Summary
Questo protocollo descrive un robusto metodo di innesto di piantine che non richiede alcuna esperienza o formazione precedente e può essere eseguito a un costo molto basso utilizzando materiali facilmente accessibili nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare.
Abstract
L'innesto di piantine in fase iniziale è diventato uno strumento popolare nella genetica molecolare per studiare le relazioni radice-germoglio all'interno delle piante. L'innesto di piantine in fase iniziale della piccola pianta modello, Arabidopsis thaliana, è tecnicamente impegnativo e richiede tempo a causa delle dimensioni e della fragilità delle sue piantine. Una crescente raccolta di metodi pubblicati descrive questa tecnica con diversi tassi di successo, difficoltà e costi associati. Questo documento descrive una semplice procedura per realizzare un dispositivo di innesto riutilizzabile internamente utilizzando una miscela di elastomero siliconico e come utilizzare questo dispositivo per l'innesto di piantine. Al momento di questa pubblicazione, ogni dispositivo di innesto riutilizzabile costa solo $ 0,47 in materiali di consumo da produrre. Utilizzando questo metodo, i principianti possono avere le loro prime piantine innestate con successo in meno di 3 settimane dall'inizio alla fine. Questa procedura altamente accessibile consentirà ai laboratori di genetica molecolare vegetale di stabilire l'innesto di piantine come parte normale del loro processo sperimentale. A causa del pieno controllo che gli utenti hanno nella creazione e nella progettazione di questi dispositivi di innesto, questa tecnica potrebbe essere facilmente adattata per l'uso in piante più grandi, come il pomodoro o il tabacco, se lo si desidera.
Introduction
L'innesto è un'antica tecnica orticola che divenne una pratica agricola consolidata dal 500 aC1. L'innesto di diverse varietà di piante coltivate per migliorare le rese è stato il primo uso di questa tecnica e continua ad essere utilizzato per questo scopo oggi. Nell'ultimo decennio, l'innesto ha attirato una crescente attenzione come strumento per i biologi molecolari per studiare la segnalazione a lunga distanza nelle piante 2,3,4,5. Mentre l'innesto di piante adulte è relativamente facile, l'innesto di piante subito dopo la germinazione è impegnativo. Nonostante ciò, a volte è necessario valutare gli effetti della segnalazione a lunga distanza in processi come lo sviluppo delle piante, le risposte ambientali e la fioritura 6,7,8.
Arabidopsis thaliana è stato stabilito come l'organismo modello nella biologia vegetale per molte ragioni, tra cui le sue dimensioni relativamente piccole, che lo rendono facile da coltivare all'interno di un laboratorio. Tuttavia, le piccole dimensioni e la fragilità delle piantine di Arabidopsis rendono l'innesto di giovani piantine molto impegnativo. In molti casi, è necessaria un'ampia formazione pratica per ottenere con successo gli innesti di piantina. Ci sono stati molti miglioramenti metodologici nel corso degli anni che hanno identificato condizioni di crescita ideali e nuove tecniche per aumentare il tasso di successo dell'innesto di piantine 9,10,11. Lo strumento più recente introdotto è stato un chip di innesto di piantine di Arabidopsis, che consente anche agli utenti inesperti di raggiungere livelli accettabili di successo dell'innesto12. Mentre questo progresso ha abbassato significativamente la barriera tecnica dell'innesto di piantine, il dispositivo chip è costoso e il numero di innesti che possono essere condotti in parallelo diventa rapidamente proibitivo dal punto di vista dei costi.
Inoltre, questo dispositivo può essere utilizzato solo per piantine di Arabidopsis che hanno dimensioni ipocotiliche simili alle piantine selvatiche. Mentre Arabidopsis è la specie chiave nel mondo della genetica molecolare vegetale, recentemente è stato fatto un lavoro in altre specie utilizzando l'innesto di piantine. Gli esempi includono l'innesto di soia e fagiolo comune, tabacco a pomodoro e colza a Arabidopsis, e successivamente il campionamento di entrambi i tessuti per piccoli RNA13,14. Pertanto, è altamente auspicabile un metodo di innesto accessibile alla maggior parte dei laboratori e facilmente adattabile a una vasta gamma di specie vegetali senza grandi cambiamenti tecnici.
Questo protocollo descrive un metodo che impiega la produzione interna di un semplice dispositivo di innesto che consente la completa personalizzazione del diametro e della lunghezza del canale di innesto per adattarsi a qualsiasi morfologia della piantina nella maggior parte delle specie vegetali. La produzione di questi dispositivi è molto economica e altamente scalabile, in quanto gli unici componenti necessari sono elastomero siliconico, cablaggio o tubo delle dimensioni corrette, una lama ad alta precisione e un contenitore che funge da stampo. Seguendo il protocollo di innesto descritto qui, gli utenti possono ottenere tassi di innesto di successo del 45% (n = 105), paragonabili ai risultati dell'innesto precedentemente riportati10,12.
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Protocol
1. Preparazione del dispositivo
- Realizzare il dispositivo di innesto di silicone colando una soluzione di elastomero siliconico in una capsula di Petri quadrata (100 mm x 100 mm). Preparare 15 ml della soluzione di elastomero, seguendo le linee guida del produttore.
NOTA: I kit di elastomero siliconico includono in genere un liquido a base di silicone e un agente polimerizzante che, se miscelati insieme, consentono al silicone di solidificarsi. - Preparare la capsula di Petri quadrata posando quattro pezzi dritti di filo da 29 G nella capsula di Petri quadrata, equidistanti l'uno dall'altro (Figura 1A). Assicurarsi che il filo si trovi a filo con il fondo dello stampo. Per raddrizzare completamente il filo, arrotolarlo su una superficie uniforme dura con un oggetto pesante e piatto (ad esempio, una cremagliera metallica).
NOTA: Le cravatte a torsione contengono spesso filo da 29 G e possono essere utilizzate dopo aver rimosso il rivestimento esterno di carta con acetone. - Versare la soluzione mista di elastomero siliconico sopra i fili e coprire con la parte superiore della capsula di Petri. Lasciare polimerizzare il silicone per 24-48 ore a temperatura ambiente.
- Rimuovere il foglio di silicone dalla piastra di Petri con una pinza pulita e spostarlo su una superficie piana pulita.
- Rimuovere i fili dal foglio di silicone. Rimuovere il sottile strato di silicone rimasto all'esterno del canale con una pinza a punta fine, per consentire al canale di essere aperto su un lato (Figura 1A).
- Tagliare il foglio di silicone perpendicolarmente ai canali in strisce da 3 mm usando delle forbici pulite. Spostare ogni striscia su una busta di alluminio e sigillare con nastro adesivo.
- Autoclavare le strisce a 121 °C per almeno 30 minuti e conservare fino al momento dell'uso.
2. Preparazione della piantina
- Sterilizzare e vernalizzare i semi.
- Sospendere fino a 100 semi di Arabidopsis in 1 ml di soluzione di candeggina al 50% contenente lo 0,1% di Tween 20 in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e incubare per 5-10 minuti. Rimuovere la soluzione di candeggina mediante pipettaggio o aspirazione in condizioni sterili. Risciacquare i semi con 1 mL di dH2O sterilizzato. Assicurati di capovolgere i tubi per sciacquare adeguatamente i semi e rimuovere qualsiasi soluzione di candeggina rimasta nella parte superiore del tubo. Ripetere il risciacquo 4x.
- Lasciare circa 0,25 ml di acqua nei tubi con i semi e conservare a 4 °C per 3 giorni al buio.
- Impiattare i semi in preparazione per l'innesto.
- Preparare una piastra MS di agar all'1% come segue: per 1 L di MS (0,5% di saccarosio) terreno solido, mescolare 4,4 g di sale MS, 5 g di saccarosio e 10 g di agar in 800 ml di acqua, regolare il pH a 5,7 con KOH, quindi portare il volume totale a 1 L con acqua aggiuntiva. Autoclave per almeno 20, min prima di versare ~25 mL nelle piastre di Petri quadrate.
- In condizioni sterili, spostare il numero appropriato di semi preparati sulla piastra, utilizzando una punta di pipetta da 20 μL per aspirare e trasferire i semi.
- Posizionare una striscia sterile sulla superficie della piastra per guidare il posizionamento dei semi, in modo che i semi siano allineati con i canali sulla striscia. Rimuovere la striscia una volta che i semi sono placcati.
NOTA: Una piastra quadrata da 100 mm x 100 mm può ospitare due file di piantine (Figura 1B). - Una volta che le piastre sono in piedi, lasciare che il liquido evapori fuori dal mezzo solido e si accumuli sul fondo del piatto. Dopo aver posto i semi sulla piastra, mettere sul coperchio della piastra e sigillare un lato della piastra parallelo alle due file di semi (indicato dalla regione evidenziata in blu nella Figura 1B) con parafilm. Avvolgere il nastro traspirante sulla parte superiore del parafilm e attorno a tutti gli altri bordi della piastra.
- Posizionare con cautela due piastre con il lato sigillato con parafilm rivolto verso il basso. Separare le due piastre sul fondo posizionando un tubo di centrifuga orizzontale da 15 mL tra di loro e fissarle con un elastico. Assicurarsi che le superfici della piastra formino un angolo di 100°-110° con la superficie del piano di lavoro (Figura 1C).
- Conservare le piastre in questo orientamento per 72 ore in totale oscurità a 21 °C, per consentire agli ipocotili della piantina di crescere ~5 mm di lunghezza. Dopo 72 h, rimuovere le piastre dal buio e crescere sotto 16 h di luce (intensità di 100 μE m-2 sec-1) e 8 h cicli di buio per altri 2-4 giorni alla stessa temperatura prima dell'innesto.
- Innesare le piantine tra 5 e 7 giorni dopo essere state placcate. Posizionare una striscia di innesto sulle piantine, adattando i loro ipocotili nei canali. Posizionare delicatamente la piantina in modo che la giunzione radice-ipocotile sia posizionata sul fondo della striscia di silicone per preparare la piantina per il taglio (Figura 1D).
3. Procedura di innesto
- Preparare un ambiente di lavoro sterile sanificando un cannocchiale di dissezione con etanolo al 70% e autoclavando due paia di pinze a punta fine e un manico di bisturi. Eseguire tutte le procedure di innesto in un cappuccio sterile e con l'aiuto di un cannocchiale di dissezione, se necessario. Eseguire la maggior parte dell'innesto utilizzando un ingrandimento di 10,5x.
- Preparare i rampolli. Utilizzare una lama di bisturi fresca per tagliare l'ipocotile perpendicolarmente per creare un taglio netto e dritto. Spingere la lama in avanti piuttosto che premere verso il basso nella pianta per evitare che la piantina venga spinta nell'agar (Video 1).
- Rimuovi le riprese. Fare attenzione a mantenere idratata la parte tagliata del germoglio assicurando il contatto con la superficie del supporto. In alternativa, spostare il germoglio in un'area di attesa designata, come la parte superiore di una capsula di Petri riempita con dH2O sterile, fino al momento dell'uso.
- Preparare i portinnesti. Tirare delicatamente la radice afferrando la radice nello spazio rimasto tra le pinze chiuse e girandole, lasciando la sezione tagliata dei portainnesti nel mezzo della striscia (Video 2).
NOTA: La radice fragile sarà danneggiata se schiacciata direttamente tra le pinze chiuse, rendendo necessario incuneare la radice nell'angolo acuto delle estremità della pinzetta per manipolare il tessuto. - Raccogli delicatamente il germoglio desiderato usando la pinza a punta fine e inseriscilo nella parte superiore del canale.
NOTA: È fondamentale confermare visivamente il contatto tra i rampolli e i portainnesti per ottenere un innesto di successo (Video 3). - Dopo aver fatto tutti gli innesti, avvolgere le piastre con parafilm e nastro traspirante e sistemare le piastre nello stesso modo di prima, senza disturbare le piantine o le strisce di silicone. Spostare con cautela le piastre in una camera di crescita impostata a 26 °C con cicli di luce e 8 ore di buio.
- Valutare le piantine innestate in condizioni sterili dopo 7-10 giorni. Rimuovere con attenzione la striscia di silicone usando una pinza staccando un lato, consentendo ai canali di liberare le piantine. Rimuovere eventuali radici avventizie che crescono dal rampollo tagliandole dal rampollo con una lama di bisturi fresca o schiacciandole con una pinza a punta fine. Valutare visivamente se il portainnesto è diventato saldamente attaccato al rampollo per formare un innesto di successo (Figura 2).
- Spostare gli innesti di successo nel terreno di propagazione della piantina per crescere per tutto il tempo necessario. Coprire il terreno con plastica trasparente per alcuni giorni man mano che le piantine si stabiliscono. Dopo aver trasferito le piante nel terreno, crescere sotto i cicli di luce e buio precedentemente menzionati a 21 ° C.
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Representative Results
Sono stati testati vari aspetti del design della striscia di innesto per identificare le condizioni ottimali di innesto che richiedevano la minima quantità di abilità tecnica (Tabella 1). Tutte le prove di innesto sono state completate su terreno MS di saccarosio allo 0,5%, che è stato precedentemente segnalato come un mezzo di innesto ideale11,12.
La crescita ottimale della piantina non può essere raggiunta con la germinazione su striscia
Nella prima iterazione della striscia di silicone, i canali chiusi sono stati realizzati lasciando il sottile strato di silicone che rimane sul retro dei canali della striscia dopo che i fili sono stati rimossi dai fogli di silicone. Invece di germinare le piantine direttamente sul piatto e successivamente posizionare la striscia di innesto sugli ipocotilesi della piantina, i semi sono stati germinati direttamente sulla striscia dopo aver inserito i semi nel canale riempito con una piccola quantità di terreno MS. Usando questa tecnica, metà delle piantine rimanevano bloccate nei canali durante la germinazione e non riuscivano ad allungarsi. Includendo le piantine non germinate e non allungate, sono stati raggiunti tassi di innesto di successo del 25% (n = 16) (Tabella 1). Per affrontare il fallimento dell'allungamento osservato, i semi sono stati orientati in modo che i cotiledoni e il radicale dell'embrione puntassero verso il basso durante la germinazione. Utilizzando questo metodo, il 75% dei semi ha germinato e allungato con successo, il che ha comportato un leggero aumento dell'efficienza dell'innesto (33% di successo, n = 12) (Tabella 1). Per aumentare il successo dello sviluppo della piantina, il sottile strato di silicone che chiude il canale è stato rimosso dal lato medio della striscia di innesto per consentire il contatto tra il seme e il terreno di crescita (Figura 1A). Utilizzando questo metodo, l'85% delle piantine ha germinato e allungato con successo e il 31% (n = 16) è stato innestato con successo (Tabella 1). Nonostante aumenti significativamente il tasso di corretto sviluppo dei semi sulla striscia, perdere anche un piccolo numero di piantine può avere un impatto significativo sulla dimensione della popolazione sperimentale quando si eseguono innesti reciproci tra diversi gruppi sperimentali. Per questo motivo, germinare le piantine direttamente sulla superficie media è stato determinato come ideale.
Mantenere il tasso di sopravvivenza della piantina e ridurre al minimo i tempi e gli sforzi di elaborazione
Le piantine sono state prima coltivate per l'innesto su piastre MS (1% di saccarosio), trasferite su una superficie solida (come il coperchio di una capsula di Petri riempita d'acqua) per il taglio, quindi assemblate su una piastra con la striscia per l'innesto. Utilizzando questa tecnica, è stato osservato un tasso di successo del 50% (n = 8) (Tabella 1). Mentre questo metodo ha ottenuto il più alto tasso di successo, è stato dispendioso in termini di tempo e sforzo, richiedendo 2,5 minuti per ogni innesto, limitando il numero di innesti che potevano essere assemblati contemporaneamente. Per ridurre il tempo e lo sforzo richiesto, le piantine sono state coltivate verticalmente sulla piastra di innesto (0,5% di saccarosio) e poi inserite nella striscia direttamente prima dell'innesto, come descritto in questo protocollo. Per testare ulteriormente questo metodo, sono stati condotti tre studi di varie dimensioni. I primi due studi hanno entrambi avuto un tasso di successo del 48% (n = 25 e 64) e il terzo studio ha avuto un tasso di successo del 25% (n = 16) (Tabella 1). Insieme, questi studi indicano un tasso di successo del 45% (n = 105). Questo tasso di successo è paragonabile al metodo più dispendioso in termini di tempo e richiede circa 1 minuto per innesto per posizionare la striscia di innesto sulle piantine e completare l'innesto (fasi del protocollo 3.2-3.5).
Il tasso di successo dell'innesto dipende fortemente dalla qualità della costruzione della striscia di innesto. Mentre i primi due studi hanno un tasso di successo del 48%, il terzo studio ha un tasso di successo inferiore. La qualità artigianale della striscia di innesto si traduce intrinsecamente in una leggera variabilità tra i siti di innesto. Se i fili utilizzati per la costruzione della striscia non sono completamente dritti, i canali nelle strisce non saranno a filo con il fondo dello stampo e si tradurranno in canali di profondità leggermente variabili. In totale, vengono realizzate 25 strisce in ogni colata di strisce, risultando in 100 siti di innesto unici (Tabella 2). Mentre l'effetto di una leggera variazione nei siti di innesto è bilanciato nei due studi più grandi, nello studio più piccolo con tassi di successo inferiori, sembra che i siti di innesto con maggiori variazioni dovute a fili leggermente curvi possano avere un impatto negativo sulla formazione dell'innesto. Per ridurre al minimo questo tipo di variazione, una tecnica di raddrizzamento del filo è descritta nella fase 1.2 del protocollo.
Figura 1: Illustrazione delle fasi di preparazione dell'innesto . (A) Modello del disegno dello stampo per strisce di silicone. Questo pannello dimostra lo stampo a piastre quadrate utilizzato per la fusione delle strisce di silicone. Quattro sezioni di fili da 29 G di uguale lunghezza sono posate sul fondo della piastra e la miscela di elastomero siliconico viene versata sopra di esse (sopra). Dopo che il silicone si è completamente polimerizzato, il quadrato di silicone viene rimosso dalla piastra e i fili vengono rimossi per creare i canali di innesto. Un sottile strato di silicone rimane sul fondo dei canali dopo la rimozione dei fili (indicato da *). Questo strato deve essere rimosso per lasciare i canali aperti sul fondo (sotto). Il quadrato viene quindi tagliato perpendicolarmente ai canali del filo in strisce di 3 mm, come mostrato dalle linee tratteggiate (sopra). (B) Posizionamento delle sementi sulla piastra di innesto. Utilizzando l'ausilio di una striscia sterile, due file di semi vengono posizionate sulla piastra in linea con i canali della striscia. Dopo aver posizionato i semi, questa striscia deve essere rimossa per evitare qualsiasi ostacolo alla germinazione. Per preparare le lastre MS alla crescita verticale, il parafilm deve essere avvolto lungo il bordo inferiore (lato radice) della piastra, contrassegnato qui con evidenziazione blu. (C) Posizione verticale della piastra per la germinazione dei semi. Dopo la placcatura, i semi vengono germinati verticalmente su piastre angolate. Un tubo conico da 15 mL è posto alla base di due piastre per creare un angolo leggermente ottuso tra la superficie della piastra e il piano di lavoro. Il bordo parafilmato (contrassegnato con il blu) della piastra è orientato verso la superficie del banco. Un elastico è avvolto intorno alla parte superiore delle due piastre per tenerle in posizione. (D) Posizionamento della piantina nella striscia direttamente prima dell'innesto. Le strisce di innesto sterili sono poste sopra le piantine con ipocotili all'interno dei canali della striscia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagine catturata su un oscilloscopio di dissezione che mostra un sito di innesto guarito. La freccia nera indica il sito di giunzione dell'innesto e le frecce rosse indicano le radici avventizie che sono state rimosse durante il processo di valutazione dell'innesto. Barra di scala = 0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Video 1: Dimostrazione dell'innesto attivo utilizzando l'imaging di piante vive. Il posizionamento e il movimento della lama del bisturi per creare un taglio netto. L'ipocotile della piantina viene tagliato direttamente sopra la striscia di innesto spingendo in avanti la lama del bisturi. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Posizionamento dell'ipocotile del portainnesto tagliato per l'innesto all'interno della striscia. Il portainnesto viene tirato delicatamente usando una pinza per posizionare il sito di giunzione dell'innesto al centro della striscia. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 3: Posizionare il rampollo e completare l'innesto. Il rampollo viene sostituito e spinto nella striscia fino a quando non si collega con il portainnesto. Il corretto allineamento e contatto viene valutato osservando l'ipocotile rispondere quando il rampollo viene leggermente spinto. Clicca qui per scaricare questo video.
Tabella 1: Variabili di prova di innesto e tassi di successo. Questa tabella riassume i risultati delle prove di innesto utilizzate per determinare il protocollo di innesto ottimale per i più alti tassi di successo. Le variabili esaminate in questi studi includono le condizioni di germinazione della piantina, la costruzione della striscia di silicone e quando le piantine sono state inserite nei canali della striscia di silicone durante l'innesto. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Il numero di siti di innesto che possono essere generati da un flacone da 250 ml di elastomero siliconico. Anche il prezzo per ciascuna unità di produzione è mostrato qui (al momento della pubblicazione) e può essere facilmente regolato in base alle fluttuazioni del valore di mercato dei reagenti in elastomero siliconico. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Riassunto e significato
La formazione di un'unione di innesto è fondamentale per un innesto di successo, che richiede un contatto diretto e indisturbato tra il portinnesto e il rampollo. Le dimensioni in miniatura e la fragilità delle piantine di piccole piante come Arabidopsis rendono tecnicamente difficile soddisfare questo requisito. Una tecnica sviluppata nei primi metodi di innesto della piantina di Arabidopsis era quella di inserire sia il rampollo che il portainnesto in un collare corto di tubi di silicone per sostenere la giunzione dell'innesto10. Mentre questo metodo è molto efficace nel proteggere le due parti dell'innesto dalla separazione, non è un compito facile inserire il fragile rampollo e il portainnesto in un tubo a foro stretto. Inoltre, l'ispessimento alla giunzione dalla crescita spesso rende difficile rimuovere i tubi di silicone a foro stretto senza danneggiare le piantine innestate. Altri metodi hanno utilizzato tecniche alternative per evitare l'uso di un collare di innesto impedendo alle piantine di muoversi durante la crescita, compresa la rimozione di entrambi i cotiledoni dai rampolli e la crescita di piantine innestate su una superficie obliqua 9,11. Mentre questi metodi richiedono poche risorse per essere completati, una volta testati, questi metodi hanno portato ad alti livelli di migrazione del rampollo lontano dal portainnesto, con conseguente successo dell'innesto inferiore a quello riportato (80% in media per le condizioni raccomandate in entrambi gli studi) utilizzando queste tecniche. Inoltre, entrambi richiedono all'utente di allineare l'interfaccia tra le parti della piantina di innesto senza alcun aiuto, un compito che richiede un alto livello di abilità. Un microinnesto progettato specificamente per l'innesto di piantine di Arabidopsis è stato recentemente segnalato12. Ogni chip contiene quattro micro-camere per consentire a quattro piantine di crescere, con lo speciale design dello spazio della camera che consente all'ipocotile di crescere all'interno di un micro-canale. I portainnesti vengono generati sul posto sul chip e i rampolli vengono inseriti nei microcanali. Ciò elimina la necessità di gestire sia i portinnesti che i rampolli per l'innesto, e il micro-canale confina l'innesto in posizione senza sacrificare la facilità di rimuovere le piantine una volta formata l'unione dell'innesto. Mentre questo nuovo metodo riduce notevolmente la barriera tecnica dell'innesto di piantine, la fabbricazione del chip di microinnesto richiede Micro-Electro Mechanical Systems (MEMS), una tecnologia non facilmente accessibile alla maggior parte dei laboratori di biologia. Le dimensioni della microcamera sul chip di microinnesto sono state ottimizzate per Arabidopsis Col-012. Ciò impedisce l'uso dei chip per altre specie o diverse accessioni/mutanti di Arabidopsis che hanno ipocotili che variano in altezza o spessore15,16,17.
Il metodo a basso costo, flessibile e facile da seguire qui descritto è stato ispirato dal precedente lavoro sui chip di microinnesto per facilitare l'innesto di giovani piantine. In questo metodo, la manipolazione di piantine delicate è minima, facilitando l'uso per i nuovi utenti. I canali nelle strisce aiutano i nuovi utenti ad allineare le piantine innestate e mantengono la radice e il germoglio in buon contatto durante la formazione del sito di innesto, garantendo anche una facile rimozione dopo che l'innesto è stato formato. A causa della produzione ad alta produttività delle strisce di silicone e del costo relativamente basso dei materiali di partenza, l'innesto di un gran numero di piantine può essere ottenuto a una frazione del costo dei trucioli di microinnesto. Si stima che questo dispositivo fatto in casa costi $ 0,12 per sito di innesto, rendendolo un'opzione economica per i laboratori che lavorano con una varietà di specie vegetali o fenotipi di piantine (Tabella 2). Mentre l'aspetto artigianale delle strisce di innesto riduce i costi associati a questo metodo, introduce anche la possibilità di variabilità tra le diverse strisce. Come sottolineato in precedenza, la qualità delle strisce di innesto è la chiave per il successo di questo metodo. L'aumento dell'uso dell'innesto di piantine in fase iniziale nella genetica molecolare ha dato al campo della genetica vegetale un potente strumento per studiare la segnalazione a lunga distanza nelle piante. Questo metodo semplice, a basso costo e facilmente accessibile fornirà un altro strumento per facilitare l'adozione di successo della tecnica di innesto della piantina da parte di laboratori con una formazione e un'esperienza precedenti minime.
Considerazioni critiche
Processi come l'avvio di una risposta di riparazione della ferita, la comunicazione cellula-cellula tra rampollo e portainnesto e, infine, la formazione di vascolarizzazione, sono necessari per la formazione di un innesto di successo9. Durante il processo di innesto, è importante mantenere le piantine idratate e non danneggiate oltre la necessità. Utilizzando questo metodo, le estremità tagliate delle radici e dei rampolli devono essere pulite e perpendicolari per garantire una connessione a filo tra il rampollo e il portainnesto. Se il sito di innesto è danneggiato durante il taglio o i pezzi dell'innesto non vengono tagliati con la stessa angolazione, è improbabile che l'innesto abbia successo a causa della mancanza di stretto contatto tra gli strati cellulari attraverso la giunzione dell'innesto. Se una qualsiasi delle parti dell'innesto della pianta viene lasciata asciugare o è danneggiata, i processi precedentemente menzionati saranno inibiti e l'innesto non avrà successo. Le giovani piantine sono fragili e facilmente schiacciate dal forcipe. Se gli utenti lo ritengono necessario, la pinza può essere utilizzata per trattenere uno dei due cotiledoni per manovrare il rampollo. Rispetto al metodo del chip di innesto precedentemente riportato, aumenta la possibilità di danneggiare il portinnesto mentre si tira l'ipocotile nella striscia di silicone. Le tecniche di gestione per ridurre al minimo questo rischio sono descritte nella fase 3.4 del protocollo.
Un totale di quattro siti di innesto per striscia è il numero raccomandato di posizioni per garantire che le piantine non si tocchino durante la fase di formazione della giunzione dell'innesto. Per aumentare il numero totale di innesti eseguiti contemporaneamente, si consiglia agli utenti di aumentare il numero di piastre utilizzate, piuttosto che diminuire la quantità di spazio utilizzato per innesto.
La modifica del protocollo è possibile per accogliere specie divergenti di crescita ipocotile o non Arabidopsis
Alcuni mutanti eziolano a velocità diverse rispetto alle piante selvatiche. I fitormoni come le gibberelline, i brassinosteroidi, l'etilene e l'auxina svolgono un ruolo importante nella regolazione della crescita delle piantine18,19,20. Le linee mutanti difettose in queste vie ormonali possono manifestare tassi di eziolazione atipici16,17. Il design controllato dall'utente della striscia di innesto consente di accogliere queste differenze fenotipiche, ma in questi casi sono necessari test sufficienti. Se viene utilizzata una linea genetica che sperimenta l'eziolazione a tassi significativamente diversi dal tipo selvatico, gli utenti dovrebbero determinare se il periodo di eziolazione di 3 giorni qui descritto è appropriato per le loro linee prima di iniziare. Le piantine non adeguatamente etiolizzate comporteranno un innesto difficile a causa di un ipocotile accorciato o eccessivamente esteso (e più sottile). Gli utenti interessati all'innesto di piantine di specie diverse da Arabidopsipossono adattare questo protocollo alle loro esigenze modificando il diametro del canale di innesto. Le piantine di pomodoro e tabacco coltivate fino a un'età di innesto appropriata sembrano richiedere canali di innesto di 0,8 e 0,4 mm di diametro, rispettivamente9.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Grazie a Javier Brumos per la formazione iniziale e la guida nell'innesto di piantine di Arabidopsis .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E.
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y.
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
