Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת השתלת שתילים חזקה שאינה דורשת ניסיון או הכשרה קודמים וניתן לבצע אותה בעלות נמוכה מאוד תוך שימוש בחומרים הנגישים בקלות ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית.
Abstract
השתלת שתילים בשלב מוקדם הפכה לכלי פופולרי בגנטיקה מולקולרית לחקר יחסי שורשים-נבטים בתוך צמחים. השתלת שתילים בשלב מוקדם של צמח המודל הקטן, Arabidopsis thaliana, היא מאתגרת מבחינה טכנית וגוזלת זמן רב בשל גודלם ושבריריותם של שתיליו. אוסף הולך וגדל של שיטות שפורסמו מתארות טכניקה זו עם שיעורי הצלחה משתנים, קושי ועלויות נלוות. מאמר זה מתאר הליך פשוט להכנת מכשיר השתלה לשימוש חוזר פנימי באמצעות תערובת אלסטומרים מסיליקון, וכיצד להשתמש במכשיר זה להשתלת שתילים. בזמן פרסום זה, כל מכשיר השתלה לשימוש חוזר עולה רק $0.47 בחומרים מתכלים לייצר. באמצעות שיטה זו, מתחילים יכולים לקבל שתילים מוצלחים הראשונים שלהם בתוך פחות מ 3 שבועות מתחילתו ועד סופו. הליך נגיש זה יאפשר למעבדות גנטיקה מולקולרית של צמחים לבסס השתלת שתילים כחלק נורמלי מתהליך הניסוי שלהם. בשל השליטה המלאה שיש למשתמשים ביצירה ועיצוב של מכשירי השתלה אלה, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לשימוש בצמחים גדולים יותר, כגון עגבניות או טבק, אם תרצה בכך.
Introduction
השתלה היא טכניקת גננות עתיקה שהפכה לפרקטיקה חקלאית מבוססת בשנת 500 לפנה"ס1. השתלת זנים שונים של צמחי יבול לשיפור היבול הייתה השימוש הראשון בטכניקה זו, וממשיכה לשמש למטרה זו כיום. בעשור האחרון, השתלה משכה כמות הולכת וגדלה של תשומת לב ככלי עבור ביולוגים מולקולריים לחקור איתות למרחקים ארוכים בצמחים 2,3,4,5. בעוד שהשתלת צמחים בוגרים היא קלה יחסית, השתלת צמחים זמן קצר לאחר הנביטה היא מאתגרת. למרות זאת, לעיתים נדרש להעריך את ההשפעות של איתות למרחקים ארוכים בתהליכים כגון התפתחות צמחים, תגובות סביבתיות ופריחה 6,7,8.
Arabidopsis thaliana נקבע כאורגניזם מודל בביולוגיה של צמחים מסיבות רבות, כולל גודלו הקטן יחסית, מה שהופך אותו קל לגדול בתוך מעבדה. עם זאת, גודלם הקטן ושבריריותם של שתילי ארבידופסיס הופכים את השתלת שתילים צעירים למאתגרת מאוד. במקרים רבים, נדרשת הכשרה מעשית נרחבת כדי להשיג בהצלחה שתלי שתילים. במהלך השנים חלו שיפורים מתודולוגיים רבים שזיהו תנאי גידול אידיאליים וטכניקות חדשות להגדלת שיעור ההצלחה של השתלת שתילים 9,10,11. הכלי האחרון שהוצג היה שבב השתלת שתיל Arabidopsis, המאפשר גם למשתמשים חסרי ניסיון להשיג רמות מקובלות של הצלחת השתלה12. בעוד התקדמות זו הורידה משמעותית את המחסום הטכני של השתלת שתילים, מכשיר השבב יקר, ומספר השתלים שניתן לבצע במקביל הופך במהירות ליקר ביותר.
בנוסף, מכשיר זה יכול לשמש רק עבור שתילי Arabidopsis שיש להם ממדים hypocotyl הדומים שתילים מסוג בר. בעוד ארבידופסיס הוא מין אבן היסוד בעולם הגנטיקה המולקולרית של הצמח, לאחרונה נעשתה עבודה במינים אחרים באמצעות השתלת שתילים. דוגמאות לכך כוללות השתלת פולי סויה והשעועית הנפוצה, טבק לעגבנייה וקנולה לארבידופסיס, ולאחר מכן דגימת שתי הרקמות עבור רנ"א קטן13,14. לכן, שיטת השתלה הנגישה לרוב המעבדות וניתנת להתאמה בקלות למגוון רחב של מיני צמחים ללא שינויים משמעותיים בטכניקה היא רצויה ביותר.
פרוטוקול זה מפרט שיטה המשתמשת בייצור פנימי של מכשיר השתלה פשוט המאפשר התאמה אישית מלאה של קוטר ואורך תעלת השתלה כדי להתאים לכל מורפולוגיית שתיל ברוב מיני הצמחים. הייצור של מכשירים אלה הוא זול מאוד מדרגי מאוד, כמו הרכיבים היחידים הדרושים הם אלסטומר סיליקון, חיווט או צינורות בגודל הנכון, להב דיוק גבוה, מיכל לשמש תבנית. בעקבות פרוטוקול ההשתלה המפורט כאן, משתמשים יכולים להשיג שיעורי השתלה מוצלחים של 45% (n = 105), בדומה לתוצאות ההשתלה שדווחו בעבר10,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת המכשיר
- הפוך את מכשיר השתלת הסיליקון על ידי יציקת תמיסת אלסטומר סיליקון בצלחת פטרי מרובעת (100 מ"מ x 100 מ"מ). הכן 15 מ"ל של תמיסת האלסטומר, בהתאם להנחיות היצרן.
הערה: ערכות אלסטומרים מסיליקון כוללות בדרך כלל נוזל על בסיס סיליקון וחומר ריפוי, שכאשר מערבבים אותם יחד מאפשרים לסיליקון להתמצק. - הכינו את צלחת הפטרי המרובעת על-ידי הנחת ארבע חתיכות ישרות של חוט 29 G בצלחת הפטרי המרובעת, במרחק שווה זו מזו (איור 1A). ודא כי החוט שוכב סומק עם החלק התחתון של התבנית. כדי ליישר את החוט במלואו, גלגלו אותו על משטח אחיד וקשיח עם חפץ כבד ושטוח (למשל, מתלה צינורות מתכת).
הערה: עניבות פיתול מכילות לרוב חוט 29 G וניתן להשתמש בהן לאחר הסרת ציפוי הנייר החיצוני באצטון. - יוצקים את תמיסת האלסטומר הסיליקון המעורבת על גבי החוטים ומכסים בחלק העליון של צלחת הפטרי. תנו לסיליקון להחלים במשך 24-48 שעות בטמפרטורת החדר.
- מוציאים את יריעת הסיליקון מצלחת הפטרי בעזרת מלקחיים נקיים ועוברים למשטח שטוח ונקי.
- הסירו את החוטים מיריעת הסיליקון. הסירו את שכבת הסיליקון הדקה שנותרה בצד החיצוני של התעלה בעזרת מלקחיים דקיקים, כדי לאפשר לתעלה להיות פתוחה בצד אחד (איור 1A).
- חותכים את יריעת הסיליקון בניצב לתעלות לרצועות 3 מ"מ באמצעות מספריים נקיים. מעבירים כל רצועה למעטפת רדיד אלומיניום ואוטמים בסרט הדבקה אוטומטי.
- יש למרוח את הרצועות בטמפרטורה של 121°C למשך 30 דקות לפחות ולאחסן עד שהן מוכנות לשימוש.
2. הכנת שתילים
- לעקר ולוונליזציה של זרעים.
- יש להשהות עד 100 זרעי Arabidopsis ב-1 מ"ל של תמיסת אקונומיקה 50% המכילה 0.1% Tween 20 בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, ולדגור במשך 5-10 דקות. מוציאים את תמיסת האקונומיקה באמצעות צנרת או שאיפה בתנאים סטריליים. שטפו את הזרעים עם 1 מ"ל של dH2O. הקפידו להפוך את הצינורות כדי לשטוף כראוי את הזרעים ולהסיר כל תמיסת אקונומיקה שנותרה בחלק העליון של הצינור. חזור על השטיפה 4x.
- השאירו כ 0.25 מ"ל מים בצינורות עם הזרעים ולאחסן ב 4 °C במשך 3 ימים בחושך.
- מקציפים את הזרעים כהכנה להשתלה.
- הכינו צלחת אגר MS 1% כדלקמן: עבור 1 ליטר של MS (0.5% סוכרוז) מוצק בינוני, מערבבים 4.4 גרם מלח MS, 5 גרם סוכרוז ו 10 גרם אגר ב 800 מ"ל מים, להתאים את ה- pH ל 5.7 עם KOH, ולאחר מכן להביא את נפח הכולל ל 1 L עם מים נוספים. Autoclave לפחות 20, דקה לפני לשפוך ~ 25 מ"ל לתוך צלחת פטרי מרובע.
- בתנאים סטריליים, העבירו את המספר המתאים של זרעים מוכנים לצלחת, בעזרת קצה פיפטה של 20 μL כדי לשאוף ולהעביר את הזרעים.
- הניחו רצועה סטרילית על משטח הצלחת כדי לכוון את מיקום הזרעים, כך שהזרעים מיושרים עם התעלות שעל הרצועה. מוציאים את הרצועה ברגע שהזרעים מצופים.
הערה: צלחת מרובעת אחת בגודל 100 מ"מ x 100 מ"מ יכולה להכיל שתי שורות שתילים (איור 1B). - ברגע שהצלחות עומדות, הניחו לנוזל להתאדות מתוך התווך המוצק והצטברו בתחתית הצלחת. לאחר שהזרעים מונחים על הצלחת, הניחו על מכסה הצלחת ואטמו צד אחד של הצלחת המקביל לשתי שורות הזרעים (מסומן על-ידי האזור המסומן בכחול באיור 1B) באמצעות פרפילם. עטפו סרט נושם על גבי הפרפילם וסביב כל שאר הקצוות של הצלחת.
- העמידו בזהירות שתי צלחות כשהצד האטום בפרפילם פונה כלפי מטה. הפרידו את שני הלוחות בתחתית על ידי הנחת צינור צנטריפוגה אופקי של 15 מ"ל ביניהם והדקו באמצעות גומייה. ודא שמשטחי הלוחות יוצרים זווית של 100°-110° עם משטח הספסל (איור 1C).
- אחסן את הצלחות בכיוון זה במשך 72 שעות בחושך מוחלט ב 21 ° C, כדי לאפשר hypocotyls שתיל לגדול ~ 5 מ"מ אורך. לאחר 72 שעות, הסר את הלוחות מהחושך וגדל תחת 16 שעות אור (עוצמה של 100 μE m-2 sec-1) ו 8 שעות מחזורים כהים במשך 2-4 ימים נוספים באותה טמפרטורה לפני grafting.
- שתל את השתילים בין 5 ל 7 ימים לאחר צלחת. מניחים רצועת השתלה מעל השתילים, ומתאימים את ההיפוקוטיל שלהם לתעלות. מקמו בעדינות את השתיל כך שצומת השורשים-היפוקוטיל ימוקם בתחתית רצועת הסיליקון כדי להכין את השתיל לחיתוך (איור 1D).
3. הליך השתלה
- הכינו סביבת עבודה סטרילית על ידי חיטוי היקף דיסקציה עם 70% אתנול וחציבה אוטומטית של שני זוגות מלקחיים עדינים וידית אזמל. יש לבצע את כל הליכי ההשתלה במכסה מנוע סטרילי ובעזרת היקף דיסקציה לפי הצורך. בצע את רוב ההשתלה באמצעות הגדלה של פי 10.5.
- הכינו את השריגים. השתמש בלהב אזמל טרי כדי לחתוך את ההיפוקוטיל בניצב כדי ליצור חתך ישר ונקי. דחפו את הלהב קדימה במקום ללחוץ למטה לתוך הצמח כדי למנוע מהשתיל להידחף לתוך האגר (סרטון 1).
- הסר את הצילומים. הקפד לשמור על החלק החתוך של הצילום hydrated על ידי הבטחת מגע עם משטח התקשורת. לחלופין, העבירו את הנבטה לאזור החזקה ייעודי, כגון החלק העליון של צלחת פטרי מלאה ב-dH2O סטרילי, עד שהיא מוכנה לשימוש.
- הכינו את השורשים. משכו בעדינות את השורש על ידי תפיסת השורש ברווח שנותר בין המלקחיים הסגורים וסיבובם, תוך השארת החלק החתוך של השורשים באמצע הרצועה (סרטון 2).
הערה: השורש השביר ייפגע אם יימעך ישירות בין המלקחיים הסגורים, מה שיצריך לקשור את השורש בזווית החדה של קצות הפינצטה כדי לתפעל את הרקמה. - הרימו בעדינות את הצילום הרצוי באמצעות המלקחיים העדינים והכניסו לחלק העליון של הערוץ.
הערה: קריטי לאשר באופן חזותי את המגע בין הגזעים לשורשים כדי להשיג שתל מוצלח (סרטון 3). - לאחר שכל השתלים נעשו, עטפו את הצלחות בפרפילם ובסרט נושם והקימו את הצלחות באותו אופן כמו קודם, מבלי להפריע לשתילים או לרצועות הסיליקון. בזהירות להעביר את הלוחות לתא צמיחה להגדיר על 26 ° C עם 16 שעות אור / 8 שעות מחזורים כהים.
- להעריך את השתילים המושתלים בתנאים סטריליים לאחר 7-10 ימים. בזהירות להסיר את רצועת הסיליקון באמצעות מלקחיים על ידי קילוף צד אחד, המאפשר את התעלות לשחרר את השתילים. הסר את כל השורשים ההרפתקניים הצומחים מן הנצר על ידי חיתוך אותם מן הנצר עם להב אזמל טרי או ריסוק אותם באמצעות מלקחיים עדינים. העריכו ויזואלית אם השורש נצמד היטב לנצר כדי ליצור שתל מוצלח (איור 2).
- העבר שתלים מוצלחים לאדמת ריבוי שתילים כדי לגדול כל עוד נדרש. מכסים את האדמה בפלסטיק שקוף למשך מספר ימים עם התבססות השתילים. לאחר העברת הצמחים לאדמה, לגדול תחת מחזורי אור וחושך שהוזכרו לעיל ב 21 °C (75 °F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היבטים שונים של עיצוב רצועת ההשתלה נבדקו כדי לזהות את תנאי ההשתלה האופטימליים הדורשים את המיומנות הטכנית הנמוכה ביותר (טבלה 1). כל ניסויי ההשתלה הושלמו על 0.5% סוכרוז MS בינוני, אשר דווח בעבר כמדיום השתלה אידיאלי11,12.
לא ניתן להשיג גידול אופטימלי של שתילים באמצעות נביטה ברצועה
באיטרציה הראשונה של רצועת הסיליקון, התעלות הסגורות נוצרו על ידי השארת שכבת הסיליקון הדקה שנותרה על גב תעלות הרצועה לאחר הסרת החוטים מיריעות הסיליקון. במקום להנביט את השתילים ישירות על הצלחת ולאחר מכן להניח את רצועת ההשתלה מעל ההיפוקוטיל של השתיל, הזרעים נבטו ישירות על הרצועה לאחר החדרת הזרעים לתעלה מלאה בכמות קטנה של מדיום טרשת נפוצה. בטכניקה זו, מחצית מהשתילים נתקעו בתעלות במהלך הנביטה ולא הצליחו להתארך. כולל השתילים הלא מונבטים והלא מוארכים, הושגו שיעורי השתלה מוצלחים של 25% (n = 16) (טבלה 1). כדי לטפל בכשל ההתארכות שנצפה, הזרעים היו מכוונים כך שהקוטילדונים והרדיקלים של העובר הצביעו כלפי מטה במהלך הנביטה. בשיטה זו, 75% מהזרעים נבטו והתארכות בהצלחה, מה שהביא לעלייה קלה ביעילות ההשתלה (33% הצלחה, n = 12) (טבלה 1). כדי להגביר התפתחות מוצלחת של שתילים, שכבת הסיליקון הדקה שסוגרת את התעלה הוסרה מהצד הבינוני של רצועת ההשתלה כדי לאפשר מגע בין הזרע למדיום הגידול (איור 1A). בשיטה זו, 85% מהשתילים נבטו והוארך בהצלחה, ו-31% (n = 16) הושתלו בהצלחה (טבלה 1). למרות עלייה משמעותית בקצב התפתחות הזרעים התקין ברצועה, אובדן אפילו מספר קטן של שתילים יכול להשפיע באופן משמעותי על גודל אוכלוסיית הניסוי בעת ביצוע שתלים הדדיים בין קבוצות ניסוי שונות. מסיבה זו, נביטת שתילים ישירות על פני השטח הבינוניים נקבעה כאידיאלית.
שמירה על שיעור הישרדות השתיל וצמצום זמן עיבוד ומאמצים
שתילים טופחו תחילה להשתלה על צלחות טרשת נפוצה (1% סוכרוז), הועברו למשטח מוצק (כגון מכסה צלחת פטרי מלאה במים) לחיתוך, ולאחר מכן הורכבו על צלחת עם הרצועה להשתלה. באמצעות טכניקה זו נצפה שיעור הצלחה של 50% (n = 8) (טבלה 1). בעוד ששיטה זו השיגה את שיעור ההצלחה הגבוה ביותר, היא הייתה גוזלת זמן ודורשת מאמץ רב, ודרשה 2.5 דקות לכל שתל, מה שהגביל את מספר השתלים שניתן היה להרכיב בבת אחת. כדי להפחית את הזמן והמאמץ הנדרשים, שתילים טופחו במאונך על צלחת ההשתלה (0.5% סוכרוז) ולאחר מכן הוכנסו לרצועה ישירות לפני ההשתלה, כמתואר בפרוטוקול זה. כדי להמשיך ולבחון שיטה זו, נערכו שלושה ניסויים בגדלים שונים. לשני הניסויים הראשונים היה שיעור הצלחה של 48% (n = 25 ו-64) ולניסוי השלישי היה שיעור הצלחה של 25% (n = 16) (טבלה 1). יחד, ניסויים אלה מצביעים על שיעור הצלחה של 45% (n = 105). שיעור הצלחה זה דומה לשיטה הגוזלת זמן רב יותר ודורש כדקה לכל שתל כדי להניח את רצועת ההשתלה מעל השתילים ולהשלים את ההשתלה (שלבי פרוטוקול 3.2-3.5).
שיעור הצלחת ההשתלה תלוי במידה רבה באיכות בניית רצועת ההשתלה. בעוד שלשני הניסויים הראשונים יש שיעור הצלחה של 48%, לניסוי השלישי יש שיעור הצלחה נמוך יותר. האיכות בעבודת יד של רצועת ההשתלה גורמת מטבעה לשונות קלה בין אתרי ההשתלה. אם החוטים המשמשים לבניית הרצועה אינם ישרים לחלוטין, אזי התעלות ברצועות לא יהיו צמודות לתחתית התבנית ויגרמו לתעלות בעומקים מעט משתנים. בסך הכל, 25 רצועות מיוצרות בכל יציקת רצועה, והתוצאה היא 100 אתרי השתלה ייחודיים (טבלה 2). בעוד ההשפעה של שונות קלה באתרי ההשתלה מאוזנת בשני הניסויים הגדולים יותר, בניסוי הקטן יותר עם שיעורי הצלחה נמוכים יותר, נראה כי אתרי השתלה עם שונות רבה יותר עקב חוטים מתעקלים מעט עלולים להשפיע לרעה על היווצרות השתל. כדי למזער סוג זה של וריאציה, טכניקת יישור חוטים מתוארת בשלב 1.2 של הפרוטוקול.
איור 1: המחשה של שלבי ההכנה להשתלה . (A) דגם של עיצוב תבנית רצועת הסיליקון. פאנל זה מדגים את תבנית הפלטה המרובעת המשמשת ליציקת רצועות הסיליקון. ארבעה חלקים של 29 חוטי G באורך שווה מונחים בתחתית הצלחת, ותערובת אלסטומר סיליקון נשפך עליהם (מעל). לאחר שהסיליקון נרפא במלואו, ריבוע הסיליקון מוסר מהצלחת והחוטים מוסרים כדי ליצור את תעלות ההשתלה. שכבה דקה של סיליקון נשארת בתחתית התעלות לאחר הסרת החוטים (מסומנת על ידי *). יש להסיר שכבה זו כדי להשאיר את הערוצים פתוחים בתחתית (להלן). לאחר מכן חותכים את הריבוע בניצב לתעלות התיל לרצועות 3 מ"מ, כפי שמוצג בקווים המקווקוים (למעלה). (B) מיקום זרעים על צלחת ההשתלה. בעזרת רצועה סטרילית מונחות על הצלחת שתי שורות זרעים בקו אחד עם תעלות הרצועה. לאחר הנחת הזרעים, יש להסיר רצועה זו כדי למנוע כל מכשול נביטה. כדי להכין לוחות MS לצמיחה אנכית, יש לעטוף את הפרפילם לאורך הקצה התחתון (צד השורש) של הצלחת, המסומן כאן בהדגשה כחולה. (C) מיקום צלחת אנכית לנביטת זרעים. לאחר הציפוי, הזרעים נובטים אנכית על לוחות זוויתיים. צינור חרוטי בנפח 15 מ"ל ממוקם בבסיסן של שתי פלטות כדי ליצור זווית מעט מעורפלת בין משטח הצלחת לספסל. הקצה הפרפילם (מסומן בכחול) של הלוח מכוון לכיוון משטח הספסל. גומייה נכרכת סביב החלק העליון של שתי הצלחות כדי לשמור אותן במקומן. (D) מיקום שתיל ברצועה ישירות לפני ההשתלה. רצועות השתלה סטריליות מונחות על גבי השתילים עם היפוקוטיל בתוך תעלות הרצועה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונה שצולמה על טווח דיסקציה המראה אתר השתלה שנרפא. החץ השחור מציין את אתר צומת השתל, והחצים האדומים מציינים שורשים הרפתקניים שהוסרו בתהליך הערכת השתל. סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
סרטון 1: הדגמה של השתלה פעילה באמצעות הדמיה חיה של צמחים. המיקום והתנועה של להב האזמל ליצירת חתך נקי. היפוקוטיל השתיל נחתך ישירות מעל רצועת השתל על ידי דחיפת להב האזמל קדימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 2: מיקום היפוקוטיל השורש החתוך להשתלה בתוך הרצועה. השורש נמשך בעדינות באמצעות מלקחיים כדי למקם את אתר צומת השתל במרכז הרצועה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 3: הנחת הנצר והשלמת השתל. הנצר מוחלף ונדחף לתוך הרצועה עד שהוא מתחבר עם השורש. יישור ומגע נכונים מוערכים על ידי ראיית תגובת ההיפוקוטיל כאשר הצאצא נדחף קלות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
טבלה 1: משתני ניסוי השתלה ושיעורי הצלחה. טבלה זו מסכמת את תוצאות ניסויי ההשתלה המשמשים לקביעת פרוטוקול ההשתלה האופטימלי לשיעורי ההצלחה הגבוהים ביותר. המשתנים שנבדקו בניסויים אלה כוללים תנאי נביטה של שתילים, בניית רצועות סיליקון ומתי הוכנסו שתילים לתעלות רצועת הסיליקון במהלך ההשתלה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: מספר אתרי ההשתלה שניתן להפיק מבקבוק של 250 מ"ל של אלסטומר סיליקון. המחיר עבור כל יחידת ייצור מוצג גם כאן (בזמן הפרסום), וניתן להתאים אותו בקלות לתנודות בשווי השוק של ריאגנטים אלסטומרים סיליקון. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סיכום ומשמעות
יצירת איחוד שתלים היא קריטית להשתלה מוצלחת, הדורשת מגע ישיר ובלתי מופרע בין השורש לסיון. הגודל המיניאטורי והשבריריות של שתילים של צמחים קטנים כגון Arabidopsis עושה את זה מאתגר מבחינה טכנית כדי לענות על דרישה זו. טכניקה אחת שפותחה בשיטות השתלת שתיל ארבידופסיס המוקדמות הייתה להחדיר הן את הנצר והן את השורש לתוך צווארון צינורות סיליקון קצר כדי לתמוך בצומת השתל10. בעוד ששיטה זו יעילה מאוד בהגנה על שני חלקי השתל מפני הפרדה, אין זו משימה קלה להחדיר את הנצר השביר ואת השורש לצינור צר. יתר על כן, העיבוי בצומת מהצמיחה מקשה פעמים רבות על הסרת צינורות הסיליקון הצרים מבלי לפגוע בשתילים המושתלים. שיטות אחרות השתמשו בטכניקות חלופיות כדי להימנע משימוש בקולר השתלה תוך מניעת תזוזת שתילים במהלך הצמיחה, כולל הסרת שני הקוטילדונים מהסקיונס וגידול שתילים מושתלים על משטח אלכסוני 9,11. בעוד ששיטות אלה דורשות מעט משאבים כדי להשלים, כאשר נוסו, שיטות אלה הביאו לרמות גבוהות של נדידת צאצאים הרחק ממלאי השורש, וכתוצאה מכך הצלחת השתלה נמוכה יותר ממה שדווח (80% בממוצע עבור התנאים המומלצים בשני המחקרים) באמצעות טכניקות אלה. בנוסף, שניהם דורשים מהמשתמש ליישר את הממשק בין חלקי שתיל השתל ללא עזרים, משימה הדורשת רמה גבוהה של מיומנות. לאחרונה דווח על שבב מיקרו-השתלה שתוכנן במיוחד להשתלת שתיל Arabidopsis 12. כל שבב מכיל ארבעה מיקרו-תאים המאפשרים לארבעה שתילים לגדול, כאשר העיצוב המיוחד של חלל התא מאפשר להיפוקוטיל לגדול בתוך מיקרו-ערוץ. השורשים נוצרים במקום על השבב, ואת scions מוכנסים לתוך micro-channels. זה מבטל את הצורך לטפל הן בשורשים והן בשיניים לצורך השתלה, והמיקרו-ערוץ מגביל את השתל במקום מבלי להקריב את הקלות של הסרת שתילים ברגע שנוצר איחוד השתלים. בעוד שיטה חדשה זו מפחיתה באופן משמעותי את המחסום הטכני של השתלת שתילים, ייצור שבב המיקרו-השתלה דורש מערכות מיקרו-אלקטרו-מכניות (MEMS), טכנולוגיה שאינה נגישה בקלות לרוב מעבדות הביולוגיה. הממדים של תא מיקרו על שבב micrografting היו אופטימיזציה עבור Arabidopsis Col-012. זה מונע שימוש בשבבים עבור מינים אחרים או אביזרים שונים Arabidopsis / מוטנטים שיש hypocotyls המשתנים גובה או עובי15,16,17.
השיטה הזולה, הגמישה והקלה למעקב המתוארת כאן קיבלה השראה מעבודות קודמות של שבבי מיקרו-השתלה כדי להקל על השתלת שתילים צעירים. בשיטה זו, מניפולציה של שתילים עדינים הוא מינימלי, להקל על השימוש עבור משתמשים חדשים. התעלות ברצועות מסייעות למשתמשים חדשים ליישר את השתילים המושתלים ולשמור על השורש והנבטה במגע טוב במהלך היווצרות אתר השתל, תוך הבטחת הסרה קלה לאחר יצירת השתל. בשל התפוקה הגבוהה של רצועות הסיליקון והעלות הנמוכה יחסית של חומרי ההתחלה, ניתן להשיג השתלת מספר רב של שתילים בשבריר מעלות שבבי המיקרו-השתלה. המכשיר הביתי הזה מוערך בעלות של 0.12 דולר לאתר השתלה, מה שהופך אותו לאופציה כלכלית עבור מעבדות שעובדות עם מגוון מיני צמחים או פנוטיפים של שתילים (טבלה 2). בעוד שההיבט בעבודת יד של רצועות ההשתלה מפחית את העלויות הכרוכות בשיטה זו, הוא גם מציג את הסיכוי לשונות בין רצועות שונות. כפי שהודגש קודם לכן, איכות רצועות ההשתלה היא המפתח להצלחת שיטה זו. העלייה בשימוש בהשתלת שתילים בשלב מוקדם בגנטיקה מולקולרית העניקה לתחום הגנטיקה של צמחים כלי רב עוצמה לחקר איתות למרחקים ארוכים בצמחים. שיטה פשוטה, זולה ונגישה זו תספק כלי נוסף שיסייע באימוץ מוצלח של טכניקת השתלת השתיל על ידי מעבדות עם הכשרה וניסיון מוקדמים מינימליים.
שיקולים קריטיים
תהליכים כגון ייזום תגובה לתיקון פצעים, יצירת תקשורת בין תא לתא בין הנצר לשורש, ובסופו של דבר היווצרות כלי דם, נחוצים ליצירת שתל מוצלח9. במהלך תהליך ההשתלה, חשוב לשמור על השתילים מיובשים ולא פגומים מעבר לצורך. בשיטה זו, הקצוות החתוכים של השורשים והשורשים חייבים להיות נקיים ומאונכים כדי להבטיח חיבור סומק בין הנצר לשורש. אם אתר ההשתלה ניזוק במהלך החיתוך, או שחלקי ההשתלה אינם נחתכים באותה זווית, השתלה מוצלחת אינה סבירה בשל היעדר מגע הדוק בין שכבות התא לאורך צומת ההשתלה. אם מאפשרים לאחד מחלקי ההשתלה של הצמח להתייבש או פגומים, התהליכים שהוזכרו לעיל יעוכבו, וההשתלה לא תצליח. שתילים צעירים הם שבירים ונמחצים בקלות על ידי מלקחיים. אם המשתמשים מוצאים צורך בכך, ניתן להשתמש במלקחיים כדי לאחוז באחד משני הקוטילדונים כדי לתמרן את הסקיון. בהשוואה לשיטת שבב ההשתלה שדווחה בעבר, הסיכוי לפגוע בשורש תוך משיכת ההיפוקוטיל מטה לתוך רצועת הסיליקון גדל. טכניקות טיפול למזעור סיכון זה מתוארות בשלב 3.4 של הפרוטוקול.
סה"כ ארבעה אתרי השתלה בכל רצועה הוא מספר התנוחות המומלץ כדי להבטיח שהשתילים לא ייגעו זה בזה בשלב היווצרות צומת השתל. כדי להגדיל את המספר הכולל של השתלים המבוצעים בו זמנית, מומלץ למשתמשים להגדיל את מספר הלוחות המשמשים, במקום להקטין את כמות השטח המשמש לכל שתל.
שינוי הפרוטוקול אפשרי כדי להתאים לגידול היפוקוטיל מסתעף או מינים שאינם ארבידופסיס
חלק מהמוטנטים עוברים אטיולים בקצב שונה מצמחים מסוג בר. פיטוהורמונים כגון גיברלינים, ברסינוסטרואידים, אתילן ואוקסין ממלאים תפקיד נרחב בוויסות גדילת שתילים18,19,20. קווים מוטנטיים פגומים במסלולי הורמונים אלה עשויים לחוות שיעורי אטיולציה לא טיפוסיים16,17. העיצוב הנשלט על ידי המשתמש של רצועת ההשתלה מאפשר התאמה של הבדלים פנוטיפיים אלה, אך נדרשת בדיקה מספקת במקרים אלה. אם נעשה שימוש בקו גנטי שחווה אטיולציה בקצב שונה משמעותית מהסוג הפראי, על המשתמשים לקבוע אם תקופת האטיולציה בת 3 הימים המתוארת כאן מתאימה לקווים שלהם לפני שהם מתחילים. שתילים לא מנוצלים כראוי יגרמו להשתלה קשה עקב היפוקוטיל מקוצר או מורחב יתר על המידה (ודק יותר). משתמשים המעוניינים להשתיל שתילים של זנים שאינם Arabidopsis יכולים להתאים פרוטוקול זה לצרכיהם באמצעות שינוי קוטר תעלת ההשתלה. נראה כי שתילי עגבניות וטבק הגדלים לגיל השתלה מתאים דורשים תעלות השתלה בקוטר 0.8 ו-0.4 מ"מ, בהתאמה9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
תודה לחבייר ברומוס על ההכשרה הראשונית וההדרכה בהשתלת שתילי ארבידופסיס .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E.
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y.
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
