtement extérieur de papier avec de l’acétone. - Versez la solution d’élastomère de silicone mélangée sur les fils et couvrez avec le dessus de la boîte de Pétri. Laisser durcir le silicone pendant 24-48 h à température ambiante.
- Retirez la feuille de silicone de la boîte de Petri à l’aide d’une pince propre et déplacez-la sur une surface plane et propre.
- Retirez les fils de la feuille de silicone. Retirez la fine couche de silicone restant à l’extérieur du canal à l’aide d’une pince à pointe fine, pour permettre au canal d’être ouvert d’un côté (Figure 1A).
- Couper la feuille de silicone perpendiculairement aux canaux en bandes de 3 mm à l’aide de ciseaux propres. Déplacez chaque bande dans une enveloppe en papier d’aluminium et scellez-la avec du ruban autoclave.
- Autoclaver les bandes à 121 °C pendant au moins 30 min et conserver jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.
2. Préparation des plantules
- Stériliser et vernaliser les graines.
- Suspendre jusqu’à 100 graines d’Arabidopsis dans 1 mL de solution d’eau de Javel à 50 % contenant 0,1 % de Tween 20 dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et incuber pendant 5 à 10 minutes. Retirer la solution d’eau de Javel par pipetage ou aspiration dans des conditions stériles. Rincer les graines avec 1 mL de dH2O stérilisé. Assurez-vous d’inverser les tubes pour rincer adéquatement les graines et retirez toute solution d’eau de Javel laissée au sommet du tube. Répétez le rinçage 4x.
- Laisser environ 0,25 mL d’eau dans les tubes avec les graines et conserver à 4 °C pendant 3 jours dans l’obscurité.
- Plaquer les graines en préparation pour la greffe.
- Préparer une plaque de gélose MS à 1 % comme suit : pour 1 L de milieu solide MS (0,5 % saccharose), mélanger 4,4 g de sel MS, 5 g de saccharose et 10 g de gélose dans 800 mL d’eau, ajuster le pH à 5,7 avec KOH, puis porter le volume total à 1 L avec de l’eau supplémentaire. Autoclave pendant au moins 20, min avant de verser ~25 ml dans les boîtes de Petri carrées.
- Dans des conditions stériles, déplacer le nombre approprié de graines préparées dans l’assiette, à l’aide d’un embout de pipette de 20 μL pour aspirer et transférer les graines.
- Placez une bande stérile sur la surface de la plaque pour guider le positionnement des graines, de sorte que les graines soient alignées avec les canaux sur la bande. Retirez la bande une fois les graines plaquées.
REMARQUE : Une plaque carrée de 100 mm x 100 mm peut accueillir deux rangées de semis (figure 1B). - Une fois que les plaques sont debout, laissez le liquide s’évaporer du milieu solide et accumulez au fond de la plaque. Une fois les graines placées sur l’assiette, placez sur le couvercle de la plaque et scellez un côté de la plaque parallèle aux deux rangées de graines (indiquées par la région surlignée en bleu à la figure 1B) avec un parafilm. Enroulez du ruban adhésif respirant sur le dessus du parafilm et autour de tous les autres bords de la plaque.
- Dressez soigneusement deux plaques avec le côté scellé au parafilm vers le bas. Séparez les deux plaques au fond en plaçant un tube centrifuge horizontal de 15 mL entre elles et fixez-les à l’aide d’un élastique. Assurez-vous que les surfaces de la plaque forment un angle de 100°-110° avec la surface de paillasse (Figure 1C).
- Conserver les plaques dans cette orientation pendant 72 h dans l’obscurité totale à 21 °C, pour permettre aux hypocotyles de la plantule de croître ~5 mm de longueur. Après 72 h, retirez les plaques de l’obscurité et poussez sous 16 h de lumière (intensité de 100 μE m-2 sec-1) et 8 h de cycles d’obscurité pendant 2-4 jours de plus à la même température avant la greffe.
- Greffez les plants entre 5 et 7 jours après avoir été plaqués. Placez une bande de greffe sur les plantules en insérant leurs hypocotyles dans les canaux. Positionner doucement le semis de manière à ce que la jonction racine-hypocotyle soit positionnée au bas de la bande de silicone pour préparer le semis à la coupe (figure 1D).
3. Procédure de greffe
- Préparez un environnement de travail stérile en désinfectant une lunette de dissection avec de l’éthanol à 70 % et en autoclavant deux paires de pinces à pointe fine et un manche de scalpel. Effectuer toutes les procédures de greffe dans une goulotte stérile et à l’aide d’une lunette de dissection au besoin. Effectuez la majeure partie de la greffe en utilisant un grossissement de 10,5x.
- Préparez les scions. Utilisez une lame de scalpel fraîche pour couper l’hypocotyle perpendiculairement afin de créer une coupe droite et nette. Poussez la lame vers l’avant plutôt que d’appuyer vers le bas dans la plante pour éviter que le semis ne soit poussé dans la gélose (vidéo 1).
- Retirez la pousse. Prenez soin de garder la partie coupée de la pousse hydratée en assurant le contact avec la surface du support. Vous pouvez également déplacer la pousse dans une zone d’attente désignée, telle que le dessus d’une boîte de Petri remplie de dH2O stérile, jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.
- Préparez les porte-greffes. Tirez doucement la racine en attrapant la racine dans l’espace laissé entre les pinces fermées et en les tournant, en laissant la section coupée des porte-greffes au milieu de la bande (vidéo 2).
REMARQUE: La racine fragile sera endommagée si elle est écrasée directement entre les pinces fermées, ce qui nécessite de coincer la racine dans l’angle aigu des extrémités de la pince à épiler pour manipuler le tissu. - Prenez doucement la pousse désirée à l’aide de la pince à pointe fine et insérez-la dans le haut du canal.
REMARQUE : Il est essentiel de confirmer visuellement le contact entre les greffons et les porte-greffes pour obtenir une greffe réussie (vidéo 3). - Une fois que toutes les greffes ont été faites, enveloppez les plaques avec du parafilm et du ruban respirant et installez les plaques de la même manière qu’auparavant, sans déranger les plants ou les bandes de silicone. Déplacez délicatement les plaques dans une chambre de croissance réglée à 26 °C avec 16 h de cycles de lumière/8 h d’obscurité.
- Évaluer les plants greffés dans des conditions stériles après 7 à 10 jours. Retirez délicatement la bande de silicone à l’aide d’une pince en décollant un côté, ce qui permet aux canaux de libérer les semis. Enlevez toutes les racines adventives qui poussent à partir du greffon en les coupant du greffon avec une lame de scalpel fraîche ou en les écrasant à l’aide d’une pince à pointe fine. Évaluez visuellement si le porte-greffe s’est solidement attaché au greffon pour former un greffon réussi (Figure 2).
- Déplacer les greffons réussis vers le sol de multiplication des semis pour qu’ils poussent aussi longtemps que nécessaire. Couvrez le sol avec du plastique transparent pendant quelques jours pendant que les semis s’établissent. Après avoir transféré les plantes dans le sol, cultivez sous les cycles de lumière et d’obscurité mentionnés précédemment à 21 ° C.
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Representative Results
Divers aspects de la conception de la bandelette de greffe ont été testés afin d’identifier les conditions de greffe optimales qui nécessitaient le moins de compétences techniques (tableau 1). Tous les essais de greffe ont été réalisés sur un milieu de SEP à 0,5 %, qui a déjà été signalé comme un milieu de greffe idéal11,12.
La croissance optimale des plantules ne peut pas être obtenue avec la germination sur bandelette
Dans la première itération de la bande de silicone, les canaux fermés ont été fabriqués en laissant la fine couche de silicone qui reste à l’arrière des canaux de bande après le retrait des fils des feuilles de silicone. Au lieu de faire germer les plantules directement sur la plaque et de placer plus tard la bande de greffe sur les hypocotyles des plantules, les graines ont germé directement sur la bandelette après avoir inséré les graines dans le canal rempli d’une petite quantité de milieu MS. En utilisant cette technique, la moitié des plantules restaient coincées dans les canaux pendant la germination et ne s’allongeaient pas. En incluant les plantules non germées et les plantules non allongées, des taux de greffage réussis de 25 % (n = 16) ont été atteints (tableau 1). Pour remédier à l’échec d’allongement observé, les graines ont été orientées de manière à ce que les cotylédons et les radicaux de l’embryon pointent vers le bas pendant la germination. En utilisant cette méthode, 75% des graines ont germé et se sont allongées avec succès, ce qui a entraîné une légère augmentation de l’efficacité de greffe (33% de réussite, n = 12) (tableau 1). Pour favoriser le développement réussi des semis, la fine couche de silicone fermant le canal a été retirée du côté moyen de la bande de greffe pour permettre le contact entre la graine et le milieu de croissance (figure 1A). En utilisant cette méthode, 85% des plantules ont germé et se sont allongées avec succès, et 31% (n = 16) ont été greffées avec succès (tableau 1). Malgré l’augmentation significative du taux de développement approprié des graines sur la bande, la perte même d’un petit nombre de plantules peut avoir un impact significatif sur la taille de la population expérimentale lors de la réalisation de greffes réciproques entre différents groupes expérimentaux. Pour cette raison, la germination des semis directement sur la surface moyenne a été jugée idéale.
Maintenir le taux de survie des semis et minimiser le temps et les efforts de traitement
Les plantules ont d’abord été cultivées pour être greffées sur des plaques de MS (1% de saccharose), transférées sur une surface solide (comme le couvercle d’une boîte de Petri remplie d’eau) pour la coupe, puis assemblées sur une plaque avec la bande pour greffage. En utilisant cette technique, un taux de réussite de 50 % (n = 8) a été observé (tableau 1). Bien que cette méthode ait obtenu le taux de réussite le plus élevé, elle prenait beaucoup de temps et d’efforts, nécessitant 2,5 minutes pour chaque greffe, limitant le nombre de greffons pouvant être assemblés en même temps. Pour réduire le temps et les efforts requis, les plantules ont été cultivées verticalement sur la plaque de greffage (0,5% de saccharose), puis insérées dans la bande directement avant la greffe, comme décrit dans ce protocole. Pour tester davantage cette méthode, trois essais de différentes tailles ont été menés. Les deux premiers essais avaient tous deux un taux de réussite de 48 % (n = 25 et 64) et le troisième essai avait un taux de réussite de 25 % (n = 16) (Tableau 1). Ensemble, ces essais indiquent un taux de réussite de 45 % (n = 105). Ce taux de réussite est comparable à la méthode plus longue et nécessite environ 1 minute par greffon pour placer la bandelette de greffage sur les plantules et terminer la greffe (étapes du protocole 3.2-3.5).
Le taux de réussite de la greffe dépend fortement de la qualité de la construction de la bande de greffe. Alors que les deux premiers essais ont un taux de réussite de 48%, le troisième essai a un taux de réussite inférieur. La qualité artisanale de la bande de greffage entraîne intrinsèquement une légère variabilité entre les sites de greffe. Si les fils utilisés pour la construction des bandes ne sont pas complètement droits, les canaux dans les bandes ne seront pas alignés avec le fond du moule et donneront des canaux de profondeurs légèrement variables. Au total, 25 bandes sont fabriquées dans chaque coulée de bandes, ce qui donne 100 sites de greffage uniques (tableau 2). Alors que l’effet d’une légère variation dans les sites de greffe est équilibré dans les deux essais plus importants, dans l’essai plus petit avec des taux de réussite plus faibles, il semble que les sites de greffe avec plus de variation en raison de fils légèrement incurvés puissent avoir un impact négatif sur la formation du greffon. Pour minimiser ce type de variation, une technique de redressement de fil est décrite à l’étape 1.2 du protocole.
Figure 1 : Illustration des étapes de préparation de la greffe. (A) Modèle de la conception du moule en bande de silicone. Ce panneau montre le moule de plaque carrée utilisé pour couler les bandes de silicone. Quatre sections de fils de 29 G de longueur égale sont posées au bas de la plaque et un mélange d’élastomère de silicone est versé dessus (ci-dessus). Une fois que le silicone a complètement durci, le carré de silicone est retiré de la plaque et les fils sont retirés pour créer les canaux de greffe. Une fine couche de silicone reste au fond des canaux après le retrait des fils (indiqué par *). Cette couche doit être retirée pour laisser les canaux ouverts en bas (ci-dessous). Le carré est ensuite découpé perpendiculairement aux canaux métalliques en bandes de 3 mm, comme le montrent les lignes pointillées (ci-dessus). (B) Positionnement des graines sur la plaque de greffe. À l’aide d’une bande stérile, deux rangées de graines sont positionnées sur la plaque dans l’alignement des canaux de la bande. Après avoir placé les graines, cette bande doit être retirée pour éviter tout obstacle à la germination. Pour préparer les plaques MS à la croissance verticale, le parafilm doit être enroulé le long du bord inférieur (côté racine) de la plaque, marqué ici d’un surlignage bleu. (C) Position verticale de la plaque pour la germination des graines. Après le placage, les graines sont germées verticalement sur des plaques inclinées. Un tube conique de 15 mL est placé à la base de deux plaques pour créer un angle légèrement obtus entre la surface de la plaque et le plan de travail. Le bord parafilmé (marqué de bleu) de la plaque est orienté vers la surface de la paillasse. Un élastique est enroulé autour du dessus des deux plaques pour les maintenir en place. (D) Positionnement des plantules dans la bande directement avant la greffe. Des bandes de greffe stériles sont placées sur les plantules avec des hypocotyles à l’intérieur des canaux de bandelettes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Image capturée sur une lunette de dissection montrant un site de greffe cicatrisé. La flèche noire indique le site de jonction du greffon et les flèches rouges indiquent les racines adventives qui ont été enlevées pendant le processus d’évaluation du greffon. Barre d’échelle = 0,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : Démonstration de greffage actif à l’aide de l’imagerie de plantes vivantes. Le placement et le mouvement de la lame du scalpel pour créer une coupe nette. L’hypocotyle de la plantule est coupé directement au-dessus de la bande de greffe en poussant la lame du scalpel vers l’avant. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2: Positionnement de l’hypocotyle du porte-greffe coupé pour la greffe dans la bandelette. Le porte-greffe est doucement tiré à l’aide d’une pince pour positionner le site de jonction du greffon au milieu de la bande. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 3 : Placer le greffon et terminer la greffe. Le greffon est remplacé et poussé dans la bande jusqu’à ce qu’il se connecte au porte-greffe. L’alignement et le contact appropriés sont évalués en voyant l’hypocotyle réagir lorsque le greffon est légèrement poussé. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Tableau 1 : Variables de l’essai de greffe et taux de réussite. Ce tableau résume les résultats des essais de greffe utilisés pour déterminer le protocole de greffe optimal pour les taux de réussite les plus élevés. Les variables examinées dans ces essais comprennent les conditions de germination des semis, la construction des bandes de silicone et le moment où les plantules ont été insérées dans les canaux de la bande de silicone pendant la greffe. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Nombre de sites de greffe pouvant être générés à partir d’une bouteille de 250 ml d’élastomère de silicone. Le prix de chaque unité de production est également indiqué ici (au moment de la publication) et peut être facilement ajusté en fonction des fluctuations de la valeur marchande des réactifs en élastomère de silicone. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Résumé et importance
La formation d’une union de greffe est cruciale pour une greffe réussie, qui nécessite un contact direct et non perturbé entre le porte-greffe et le greffon. La taille miniature et la fragilité des semis de petites plantes telles qu’Arabidopsis rendent techniquement difficile de répondre à cette exigence. Une technique développée dans les premières méthodes de greffe de plantules d’Arabidopsis consistait à insérer à la fois le greffon et le porte-greffe dans un court collier de tuyau en silicone pour soutenir la jonction de greffe10. Bien que cette méthode soit très efficace pour protéger les deux parties du greffon de la séparation, il n’est pas facile d’insérer le greffon fragile et le porte-greffe dans un tube à alésage étroit. De plus, l’épaississement à la jonction de la croissance rend souvent difficile l’élimination des tubes en silicone à faible alésage sans endommager les plantules greffées. D’autres méthodes ont utilisé des techniques alternatives pour éviter l’utilisation d’un collier de greffage tout en empêchant les plantules de bouger pendant la croissance, y compris le retrait des deux cotylédons des greffons et la croissance des plantules greffées sur une surface oblique 9,11. Bien que ces méthodes nécessitent peu de ressources, lorsqu’elles ont été mises à l’essai, elles ont entraîné des niveaux élevés de migration des greffons loin du porte-greffe, ce qui a entraîné un succès de greffe inférieur à celui rapporté (80% en moyenne pour les conditions recommandées dans les deux études) en utilisant ces techniques. De plus, ils exigent tous deux que l’utilisateur aligne l’interface entre les parties des plants de greffe sans aucune aide, une tâche nécessitant un haut niveau de compétence. Une puce de microgreffe conçue spécifiquement pour la greffe de plantules d’Arabidopsis a récemment été signalée12. Chaque puce contient quatre micro-chambres pour permettre à quatre plantules de se développer, avec la conception spéciale de l’espace de la chambre permettant à l’hypocotyle de se développer à l’intérieur d’un micro-canal. Les porte-greffes sont générés sur place sur la puce et les greffons sont insérés dans les micro-canaux. Cela élimine le besoin de manipuler à la fois des porte-greffes et des greffons pour la greffe, et le micro-canal confine la greffe en place sans sacrifier la facilité d’enlèvement des plantules une fois l’union du greffon formée. Bien que cette nouvelle méthode réduise considérablement la barrière technique de la greffe des semis, la fabrication de la puce de microgreffe nécessite des systèmes micro-électromécaniques (MEMS), une technologie difficilement accessible à la plupart des laboratoires de biologie. Les dimensions de la micro-chambre sur la puce de microgreffe ont été optimisées pour Arabidopsis Col-012. Cela empêche l’utilisation des puces pour d’autres espèces ou différentes accessions / mutants d’Arabidopsis qui ont des hypocotyles dont la hauteur ou l’épaisseur varie 15,16,17.
La méthode peu coûteuse, flexible et facile à suivre décrite ici a été inspirée par des travaux antérieurs de microgreffage de puces pour faciliter la greffe de jeunes semis. Dans cette méthode, la manipulation de semis délicats est minimale, ce qui facilite l’utilisation pour les nouveaux utilisateurs. Les canaux dans les bandes aident les nouveaux utilisateurs à aligner les plantules greffées et à maintenir la racine et la pousse en bon contact pendant la formation du site de greffe, tout en assurant un retrait facile après la formation du greffon. En raison de la production à haut débit des bandes de silicone et du coût relativement faible des matériaux de départ, la greffe d’un grand nombre de plants peut être réalisée à une fraction du coût des puces de microgreffe. Le coût de ce dispositif maison est estimé à 0,12 $ par site de greffe, ce qui en fait une option économique pour les laboratoires travaillant avec une variété d’espèces végétales ou de phénotypes de semis (tableau 2). Bien que l’aspect artisanal des bandes de greffe diminue les coûts associés à cette méthode, il introduit également un risque de variabilité entre les différentes bandes. Comme souligné précédemment, la qualité des bandelettes de greffe est la clé du succès de cette méthode. L’augmentation de l’utilisation de la greffe de semis à un stade précoce en génétique moléculaire a donné au domaine de la génétique végétale un outil puissant pour étudier la signalisation à longue distance chez les plantes. Cette méthode simple, peu coûteuse et facilement accessible fournira un autre outil pour faciliter l’adoption réussie de la technique de greffe de semis par des laboratoires ayant une formation et une expérience préalables minimales.
Considérations critiques
Des processus tels que l’initiation d’une réponse de réparation de la plaie, l’établissement d’une communication de cellule à cellule entre le greffon et le porte-greffe, et finalement la formation du système vasculaire, sont nécessaires à la formation d’une greffe réussie9. Pendant le processus de greffe, il est important de garder les plantules hydratées et intactes au-delà de la nécessité. En utilisant cette méthode, les extrémités coupées des racines et des greffons doivent être propres et perpendiculaires pour assurer une connexion affleurante entre le greffon et le porte-greffe. Si le site de greffe est endommagé pendant la coupe ou si les morceaux de greffe ne sont pas coupés sous le même angle, une greffe réussie est peu probable en raison d’un manque de contact étroit entre les couches cellulaires à travers la jonction de greffe. Si l’une des parties de greffe de la plante est laissée sécher ou est endommagée, les processus mentionnés précédemment seront inhibés et la greffe ne réussira pas. Les jeunes plants sont fragiles et facilement écrasés par forceps. Si les utilisateurs le jugent nécessaire, la pince peut être utilisée pour tenir l’un des deux cotylédons afin de manœuvrer le scion. Par rapport à la méthode de puce de greffe précédemment rapportée, le risque d’endommager le porte-greffe tout en tirant l’hypocotyle vers le bas dans la bande de silicone est augmenté. Les techniques de manipulation permettant de minimiser ce risque sont décrites à l’étape 3.4 du protocole.
Un total de quatre sites de greffe par bande est le nombre de positions recommandé pour s’assurer que les plantules ne se touchent pas pendant la phase de formation de la jonction du greffon. Pour augmenter le nombre total de greffons effectués en même temps, il est recommandé aux utilisateurs d’augmenter le nombre de plaques utilisées, plutôt que de diminuer la quantité d’espace utilisée par greffe.
La modification du protocole est possible pour tenir compte de la croissance divergente de l’hypocotyle ou des espèces non Arabidopsis
Certains mutants étiolent à des rythmes différents des plantes de type sauvage. Les phytohormones telles que les gibbérellines, les brassinostéroïdes, l’éthylène et l’auxine jouent un rôle important dans la régulation de la croissance des plantules18,19,20. Les lignées mutantes défectueuses dans ces voies hormonales peuvent connaître des taux d’étiolation atypiques16,17. La conception contrôlée par l’utilisateur de la bandelette de greffe permet de tenir compte de ces différences phénotypiques, mais des tests suffisants sont nécessaires dans ces cas. Si une lignée génétique est utilisée qui connaît une étiolation à des taux significativement différents de ceux du type sauvage, les utilisateurs doivent déterminer si la période d’étiolation de 3 jours décrite ici est appropriée pour leurs lignées avant de commencer. Des plantules mal étiolées entraîneront une greffe difficile en raison d’un hypocotyle raccourci ou excessivement étendu (et plus mince). Les utilisateurs intéressés par la greffe de semis d’espèces autres qu’Arabidopsipeuvent adapter ce protocole à leurs besoins en modifiant le diamètre du canal de greffe. Les plants de tomates et de tabac cultivés à un âge de greffage approprié semblent nécessiter des canaux de greffage de 0,8 et 0,4 mm de diamètre, respectivement9.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Merci à Javier Brumos pour la formation initiale et les conseils dans la greffe de plants d’Arabidopsis .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
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- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
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