Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Veredelung von Keimlingen, die keine Vorkenntnisse oder Schulungen erfordert und mit sehr geringen Kosten unter Verwendung von Materialien durchgeführt werden kann, die in den meisten molekularbiologischen Labors leicht zugänglich sind.
Abstract
Die Veredelung von Sämlingen im Frühstadium ist zu einem beliebten Werkzeug in der Molekulargenetik geworden, um Wurzel-Spross-Beziehungen innerhalb von Pflanzen zu untersuchen. Die Veredelung von Sämlingen der kleinen Modellpflanze Arabidopsis thaliana im Frühstadium ist aufgrund der Größe und Zerbrechlichkeit ihrer Sämlinge technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig. Eine wachsende Sammlung von veröffentlichten Methoden beschreibt diese Technik mit unterschiedlichen Erfolgsraten, Schwierigkeitsgraden und damit verbundenen Kosten. In diesem Artikel wird ein einfaches Verfahren beschrieben, um ein internes wiederverwendbares Pfropfgerät unter Verwendung einer Silikonelastomermischung herzustellen, und wie dieses Gerät zum Pfropfen von Sämlingen verwendet wird. Zum Zeitpunkt dieser Veröffentlichung kostet die Herstellung jedes wiederverwendbaren Pfropfgeräts nur 0,47 US-Dollar an Verbrauchsmaterialien. Mit dieser Methode können Anfänger ihre ersten erfolgreich gepfropften Sämlinge in weniger als 3 Wochen von Anfang bis Ende erhalten. Dieses leicht zugängliche Verfahren wird es Labors für Pflanzenmolekulargenetik ermöglichen, die Keimlingsveredelung als normalen Teil ihres experimentellen Prozesses zu etablieren. Aufgrund der vollen Kontrolle, die die Benutzer bei der Erstellung und Gestaltung dieser Pfropfvorrichtungen haben, kann diese Technik auf Wunsch leicht für den Einsatz in größeren Pflanzen wie Tomaten oder Tabak angepasst werden.
Introduction
Das Pfropfen ist eine alte Gartenbautechnik, die um 500 v. Chr. zu einer etablierten landwirtschaftlichen Praxis wurde1. Das Pfropfen verschiedener Sorten von Kulturpflanzen zur Verbesserung der Erträge war die erste Anwendung dieser Technik und wird auch heute noch zu diesem Zweck eingesetzt. In den letzten zehn Jahren hat die Veredelung als Werkzeug für Molekularbiologen zur Untersuchung von Fernsignalen in Pflanzen zunehmend Aufmerksamkeit erregt 2,3,4,5. Während das Pfropfen erwachsener Pflanzen relativ einfach ist, ist das Pfropfen von Pflanzen kurz nach der Keimung eine Herausforderung. Trotzdem ist es manchmal erforderlich, die Auswirkungen von Fernsignalen auf Prozesse wie Pflanzenentwicklung, Umweltreaktionen und Blüte zu bewerten 6,7,8.
Arabidopsis thaliana hat sich aus vielen Gründen als Modellorganismus in der Pflanzenbiologie etabliert, unter anderem wegen seiner relativ geringen Größe, die es einfach macht, ihn in einem Labor zu züchten. Die geringe Größe und Zerbrechlichkeit von Arabidopsis-Sämlingen macht das Pfropfen junger Sämlinge jedoch sehr schwierig. In vielen Fällen ist ein umfangreiches praktisches Training erforderlich, um erfolgreich Sämlingstransplantate zu erhalten. Im Laufe der Jahre gab es viele methodische Verbesserungen, die ideale Wachstumsbedingungen und neue Techniken zur Erhöhung der Erfolgsrate der Sämlingsveredelung identifizierthaben 9,10,11. Das zuletzt eingeführte Werkzeug war ein Arabidopsis-Sämlings-Pfropfchip, der es auch unerfahrenen Anwendern ermöglicht, ein akzeptables Maß an Pfropferfolg zu erzielen12. Während dieser Fortschritt die technische Barriere der Keimlingsveredelung erheblich gesenkt hat, ist die Chip-Vorrichtung teuer, und die Anzahl der Transplantate, die parallel durchgeführt werden können, wird schnell unerschwinglich.
Darüber hinaus kann dieses Gerät nur für Arabidopsis-Sämlinge verwendet werden, deren Hypokotylabmessungen denen von Wildtyp-Sämlingen ähneln. Während Arabidopsis die Schlüsselart in der Welt der pflanzlichen Molekulargenetik ist, wurden neuere Arbeiten bei anderen Arten unter Verwendung der Sämlingspfropfung durchgeführt. Beispiele hierfür sind die Veredelung von Sojabohnen und der gemeinen Bohne, Tabak zu Tomaten und Raps zu Arabidopsis und die anschließende Probenahme beider Gewebe auf kleine RNAs13,14. Daher ist eine Pfropfmethode, die für die meisten Laboratorien zugänglich ist und ohne größere technische Änderungen leicht an eine Vielzahl von Pflanzenarten angepasst werden kann, sehr wünschenswert.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, bei der eine einfache Pfropfvorrichtung im eigenen Haus hergestellt wird, die die vollständige Anpassung des Durchmessers und der Länge des Pfropfkanals ermöglicht, um die Morphologie der Sämlinge bei den meisten Pflanzenarten zu berücksichtigen. Die Herstellung dieser Geräte ist sehr kostengünstig und hochgradig skalierbar, da die einzigen Komponenten, die benötigt werden, Silikonelastomer, Kabel oder Schläuche der richtigen Größe, eine hochpräzise Klinge und ein Behälter sind, der als Form dient. Nach dem hier beschriebenen Pfropfprotokoll können Anwender erfolgreiche Pfropfraten von 45% (n = 105) erreichen, vergleichbar mit den zuvor berichteten Pfropfergebnissen10,12.
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Protocol
1. Vorbereitung des Geräts
- Stellen Sie die Silikonpfropfvorrichtung her, indem Sie die Silikonelastomerlösung in eine quadratische Petrischale (100 mm x 100 mm) gießen. Bereiten Sie 15 ml der Elastomerlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
HINWEIS: Silikonelastomer-Kits enthalten typischerweise eine Flüssigkeit auf Silikonbasis und ein Härtungsmittel, die beim Mischen das Silikon verfestigen lassen. - Bereiten Sie die quadratische Petrischale vor, indem Sie vier gerade Stücke 29-g-Draht in die quadratische Petrischale legen, die gleich weit voneinander entfernt sind (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass der Draht bündig mit dem Boden der Form abschließt. Um den Draht vollständig zu begradigen, rollen Sie ihn auf einer harten, gleichmäßigen Oberfläche mit einem schweren und flachen Gegenstand (z. B. einem Metallrohrgestell).
HINWEIS: Kabelbinder enthalten oft 29 G Draht und können nach dem Entfernen der äußeren Papierbeschichtung mit Aceton verwendet werden. - Gießen Sie die gemischte Silikonelastomerlösung auf die Drähte und bedecken Sie sie mit der Oberseite der Petrischale. Lassen Sie das Silikon 24-48 h bei Raumtemperatur aushärten.
- Entfernen Sie die Silikonfolie mit einer sauberen Pinzette aus der Petrischale und bewegen Sie sie auf eine saubere, ebene Fläche.
- Entfernen Sie die Drähte von der Silikonfolie. Entfernen Sie die dünne Silikonschicht, die auf der Außenseite des Kanals verbleibt, mit einer Zange, damit der Kanal auf einer Seite offen ist (Abbildung 1A).
- Schneiden Sie die Silikonfolie senkrecht zu den Kanälen mit einer sauberen Schere in 3 mm dicke Streifen. Legen Sie jeden Streifen in einen Aluminiumfolienumschlag und verschließen Sie ihn mit Autoklavenband.
- Autoklavieren Sie die Streifen mindestens 30 Minuten lang bei 121 °C und lagern Sie sie bis zur Verwendung.
2. Vorbereitung des Sämlings
- Samen sterilisieren und vernalisieren.
- Suspendieren Sie bis zu 100 Arabidopsis-Samen in 1 ml 50%iger Bleichlösung, die 0,1% Tween 20 enthält, in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie sie 5-10 Minuten lang. Entfernen Sie die Bleichlösung durch Pipettieren oder Aspirieren unter sterilen Bedingungen. Spülen Sie die Samen mit 1 ml sterilisiertem dH2O. Achten Sie darauf, die Röhrchen umzudrehen, um die Samen ausreichend zu spülen, und entfernen Sie alle Bleichlösung, die oben im Röhrchen verbleibt. Wiederholen Sie das Spülen 4x.
- Lassen Sie ca. 0,25 ml Wasser in den Röhrchen mit den Samen und lagern Sie sie 3 Tage lang bei 4 °C im Dunkeln.
- Tellern Sie die Samen in Vorbereitung auf das Pfropfen.
- Bereiten Sie eine 1%ige Agar-MS-Platte wie folgt vor: Mischen Sie für 1 l MS (0,5% Saccharose) festes Medium 4,4 g MS-Salz, 5 g Saccharose und 10 g Agar in 800 ml Wasser, stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 5,7 ein und bringen Sie dann das Gesamtvolumen mit zusätzlichem Wasser auf 1 l. Autoklavieren Sie mindestens 20 Minuten, bevor Sie ~25 ml in die quadratischen Petrischalen gießen.
- Bewegen Sie unter sterilen Bedingungen die entsprechende Anzahl der vorbereiteten Samen auf den Teller, wobei Sie eine 20-μl-Pipettenspitze verwenden, um die Samen abzusaugen und zu übertragen.
- Legen Sie einen sterilen Streifen auf die Plattenoberfläche, um die Samenpositionierung zu steuern, sodass die Samen mit den Kanälen auf dem Streifen ausgerichtet sind. Entfernen Sie den Streifen, sobald die Samen plattiert sind.
HINWEIS: Eine quadratische Platte mit den Maßen 100 mm x 100 mm kann zwei Reihen von Sämlingen aufnehmen (Abbildung 1B). - Sobald die Platten aufstehen, lassen Sie die Flüssigkeit aus dem festen Medium verdampfen und sammeln Sie sich am Boden der Platte. Nachdem die Samen auf den Teller gelegt wurden, legen Sie den Tellerdeckel auf und versiegeln Sie eine Seite des Tellers, die parallel zu den beiden Samenreihen verläuft (gekennzeichnet durch den blau hervorgehobenen Bereich in Abbildung 1B), mit Parafilm. Wickeln Sie atmungsaktives Klebeband auf den Parafilm und um alle anderen Kanten der Platte.
- Stellen Sie zwei Platten vorsichtig mit der mit Parafilm versiegelten Seite nach unten auf. Trennen Sie die beiden Platten an der Unterseite, indem Sie ein horizontales 15-ml-Zentrifugenröhrchen dazwischen legen und mit einem Gummiband sichern. Stellen Sie sicher, dass die Plattenoberflächen einen Winkel von 100°-110° zur Tischoberfläche bilden (Abbildung 1C).
- Lagern Sie die Platten in dieser Ausrichtung für 72 h in völliger Dunkelheit bei 21 °C, damit die Hypokotyle des Keimlings ~5 mm lang werden können. Entfernen Sie die Platten nach 72 h aus der Dunkelheit und wachsen Sie vor dem Pfropfen unter 16 h Licht (Intensität von 100 μE m-2 sec-1) und 8 h Dunkelzyklen für weitere 2-4 Tage bei der gleichen Temperatur.
- Pfropfen Sie die Sämlinge zwischen 5 und 7 Tagen nach dem Anplattieren. Legen Sie einen Pfropfstreifen über die Sämlinge und passen Sie ihre Hypokotyle in die Kanäle an. Positionieren Sie den Sämling vorsichtig so, dass der Wurzel-Hypokotyl-Übergang am unteren Rand des Silikonstreifens positioniert ist, um den Sämling für den Schnitt vorzubereiten (Abbildung 1D).
3. Pfropfverfahren
- Bereiten Sie eine sterile Arbeitsumgebung vor, indem Sie ein Dissektionsrohr mit 70% Ethanol desinfizieren und zwei Paar Pinzetten mit feiner Spitze und einen Skalpellgriff autoklavieren. Führen Sie alle Pfropfvorgänge in einer sterilen Haube und bei Bedarf mit Hilfe eines Dissektionszielfernrohrs durch. Führen Sie den größten Teil der Transplantation mit einer 10,5-fachen Vergrößerung durch.
- Bereiten Sie die Sprossen vor. Verwenden Sie eine frische Skalpellklinge, um das Hypokotyl senkrecht zu schneiden, um einen geraden, sauberen Schnitt zu erzielen. Schieben Sie die Klinge nach vorne, anstatt sie nach unten in die Pflanze zu drücken, um zu verhindern, dass der Sämling in den Agar gedrückt wird (Video 1).
- Entfernen Sie den Trieb. Achten Sie darauf, den geschnittenen Teil des Triebs mit Feuchtigkeit zu versorgen, indem Sie den Kontakt mit der Medienoberfläche sicherstellen. Alternativ können Sie den Spross bis zur Verwendung in einen dafür vorgesehenen Haltebereich bringen, z. B. auf die Oberseite einer mit sterilemdH 2O gefüllten Petrischale.
- Bereiten Sie die Wurzelstöcke vor. Ziehen Sie vorsichtig an der Wurzel, indem Sie die Wurzel in dem Raum zwischen den geschlossenen Pinzetten fangen und drehen, wobei der geschnittene Abschnitt der Wurzelstöcke in der Mitte des Streifens verbleibt (Video 2).
HINWEIS: Die zerbrechliche Wurzel wird beschädigt, wenn sie direkt zwischen die geschlossene Pinzette gedrückt wird, so dass die Wurzel im scharfen Winkel der Pinzettenenden eingeklemmt werden muss, um das Gewebe zu manipulieren. - Nehmen Sie den gewünschten Trieb vorsichtig mit der Pinzette mit feiner Spitze auf und führen Sie ihn in die Oberseite des Kanals ein.
HINWEIS: Es ist wichtig, den Kontakt zwischen den Sprossen und den Wurzelstöcken visuell zu bestätigen, um ein erfolgreiches Transplantat zu erhalten (Video 3). - Nachdem alle Transplantate hergestellt wurden, wickeln Sie die Platten mit Parafilm und atmungsaktivem Klebeband ein und stellen Sie die Platten wie zuvor auf, ohne die Sämlinge oder Silikonstreifen zu stören. Bewegen Sie die Platten vorsichtig in eine auf 26 °C eingestellte Wachstumskammer mit 16 h hellen/8 h dunklen Zyklen.
- Bewerten Sie die gepfropften Sämlinge nach 7-10 Tagen unter sterilen Bedingungen. Entfernen Sie den Silikonstreifen vorsichtig mit einer Pinzette, indem Sie eine Seite abziehen, damit die Kanäle die Sämlinge befreien können. Entfernen Sie alle zufälligen Wurzeln, die aus dem Spross wachsen, indem Sie sie mit einer frischen Skalpellklinge vom Spross abschneiden oder mit einer Pinzette mit feiner Spitze zerdrücken. Beurteilen Sie visuell, ob der Wurzelstock fest mit dem Spross verbunden ist, um ein erfolgreiches Transplantat zu bilden (Abbildung 2).
- Bewegen Sie erfolgreiche Transplantate in den Vermehrungsboden der Sämlinge, um so lange wie nötig zu wachsen. Decken Sie den Boden einige Tage lang mit transparentem Kunststoff ab, während sich die Sämlinge etablieren. Nachdem Sie die Pflanzen in den Boden gebracht haben, wachsen Sie unter den zuvor erwähnten Hell- und Dunkelzyklen bei 21 ° C.
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Representative Results
Verschiedene Aspekte des Designs des Pfropfstreifens wurden getestet, um die optimalen Pfropfbedingungen zu ermitteln, die das geringste Maß an technischem Geschick erforderten (Tabelle 1). Alle Pfropfversuche wurden mit 0,5% Saccharose-MS-Medium durchgeführt, von dem zuvor berichtet wurde, dass es sich um ein ideales Pfropfmediumhandelt 11,12.
Ein optimales Sämlingswachstum kann mit der Keimung auf dem Streifen nicht erreicht werden
In der ersten Iteration des Silikonstreifens wurden geschlossene Kanäle hergestellt, indem die dünne Silikonschicht belassen wurde, die auf der Rückseite der Streifenkanäle verbleibt, nachdem die Drähte von den Silikonfolien entfernt wurden. Anstatt die Sämlinge direkt auf dem Teller zu keimen und später den Pfropfstreifen über die Hypokotyle der Sämlinge zu legen, wurden die Samen direkt auf dem Streifen gekeimt, nachdem die Samen in den mit einer kleinen Menge MS-Medium gefüllten Kanal eingeführt wurden. Bei dieser Technik blieb die Hälfte der Sämlinge während der Keimung in den Kanälen stecken und verlängerte sich nicht. Einschließlich der nicht gekeimten und der nicht verlängerten Sämlinge wurden erfolgreiche Pfropfraten von 25% (n = 16) erreicht (Tabelle 1). Um das beobachtete Dehnungsversagen zu beheben, wurden die Samen so ausgerichtet, dass die Keimblätter und das Radikal des Embryos während der Keimung nach unten zeigten. Mit dieser Methode keimten und verlängerten sich 75 % der Samen erfolgreich, was zu einer leichten Steigerung der Pfropfeffizienz führte (33 % Erfolg, n = 12) (Tabelle 1). Um die erfolgreiche Entwicklung der Sämlinge zu erhöhen, wurde die dünne Silikonschicht, die den Kanal verschließt, von der mittleren Seite des Pfropfstreifens entfernt, um den Kontakt zwischen dem Samen und dem Wachstumsmedium zu ermöglichen (Abbildung 1A). Mit dieser Methode keimten und verlängerten sich 85% der Sämlinge erfolgreich und 31% (n = 16) wurden erfolgreich gepfropft (Tabelle 1). Trotz einer signifikanten Erhöhung der Geschwindigkeit der ordnungsgemäßen Samenentwicklung auf dem Streifen kann der Verlust selbst einer kleinen Anzahl von Sämlingen die experimentelle Populationsgröße erheblich beeinflussen, wenn wechselseitige Transplantate zwischen verschiedenen Versuchsgruppen durchgeführt werden. Aus diesem Grund wurde das Keimen von Sämlingen direkt auf der mittleren Oberfläche als ideal eingestuft.
Aufrechterhaltung der Überlebensrate der Sämlinge und Minimierung der Verarbeitungszeit und des Arbeitsaufwands
Die Sämlinge wurden zunächst zum Pfropfen auf MS-Platten (1% Saccharose) kultiviert, zum Schneiden auf eine feste Oberfläche (z. B. den Deckel einer mit Wasser gefüllten Petrischale) übertragen und dann mit dem Streifen zum Pfropfen auf einer Platte zusammengesetzt. Mit dieser Technik wurde eine Erfolgsquote von 50% (n = 8) beobachtet (Tabelle 1). Obwohl diese Methode die höchste Erfolgsrate erzielte, war sie zeitaufwändig und aufwandsintensiv, da sie 2,5 Minuten für jedes Transplantat erforderte, wodurch die Anzahl der Transplantate, die gleichzeitig zusammengestellt werden konnten, begrenzt wurde. Um den Zeit- und Arbeitsaufwand zu verringern, wurden die Sämlinge senkrecht auf der Pfropfplatte (0,5% Saccharose) kultiviert und dann direkt vor dem Pfropfen in den Streifen eingesetzt, wie in diesem Protokoll beschrieben. Um diese Methode weiter zu testen, wurden drei Studien unterschiedlicher Größe durchgeführt. Die ersten beiden Studien hatten beide eine Erfolgsrate von 48% (n = 25 und 64) und die dritte Studie hatte eine Erfolgsrate von 25% (n = 16) (Tabelle 1). Zusammen zeigen diese Studien eine Erfolgsrate von 45% (n = 105). Diese Erfolgsrate ist vergleichbar mit der zeitaufwändigeren Methode und benötigt ca. 1 min pro Transplantat, um den Pfropfstreifen über die Sämlinge zu legen und die Pfropfung abzuschließen (Protokollschritte 3.2-3.5).
Die Geschwindigkeit des Pfropferfolgs hängt stark von der Qualität der Pfropfstreifenkonstruktion ab. Während die ersten beiden Studien eine Erfolgsrate von 48% aufweisen, weist die dritte Studie eine geringere Erfolgsrate auf. Die handgefertigte Qualität des Pfropfstreifens führt von Natur aus zu einer leichten Variabilität zwischen den Pfropfstellen. Wenn die für den Bandaufbau verwendeten Drähte nicht vollständig gerade sind, sind die Kanäle in den Streifen nicht bündig mit dem Boden der Form und führen zu Kanälen mit leicht variabler Tiefe. Insgesamt werden in jedem Bandguss 25 Streifen hergestellt, was zu 100 einzigartigen Pfropfstellen führt (Tabelle 2). Während der Effekt einer leichten Variation der Pfropfstellen in den beiden größeren Studien ausgeglichen ist, scheint es in der kleineren Studie mit geringeren Erfolgsraten, dass Pfropfstellen mit mehr Variation aufgrund leicht gekrümmter Drähte die Transplantatbildung negativ beeinflussen können. Um diese Art von Variation zu minimieren, wird in Protokollschritt 1.2 eine Drahtrichttechnik beschrieben.
Abbildung 1: Illustration der Schritte zur Vorbereitung der Pfropfung . (A) Modell des Silikonstreifenformdesigns. Diese Tafel zeigt die quadratische Plattenform, die zum Gießen der Silikonstreifen verwendet wird. Am Boden der Platte werden vier Abschnitte mit 29-G-Drähten gleicher Länge verlegt, auf die eine Silikonelastomermischung gegossen wird (oben). Nachdem das Silikon vollständig ausgehärtet ist, wird das Silikonquadrat von der Platte entfernt und die Drähte werden entfernt, um die Pfropfkanäle zu erzeugen. Eine dünne Silikonschicht verbleibt auf der Unterseite der Kanäle, nachdem die Drähte entfernt wurden (gekennzeichnet durch *). Diese Schicht sollte entfernt werden, um die Kanäle auf der Unterseite (unten) offen zu lassen. Das Quadrat wird dann senkrecht zu den Drahtkanälen in 3-mm-Streifen geschnitten, wie durch die gestrichelten Linien (oben) dargestellt. (B) Positionierung des Saatguts auf der Pfropfplatte. Mit Hilfe eines sterilen Streifens werden zwei Reihen von Samen in einer Linie mit den Streifenkanälen auf der Platte positioniert. Nach dem Einlegen der Samen sollte dieser Streifen entfernt werden, um eine Keimbehinderung zu vermeiden. Um MS-Platten für das vertikale Wachstum vorzubereiten, sollte Parafilm entlang der unteren (wurzelseitigen) Kante der Platte gewickelt werden, die hier mit blauer Hervorhebung markiert ist. (C) Vertikale Plattenposition für die Samenkeimung. Nach dem Anrichten werden die Samen senkrecht auf abgewinkelten Platten gekeimt. Ein konisches 15-ml-Röhrchen wird an der Basis von zwei Platten platziert, um einen leicht stumpfen Winkel zwischen der Plattenoberfläche und der Tischplatte zu erzeugen. Der parafilmierte Rand (blau markiert) der Platte ist zur Tischfläche hin ausgerichtet. Ein Gummiband ist um die Oberseite der beiden Platten gewickelt, um sie an Ort und Stelle zu halten. (D) Positionierung der Sämlinge im Streifen direkt vor der Veredelung. Sterile Pfropfstreifen werden mit Hypokotylen in den Streifenkanälen auf die Sämlinge gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bild, aufgenommen mit einem Dissektionsfernrohr, das eine verheilte Transplantationsstelle zeigt. Der schwarze Pfeil zeigt die Transplantatverbindungsstelle an, und die roten Pfeile zeigen zufällige Wurzeln an, die während des Transplantatbewertungsprozesses entfernt wurden. Maßstabsleiste = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: Demonstration der aktiven Veredelung mittels Live-Pflanzenbildgebung. Die Platzierung und Bewegung der Skalpellklinge, um einen sauberen Schnitt zu erzeugen. Das Hypokotyl des Keimlings wird direkt über dem Pfropfstreifen geschnitten, indem die Skalpellklinge nach vorne gedrückt wird. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Positionieren des geschnittenen Wurzelstockhypokotyls zum Pfropfen innerhalb des Streifens. Der Wurzelstock wird vorsichtig mit einer Pinzette gezogen, um die Transplantatverbindungsstelle in der Mitte des Streifens zu positionieren. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 3: Platzieren des Sprosses und Vervollständigen des Transplantats. Der Spross wird ausgetauscht und in den Streifen geschoben, bis er sich mit dem Wurzelstock verbindet. Die richtige Ausrichtung und der richtige Kontakt werden bewertet, indem beobachtet wird, wie das Hypokotyl reagiert, wenn der Spross leicht gedrückt wird. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Tabelle 1: Variablen für Pfropfversuche und Erfolgsraten. Diese Tabelle fasst die Ergebnisse der Pfropfversuche zusammen, die zur Bestimmung des optimalen Pfropfprotokolls für die höchsten Erfolgsraten verwendet wurden. Zu den in diesen Versuchen untersuchten Variablen gehören die Keimbedingungen der Sämlinge, der Aufbau von Silikonstreifen und der Zeitpunkt, zu dem die Sämlinge während der Veredelung in die Silikonstreifenkanäle eingeführt wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Die Anzahl der Pfropfstellen, die aus einer 250-ml-Flasche Silikonelastomer erzeugt werden können. Der Preis für jede Produktionseinheit wird hier ebenfalls angezeigt (zum Zeitpunkt der Veröffentlichung) und kann leicht an Schwankungen des Marktwerts der Silikonelastomer-Reagenzien angepasst werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Zusammenfassung und Bedeutung
Die Bildung einer Transplantatvereinigung ist entscheidend für eine erfolgreiche Pfropfung, die einen direkten und ungestörten Kontakt zwischen Wurzelstock und Spross erfordert. Die Miniaturgröße und Zerbrechlichkeit von Sämlingen kleiner Pflanzen wie Arabidopsis macht es technisch schwierig, diese Anforderung zu erfüllen. Eine Technik, die in frühen Arabidopsis-Sämlingspfropfmethoden entwickelt wurde, bestand darin, sowohl den Spross als auch den Wurzelstock in einen kurzen Silikonschlauchkragen einzuführen, um die Transplantatverbindung10 zu stützen. Während diese Methode sehr effektiv ist, um die beiden Transplantatteile vor der Trennung zu schützen, ist es keine leichte Aufgabe, den zerbrechlichen Spross und den Wurzelstock in ein Rohr mit schmalem Lauf einzuführen. Darüber hinaus macht es die Verdickung an der Verbindungsstelle durch Wachstum oft schwierig, die Silikonschläuche mit schmalem Lauf zu entfernen, ohne die gepfropften Sämlinge zu beschädigen. Andere Methoden verwendeten alternative Techniken, um die Verwendung eines Pfropfkragens zu vermeiden und gleichzeitig zu verhindern, dass sich die Sämlinge während des Wachstums bewegen, einschließlich des Entfernens beider Keimblätter aus den Sprossen und des Züchtens von gepfropften Sämlingen auf einer schrägen Oberfläche 9,11. Während diese Methoden nur wenige Ressourcen erfordern, führten diese Methoden, wenn sie getestet wurden, zu einer hohen Sprossmigration weg vom Wurzelstock, was zu einem geringeren Pfropferfolg führte als berichtet (80% im Durchschnitt für die empfohlenen Bedingungen in beiden Studien) mit diesen Techniken. Darüber hinaus erfordern beide vom Benutzer, dass er die Schnittstelle zwischen den Teilen des Pfropfsämlings ohne Hilfsmittel ausrichtet, eine Aufgabe, die ein hohes Maß an Geschick erfordert. Kürzlich wurde über einen Mikrotransplantationschip berichtet, der speziell für die Veredelung von Arabidopsis-Sämlingen entwickelt wurde12. Jeder Chip enthält vier Mikrokammern, in denen vier Sämlinge wachsen können, wobei das spezielle Design des Kammerraums es dem Hypokotyl ermöglicht, in einem Mikrokanal zu wachsen. Die Wurzelstöcke werden direkt auf dem Chip erzeugt und die Sprossen werden in die Mikrokanäle eingeführt. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, sowohl Wurzelstöcke als auch Sprossen zum Pfropfen zu handhaben, und der Mikrokanal schränkt die Pfropfung an Ort und Stelle ein, ohne die Leichtigkeit des Entfernens von Sämlingen zu beeinträchtigen, sobald sich die Pfropfverbindung gebildet hat. Während diese neue Methode die technische Barriere der Keimlingsveredelung erheblich reduziert, erfordert die Herstellung des Mikroveredelungschips mikroelektromechanische Systeme (MEMS), eine Technologie, die für die meisten Biologielabors nicht ohne weiteres zugänglich ist. Die Abmessungen der Mikrokammer auf dem Mikrotransplantat-Chip wurden für Arabidopsis Col-012 optimiert. Dies verhindert die Verwendung der Chips für andere Spezies oder andere Arabidopsis-Akzessionen/Mutanten, die Hypokotyle aufweisen, die in Höhe oder Dicke variieren15,16,17.
Die hier beschriebene kostengünstige, flexible und einfach zu befolgende Methode wurde von früheren Mikroveredelungschips inspiriert, um die Veredelung junger Sämlinge zu erleichtern. Bei dieser Methode ist die Manipulation empfindlicher Sämlinge minimal, was die Verwendung für neue Benutzer erleichtert. Die Kanäle in den Streifen helfen neuen Benutzern bei der Ausrichtung der gepfropften Sämlinge und halten die Wurzel und den Spross während der Bildung der Transplantatstelle in gutem Kontakt, während sie gleichzeitig eine einfache Entfernung nach der Bildung des Transplantats gewährleisten. Aufgrund der Hochdurchsatzproduktion der Silikonstreifen und der relativ geringen Kosten für die Ausgangsmaterialien kann die Pfropfung einer großen Anzahl von Sämlingen zu einem Bruchteil der Kosten der Mikroveredelungschips erreicht werden. Dieses selbstgebaute Gerät kostet schätzungsweise 0,12 US-Dollar pro Pfropfstelle, was es zu einer wirtschaftlichen Option für Labore macht, die mit einer Vielzahl von Pflanzenarten oder Sämlingsphänotypen arbeiten (Tabelle 2). Während der handgefertigte Aspekt der Pfropfstreifen die mit dieser Methode verbundenen Kosten senkt, bietet er auch die Möglichkeit der Variabilität zwischen verschiedenen Streifen. Wie bereits erwähnt, ist die Qualität der Pfropfstreifen entscheidend für den Erfolg dieser Methode. Die zunehmende Verwendung der Keimlingsveredelung im Frühstadium in der Molekulargenetik hat dem Gebiet der Pflanzengenetik ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Fernsignalen in Pflanzen gegeben. Diese einfache, kostengünstige und leicht zugängliche Methode bietet ein weiteres Werkzeug, um die erfolgreiche Einführung der Sämlingspfropftechnik durch Labore mit minimaler Vorbildung und Erfahrung zu erleichtern.
Kritische Überlegungen
Prozesse wie die Einleitung einer Wundheilungsreaktion, die Herstellung der Zell-zu-Zell-Kommunikation zwischen Spross und Wurzelstock und schließlich die Gefäßbildung sind für die Bildung eines erfolgreichen Transplantatsnotwendig 9. Während des Pfropfprozesses ist es wichtig, die Sämlinge über die Notwendigkeit hinaus hydratisiert und unbeschädigt zu halten. Bei dieser Methode müssen die abgeschnittenen Enden der Wurzeln und Sprossen sauber und senkrecht sein, um eine bündige Verbindung zwischen Spross und Wurzelstock zu gewährleisten. Wenn die Pfropfstelle während des Schneidens beschädigt wird oder die Pfropfstücke nicht im gleichen Winkel geschnitten werden, ist eine erfolgreiche Pfropfung unwahrscheinlich, da kein enger Kontakt zwischen den Zellschichten über die Pfropfverbindung besteht. Wenn einer der Pfropfteile der Pflanze trocknen oder beschädigt wird, werden die zuvor genannten Prozesse gehemmt und das Pfropfen ist nicht erfolgreich. Junge Sämlinge sind zerbrechlich und können leicht mit einer Pinzette zerkleinert werden. Wenn Benutzer es für notwendig halten, kann die Pinzette verwendet werden, um sich an einem der beiden Keimblätter festzuhalten, um den Spross zu manövrieren. Im Vergleich zu der zuvor berichteten Pfropfchip-Methode ist die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass der Wurzelstock beim Herunterziehen des Hypokotyls in den Silikonstreifen beschädigt wird. Handhabungstechniken zur Minimierung dieses Risikos sind in Protokollschritt 3.4 beschrieben.
Insgesamt vier Pfropfstellen pro Streifen sind die empfohlene Anzahl von Positionen, um sicherzustellen, dass sich die Sämlinge während der Transplantatbildung nicht berühren. Um die Gesamtzahl der gleichzeitig durchgeführten Transplantate zu erhöhen, wird empfohlen, dass Benutzer die Anzahl der verwendeten Platten erhöhen, anstatt den pro Transplantat verwendeten Platz zu verringern.
Eine Modifikation des Protokolls ist möglich, um divergentes Hypokotylwachstum oder Nicht-Arabidopsis-Arten zu berücksichtigen
Einige Mutanten etioraten unterschiedlich schnell wie Wildtyp-Pflanzen. Phytohormone wie Gibberelline, Brassinosteroide, Ethylen und Auxin spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation des Keimlingswachstums18,19,20. Mutantenlinien, die in diesen Hormonwegen defekt sind, können atypische Etiolationsraten aufweisen16,17. Das benutzergesteuerte Design des Pfropfstreifens ermöglicht die Anpassung an diese phänotypischen Unterschiede, aber in diesen Fällen sind ausreichende Tests erforderlich. Wenn eine genetische Linie verwendet wird, die eine Etiolation mit signifikant anderen Raten als der Wildtyp erfährt, sollten die Benutzer vor Beginn feststellen, ob die hier beschriebene Etiolationsperiode von 3 Tagen für ihre Linien geeignet ist. Unzureichend etiolierte Sämlinge führen aufgrund eines verkürzten oder übermäßig ausgedehnten (und dünneren) Hypokotyls zu einer schwierigen Pfropfung. Anwender, die an der Veredelung von Sämlingen anderer Arten als Arabidopsisinteressiert sind, können dieses Protokoll an ihre Bedürfnisse anpassen, indem sie den Durchmesser des Pfropfkanals ändern. Tomaten- und Tabaksämlinge, die auf ein angemessenes Pfropfalter gezüchtet wurden, scheinen Pfropfkanäle mit einem Durchmesser von 0,8 bzw. 0,4 mm zu benötigen9.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Vielen Dank an Javier Brumos für die Erstausbildung und Anleitung bei der Veredelung von Arabidopsis-Sämlingen .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
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