Summary
이 프로토콜은 사전 경험이나 교육이 필요하지 않으며 대부분의 분자 생물학 실험실에서 쉽게 접근할 수 있는 재료를 사용하여 매우 저렴한 비용으로 실행할 수 있는 강력한 묘목 접목 방법을 설명합니다.
Abstract
초기 단계의 묘목 접목은 식물 내에서 뿌리-싹 관계를 연구하기 위한 분자 유전학에서 인기 있는 도구가 되었습니다. 작은 모델 식물인 Arabidopsis thaliana의 초기 단계 묘목을 접목하는 것은 묘목의 크기와 취약성으로 인해 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 점점 더 많은 출판된 방법 모음에서 이 기술을 다양한 성공률, 난이도 및 관련 비용으로 설명합니다. 이 논문은 실리콘 엘라스토머 믹스를 사용하여 사내 재사용 가능한 접목 장치를 만드는 간단한 절차와 이 장치를 묘목 접목에 사용하는 방법을 설명합니다. 이 출판 당시 각 재사용 가능한 접목 장치는 생산 소모품이 $0.47에 불과합니다. 이 방법을 사용하면 초보자는 처음부터 끝까지 3 주 이내에 첫 번째 성공적으로 접목 된 묘목을 가질 수 있습니다. 이 접근성이 높은 절차를 통해 식물 분자 유전학 실험실은 묘목 접목을 실험 과정의 정상적인 부분으로 설정할 수 있습니다. 사용자가 이러한 접목 장치를 만들고 설계할 때 완전한 통제권을 갖기 때문에 이 기술은 원하는 경우 토마토나 담배와 같은 더 큰 식물에서 사용하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.
Introduction
접목은 기원전 500년경에 확립된 농업 관행이 된 고대 원예 기술입니다1. 수확량을 향상시키기 위해 다양한 종류의 작물을 접목하는 것이 이 기술의 첫 번째 사용이었으며 오늘날에도 이 목적으로 계속 사용되고 있습니다. 지난 10년 동안 접목은 분자생물학자들이 식물 2,3,4,5에서 장거리 신호를 연구하기 위한 도구로서 점점 더 많은 관심을 끌었습니다. 성인 식물을 접목하는 것은 비교적 쉽지만 발아 직후 식물을 접목하는 것은 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 식물 발달, 환경 반응 및 개화와 같은 과정에서 장거리 신호 전달의 효과를 평가해야 하는 경우가 있습니다 6,7,8.
애기장대는 상대적으로 작은 크기를 포함하여 여러 가지 이유로 식물 생물학의 모델 유기체로 자리 잡았으며 실험실 내에서 쉽게 자랄 수 있습니다. 그러나 애기장대 묘목의 작은 크기와 취약성은 어린 묘목을 접목하는 것을 매우 어렵게 만듭니다. 많은 경우 묘목 이식편을 성공적으로 얻기 위해서는 광범위한 실습 교육이 필요합니다. 묘목 접목의 성공률을 높이기 위한 이상적인 재배 조건과 새로운 기술을 식별한 많은 방법론적 개선이 수년에 걸쳐 있었습니다 9,10,11. 가장 최근에 도입된 도구는 애기장대 묘목 접목 칩으로, 경험이 없는 사용자도 허용 가능한 수준의 접목 성공을 달성할 수 있습니다12. 이러한 발전으로 묘목 접목의 기술적 장벽이 크게 낮아졌지만 칩 장치는 비싸고 병렬로 수행할 수 있는 이식편의 수는 빠르게 비용이 많이 듭니다.
또한 이 장치는 야생형 묘목과 유사한 배축 치수를 가진 애기장대 묘목에만 사용할 수 있습니다. 애기장대는 식물 분자 유전학의 세계에서 핵심 종이지만 최근에는 묘목 접목을 사용하여 다른 종에서 연구가 수행되었습니다. 예를 들면 대두와 일반 콩, 담배를 토마토, 카놀라를 애기장대에 접목한 다음 두 조직을 모두 샘플링하여 작은 RNA를 채취하는 것이 있습니다13,14. 따라서 대부분의 실험실에서 접근할 수 있고 주요 기술 변경 없이 광범위한 식물 종에 쉽게 적용할 수 있는 접목 방법이 매우 바람직합니다.
이 프로토콜은 대부분의 식물 종에 걸쳐 모든 묘목 형태를 수용하기 위해 접목 채널 직경과 길이를 완전히 맞춤화할 수 있는 간단한 접목 장치의 자체 생산을 사용하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 장치의 생산은 실리콘 엘라스토머, 올바른 크기의 배선 또는 튜브, 고정밀 블레이드 및 금형 역할을 하는 컨테이너만 필요하기 때문에 매우 저렴하고 확장성이 뛰어납니다. 여기에 상술된 접목 프로토콜에 따라, 사용자는 이전에 보고된 접목 결과(10,12)와 비교할 수 있는 45%(n=105)의 성공적인 접목률을 달성할 수 있다.
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Protocol
1. 장치 준비
- 실리콘 엘라스토머 용액을 정사각형 페트리 접시(100mm x 100mm)에 캐스팅하여 실리콘 그래프팅 장치를 만듭니다. 제조업체의 지침에 따라 엘라스토머 용액 15mL를 준비합니다.
알림: 실리콘 엘라스토머 키트에는 일반적으로 실리콘 기반 액체와 경화제가 포함되어 있으며, 함께 혼합하면 실리콘이 응고됩니다. - 정사각형 페트리 접시에 29G 와이어의 직선 조각 4개를 서로 등거리에 놓아 정사각형 페트리 접시를 준비합니다(그림 1A). 와이어가 금형 바닥과 같은 높이에 있는지 확인하십시오. 와이어를 완전히 곧게 펴려면 무겁고 평평한 물체(예: 금속 튜브 랙)로 단단하고 균일한 표면에 굴립니다.
알림: 트위스트 타이에는 종종 29G 와이어가 포함되어 있으며 아세톤으로 코팅된 외부 종이를 제거한 후 사용할 수 있습니다. - 혼합 된 실리콘 엘라스토머 용액을 와이어 위에 붓고 페트리 접시 상단으로 덮습니다. 실리콘이 실온에서 24-48시간 동안 경화되도록 합니다.
- 깨끗한 집게를 사용하여 페트리 접시에서 실리콘 시트를 제거하고 깨끗하고 평평한 표면으로 이동합니다.
- 실리콘 시트에서 전선을 제거합니다. 채널이 한쪽에서 열릴 수 있도록 미세한 집게로 채널 외부에 남아 있는 얇은 실리콘 층을 제거합니다(그림 1A).
- 깨끗한 가위를 사용하여 실리콘 시트를 채널에 수직으로 3mm 스트립으로 자릅니다. 각 스트립을 알루미늄 호일 봉투로 옮기고 오토클레이브 테이프로 밀봉합니다.
- 스트립을 121°C에서 최소 30분 동안 오토클레이브하고 사용할 준비가 될 때까지 보관하십시오.
2. 묘목 준비
- 씨앗을 살균하고 vernalize.
- 100mL 미세원심분리기 튜브에 0.1% 트윈 20을 함유한 50% 표백제 용액 1mL에 최대 1.5개의 애기장대 종자를 현탁하고 5-10분 동안 배양합니다. 무균 상태에서 피펫팅 또는 흡인을 통해 표백제 용액을 제거합니다. 멸균 된 dH2O 1mL로 씨앗을 헹구십시오. 튜브를 뒤집어 씨앗을 적절하게 헹구고 튜브 상단에 남아있는 표백제 용액을 제거하십시오. 헹굼을 4 번 반복하십시오.
- 씨앗이 있는 튜브에 약 0.25mL의 물을 남겨두고 4°C에서 3일 동안 어두운 곳에서 보관합니다.
- 접목을 준비하기 위해 씨앗을 접시에 담습니다.
- 1L의 MS(0.5% 수크로오스) 고체 배지에 대해 800mL의 물에 MS 염 4.4g, 수크로스 5g 및 한천 10g을 혼합하고 KOH로 pH를 5.7로 조정한 후 추가 물로 총 부피를 1L로 가져옵니다. 정사각형 페트리 접시에 ~20mL를 붓기 전에 최소 25분 동안 오토클레이브합니다.
- 무균 조건에서 20μL 피펫 팁을 사용하여 적절한 수의 준비된 종자를 플레이트로 옮겨 종자를 흡인하고 옮깁니다.
- 종자 위치를 안내하기 위해 플레이트 표면에 멸균 스트립을 놓아 종자가 스트립의 채널과 정렬되도록 합니다. 씨앗이 도금되면 스트립을 제거하십시오.
알림: 100mm x 100mm 정사각형 플레이트 1개에 두 줄의 묘목을 수용할 수 있습니다(그림 1B). - 플레이트가 세워지면 액체가 고체 매체에서 증발하고 플레이트 바닥에 고이도록 합니다. 씨앗을 접시에 놓은 후 접시 덮개를 덮고 두 줄의 씨앗과 평행한 접시의 한쪽 면( 그림 1B에서 파란색 강조 영역으로 표시됨)을 파라필름으로 밀봉합니다. 파라필름 상단과 플레이트의 다른 모든 가장자리에 통기성 테이프를 감습니다.
- 파라필름으로 밀봉된 면이 아래를 향하도록 두 개의 플레이트를 조심스럽게 세웁니다. 수평 15mL 원심분리기 튜브를 사이에 놓고 바닥에 있는 두 개의 플레이트를 분리하고 고무 밴드로 고정합니다. 플레이트 표면이 벤치탑 표면과 100°-110° 각도를 이루는지 확인합니다(그림 1C).
- 묘목 배축이 ~5mm 길이로 자랄 수 있도록 21°C의 완전한 어둠 속에서 72시간 동안 이 방향으로 플레이트를 보관합니다. 72 시간 후, 어둠에서 플레이트를 제거하고 접목하기 전에 동일한 온도에서 2-4 일 동안 16 시간 빛 (100 μE m-2 sec-1의 강도) 및 8 시간 암흑주기 하에서 성장합니다.
- 도금 후 5 일에서 7 일 사이에 묘목을 이식하십시오. 묘목 위에 접목 스트립을 놓고 배축을 채널에 맞 춥니 다. 묘목을 부드럽게 배치하여 뿌리-배축 접합부가 실리콘 스트립의 바닥에 위치하도록 하여 묘목을 절단할 준비를 합니다(그림 1D).
3. 접목 절차
- 70% 에탄올로 해부 내시경을 소독하고 두 쌍의 미세한 팁 집게와 메스 손잡이를 고압 증기멸균하여 멸균 작업 환경을 준비합니다. 모든 접목 절차는 멸균 후드에서 수행하고 필요에 따라 해부 내시경을 사용하여 수행하십시오. 10.5x의 배율을 사용하여 대부분의 접목을 수행합니다.
- 접순을 준비하십시오. 새 메스 칼날을 사용하여 배축을 수직으로 절단하여 직선으로 깨끗하게 절단합니다. 묘목이 한천으로 밀려나는 것을 방지하기 위해 식물을 누르지 않고 칼날을 앞으로 밉니다(비디오 1).
- 촬영을 제거하십시오. 미디어 표면과의 접촉을 보장하여 촬영의 절단 부분에 수분을 공급하도록 주의하십시오. 또는 사용할 준비가 될 때까지 멸균 dH2O로 채워진 페트리 접시 상단과 같은 지정된 보관 영역으로 싹을 옮깁니다.
- 대목을 준비하십시오. 닫힌 집게 사이의 왼쪽 공간에서 뿌리를 잡고 돌려서 뿌리를 부드럽게 잡아 당겨 뿌리 줄기의 절단 부분을 스트립 중앙에 남겨 둡니다 (비디오 2).
알림: 깨지기 쉬운 뿌리는 닫힌 집게 사이에서 직접 으깨지면 손상되므로 조직을 조작하려면 핀셋 끝의 날카로운 각도로 뿌리를 쐐기로 고정해야 합니다. - 끝이 가는 집게를 사용하여 원하는 촬영을 부드럽게 집어 들고 채널 상단에 삽입합니다.
참고: 성공적인 이식편을 얻으려면 접목과 대목 사이의 접촉을 육안으로 확인하는 것이 중요합니다(비디오 3). - 모든 이식편이 만들어진 후, 파라 필름과 통기성 테이프로 판을 감싸고 묘목이나 실리콘 스트립을 방해하지 않고 이전과 같은 방식으로 판을 설치하십시오. 플레이트를 26 ° C에서 16 시간 라이트 / 8 시간 다크 사이클로 설정된 성장 챔버로 조심스럽게 옮깁니다.
- 7-10 일 후에 멸균 상태에서 접목 된 묘목을 평가하십시오. 한쪽을 벗겨서 집게를 사용하여 실리콘 스트립을 조심스럽게 제거하여 채널이 묘목을 자유롭게 할 수 있도록합니다. 신선한 메스 칼날로 접순에서 자라고 있는 우발적인 뿌리를 제거하거나 끝이 가는 집게를 사용하여 으깨서 제거합니다. 대목이 접순에 단단히 부착되어 성공적인 이식편을 형성했는지 시각적으로 평가합니다(그림 2).
- 성공적인 이식편을 묘목 번식 토양으로 옮겨 필요한만큼 오래 자랄 수 있습니다. 묘목이 자리를 잡으면 며칠 동안 투명한 플라스틱으로 토양을 덮으십시오. 식물을 토양으로 옮긴 후 21°C에서 앞서 언급한 명암 주기 하에서 자랍니다.
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Representative Results
최소한의 기술이 필요한 최적의 접목 조건을 식별하기 위해 접목 스트립 설계의 다양한 측면을 테스트했습니다(표 1). 모든 접목 시험은 0.5% 슈크로오스 MS 배지 상에서 완료되었으며, 이는 이전에 이상적인 접목 배지인 것으로 보고되었다11,12.
최적의 묘목 성장은 스트립 발아로 달성 할 수 없습니다
실리콘 스트립의 첫 번째 반복에서, 실리콘 시트로부터 와이어가 제거된 후 스트립 채널의 후면에 남아있는 실리콘의 얇은 층을 남겨둠으로써 밀폐된 채널이 만들어졌다. 묘목을 플레이트에 직접 발아시키고 나중에 묘목 배축 위에 접목 스트립을 놓는 대신, 소량의 MS 배지로 채워진 채널에 씨앗을 삽입한 후 씨앗을 스트립에 직접 발아시켰습니다. 이 기술을 사용하면 묘목의 절반이 발아 중에 채널에 달라 붙어 늘어나지 않았습니다. 발아되지 않은 묘목과 길지 않은 묘목을 포함하여 25%(n=16)의 성공적인 접목률이 달성되었습니다(표 1). 관찰된 신장 실패를 해결하기 위해 씨앗은 발아 중에 배아의 자엽과 라디칼이 아래쪽을 향하도록 방향을 잡았습니다. 이 방법을 사용하여 종자의 75 %가 발아하고 성공적으로 길어졌으며 접목 효율이 약간 증가했습니다 (33 % 성공, n = 12) (표 1). 성공적인 묘목 발달을 증가시키기 위해, 종자와 성장 배지 사이의 접촉을 허용하기 위해 접목 스트립의 배지 측에서 채널을 닫는 실리콘의 얇은 층을 제거했습니다(그림 1A). 이 방법을 사용하여 묘목의 85 %가 성공적으로 발아되고 길어졌으며 31 % (n = 16)가 성공적으로 접목되었습니다 (표 1). 스트립에서 적절한 종자 발달 속도를 크게 높였음에도 불구하고 적은 수의 묘목을 잃어도 서로 다른 실험 그룹 간에 상호 이식을 수행할 때 실험 개체군 크기에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 이유로 중간 표면에서 직접 묘목을 발아시키는 것이 이상적인 것으로 결정되었습니다.
묘목 생존율 유지 및 처리 시간 및 노력 최소화
묘목을 먼저 MS 플레이트(1% 자당)에 접목하기 위해 재배하고, 절단을 위해 단단한 표면(예: 물로 채워진 페트리 접시의 뚜껑)으로 옮긴 다음, 접목용 스트립이 있는 플레이트에 조립했습니다. 이 기술을 사용하여 50%의 성공률(n=8)이 관찰되었습니다(표 1). 이 방법은 가장 높은 성공률을 얻었지만 시간과 노력이 많이 소요되어 각 이식편에 2.5분이 소요되어 한 번에 조립할 수 있는 이식편의 수가 제한되었습니다. 필요한 시간과 노력을 줄이기 위해 묘목을 접목 플레이트(0.5% 자당)에서 수직으로 재배한 다음 이 프로토콜에 설명된 대로 접목 직전에 스트립에 삽입했습니다. 이 방법을 추가로 테스트하기 위해 다양한 크기의 3건의 시험이 수행되었습니다. 처음 두 시험은 모두 48%(n=25 및 64)의 성공률을 보였고 세 번째 시험은 25%(n=16)의 성공률을 보였습니다(표 1). 이 시험들은 함께 45%의 성공률을 나타낸다(n = 105). 이 성공률은 시간이 많이 걸리는 방법과 비슷하며 묘목 위에 접목 스트립을 놓고 접목을 완료하는 데 이식당 약 1분이 필요합니다(프로토콜 단계 3.2-3.5).
접목 성공률은 접목 스트립 구조의 품질에 크게 의존합니다. 처음 두 번의 성공률은 48%인 반면, 세 번째 시도의 성공률은 더 낮습니다. 접목 스트립의 수제 품질은 본질적으로 접목 부위 간에 약간의 변동성을 초래합니다. 스트립 구성에 사용되는 와이어가 완전히 직선이 아닌 경우 스트립의 채널이 금형 바닥과 같은 높이가 되지 않아 깊이가 약간 가변적인 채널이 됩니다. 총 25개의 스트립이 각 스트립 주조에 만들어져 100개의 고유한 접목 부위가 생성됩니다(표 2). 이식 부위의 약간의 변동의 영향은 두 개의 큰 시험에서 균형을 이루었지만, 성공률이 낮은 소규모 시험에서는 약간 구부러진 와이어로 인해 더 많은 변동이 있는 이식 부위가 이식편 형성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 것으로 보입니다. 이러한 유형의 변형을 최소화하기 위해 와이어 교정 기술은 프로토콜 단계 1.2에 설명되어 있습니다.
그림 1: 접목 준비 단계의 그림. (A) 실리콘 스트립 몰드 디자인의 모델. 이 패널은 실리콘 스트립을 주조하는 데 사용되는 정사각형 플레이트 몰드를 보여줍니다. 동일한 길이의 29G 와이어의 4 개 섹션이 플레이트 바닥에 놓여지고 실리콘 엘라스토머 혼합물이 그 위에 부어집니다 (위). 실리콘이 완전히 경화된 후 실리콘 사각형을 플레이트에서 제거하고 와이어를 제거하여 접목 채널을 만듭니다. 얇은 실리콘 층은 와이어가 제거된 후에도 채널 바닥에 남아 있습니다(*로 표시). 이 레이어는 하단(아래)에 채널을 열어 두려면 제거해야 합니다. 그런 다음 정사각형은 점선(위)과 같이 와이어 채널에 수직으로 3mm 스트립으로 절단됩니다. (B) 접목 플레이트의 종자 위치. 멸균 스트립의 도움을 사용하여 두 줄의 씨앗이 스트립 채널과 일치하도록 플레이트에 배치됩니다. 씨앗을 놓은 후에는 발아 장애를 방지하기 위해 이 스트립을 제거해야 합니다. 수직 성장을 위해 MS 플레이트를 준비하려면 플레이트의 하단 (뿌리 쪽) 가장자리를 따라 파라 필름을 감싸고 여기에 파란색 강조 표시로 표시해야합니다. (C) 종자 발아를 위한 수직 플레이트 위치. 도금 후, 씨앗은 각진 판에 수직으로 발아됩니다. 15mL 원뿔형 튜브를 두 플레이트의 바닥에 배치하여 플레이트 표면과 벤치탑 사이에 약간 둔한 각도를 만듭니다. 플레이트의 파라필름 가장자리(파란색으로 표시)는 벤치탑 표면을 향합니다. 두 판의 상단을 고무 밴드로 감싸서 제자리에 고정합니다. (D) 접목 직전에 스트립에 묘목 위치. 멸균 접목 스트립은 스트립 채널 내부에 배축이있는 묘목 위에 놓입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 치유된 이식 부위를 보여주는 해부 스코프에서 캡처한 이미지. 검은색 화살표는 이식편 접합 부위를 나타내고 빨간색 화살표는 이식편 평가 과정에서 제거된 우발적 뿌리를 나타냅니다. 스케일 바 = 0.5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 살아있는 식물 이미징을 사용한 능동 접목 시연. 메스 칼날의 배치와 움직임은 깔끔한 절단을 만듭니다. 묘목 배축은 메스 블레이드를 앞으로 밀어 접목 스트립 바로 위에 절단됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2 : 스트립 내에 접목하기 위해 절단 된 대목 배축을 배치합니다. 대목은 집게를 사용하여 부드럽게 당겨 스트립 중앙에 이식편 접합 부위를 배치합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 3 : 접순을 배치하고 이식편을 완성합니다. 접순은 교체되어 대목과 연결될 때까지 스트립으로 밀어 넣습니다. 적절한 정렬과 접촉은 접순을 가볍게 밀었을 때 배축이 반응하는 것을 보고 평가됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 시험 변수 및 성공률 접목. 이 표는 가장 높은 성공률을 위한 최적의 이식 프로토콜을 결정하는 데 사용된 이식 시험의 결과를 요약합니다. 이 시험에서 조사된 변수에는 묘목 발아 조건, 실리콘 스트립 구성 및 이식 중 묘목이 실리콘 스트립 채널에 삽입된 시기가 포함됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 실리콘 엘라스토머 250mL 병에서 생성할 수 있는 이식 부위의 수. 각 생산 단위의 가격도 여기에 표시되며(발행 당시), 실리콘 엘라스토머 시약의 시장 가치의 변동에 따라 쉽게 조정할 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
요약 및 의의
이식편 결합의 형성은 성공적인 접목에 매우 중요하며, 이를 위해서는 대목과 접순 사이의 직접적이고 방해받지 않는 접촉이 필요합니다. 애기장대와 같은 작은 식물 묘목의 미니어처 크기와 취약성으로 인해 이 요구 사항을 충족하는 것이 기술적으로 어렵습니다. 초기 애기장대 묘목 접목 방법에서 개발된 한 가지 기술은 접순과 대목을 짧은 실리콘 튜브 칼라에 삽입하여 이식편 접합부(10)를 지지하는 것이었습니다. 이 방법은 두 이식편이 분리되지 않도록 보호하는 데 매우 효과적이지만 깨지기 쉬운 접순과 대목을 좁은 구멍 튜브에 삽입하는 것은 쉬운 일이 아닙니다. 더욱이, 성장으로 인한 접합부의 두꺼워짐은 접목된 묘목을 손상시키지 않고 좁은 구멍의 실리콘 튜브를 제거하기 어렵게 만드는 경우가 많습니다. 다른 방법은 접목 고리의 사용을 피하면서 묘목이 성장하는 동안 움직이는 것을 방지하기 위해 대체 기술을 사용했는데, 여기에는 자손에서 두 자엽을 모두 제거하고 비스듬한 표면에 접목된 묘목을 재배하는 것이 포함됩니다 9,11. 이러한 방법을 완료하는 데 리소스가 거의 필요하지 않지만 시도했을 때 이러한 방법은 대목에서 높은 수준의 접순 이동을 초래하여 이러한 기술을 사용하여 보고된 것보다 이식 성공률이 낮았습니다(두 연구에서 권장 조건에 대해 평균 80%). 또한 둘 다 사용자가 보조 장치 없이 이식편 묘목 부분 사이의 인터페이스를 정렬해야 하므로 높은 수준의 기술이 필요한 작업입니다. 애기장대 묘목 접목을 위해 특별히 설계된 미세 이식 칩이 최근 보고되었습니다12. 각 칩에는 4개의 묘목이 자랄 수 있도록 4개의 마이크로 챔버가 포함되어 있으며, 챔버 공간의 특수 설계는 배축이 마이크로 채널 내부에서 자랄 수 있도록 합니다. 대목은 칩에서 제자리에서 생성되고 사이온은 마이크로 채널에 삽입됩니다. 이렇게 하면 접목을 위해 대목과 접목을 모두 처리할 필요가 없으며 마이크로 채널은 접목 결합이 형성되면 묘목을 쉽게 제거할 수 있는 기회를 희생하지 않으면서 접목을 제자리에 제한합니다. 이 새로운 방법은 묘목 접목의 기술적 장벽을 크게 줄여주지만, 미세 이식 칩의 제조에는 대부분의 생물학 실험실에서 쉽게 접근할 수 없는 기술인 MEMS(Micro-Electro Mechanical Systems)가 필요합니다. 마이크로그라프팅 칩 상의 마이크로챔버의 치수는 애기장대 Col-012에 최적화되었다. 이것은 높이 또는 두께가 다양한 배축을 가진 다른 종 또는 다른 애기장대 접근/돌연변이에 대한 칩 사용을 방지합니다15,16,17.
여기에 설명된 저렴하고 유연하며 따라하기 쉬운 방법은 어린 묘목 접목을 용이하게 하기 위한 이전의 미세 이식 칩 작업에서 영감을 받았습니다. 이 방법에서는 섬세한 묘목의 조작이 최소화되어 새로운 사용자가 쉽게 사용할 수 있습니다. 스트립의 채널은 새로운 사용자가 접목된 묘목을 정렬하는 데 도움이 되며 이식 부위가 형성되는 동안 뿌리와 새싹이 잘 접촉되도록 유지하는 동시에 이식편이 형성된 후 쉽게 제거할 수 있도록 합니다. 실리콘 스트립의 높은 처리량 생산과 출발 물질의 상대적으로 낮은 비용으로 인해 미세 이식 칩 비용의 일부만으로 많은 수의 묘목을 접목할 수 있습니다. 이 수제 장치는 접목 부위당 $0.12의 비용이 들 것으로 추정되며, 다양한 식물 종 또는 묘목 표현형을 다루는 실험실에 경제적인 옵션입니다(표 2). 접목 스트립의 수제 측면은 이 방법과 관련된 비용을 줄이는 동시에 서로 다른 스트립 간의 변동성 가능성도 도입합니다. 앞서 강조했듯이 접목 스트립의 품질은 이 방법의 성공의 열쇠입니다. 분자 유전학에서 초기 단계 묘목 접목의 사용이 증가함에 따라 식물 유전학 분야는 식물의 장거리 신호 전달을 연구하기 위한 강력한 도구를 갖게 되었습니다. 이 간단하고 저렴하며 쉽게 접근할 수 있는 방법은 최소한의 사전 교육과 경험으로 실험실에서 묘목 접목 기술을 성공적으로 채택하는 데 도움이 되는 또 다른 도구를 제공합니다.
중요 고려 사항
성공적인 이식편 형성을 위해서는 상처 회복 반응(wound repair response)을 시작하고, 접순과 대목(stemstock) 사이의 세포 간 소통을 확립하고, 궁극적으로 혈관 구조를 형성하는 과정이 필요하다9. 접목 과정에서 묘목을 필요 이상으로 수분을 공급하고 손상되지 않도록 유지하는 것이 중요합니다. 이 방법을 사용하면 접순과 대목 사이의 플러시 연결을 보장하기 위해 뿌리와 접순의 절단 끝이 깨끗하고 수직이어야 합니다. 절단 중에 접목 부위가 손상되거나 접목 조각이 같은 각도로 절단되지 않으면 접목 접합부를 가로질러 세포층 간의 긴밀한 접촉이 부족하여 성공적인 접목이 이루어지지 않을 것입니다. 식물의 접목 부분이 건조되거나 손상되면 앞서 언급 한 과정이 금지되고 접목이 성공하지 못합니다. 어린 묘목은 깨지기 쉽고 집게에 의해 쉽게 부서집니다. 사용자가 필요하다고 생각하면 집게를 사용하여 두 자엽 중 하나를 잡고 접순을 조종할 수 있습니다. 이전에 보고된 접목 칩 방법과 비교하여 배축을 실리콘 스트립으로 끌어당기는 동안 대목을 손상시킬 가능성이 증가합니다. 이러한 위험을 최소화하기 위한 핸들링 기술은 프로토콜 단계 3.4에 설명되어 있습니다.
스트립 당 총 4 개의 접목 부위는 이식편 접합 형성 단계에서 묘목이 서로 닿지 않도록하는 권장 위치 수입니다. 한 번에 수행되는 총 이식편 수를 늘리려면 사용자가 이식편당 사용되는 공간을 줄이는 대신 사용되는 플레이트 수를 늘리는 것이 좋습니다.
프로토콜의 수정은 발산하는 배축 성장 또는 비애기장대 종을 수용하기 위해 가능합니다.
일부 돌연변이는 야생형 식물과 다른 속도로 etiolate. 지베렐린, 브라시노스테로이드, 에틸렌, 옥신과 같은 식물호르몬은 묘목 성장 조절에 광범위한 역할을 한다18,19,20. 이러한 호르몬 경로에 결함이 있는 돌연변이 계통은 비정형 에탈레이션 비율을 경험할 수 있다16,17. 이식 스트립의 사용자 제어 설계는 이러한 표현형 차이를 수용할 수 있지만 이러한 경우 충분한 테스트가 필요합니다. 야생형과 상당히 다른 속도로 에치올레이션을 경험하는 유전자주를 사용하는 경우, 사용자는 시작하기 전에 여기에 설명된 3일의 에터레이션 기간이 자신의 라인에 적합한지 결정해야 합니다. 부적절하게 부식 된 묘목은 짧아 지거나 과도하게 확장 된 (그리고 더 얇은) 배축으로 인해 접목이 어려워집니다. 애기장대이외의 종의 묘목을 접목하는 데 관심이 있는 사용자는 접목 채널 직경을 변경하여 필요에 맞게 이 프로토콜을 조정할 수 있습니다. 적절한 접목 연령으로 자란 토마토 및 담배 묘목은 각각 0.8 및 0.4 mm 직경의 접목 채널이 필요한 것으로 나타난다9.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
애기장대 묘목 접목에 대한 초기 교육과 안내를 해주신 Javier Brumos에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
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