Summary
このプロトコルは、事前の経験やトレーニングを必要とせず、ほとんどの分子生物学ラボで簡単にアクセスできる材料を使用して非常に低コストで実行できる堅牢な苗接ぎ木方法について説明しています。
Abstract
初期段階の苗の接ぎ木は、植物内の根とシュートの関係を研究するための分子遺伝学の人気のあるツールになっています。小型モデル植物である シロイヌナズナの初期段階の苗木の接ぎ木は、その苗木のサイズと脆弱性のために技術的に困難で時間がかかります。公開されているメソッドのコレクションが増えており、成功率、難易度、および関連するコストがさまざまでこの手法について説明しています。本稿では,シリコーンエラストマーミックスを用いて社内で再利用可能な接ぎ木装置を作る簡単な手順と,この装置を苗接ぎ木に使用する方法について述べる.この出版物の時点では、各再利用可能なグラフトデバイスの製造には、消耗品のコストはわずか0.47ドルです。この方法を使用すると、初心者は最初から最後まで3週間以内に最初の苗木をうまく接ぎ木することができます。この非常にアクセスしやすい手順により、植物分子遺伝学ラボは、実験プロセスの通常の部分として苗の接ぎ木を確立することができます。ユーザーがこれらの接ぎ木装置の作成と設計を完全に制御できるため、この技術は、必要に応じてトマトやタバコなどのより大きな植物で使用するために簡単に調整できます。
Introduction
接ぎ木は、紀元前500年までに確立された農業慣行となった古代の園芸技術です1。収量を改善するためにさまざまな種類の作物を接ぎ木することは、この技術の最初の使用であり、今日でもこの目的のために使用され続けています。過去10年間で、接ぎ木は、分子生物学者が植物の長距離シグナル伝達を研究するためのツールとしてますます注目を集めています2,3,4,5。成体植物の接ぎ木は比較的簡単ですが、発芽後すぐに植物を接ぎ木することは困難です。それにもかかわらず、植物の発育、環境応答、開花などのプロセスにおける長距離シグナル伝達の影響を評価する必要がある場合があります6,7,8。
シロイヌナズナは、植物生物学のモデル生物として確立されており、サイズが比較的小さく、実験室内で成長しやすいなど、さまざまな理由から確立されています。しかし、シロイヌナズナの苗のサイズが小さくてもろいため、幼苗の接ぎ木は非常に困難です。多くの場合、苗の接ぎ木をうまく入手するには、広範な実践的なトレーニングが必要です。何年にもわたって多くの方法論的改善が行われ、理想的な成長条件と苗接ぎ木の成功率を高めるための新しい技術が特定されてきました9,10,11。導入された最新のツールはシロイヌナズナの苗接ぎ木チップで、経験の浅いユーザーでも許容レベルの接ぎ木成功を達成できます12。この進歩により、苗接ぎ木の技術的障壁は大幅に低下しましたが、チップデバイスは高価であり、並行して迅速に実行できる移植の数は法外なコストになります。
さらに、この装置は、野生型の苗に似た胚軸寸法を有するシロイヌナズナの苗にのみ使用できます。シロイヌナズナは植物分子遺伝学の世界の要種ですが、最近は他の種でも苗接ぎ木を用いた研究が行われています。例としては、ダイズと一般豆の接ぎ木、トマトへのタバコ、シロイヌナズナへのキャノーラの接ぎ木、続いて低分子RNAについて両方の組織をサンプリングすることが含まれます13,14。したがって、ほとんどの実験室が利用でき、大きな技術を変更することなく幅広い植物種に容易に適応できる接ぎ木法が非常に望ましい。
このプロトコルは、ほとんどの植物種にわたるあらゆる苗形態に対応するために接ぎ木チャネルの直径と長さの完全なカスタマイズを可能にする単純な接ぎ木装置の社内生産を採用する方法を詳述しています。必要なコンポーネントは、シリコーンエラストマー、正しいサイズの配線またはチューブ、高精度のブレード、および金型として機能する容器だけであるため、これらのデバイスの製造は非常に手頃な価格で非常にスケーラブルです。ここで詳述するグラフトプロトコールに従って、ユーザは、以前に報告されたグラフト結果に匹敵する45%(n = 105)の成功したグラフト率を達成することができる10,12。
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Protocol
1.デバイスの準備
- 正方形のペトリ皿(100 mm x 100 mm)にシリコーンエラストマー溶液をキャストして、シリコーングラフトデバイスを作成します。製造元のガイドラインに従って、15 mLのエラストマー溶液を調製します。
注意: シリコーンエラストマーキットには通常、シリコーンベースの液体と硬化剤が含まれており、混合するとシリコーンが固化します。 - 正方形のペトリ皿に29Gのワイヤーの4つの直線片を互いに等距離に置いて、正方形のペトリ皿を準備します(図1A)。ワイヤが金型の底面と同じ高さになっていることを確認します。ワイヤーを完全にまっすぐにするには、重くて平らな物体(金属製のチューブラックなど)のある硬くて均一な表面にワイヤーを転がします。
注意: ツイストタイには29Gのワイヤーが含まれていることが多く、アセトンで外側の紙のコーティングを取り除いた後に使用できます。 - 混合シリコーンエラストマー溶液をワイヤーの上に注ぎ、ペトリ皿の上部で覆います。シリコーンを室温で24〜48時間硬化させます。
- きれいな鉗子を使用してペトリ皿からシリコンシートを取り除き、きれいな平らな面に移動します。
- シリコンシートからワイヤーを取り外します。チャネルの外側に残っているシリコーンの薄層を細かい点鉗子で取り除き、チャネルの片側が開くようにします(図1A)。
- 清潔なはさみを使用して、シリコンシートをチャネルに対して垂直に3 mmのストリップにカットします。各ストリップをアルミホイル封筒に移動し、オートクレーブテープで密封します。
- ストリップを121°Cで少なくとも30分間オートクレーブし、使用できるようになるまで保管します。
2.苗の準備
- 種子を殺菌して春化する。
- シ ロイヌナ ズナの種子100個まで、0.1%Tween 20を含む50%漂白剤溶液1 mLに1.5 mLマイクロ遠心チューブに懸濁し、5〜10分間インキュベートします。無菌条件下でピペッティングまたは吸引によって漂白剤溶液を除去します。1mLの滅菌dH2Oで種子をすすぎ、チューブをひっくり返して種子を適切にすすぎ、チューブの上部に残っている漂白剤溶液を取り除きます。すすぎを4回繰り返します。
- 種子を入れたチューブに約0.25 mLの水を残し、4°Cで暗所で3日間保存します。
- 接ぎ木に備えて種子を盛り付けます。
- 1LのMS(0.5%スクロース)固体培地に対して、MS塩4.4g、スクロース5g、寒天10gを800mLの水に混合し、KOHでpHを5.7に調整し、さらに水で全量を1Lにします。オートクレーブを少なくとも20分間行い、~25 mLを正方形のペトリ皿に注ぎます。
- 無菌条件下で、20 μLのピペットチップを使用して、適切な数の準備されたシードをプレートに移動し、シードを吸引して移します。
- 種子の位置決めをガイドするためにプレート表面に滅菌ストリップを置き、種子がストリップ上のチャネルに整列するようにします。種がメッキされたらストリップを取り除きます。
注意: 1つの100 mm x 100 mmの正方形のプレートは、2列の苗を収容できます(図1B)。 - プレートが立ったら、液体を固体培地から蒸発させ、プレートの底に溜めます。種子をプレート上に置いた後、プレートカバーの上に置き、2列の種子に平行なプレートの片側( 図1Bの青色の強調表示された領域で示されている)をパラフィルムで密封します。パラフィルムの上とプレートの他のすべての端に通気性テープを巻きます。
- パラフィルムシール面を下に向けて2枚のプレートを慎重に立てます。水平の15 mL遠心チューブをそれらの間に置き、輪ゴムで固定することにより、下部の2つのプレートを分離します。プレートの表面がベンチトップの表面と100°〜110°の角度を形成していることを確認します(図1C)。
- プレートをこの向きにして21°Cの全暗所で72時間保存し、苗の胚軸の長さが~5mmになるようにします。72時間後、プレートを暗所から取り出し、移植前に同じ温度でさらに2〜4日間、16時間の光(100μE m-2 sec-1の強度)および8時間の暗サイクル下で成長させる。
- 播種後5〜7日で苗を接ぎ木します。苗の上に接ぎ木ストリップを置き、それらの胚軸をチャネルに取り付けます。根と胚軸の接合部がシリコンストリップの下部に配置されるように苗をそっと配置して、苗を刈り取りの準備をします(図1D)。
3.接ぎ木手順
- 解剖スコープを70%エタノールで消毒し、2対の細い先端の鉗子とメスのハンドルをオートクレーブ滅菌することにより、無菌の作業環境を準備します。滅菌フード内で、必要に応じて解剖スコープを使用して、すべての移植手順を実行します。10.5倍の倍率を使用してほとんどのグラフトを実行します。
- 穂木を準備します。新しいメスの刃を使用して胚軸を垂直にカットし、まっすぐなきれいなカットを作成します。苗が寒天に押し込まれるのを防ぐために、植物に押し下げるのではなく、ブレードを前方に押します(ビデオ1)。
- シュートを削除します。メディア表面との接触を確実にすることにより、シュートのカット部分を水和させるように注意してください。あるいは、使用できるようになるまで、滅菌dH2Oで満たされたペトリ皿の上部などの指定された保持領域にシュートを移動します。
- 台木を準備します。閉じた鉗子の間に残ったスペースに根をつかんで回し、台木の切断部分をストリップの中央に残して、根をそっと引っ張ります(ビデオ2)。
注意: 閉じた鉗子の間で直接押しつぶされると、壊れやすい根が損傷するため、組織を操作するためにピンセットの端の鋭角で根をくさびで留める必要があります。 - 細い先端の鉗子を使用して目的のシュートをそっと拾い上げ、チャネルの上部に挿入します。
注意: 接ぎ木を成功させるには、接ぎ穂と台木の間の接触を視覚的に確認することが重要です(ビデオ3)。 - すべての移植片ができたら、パラフィルムと通気性テープでプレートを包み、苗やシリコンストリップを邪魔することなく、以前と同じ方法でプレートをセットアップします。プレートを26°Cに設定された成長チャンバーに慎重に移動し、16時間の明/8時間の暗サイクルを行います。
- 7〜10日後に無菌条件下で接ぎ木苗を評価します。片側をはがして鉗子を使用してシリコンストリップを慎重に取り外し、チャネルが苗を解放できるようにします。接ぎ穂から生えている不定根を新鮮なメスの刃で切り取るか、細い先端の鉗子を使って押しつぶして取り除きます。台木が接ぎ穂にしっかりと付着して移植片を形成したかどうかを視覚的に評価します(図2)。
- 成功した接ぎ木を苗繁殖土壌に移動して、必要なだけ成長します。苗が確立されたら、数日間透明なプラスチックで土を覆います。植物を土壌に移した後、前述の明暗サイクルで21°Cで生育します。
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Representative Results
グラフトストリップの設計のさまざまな側面をテストして、最小限の技術的スキルを必要とする最適なグラフト条件を特定しました(表1)。全ての移植試験は、理想的な移植培地であることが以前に報告されている0.5%スクロースMS培地上で完了した11、12。
最適な苗の成長は、ストリップ上の発芽では達成できません
シリコーンストリップの最初の反復では、ワイヤーがシリコーンシートから取り外された後、ストリップチャネルの背面に残るシリコーンの薄層を残すことによって、密閉されたチャネルが作成されました。苗をプレート上で直接発芽させ、後で接ぎ木ストリップを実生胚軸の上に置く代わりに、種子を少量のMS培地で満たされたチャネルに挿入した後、種子をストリップ上で直接発芽させた。この技術を使用すると、苗の半分が発芽中にチャネルに詰まり、伸びることができませんでした。非発芽苗と非長苗を含めると、接ぎ木成功率25%(n=16)を達成した(表1)。観察された伸長障害に対処するために、種子は発芽中に胚の子葉とラジカルが下を向くように配向されました。この方法を使用すると、種子の75%が発芽して伸長し、接ぎ木効率がわずかに向上しました(33%成功、n = 12)(表1)。成功した苗の発育を増やすために、チャネルを閉じるシリコーンの薄層を接ぎ木ストリップの培地側から除去して、種子と成長培地との接触を可能にしました(図1A)。この方法を使用すると、実生の85%が発芽して伸長し、31%(n = 16)の接ぎ木に成功しました(表1)。ストリップ上の適切な種子発育率を大幅に上げるにもかかわらず、少数の苗木を失うことでさえ、異なる実験グループ間で相互接ぎ木を行うときに実験個体群のサイズに大きな影響を与える可能性があります。このため、培地表面上で直接苗を発芽させることが理想的であると判断された。
苗の生存率を維持し、処理時間と労力を最小限に抑える
実生苗を最初にMSプレート(1%スクロース)に接ぎ木するために栽培し、切断のために固体表面(水で満たされたペトリ皿の蓋など)に移し、次に接ぎ木用のストリップと共にプレート上に組み立てた。この手法を使用すると、50%の成功率(n = 8)が観察されました(表1)。この方法は最も高い成功率を得ましたが、時間と労力がかかり、各移植片に2.5分かかり、一度に組み立てることができる移植片の数が制限されました。必要な時間と労力を削減するために、このプロトコルに記載されているように、苗木を接ぎ木プレート(0.5%スクロース)上で垂直に栽培し、接ぎ木直前にストリップに挿入しました。この方法をさらに検証するために、さまざまなサイズの3つの試験が実施されました。最初の2件の試験の成功率はいずれも48%(n = 25および64)、3回目の試験の成功率は25%(n = 16)であった(表1)。これらの試験を合わせると、成功率は45%(n = 105)であることが示された。この成功率は、より時間のかかる方法に匹敵し、接ぎ木ストリップを苗の上に置き、接ぎ木を完了するために接ぎ木ごとに約1分を必要とします(プロトコルステップ3.2-3.5)。
接ぎ木の成功率は、接ぎ木ストリップ構造の品質に大きく依存しています。最初の2つの試験の成功率は48%ですが、3番目の試験の成功率は低くなっています。グラフトストリップの手作りの品質は、本質的にグラフト部位間でわずかなばらつきをもたらします。ストリップ構築に使用されるワイヤが完全にまっすぐでない場合、ストリップ内のチャネルは金型の底と同じ高さにならず、わずかに変化する深さのチャネルになります。合計で、各ストリップ鋳造で25のストリップが作成され、100の固有のグラフトサイトが得られます(表2)。グラフト部位のわずかな変動の効果は、2つの大規模な試験ではバランスが取れていますが、成功率が低い小規模な試験では、ワイヤーがわずかに湾曲しているため、グラフト部位の変動が大きいと、グラフト形成に悪影響を与える可能性があるようです。このタイプの変動を最小限に抑えるために、ワイヤ矯正技術がプロトコルステップ1.2で説明されています。
図1:グラフト調製工程の説明図 。 (A)シリコーンストリップモールドデザインのモデル。このパネルは、シリコーンストリップの鋳造に使用される正方形のプレートモールドを示しています。同じ長さの29Gワイヤの4つのセクションをプレートの底に置き、シリコーンエラストマーミックスをそれらの上に注ぐ(上)。シリコーンが完全に硬化した後、シリコーンの正方形をプレートから取り外し、ワイヤーを取り外してグラフトチャネルを作成します。ワイヤーを取り外した後、シリコンの薄層がチャネルの下部に残ります(*で示されます)。このレイヤーを削除して、下部(下)のチャネルを開いたままにしておく必要があります。次に、点線(上)に示すように、正方形をワイヤチャネルに対して垂直に3mmのストリップにカットします。(B)接ぎ木プレート上の種子の位置。滅菌ストリップの助けを借りて、2列の種子をストリップチャネルに沿ってプレート上に配置します。種子を置いた後、発芽障害を防ぐためにこのストリップを削除する必要があります。垂直成長用のMSプレートを準備するには、パラフィルムをプレートの下部(ルート側)の端に沿って包み、ここでは青色の強調表示でマークする必要があります。(C)種子発芽のための垂直プレート位置。メッキ後、種子は斜めのプレート上で垂直に発芽します。15mLのコニカルチューブを2つのプレートのベースに配置して、プレート表面とベンチトップの間にわずかに鈍角を作成します。プレートのパラフィルムエッジ(青色でマーク)は、ベンチトップサーフェスに向けられています。2つのプレートの上部に輪ゴムを巻き付けて所定の位置に保ちます。(D)接ぎ木の直前にストリップに苗を配置します。滅菌接ぎ木ストリップは、ストリップチャネルの内側に胚軸を有する実生の上に置かれる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:治癒した移植部位を示す解剖スコープで撮影された画像。 黒い矢印はグラフト接合部位を示し、赤い矢印はグラフト評価プロセス中に除去された不定根を示します。スケールバー = 0.5 mm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:生きた植物イメージングを使用した能動接ぎ木のデモンストレーション。 メスの刃の配置と動きで、きれいなカットを作成します。実生の胚軸は、メスの刃を前方に押すことによって接ぎ木ストリップの真上で切断される。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:ストリップ内に接ぎ木するためにカット台木胚軸を配置します。 台木は鉗子を使用して穏やかに引っ張られ、グラフト接合部位をストリップの中央に配置します。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ3:接ぎ穂を配置し、移植片を完成させます。 接ぎ穂は交換され、台木に接続するまでストリップに押し込まれます。適切な位置合わせと接触は、接ぎ穂が軽く押されたときに胚軸が反応するのを見ることによって評価されます。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表1:試行変数と成功率の接ぎ木。 この表は、最高の成功率のための最適なグラフトプロトコルを決定するために使用されたグラフト試験の結果をまとめたものです。これらの試験で検討された変数には、苗の発芽条件、シリコーンストリップの構築、および接ぎ木中に苗がシリコーンストリップチャネルに挿入された時期が含まれます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:シリコーンエラストマーの250 mLボトルから生成できるグラフト部位の数。 各生産単位の価格もここに表示されており(公開時)、シリコーンエラストマー試薬の市場価値の変動に応じて容易に調整できます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
概要と意義
接ぎ木組合の形成は接ぎ木を成功させるために重要であり、それは台木と接ぎ穂との間の直接かつ邪魔されない接触を必要とする。シロイヌナズナなどの小さな植物の苗のミニチュアサイズと脆弱性は、この要件を満たすことを技術的に困難にします。初期のシロイヌナズナ苗接ぎ木法で開発された1つの技術は、接ぎ木接合部10を支えるために、接ぎ穂と台木の両方を短いシリコンチューブカラーに挿入することでした。この方法は、2つの移植片部分を分離から保護するのに非常に効果的ですが、壊れやすい接ぎ穂と台木を狭口径チューブに挿入するのは簡単な作業ではありません。さらに、成長による接合部の肥厚は、接ぎ木された苗を損傷することなく狭口径シリコーンチューブを除去することをしばしば困難にする。他の方法では、接ぎ木から両方の子葉を取り除き、斜めの表面で接ぎ木苗を育てるなど、成長中に苗が動くのを防ぎながら接ぎ木襟の使用を避けるために代替技術を使用しました9,11。これらの方法は完了するのにほとんどリソースを必要としませんが、試行した場合、これらの方法は台木から高レベルの接ぎ穂の移動をもたらし、これらの技術を使用して報告されたよりも低い接ぎ木成功をもたらしました(両方の研究の推奨条件で平均80%)。さらに、どちらも、ユーザーが補助なしで接ぎ木苗部分間のインターフェースを調整する必要があり、高度なスキルを必要とする作業です。シロイヌナズナの苗接ぎ木用に特別に設計されたマイクログラフトチップが最近報告されています12。各チップには、4つの苗を成長させるための4つのマイクロチャンバーが含まれており、チャンバースペースの特別な設計により、胚軸がマイクロチャネル内で成長することができます。台木はチップ上にインプレースで生成され、穂木はマイクロチャネルに挿入されます。これにより、接ぎ木のために台木と接ぎ穂の両方を処理する必要がなくなり、マイクロチャネルは、接ぎ木組合が形成された後の苗の除去の容易さを犠牲にすることなく、接ぎ木を所定の位置に閉じ込めます。この新しい方法は苗接ぎ木の技術的な障壁を大幅に減らしますが、マイクログラフトチップの製造には、ほとんどの生物学研究所が容易に利用できない技術である微小電気機械システム(MEMS)が必要です。マイクログラフトチップ上のマイクロチャンバーの寸法は、シロイヌナズナCol-012に対して最適化した。これにより、他の種や、高さや厚さが異なる胚軸を持つ異なるシロイヌナズナの加入/変異体へのチップの使用を防ぐことができます15,16,17。
ここで説明する低コストで柔軟性があり、わかりやすい方法は、幼苗の接ぎ木を容易にするための以前のマイクログラフトチップ作業に触発されました。この方法では、繊細な苗の操作は最小限に抑えられ、新規ユーザーの使用が容易になります。ストリップのチャネルは、新しいユーザーが接ぎ木された苗を整列させ、接ぎ木部位の形成中に根と苗条を良好に接触させるのに役立つと同時に、接ぎ木が形成された後の除去を容易にします。シリコーンストリップのハイスループット生産および出発材料の比較的低コストのために、多数の苗をマイクログラフトチップの数分の一のコストで接ぎ木することができる。この自家製のデバイスは、接ぎ木サイトあたり0.12ドルの費用がかかると推定されており、さまざまな植物種や苗の表現型を扱うラボにとって経済的な選択肢となっています(表2)。グラフトストリップの手作りの側面は、この方法に関連するコストを削減しますが、異なるストリップ間のばらつきの可能性ももたらします。前に強調したように、グラフトストリップの品質はこの方法の成功の鍵です。分子遺伝学における初期段階の苗接ぎ木の使用の増加は、植物遺伝学の分野に植物の長距離シグナル伝達を研究するための強力なツールを与えました。このシンプルで低コストで簡単にアクセスできる方法は、最小限の事前トレーニングと経験でラボによる苗接ぎ木技術の採用を成功させるのに役立つ別のツールを提供します。
重要な考慮事項
創傷修復応答の開始、接ぎ穂と台木との間の細胞間コミュニケーションの確立、および最終的には血管系形成などのプロセスは、成功した移植片の形成に必要である9。接ぎ木プロセス中は、苗を水分補給し、必要以上に損傷を受けないようにすることが重要です。この方法を使用する場合、接ぎ穂と台木の間のフラッシュ接続を確保するために、根と接ぎ穂の切断端は清潔で垂直でなければなりません。切断中に移植部位が損傷した場合、または移植片が同じ角度で切断されない場合、移植接合部を横切る細胞層間の密接な接触がないため、移植が成功する可能性は低い。植物の接ぎ木部分のいずれかが乾燥または損傷を受けると、前述のプロセスが阻害され、接ぎ木は成功しません。幼苗は壊れやすく、鉗子で簡単に押しつぶされます。ユーザーがそれが必要であると判断した場合、鉗子を使用して2つの子葉のうちの1つを保持し、接ぎ穂を操縦することができます。以前に報告されたグラフトチップ法と比較して、胚軸をシリコーンストリップに引き下げるときに台木を損傷する可能性が高まります。このリスクを最小限に抑えるための処理手法については、プロトコルステップ3.4で説明します。
ストリップあたり合計4つの接ぎ木部位は、接ぎ木接合形成段階で苗が互いに接触しないようにするための推奨される位置数です。一度に実行されるグラフトの総数をスケールアップするには、グラフトごとに使用されるスペースの量を減らすのではなく、使用するプレートの数を増やすことをお勧めします。
プロトコルの変更は、発散する胚軸の成長または非シロイヌナズナ種に対応するために可能です
一部の変異体は、野生型植物に対して異なる速度でエチオレートします。ジベレリン、ブラシノステロイド、エチレン、オーキシンなどの植物ホルモンは、苗の成長調節に幅広い役割を果たしています18,19,20。これらのホルモン経路に欠陥のある変異株は、非定型のエチオレートを経験する可能性があります16,17。グラフトストリップのユーザー制御設計により、これらの表現型の違いに対応できますが、これらの場合は十分なテストが必要です。野生型とは有意に異なる速度でエティオレーションを経験する遺伝子系統が使用されている場合、ユーザーは、開始する前に、ここで説明する3日間のエチオレーション期間が自分の系統に適しているかどうかを判断する必要があります。不適切にエチオレートされた実生は、短くなった、または過度に伸びた(そしてより薄い)胚軸のために接ぎ木が困難になる。シロイヌナズナ以外の種の苗の接ぎ木に関心のあるユーザーは、接ぎ木チャネルの直径を変更することにより、このプロトコルをニーズに合わせて適応させることができます。適切な接ぎ木年齢に成長したトマトとタバコの苗は、それぞれ直径0.8mmと0.4mmの接ぎ木チャネルを必要とするようです9。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
シロイヌナズナの苗を接ぎ木するための初期トレーニングと指導を提供してくれたハビエル・ブルモスに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
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