Summary
यह प्रोटोकॉल एक मजबूत अंकुर ग्राफ्टिंग विधि का वर्णन करता है जिसके लिए कोई पूर्व अनुभव या प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं होती है और अधिकांश आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में आसानी से सुलभ सामग्री का उपयोग करके बहुत कम लागत पर निष्पादित किया जा सकता है।
Abstract
प्रारंभिक चरण अंकुर ग्राफ्टिंग पौधों के भीतर रूट-शूट संबंधों का अध्ययन करने के लिए आणविक आनुवंशिकी में एक लोकप्रिय उपकरण बन गया है। छोटे मॉडल पौधे, एराबिडोप्सिस थैलियाना के शुरुआती चरण के पौधों को ग्राफ्टिंग करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और इसके रोपाई के आकार और नाजुकता के कारण समय लेने वाला है। प्रकाशित विधियों का एक बढ़ता संग्रह इस तकनीक का वर्णन अलग-अलग सफलता दर, कठिनाई और संबंधित लागतों के साथ करता है। यह पेपर सिलिकॉन इलास्टोमर मिश्रण का उपयोग करके इन-हाउस पुन: प्रयोज्य ग्राफ्टिंग डिवाइस बनाने के लिए एक सरल प्रक्रिया का वर्णन करता है, और अंकुर ग्राफ्टिंग के लिए इस उपकरण का उपयोग कैसे करें। इस प्रकाशन के समय, प्रत्येक पुन: प्रयोज्य ग्राफ्टिंग डिवाइस का उत्पादन करने के लिए उपभोग्य सामग्री में केवल $ 0.47 की लागत आती है। इस विधि का उपयोग करके, शुरुआती लोग शुरू से अंत तक 3 सप्ताह से भी कम समय में अपने पहले सफलतापूर्वक ग्राफ्टेड रोपाई कर सकते हैं। यह अत्यधिक सुलभ प्रक्रिया पौधे आणविक आनुवंशिकी प्रयोगशालाओं को उनकी प्रयोगात्मक प्रक्रिया के सामान्य भाग के रूप में अंकुर ग्राफ्टिंग स्थापित करने की अनुमति देगी। इन ग्राफ्टिंग उपकरणों के निर्माण और डिजाइन में उपयोगकर्ताओं के पूर्ण नियंत्रण के कारण, इस तकनीक को बड़े पौधों, जैसे टमाटर या तंबाकू में उपयोग के लिए आसानी से समायोजित किया जा सकता है, यदि वांछित हो।
Introduction
ग्राफ्टिंग एक प्राचीन बागवानी तकनीक है जो 500ईसा पूर्व तक एक स्थापित कृषि अभ्यास बन गई। पैदावार में सुधार के लिए फसल पौधों की विभिन्न किस्मों को ग्राफ्टिंग करना इस तकनीक का पहला उपयोग था, और आज भी इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया जाता है। पिछले दशक में, ग्राफ्टिंग ने पौधों 2,3,4,5 में लंबी दूरी के सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए आणविक जीवविज्ञानी के लिए एक उपकरण के रूप में ध्यान आकर्षित किया है। जबकि वयस्क पौधों को ग्राफ्टिंग करना अपेक्षाकृत आसान है, अंकुरण के तुरंत बाद पौधों को ग्राफ्टिंग करना चुनौतीपूर्ण है। इसके बावजूद, कभी-कभी पौधे के विकास, पर्यावरणीय प्रतिक्रियाओं और फूल 6,7,8 जैसी प्रक्रियाओं में लंबी दूरी के सिग्नलिंग के प्रभावों का आकलन करना आवश्यक होता है।
एराबिडोप्सिस थैलियाना को कई कारणों से पौधे जीव विज्ञान में मॉडल जीव के रूप में स्थापित किया गया है, जिसमें इसका अपेक्षाकृत छोटा आकार भी शामिल है, जिससे प्रयोगशाला के अंदर बढ़ना आसान हो जाता है। हालांकि, एराबिडोप्सिस रोपाई का छोटा आकार और नाजुकता युवा रोपाई को बहुत चुनौतीपूर्ण बनाती है। कई मामलों में, अंकुर ग्राफ्ट को सफलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। पिछले कुछ वर्षों में कई पद्धतिगत सुधार हुए हैं जिन्होंने अंकुर ग्राफ्टिंग की सफलता दर 9,10,11 को बढ़ाने के लिए आदर्श बढ़ती स्थितियों और नई तकनीकों की पहचान की है। पेश किया गया सबसे हालिया उपकरण एक एराबिडोप्सिस सीडलिंग ग्राफ्टिंग चिप था, जो अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं को ग्राफ्टिंग सफलता के स्वीकार्य स्तर को प्राप्त करने की अनुमतिदेता है। हालांकि इस अग्रिम ने अंकुर ग्राफ्टिंग की तकनीकी बाधा को काफी कम कर दिया है, चिप डिवाइस महंगा है, और समानांतर में आयोजित किए जा सकने वाले ग्राफ्ट की संख्या जल्दी से लागत-निषेधात्मक हो जाती है।
इसके अतिरिक्त, इस उपकरण का उपयोग केवल एराबिडोप्सिस रोपाई के लिए किया जा सकता है जिसमें हाइपोकोटाइल आयाम होते हैं जो जंगली प्रकार के रोपाई के समान होते हैं। जबकि एराबिडोप्सिस पौधों के आणविक आनुवंशिकी की दुनिया में कीस्टोन प्रजाति है, हाल ही में अंकुर ग्राफ्टिंग का उपयोग करके अन्य प्रजातियों में काम किया गया है। उदाहरणों में सोयाबीन और आम बीन, टमाटर को तंबाकू और एराबिडोप्सिस के लिए कैनोला की ग्राफ्टिंग शामिल है, और बाद में छोटे आरएनए13,14 के लिए दोनों ऊतकों का नमूना लिया गया है। इसलिए, एक ग्राफ्टिंग विधि जो अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है और आसानी से किसी भी प्रमुख तकनीक परिवर्तन के बिना पौधों की प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित की जा सकती है, अत्यधिक वांछनीय है।
यह प्रोटोकॉल एक ऐसी विधि का विवरण देता है जो एक साधारण ग्राफ्टिंग डिवाइस के इन-हाउस उत्पादन को नियोजित करता है जो अधिकांश पौधों की प्रजातियों में किसी भी अंकुर आकृति विज्ञान को समायोजित करने के लिए ग्राफ्टिंग चैनल व्यास और लंबाई के पूर्ण अनुकूलन की अनुमति देता है। इन उपकरणों का उत्पादन बहुत सस्ती और अत्यधिक स्केलेबल है, क्योंकि आवश्यक एकमात्र घटक सिलिकॉन इलास्टोमर, सही आकार के वायरिंग या टयूबिंग, एक उच्च परिशुद्धता ब्लेड और एक मोल्ड के रूप में सेवा करने के लिए एक कंटेनर हैं। यहां विस्तृत ग्राफ्टिंग प्रोटोकॉल के बाद, उपयोगकर्ता 45% (एन = 105) की सफल ग्राफ्टिंग दर प्राप्त कर सकते हैं, जो पहले रिपोर्ट किए गए ग्राफ्टिंगपरिणामों 10,12 के साथ तुलनीय है।
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Protocol
1. डिवाइस की तैयारी
- एक वर्ग पेट्री डिश (100 मिमी x 100 मिमी) में सिलिकॉन इलास्टोमेर समाधान को ढालकर सिलिकॉन ग्राफ्टिंग डिवाइस बनाएं। निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए इलास्टोमेर समाधान के 15 एमएल तैयार करें।
नोट: सिलिकॉन इलास्टोमर किट में आमतौर पर एक सिलिकॉन-आधारित तरल और एक इलाज एजेंट शामिल होता है, जो एक साथ मिश्रित होने पर सिलिकॉन को ठोस बनाने की अनुमति देता है। - स्क्वायर पेट्री डिश में 29 जी तार के चार सीधे टुकड़े बिछाकर स्क्वायर पेट्री डिश तैयार करें, जो एक दूसरे से समान दूरी पर हैं (चित्रा 1 ए)। सुनिश्चित करें कि तार मोल्ड के तल के साथ फ्लश हो। तार को पूरी तरह से सीधा करने के लिए, इसे एक भारी और सपाट वस्तु (जैसे, एक धातु ट्यूब रैक) के साथ एक कठोर समान सतह पर रोल करें।
नोट: ट्विस्ट टाई में अक्सर 29 जी तार होते हैं और एसीटोन के साथ बाहरी पेपर कोटिंग को हटाने के बाद इसका उपयोग किया जा सकता है। - तारों के शीर्ष पर मिश्रित सिलिकॉन इलास्टोमेर समाधान डालें और पेट्री डिश के शीर्ष के साथ कवर करें। कमरे के तापमान पर 24-48 घंटे के लिए सिलिकॉन को ठीक करने दें।
- पेट्री डिश से सिलिकॉन शीट को साफ बल का उपयोग करके हटा दें और एक साफ सपाट सतह पर ले जाएं।
- सिलिकॉन शीट से तारों को हटा दें। चैनल के बाहर शेष सिलिकॉन की पतली परत को ठीक बिंदु बल के साथ हटा दें, ताकि चैनल एक तरफ खुला रह सके (चित्रा 1 ए)।
- सिलिकॉन शीट को चैनलों के लंबवत रूप से साफ कैंची का उपयोग करके 3 मिमी स्ट्रिप्स में काटें। प्रत्येक पट्टी को एल्यूमीनियम पन्नी लिफाफे में ले जाएं और ऑटोक्लेव टेप के साथ सील करें।
- स्ट्रिप्स को कम से कम 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव करें और उपयोग के लिए तैयार होने तक स्टोर करें।
2. अंकुर तैयारी
- बीजों को निष्फल और वर्नलाइज करें।
- 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.1% ट्वीन 20 युक्त 50% ब्लीच घोल के 1 एमएल में 100 एराबिडोप्सिस बीजों को निलंबित करें, और 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। बाँझ परिस्थितियों में पिपेटिंग या आकांक्षा के माध्यम से ब्लीच समाधान को हटा दें। बीज को 1 एमएल स्टरलाइज्ड डीएच2ओ के साथ कुल्ला करें। बीज को पर्याप्त रूप से कुल्ला करने के लिए ट्यूबों को उलटना सुनिश्चित करें और ट्यूब के शीर्ष पर बचे किसी भी ब्लीच समाधान को हटा दें। कुल्ला को 4x दोहराएं।
- बीज के साथ ट्यूबों में लगभग 0.25 मिलीलीटर पानी छोड़ दें और अंधेरे में 3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- ग्राफ्टिंग की तैयारी में बीज को प्लेट करें।
- 1% एगर एमएस प्लेट निम्नानुसार तैयार करें: एमएस (0.5% सुक्रोज) ठोस माध्यम के 1 एल के लिए, 800 एमएल पानी में 4.4 ग्राम एमएस नमक, 5 ग्राम सुक्रोज और 10 ग्राम आगर मिलाएं, पीएच को कोएच के साथ 5.7 में समायोजित करें, और फिर अतिरिक्त पानी के साथ कुल मात्रा को 1 एल तक लाएं। स्क्वायर पेट्री व्यंजनों में ~ 25 एमएल डालने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव करें।
- बाँझ परिस्थितियों में, तैयार बीजों की उचित संख्या को प्लेट में ले जाएं, बीज को एस्पिरेट करने और स्थानांतरित करने के लिए 20 μL पिपेट टिप का उपयोग करें।
- बीज की स्थिति का मार्गदर्शन करने के लिए प्लेट की सतह पर एक बाँझ पट्टी रखें, ताकि बीज पट्टी पर चैनलों के साथ संरेखित हों। बीज चढ़ाए जाने के बाद पट्टी हटा दें।
नोट: एक 100 मिमी x 100 मिमी वर्ग प्लेट रोपाई की दो पंक्तियों को समायोजित कर सकती है (चित्रा 1 बी)। - एक बार जब प्लेटें खड़ी हो जाती हैं, तो तरल को ठोस माध्यम से वाष्पित होने दें और प्लेट के तल पर पूल करें। बीज को प्लेट पर रखने के बाद, प्लेट कवर पर रखें और प्लेट के एक तरफ सील करें जो पैराफिल्म के साथ बीज की दो पंक्तियों ( चित्रा 1 बी में नीले हाइलाइट किए गए क्षेत्र द्वारा इंगित) के समानांतर है। पैराफिल्म के शीर्ष पर और प्लेट के अन्य सभी किनारों के आसपास सांस लेने योग्य टेप लपेटें।
- सावधानी से दो प्लेटों को पैराफिल्म-सील साइड के साथ नीचे की ओर खड़े करें। उनके बीच एक क्षैतिज 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखकर और रबर बैंड के साथ सुरक्षित करके नीचे दो प्लेटों को अलग करें। सुनिश्चित करें कि प्लेट की सतह बेंचटॉप सतह (चित्रा 1 सी) के साथ 100 ° -110 ° कोण बनाती है।
- प्लेटों को 21 डिग्री सेल्सियस पर कुल अंधेरे में 72 घंटे के लिए इस अभिविन्यास में स्टोर करें, ताकि अंकुर हाइपोकोटिल लंबाई में ~ 5 मिमी बढ़ सकें। 72 घंटे के बाद, प्लेटों को अंधेरे से हटा दें और ग्राफ्टिंग से पहले समान तापमान पर 2-4 दिनों के लिए 16 घंटे प्रकाश (100 μE m-2 sec-1 की तीव्रता) और 8 घंटे के अंधेरे चक्र के तहत बढ़ें।
- चढ़ाए जाने के बाद 5 से 7 दिनों के बीच रोपाई को ग्राफ्ट करें। रोपाई के ऊपर एक ग्राफ्टिंग पट्टी रखें, उनके हाइपोकोटाइल को चैनलों में फिट करें। धीरे से अंकुर को रखें ताकि जड़-हाइपोकोटिल जंक्शन को काटने के लिए अंकुर तैयार करने के लिए सिलिकॉन पट्टी के तल पर तैनात किया जा सके (चित्रा 1 डी)।
3. ग्राफ्टिंग प्रक्रिया
- 70% इथेनॉल के साथ विच्छेदन दायरे को साफ करके और दो जोड़ी महीन टिंड फोर्स और एक स्केलपेल हैंडल को ऑटोक्लेव करके एक बाँझ कामकाजी वातावरण तैयार करें। सभी ग्राफ्टिंग प्रक्रियाओं को बाँझ हुड में और आवश्यकतानुसार विच्छेदन दायरे की सहायता से करें। 10.5x के आवर्धन का उपयोग करके अधिकांश ग्राफ्टिंग करें।
- वंशज तैयार करें। सीधे साफ कट बनाने के लिए हाइपोकोटिल को लंबवत रूप से काटने के लिए एक ताजा स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें। अंकुर को आगर में धकेलने से रोकने के लिए पौधे में नीचे दबाने के बजाय ब्लेड को आगे बढ़ाएं (वीडियो 1)।
- शूट हटा दें। मीडिया की सतह के साथ संपर्क सुनिश्चित करके शूट के कटे हुए हिस्से को हाइड्रेटेड रखने का ध्यान रखें। वैकल्पिक रूप से, शूट को एक निर्दिष्ट होल्डिंग क्षेत्र में ले जाएं, जैसे कि बाँझ डीएच2ओ से भरे पेट्री डिश के शीर्ष पर, उपयोग के लिए तैयार होने तक।
- रूटस्टॉक तैयार करें। बंद बलों के बीच छोड़ी गई जगह में जड़ को पकड़कर और उन्हें मोड़कर धीरे से जड़ को खींचें, पट्टी के बीच में रूटस्टॉक के कटे हुए खंड को छोड़ दें (वीडियो 2)।
नोट: नाजुक जड़ को सीधे बंद बलों के बीच कुचलने पर क्षतिग्रस्त हो जाएगा, जिससे ऊतक में हेरफेर करने के लिए चिमटी सिरों के तेज कोण में जड़ को घुमाने की आवश्यकता होती है। - धीरे से बारीक टेप का उपयोग करके वांछित शूट उठाएं और चैनल के शीर्ष में डालें।
नोट: एक सफल ग्राफ्ट प्राप्त करने के लिए स्किऑन और रूटस्टॉक के बीच संपर्क की नेत्रहीन पुष्टि करना महत्वपूर्ण है (वीडियो 3)। - सभी ग्राफ्ट बन जाने के बाद, प्लेटों को पैराफिल्म और सांस लेने योग्य टेप के साथ लपेटें और प्लेटों को पहले की तरह ही स्थापित करें, रोपाई या सिलिकॉन स्ट्रिप्स को परेशान किए बिना। प्लेटों को सावधानीपूर्वक 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे चक्रों के साथ 26 डिग्री सेल्सियस पर सेट विकास कक्ष में ले जाएं।
- 7-10 दिनों के बाद बाँझ परिस्थितियों में ग्राफ्टेड रोपाई का मूल्यांकन करें। सावधानीपूर्वक एक तरफ छीलकर फोर्सप्स का उपयोग करके सिलिकॉन स्ट्रिप को हटा दें, जिससे चैनल रोपाई को मुक्त कर सकें। एक ताजा स्केलपेल ब्लेड के साथ वंशज से काटकर या उन्हें बारीक चिपके हुए बल का उपयोग करके उन्हें कुचलकर, किसी भी घातक जड़ को हटा दें। नेत्रहीन मूल्यांकन करें कि क्या रूटस्टॉक एक सफल ग्राफ्ट बनाने के लिए साइऑन से मजबूती से जुड़ा हुआ है (चित्रा 2)।
- सफल ग्राफ्ट को अंकुर प्रसार मिट्टी में स्थानांतरित करें ताकि जब तक आवश्यक हो तब तक बढ़ सके। कुछ दिनों के लिए मिट्टी को पारदर्शी प्लास्टिक से ढक दें क्योंकि रोपाई स्थापित हो जाती है। पौधों को मिट्टी में स्थानांतरित करने के बाद, 21 डिग्री सेल्सियस पर पहले उल्लिखित प्रकाश और अंधेरे चक्रों के तहत बढ़ें।
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Representative Results
ग्राफ्टिंग स्ट्रिप के डिजाइन के विभिन्न पहलुओं का परीक्षण इष्टतम ग्राफ्टिंग स्थितियों की पहचान करने के लिए किया गया था जिनके लिए कम से कम तकनीकी कौशल की आवश्यकता थी (तालिका 1)। सभी ग्राफ्टिंग परीक्षण 0.5% सुक्रोज एमएस माध्यम पर पूरे किए गए थे, जिसे पहले एक आदर्श ग्राफ्टिंग माध्यम11,12 बताया गया है।
ऑन-स्ट्रिप अंकुरण के साथ इष्टतम अंकुर वृद्धि प्राप्त नहीं की जा सकती है
सिलिकॉन स्ट्रिप के पहले पुनरावृत्ति में, सिलिकॉन की पतली परत को छोड़कर संलग्न चैनल बनाए गए थे जो सिलिकॉन शीट से तारों को हटाने के बाद पट्टी चैनलों के पीछे रहता है। पौधों को सीधे प्लेट पर अंकुरित करने और बाद में अंकुर हाइपोकोटिल्स के ऊपर ग्राफ्टिंग पट्टी रखने के बजाय, बीज को एमएस माध्यम की थोड़ी मात्रा से भरे चैनल में बीज डालने के बाद सीधे पट्टी पर अंकुरित किया गया था। इस तकनीक का उपयोग करके, अंकुरण के दौरान आधे पौधे चैनलों में फंस रहे थे और लम्बी होने में विफल रहे। गैर-अंकुरित और गैर-लम्बी रोपाई सहित, 25% (एन = 16) की सफल ग्राफ्टिंग दर हासिल की गई (तालिका 1)। देखे गए बढ़ाव विफलता को संबोधित करने के लिए, बीज उन्मुख थे, इसलिए भ्रूण के कोटिलेडोन और रेडिकल अंकुरण के दौरान नीचे की ओर इशारा कर रहे थे। इस विधि का उपयोग करके, 75% बीज सफलतापूर्वक अंकुरित और लम्बी हो गए, जिसके परिणामस्वरूप ग्राफ्टिंग दक्षता में मामूली वृद्धि हुई (33% सफलता, एन = 12) (तालिका 1)। सफल अंकुर विकास को बढ़ाने के लिए, चैनल को बंद करने वाली सिलिकॉन की पतली परत को ग्राफ्टिंग पट्टी के मध्यम पक्ष से हटा दिया गया था ताकि बीज और विकास माध्यम (चित्रा 1 ए) के बीच संपर्क की अनुमति मिल सके। इस विधि का उपयोग करके, 85% अंकुर अंकुरित और लम्बी हो गए, और 31% (एन = 16) को सफलतापूर्वक ग्राफ्ट किया गया (तालिका 1)। पट्टी पर उचित बीज विकास की दर में काफी वृद्धि के बावजूद, विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के बीच पारस्परिक ग्राफ्ट करते समय रोपाई की एक छोटी संख्या को खोने से प्रयोगात्मक जनसंख्या के आकार पर काफी प्रभाव पड़ सकता है। इस कारण से, मध्यम सतह पर सीधे अंकुरित रोपाई आदर्श होने के लिए निर्धारित किया गया था।
अंकुर जीवित रहने की दर को बनाए रखना और प्रसंस्करण समय और प्रयासों को कम करना
रोपाई को पहले एमएस प्लेटों (1% सुक्रोज) पर ग्राफ्टिंग के लिए उगाया गया था, काटने के लिए एक ठोस सतह (जैसे पानी से भरे पेट्री डिश का ढक्कन) में स्थानांतरित किया गया था, फिर ग्राफ्टिंग के लिए पट्टी के साथ एक प्लेट पर इकट्ठा किया गया था। इस तकनीक का उपयोग करके, 50% सफलता दर (एन = 8) देखी गई (तालिका 1)। जबकि इस विधि ने सफलता की उच्चतम दर प्राप्त की, यह समय लेने वाली और प्रयास-गहन थी, जिसमें प्रत्येक ग्राफ्ट के लिए 2.5 मिनट की आवश्यकता होती थी, जिससे एक बार में इकट्ठे किए जा सकने वाले ग्राफ्ट की संख्या सीमित हो जाती थी। आवश्यक समय और प्रयास को कम करने के लिए, रोपाई को ग्राफ्टिंग प्लेट (0.5% सुक्रोज) पर लंबवत रूप से खेती की गई थी और फिर ग्राफ्टिंग से पहले सीधे पट्टी में डाला गया था, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है। इस पद्धति का आगे परीक्षण करने के लिए, अलग-अलग आकार के तीन परीक्षण आयोजित किए गए थे। पहले दो परीक्षणों में दोनों की सफलता दर 48% (एन = 25 और 64) थी और तीसरे परीक्षण में 25% (एन = 16) की सफलता दर थी (तालिका 1)। साथ में, ये परीक्षण 45% (एन = 105) की सफलता दर का संकेत देते हैं। यह सफलता दर अधिक समय लेने वाली विधि के बराबर है और रोपाई के ऊपर ग्राफ्टिंग पट्टी रखने और ग्राफ्टिंग को पूरा करने के लिए लगभग 1 मिनट प्रति ग्राफ्ट की आवश्यकता होती है (प्रोटोकॉल चरण 3.2-3.5)।
ग्राफ्टिंग की सफलता की दर ग्राफ्टिंग पट्टी निर्माण की गुणवत्ता पर बहुत अधिक निर्भर है। जबकि पहले दो परीक्षणों में सफलता दर 48% है, तीसरे परीक्षण में कम सफलता दर है। ग्राफ्टिंग स्ट्रिप की हस्तनिर्मित गुणवत्ता स्वाभाविक रूप से ग्राफ्टिंग साइटों के बीच मामूली परिवर्तनशीलता का परिणाम है। यदि पट्टी निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले तार पूरी तरह से सीधे नहीं हैं, तो स्ट्रिप्स में चैनल मोल्ड के तल के साथ फ्लश नहीं होंगे और इसके परिणामस्वरूप थोड़ा परिवर्तनीय गहराई के चैनल होंगे। कुल मिलाकर, प्रत्येक स्ट्रिप कास्टिंग में 25 स्ट्रिप्स बनाए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप 100 अद्वितीय ग्राफ्टिंग साइटें होती हैं (तालिका 2)। जबकि ग्राफ्टिंग साइटों में मामूली भिन्नता का प्रभाव दो बड़े परीक्षणों में संतुलित है, सफलता की कम दर वाले छोटे परीक्षण में, ऐसा लगता है कि थोड़ा सुडौल तारों के कारण अधिक भिन्नता वाले ग्राफ्टिंग साइटें ग्राफ्ट गठन को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती हैं। इस प्रकार की भिन्नता को कम करने के लिए, प्रोटोकॉल चरण 1.2 में एक तार-सीधा करने की तकनीक का वर्णन किया गया है।
चित्रा 1: ग्राफ्टिंग तैयारी चरणों का चित्रण। (ए) सिलिकॉन स्ट्रिप मोल्ड डिजाइन का मॉडल। यह पैनल सिलिकॉन स्ट्रिप्स को ढालने के लिए उपयोग किए जाने वाले स्क्वायर प्लेट मोल्ड को प्रदर्शित करता है। समान लंबाई के 29 जी तारों के चार खंड प्लेट के निचले भाग में रखे जाते हैं, और सिलिकॉन इलास्टोमेर मिश्रण उनके ऊपर (ऊपर) डाला जाता है। सिलिकॉन के पूरी तरह से ठीक होने के बाद, सिलिकॉन स्क्वायर को प्लेट से हटा दिया जाता है और ग्राफ्टिंग चैनल बनाने के लिए तारों को हटा दिया जाता है। तारों को हटाने के बाद चैनलों के तल पर सिलिकॉन की एक पतली परत बनी रहती है (* द्वारा इंगित)। चैनलों को नीचे (नीचे) पर खुला छोड़ने के लिए इस परत को हटा दिया जाना चाहिए। वर्ग को तब तार चैनलों के लंबवत 3 मिमी स्ट्रिप्स में काटा जाता है, जैसा कि डॉटेड लाइनों (ऊपर) द्वारा दिखाया गया है। (बी) ग्राफ्टिंग प्लेट पर बीज की स्थिति। एक बाँझ पट्टी की सहायता से, पट्टी चैनलों के अनुरूप प्लेट पर बीज की दो पंक्तियाँ रखी जाती हैं। बीज रखने के बाद, किसी भी अंकुरण बाधा को रोकने के लिए इस पट्टी को हटा दिया जाना चाहिए। ऊर्ध्वाधर विकास के लिए एमएस प्लेटों को तैयार करने के लिए, पैराफिल्म को प्लेट के निचले (रूट-साइड) किनारे के साथ लपेटा जाना चाहिए, जिसे नीले हाइलाइटिंग के साथ यहां चिह्नित किया जाना चाहिए। (सी) बीज अंकुरण के लिए ऊर्ध्वाधर प्लेट की स्थिति। चढ़ाना के बाद, बीज को कोण प्लेटों पर लंबवत रूप से अंकुरित किया जाता है। प्लेट की सतह और बेंचटॉप के बीच थोड़ा घुमावदार कोण बनाने के लिए दो प्लेटों के आधार पर एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब रखी जाती है। प्लेट का पैराफिल्ड किनारा (नीले रंग से चिह्नित) बेंचटॉप सतह की ओर उन्मुख है। उन्हें रखने के लिए दो प्लेटों के शीर्ष के चारों ओर एक रबर बैंड लपेटा जाता है। (डी) ग्राफ्टिंग से पहले सीधे पट्टी में अंकुर की स्थिति। स्ट्रिप चैनलों के अंदर हाइपोकोटिल के साथ रोपाई के शीर्ष पर बाँझ ग्राफ्टिंग स्ट्रिप्स रखी जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: एक विच्छेदन दायरे पर कैप्चर की गई छवि एक ठीक ग्राफ्टिंग साइट दिखाती है। काला तीर ग्राफ्ट जंक्शन साइट को इंगित करता है, और लाल तीर साहसी जड़ों को इंगित करते हैं जिन्हें ग्राफ्ट मूल्यांकन प्रक्रिया के दौरान हटा दिया गया था। स्केल पट्टी = 0.5 मिमी . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 1: लाइव प्लांट इमेजिंग का उपयोग करके सक्रिय ग्राफ्टिंग का प्रदर्शन। एक साफ कट बनाने के लिए स्केलपेल ब्लेड का प्लेसमेंट और गति। स्केलपेल ब्लेड को आगे धकेलकर अंकुर हाइपोकोटिल को सीधे ग्राफ्टिंग स्ट्रिप के ऊपर काट दिया जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 2: पट्टी के भीतर ग्राफ्टिंग के लिए कटे हुए रूटस्टॉक हाइपोकोटिल को पोजिशन करना। पट्टी के बीच में ग्राफ्ट जंक्शन साइट को स्थिति में रखने के लिए रूटस्टॉक को धीरे से खींचा जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 3: वंशज को रखना और ग्राफ्ट को पूरा करना। वंशज को प्रतिस्थापित किया जाता है और पट्टी में धकेल दिया जाता है जब तक कि यह रूटस्टॉक से नहीं जुड़ता है। उचित संरेखण और संपर्क का मूल्यांकन हाइपोकोटिल प्रतिक्रिया को देखकर किया जाता है जब साइऑन को हल्के से धक्का दिया जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1: ग्राफ्टिंग परीक्षण चर और सफलता दर। यह तालिका सफलता की उच्चतम दरों के लिए इष्टतम ग्राफ्टिंग प्रोटोकॉल निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्राफ्टिंग परीक्षणों के परिणामों को सारांशित करती है। इन परीक्षणों में जांच किए गए चर में अंकुर अंकुरण की स्थिति, सिलिकॉन पट्टी निर्माण और ग्राफ्टिंग के दौरान सिलिकॉन स्ट्रिप चैनलों में रोपाई कब डाली गई थी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 2: सिलिकॉन इलास्टोमेर की 250 एमएल बोतल से उत्पन्न ग्राफ्टिंग साइटों की संख्या। उत्पादन की प्रत्येक इकाई के लिए कीमत भी यहां (प्रकाशन के समय) दिखाई गई है, और सिलिकॉन इलास्टोमर अभिकर्मकों के बाजार मूल्य में उतार-चढ़ाव पर आसानी से समायोजित किया जा सकता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
सारांश और महत्व
सफल ग्राफ्टिंग के लिए एक ग्राफ्ट यूनियन का गठन महत्वपूर्ण है, जिसके लिए रूटस्टॉक और साइऑन के बीच सीधे और अबाधित संपर्क की आवश्यकता होती है। एराबिडोप्सिस जैसे छोटे पौधों के पौधों का लघु आकार और नाजुकता इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बनाती है। शुरुआती एराबिडोप्सिस अंकुर ग्राफ्टिंग विधियों में विकसित एक तकनीक ग्राफ्ट जंक्शन10 का समर्थन करने के लिए एक छोटे सिलिकॉन ट्यूबिंग कॉलर में साइऑन और रूटस्टॉक दोनों को सम्मिलित करना था। जबकि यह विधि दो ग्राफ्ट भागों को अलगाव से बचाने में अत्यधिक प्रभावी है, नाजुक साइऑन और रूटस्टॉक को एक संकीर्ण-बोर ट्यूब में डालना आसान काम नहीं है। इसके अलावा, विकास से जंक्शन पर मोटा होने से अक्सर ग्राफ्टेड रोपाई को नुकसान पहुंचाए बिना संकीर्ण-बोर सिलिकॉन ट्यूबों को हटाना मुश्किल हो जाता है। अन्य तरीकों ने विकास के दौरान रोपाई को आगे बढ़ने से रोकने के दौरान ग्राफ्टिंग कॉलर के उपयोग से बचने के लिए वैकल्पिक तकनीकों का उपयोग किया, जिसमें दोनों कोटिलेडोन को साइऑन से हटाना और तिरछी सतह 9,11 पर ग्राफ्टेड रोपाई उगाना शामिल था। हालांकि इन विधियों को पूरा करने के लिए कुछ संसाधनों की आवश्यकता होती है, जब परीक्षण किया जाता है, तो इन विधियों के परिणामस्वरूप रूटस्टॉक से दूर उच्च स्तर के साइऑन माइग्रेशन होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप इन तकनीकों का उपयोग करके रिपोर्ट की गई तुलना में कम ग्राफ्टिंग सफलता (दोनों अध्ययनों में अनुशंसित स्थितियों के लिए औसतन 80%)। इसके अतिरिक्त, वे दोनों उपयोगकर्ता को बिना किसी सहायता के ग्राफ्ट अंकुर भागों के बीच इंटरफ़ेस को संरेखित करने की आवश्यकता होती है, एक कार्य जिसके लिए उच्च स्तर के कौशल की आवश्यकता होती है। एराबिडोप्सिस अंकुर ग्राफ्टिंग के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन की गई एक माइक्रोग्राफ्टिंग चिप हाल ही में12 की सूचना दी गई है। प्रत्येक चिप में चार माइक्रो-चैंबर होते हैं जो चार रोपाई को बढ़ने की अनुमति देते हैं, कक्ष स्थान के विशेष डिजाइन के साथ हाइपोकोटाइल को माइक्रो-चैनल के अंदर बढ़ने में सक्षम बनाता है। चिप पर रूटस्टॉक उत्पन्न होते हैं, और साइऑन को माइक्रो-चैनलों में डाला जाता है। यह ग्राफ्टिंग के लिए रूटस्टॉक और साइऑन दोनों को संभालने की आवश्यकता को समाप्त करता है, और माइक्रो-चैनल ग्राफ्ट यूनियन बनने के बाद रोपाई को हटाने में आसानी का त्याग किए बिना ग्राफ्टिंग को सीमित करता है। जबकि यह नई विधि अंकुर ग्राफ्टिंग की तकनीकी बाधा को बहुत कम कर देती है, माइक्रोग्राफ्टिंग चिप के निर्माण के लिए माइक्रो-इलेक्ट्रो मैकेनिकल सिस्टम (एमईएमएस) की आवश्यकता होती है, एक ऐसी तकनीक जो अधिकांश जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से सुलभ नहीं है। माइक्रोग्राफ्टिंग चिप पर माइक्रो-चैंबर के आयामों को एराबिडोप्सिस कोल -012 के लिए अनुकूलित किया गया था। यह अन्य प्रजातियों या विभिन्न एराबिडोप्सिस परिग्रहणों / उत्परिवर्ती के लिए चिप्स के उपयोग को रोकता है, जिनमें हाइपोकोटाइल होते हैं जो ऊंचाई या मोटाई 15,16,17 में भिन्न होते हैं।
यहां वर्णित कम लागत वाली, लचीली और आसानी से पालन की जाने वाली विधि युवा अंकुर ग्राफ्टिंग की सुविधा के लिए पिछले माइक्रोग्राफ्टिंग चिप काम से प्रेरित थी। इस विधि में, नाजुक रोपाई का हेरफेर न्यूनतम है, नए उपयोगकर्ताओं के लिए उपयोग को आसान बनाता है। स्ट्रिप्स में चैनल नए उपयोगकर्ताओं को ग्राफ्ट किए गए पौधों को संरेखित करने में सहायता करते हैं और ग्राफ्ट साइट के गठन के दौरान जड़ और शूट को अच्छे संपर्क में रखते हैं, जबकि ग्राफ्ट बनने के बाद आसानी से हटाने को भी सुनिश्चित करते हैं। सिलिकॉन स्ट्रिप्स के उच्च-थ्रूपुट उत्पादन और शुरुआती सामग्री की अपेक्षाकृत कम लागत के कारण, माइक्रोग्राफ्टिंग चिप्स की लागत के एक अंश पर बड़ी संख्या में रोपाई हासिल की जा सकती है। इस घर का बना उपकरण प्रति ग्राफ्टिंग साइट $ 0.12 खर्च करने का अनुमान है, जिससे यह विभिन्न प्रकार की पौधों की प्रजातियों या अंकुर फेनोटाइप्स के साथ काम करने वाली प्रयोगशालाओं के लिए एक आर्थिक विकल्प बन जाता है (तालिका 2)। जबकि ग्राफ्टिंग स्ट्रिप्स का हस्तनिर्मित पहलू इस विधि से जुड़ी लागतों को कम करता है, यह विभिन्न स्ट्रिप्स के बीच परिवर्तनशीलता के लिए मौका भी पेश करता है। जैसा कि पहले जोर दिया गया था, ग्राफ्टिंग स्ट्रिप्स की गुणवत्ता इस विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। आणविक आनुवंशिकी में प्रारंभिक चरण के अंकुर ग्राफ्टिंग के उपयोग में वृद्धि ने पौधों में लंबी दूरी के सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए पौधे आनुवंशिकी के क्षेत्र को एक शक्तिशाली उपकरण दिया है। यह सरल, कम लागत वाली और आसानी से सुलभ विधि न्यूनतम पूर्व प्रशिक्षण और अनुभव के साथ प्रयोगशालाओं द्वारा अंकुर ग्राफ्टिंग तकनीक को सफल रूप से अपनाने में मदद करने के लिए एक और उपकरण प्रदान करेगी।
महत्वपूर्ण विचार
घाव की मरम्मत की प्रतिक्रिया शुरू करने, साइऑन और रूटस्टॉक के बीच सेल-टू-सेल संचार स्थापित करने और अंततः वास्कुलचर गठन जैसी प्रक्रियाएं, एक सफल ग्राफ्ट9 के गठन के लिए आवश्यक हैं। ग्राफ्टिंग प्रक्रिया के दौरान, रोपाई को हाइड्रेटेड और आवश्यकता से परे क्षतिग्रस्त रखना महत्वपूर्ण है। इस विधि का उपयोग करके, जड़ों और वंशजों के कटे हुए सिरों को साफ और लंबवत होना चाहिए ताकि साइऑन और रूटस्टॉक के बीच फ्लश कनेक्शन सुनिश्चित किया जा सके। यदि ग्राफ्टिंग साइट काटने के दौरान क्षतिग्रस्त हो जाती है, या ग्राफ्टिंग के टुकड़ों को एक ही कोण पर नहीं काटा जाता है, तो ग्राफ्टिंग जंक्शन में सेल परतों के बीच निकट संपर्क की कमी के कारण सफल ग्राफ्टिंग की संभावना नहीं है। यदि पौधे के किसी भी ग्राफ्टिंग भागों को सूखने की अनुमति दी जाती है या क्षतिग्रस्त हो जाती है, तो पहले उल्लिखित प्रक्रियाओं को रोक दिया जाएगा, और ग्राफ्टिंग सफल नहीं होगी। युवा रोपाई नाजुक होती है और आसानी से बल द्वारा कुचल दी जाती है। यदि उपयोगकर्ताओं को यह आवश्यक लगता है, तो फोर्सप्स का उपयोग वंशज को पैंतरेबाज़ी करने के लिए दो कोटिलेडोन में से एक को पकड़ने के लिए किया जा सकता है। पहले रिपोर्ट की गई ग्राफ्टिंग चिप विधि की तुलना में, सिलिकॉन पट्टी में हाइपोकोटिल को नीचे खींचते समय रूटस्टॉक को नुकसान पहुंचाने की संभावना बढ़ जाती है। इस जोखिम को कम करने के लिए हैंडलिंग तकनीकों को प्रोटोकॉल चरण 3.4 में वर्णित किया गया है।
प्रति पट्टी कुल चार ग्राफ्टिंग साइटें यह सुनिश्चित करने के लिए पदों की अनुशंसित संख्या है कि ग्राफ्ट-जंक्शन गठन चरण के दौरान रोपाई एक दूसरे को न छुए। एक समय में किए गए ग्राफ्ट की कुल संख्या को बढ़ाने के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता प्रति ग्राफ्ट उपयोग की जाने वाली जगह की मात्रा को कम करने के बजाय उपयोग की जाने वाली प्लेटों की संख्या बढ़ाएं।
डाइवर्जेंट हाइपोकोटिल वृद्धि या गैर-एराबिडोप्सिस प्रजातियों को समायोजित करने के लिए प्रोटोकॉल का संशोधन संभव है
कुछ उत्परिवर्ती जंगली प्रकार के पौधों के लिए अलग-अलग दरों पर एटिओलेट करते हैं। फाइटोहार्मोन जैसे गिबेरेलिन, ब्रासिनोस्टेरॉयड, एथिलीन और ऑक्सिन अंकुर विकास विनियमन 18,19,20 में व्यापक भूमिका निभाते हैं। इन हार्मोन मार्गों में दोषपूर्ण उत्परिवर्ती लाइनों को एटिपिकल एटिओलेशन दर16,17 का अनुभव हो सकता है। ग्राफ्टिंग स्ट्रिप का उपयोगकर्ता-नियंत्रित डिजाइन इन फेनोटाइपिक मतभेदों के आवास की अनुमति देता है, लेकिन इन मामलों में पर्याप्त परीक्षण की आवश्यकता होती है। यदि एक आनुवंशिक रेखा का उपयोग किया जाता है जो जंगली प्रकार से काफी अलग दरों पर एटिओलेशन का अनुभव करता है, तो उपयोगकर्ताओं को यह निर्धारित करना चाहिए कि यहां वर्णित 3 दिन की एटिओलेशन अवधि शुरू करने से पहले उनकी लाइनों के लिए उपयुक्त है या नहीं। अपर्याप्त रूप से एटिओलाटेड रोपाई के परिणामस्वरूप एक छोटा या अत्यधिक विस्तारित (और पतला) हाइपोकोटिल के कारण मुश्किल ग्राफ्टिंग होगी। अरबिडोप्सीके अलावा अन्य प्रजातियों के ग्राफ्टिंग रोपाई में रुचि रखने वाले उपयोगकर्ता ग्राफ्टिंग चैनल व्यास को बदलकर अपनी आवश्यकताओं के अनुरूप इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित कर सकते हैं। उपयुक्त ग्राफ्टिंग आयु तक उगाए गए टमाटर और तंबाकू के पौधों को क्रमशः 0.8 और 0.4 मिमी व्यास ग्राफ्टिंगचैनलों की आवश्यकता होती है।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
एराबिडोप्सिस रोपाई में प्रारंभिक प्रशिक्षण और मार्गदर्शन के लिए जेवियर ब्रूमोस को धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
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