Summary
Denne protokollen beskriver en robust plantepodemetode som ikke krever tidligere erfaring eller opplæring, og kan utføres til en svært lav pris ved bruk av materialer som er lett tilgjengelige i de fleste molekylærbiologiske laboratorier.
Abstract
Transplantasjon av frøplanter på et tidlig stadium har blitt et populært verktøy innen molekylær genetikk for å studere rotskuddforhold i planter. Poding av frøplanter i tidlig fase av den lille modellplanten, Arabidopsis thaliana, er teknisk utfordrende og tidkrevende på grunn av plantenes størrelse og skjørhet. En voksende samling av publiserte metoder beskriver denne teknikken med varierende suksessrate, vanskelighetsgrad og tilhørende kostnader. Dette papiret beskriver en enkel prosedyre for å lage en intern gjenbrukbar podeenhet ved hjelp av silikonelastomerblanding, og hvordan du bruker denne enheten til frøplantepodning. På tidspunktet for denne publikasjonen koster hver gjenbrukbar podeenhet bare $ 0.47 i forbruksmateriell å produsere. Ved hjelp av denne metoden kan nybegynnere få sine første vellykkede podede frøplanter på mindre enn 3 uker fra start til slutt. Denne svært tilgjengelige prosedyren vil tillate laboratorier for plantemolekylærgenetikk å etablere plantetransplantasjon som en normal del av deres eksperimentelle prosess. På grunn av den fulle kontrollen brukerne har i opprettelsen og utformingen av disse podeenhetene, kan denne teknikken enkelt justeres for bruk i større planter, for eksempel tomat eller tobakk, om ønskelig.
Introduction
Poding er en gammel hagebruksteknikk som ble en etablert landbrukspraksis ved 500 fvt1. Poding av forskjellige varianter av planteplanter for å forbedre utbyttet var den første bruken av denne teknikken, og fortsetter å bli brukt til dette formålet i dag. I det siste tiåret har poding tiltrukket seg en økende mengde oppmerksomhet som et verktøy for molekylærbiologer for å studere langdistansesignalering i planter 2,3,4,5. Selv om poding av voksne planter er relativt enkelt, er poding av planter kort tid etter spiring utfordrende. Til tross for dette er det noen ganger nødvendig å vurdere effekten av langdistansesignalering i prosesser som planteutvikling, miljøresponser og blomstring 6,7,8.
Arabidopsis thaliana har blitt etablert som modellorganismen i plantebiologi av mange grunner, inkludert den relativt små størrelsen, noe som gjør det enkelt å dyrke inne i et laboratorium. Den lille størrelsen og skjøtheten til Arabidopsis-frøplanter gjør imidlertid podning av unge frøplanter svært utfordrende. I mange tilfeller er det nødvendig med omfattende praktisk opplæring for å lykkes med å skaffe frøplantetransplantater. Det har vært mange metodiske forbedringer gjennom årene som har identifisert ideelle vekstforhold og nye teknikker for å øke suksessraten for frøplantepoding 9,10,11. Det siste verktøyet som ble introdusert var en Arabidopsis frøplantepodebrikke, som gjør det mulig for selv uerfarne brukere å oppnå akseptable nivåer av podesuksess12. Selv om dette fremskrittet har senket den tekniske barrieren for frøplantetransplantasjon betydelig, er chipenheten dyr, og antall transplantater som kan utføres parallelt blir raskt kostnadsforbudende.
I tillegg kan denne enheten bare brukes til Arabidopsis-frøplanter som har hypokotyldimensjoner som ligner på frøplanter av villtype. Mens Arabidopsis er keystone-arten i verden av plantemolekylær genetikk, har nyere arbeid blitt gjort i andre arter ved hjelp av frøplantepoding. Eksempler er poding av soyabønner og vanlig bønne, tobakk til tomat og raps til Arabidopsis, og deretter prøvetaking av begge vev for små RNA13,14. Derfor er en podemetode som er tilgjengelig for de fleste laboratorier og enkelt kan tilpasses et bredt spekter av plantearter uten store tekniske endringer, svært ønskelig.
Denne protokollen beskriver en metode som benytter intern produksjon av en enkel podeinnretning som muliggjør full tilpasning av podekanaldiameter og lengde for å imøtekomme enhver frøplantemorfologi på tvers av de fleste plantearter. Produksjonen av disse enhetene er svært rimelig og svært skalerbar, da de eneste komponentene som trengs er silikonelastomer, ledninger eller rør av riktig størrelse, et høypresisjonsblad og en beholder for å tjene som en form. Ved å følge podeprotokollen som er beskrevet her, kan brukerne oppnå vellykkede transplantasjonsrater på 45 % (n = 105), sammenlignbare med tidligere rapporterte poderesultater10,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av enheten
- Lag silikontransplantasjonsenheten ved å støpe silikonelastomerløsning i en firkantet petriskål (100 mm x 100 mm). Forbered 15 ml av elastomeroppløsningen, i henhold til produsentens retningslinjer.
MERK: Silikon elastomer kits inneholder vanligvis en silikonbasert væske og et herdemiddel, som når det blandes sammen, lar silikonet størkne. - Forbered den firkantede petriskålen ved å legge fire rette stykker 29 G ledning i den firkantede petriskålen, like langt fra hverandre (figur 1A). Forsikre deg om at ledningen ligger i flukt med bunnen av formen. For å rette ledningen helt ut, rull den på en hard, jevn overflate med en tung og flat gjenstand (f.eks. et metallrørstativ).
MERK: Twist-bånd inneholder ofte 29 G ledning og kan brukes etter fjerning av det ytre papirbelegget med aceton. - Hell den blandede silikonelastomerløsningen på toppen av ledningene og dekk med toppen av petriskålen. La silikonet herde i 24-48 timer ved romtemperatur.
- Fjern silikonplaten fra petriskålen med ren tang og flytt til en ren, flat overflate.
- Fjern ledningene fra silikonplaten. Fjern det tynne laget av silikon som er igjen på utsiden av kanalen med finpunkttang, slik at kanalen kan være åpen på den ene siden (figur 1A).
- Klipp silikonarket vinkelrett på kanalene i 3 mm strimler med ren saks. Flytt hver stripe til en aluminiumsfoliekonvolutt og forsegl med autoklavbånd.
- Autoklav strimlene ved 121 °C i minst 30 minutter og oppbevar dem til de er klare til bruk.
2. Forberedelse av frøplanter
- Steriliser og vernaliser frø.
- Suspender opptil 100 Arabidopsisfrø i 1 ml 50% blekemiddeloppløsning inneholdende 0,1% Tween 20 i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, og inkuber i 5-10 minutter. Fjern blekemiddeloppløsningen gjennom pipettering eller aspirasjon under sterile forhold. Skyll frøene med 1 ml sterilisert dH2O. Pass på å invertere rørene for å skylle frøene tilstrekkelig og fjern blekemiddeloppløsning som er igjen på toppen av røret. Gjenta skyllingen 4x.
- La det være ca. 0,25 ml vann i rørene sammen med frøene og oppbevar ved 4 °C i 3 dager i mørket.
- Plate frøene som forberedelse til podning.
- Forbered en 1% agar MS-plate som følger: For 1 liter MS (0,5% sukrose) fast medium, bland 4,4 g MS-salt, 5 g sukrose og 10 g agar i 800 ml vann, juster pH til 5,7 med KOH, og bring deretter totalvolumet til 1 L med ekstra vann. Autoklav i minst 20, min før du heller ~25 ml i de firkantede petriskålene.
- Under sterile forhold, flytt riktig antall tilberedte frø til platen ved hjelp av en 20 μL pipettespiss for å aspirere og overføre frøene.
- Plasser en steril stripe på tallerkenoverflaten for å veilede frøposisjonering, slik at frøene er på linje med kanalene på stripen. Fjern stripen når frøene er belagt.
MERK: En 100 mm x 100 mm firkantet plate har plass til to rader med frøplanter (figur 1B). - Når platene står opp, la væsken fordampe ut av det faste mediet og bassenget i bunnen av platen. Etter at frøene er plassert på tallerkenen, legg på platedekselet og forsegle den ene siden av platen som er parallell med de to radene med frø (indikert med det blå uthevede området i figur 1B) med parafilm. Pakk pustende tape på toppen av parafilmen og rundt alle de andre kantene på platen.
- Reis forsiktig opp to plater med den parafilmforseglede siden vendt nedover. Separer de to platene nederst ved å plassere et horisontalt 15 ml sentrifugerør mellom dem og fest med et gummibånd. Sørg for at plateflatene danner en vinkel på 100°-110° med benkeplaten (figur 1C).
- Oppbevar platene i denne retningen i 72 timer i totalt mørke ved 21 °C, slik at frøplantehypokotylene kan vokse ~5 mm i lengde. Etter 72 timer, fjern platene fra mørket og vokse under 16 timer lys (intensitet på 100 μE m-2 sek-1) og 8 timer mørke sykluser i 2-4 dager til ved samme temperatur før podning.
- Pode plantene mellom 5 og 7 dager etter å ha blitt belagt. Legg en podestrimmel over plantene, og monter hypokotylene i kanalene. Plasser frøplanten forsiktig slik at rot-hypokotyl-krysset er plassert i bunnen av silikonstrimmelen for å forberede frøplanten for kutting (figur 1D).
3. Poding prosedyre
- Forbered et sterilt arbeidsmiljø ved å desinfisere et disseksjonsomfang med 70% etanol og autoklavere to par fine tipped tang og et skalpellhåndtak. Utfør alle podeprosedyrer i steril hette og ved hjelp av disseksjonsskop etter behov. Utfør det meste av podingen ved hjelp av en forstørrelse på 10,5x.
- Forbered scions. Bruk et nytt skalpellblad til å kutte hypokotylen vinkelrett for å skape et rett rent kutt. Skyv bladet fremover i stedet for å trykke ned i planten for å forhindre at frøplanten blir presset inn i agar (Video 1).
- Fjern skuddet. Pass på å holde den kuttede delen av skuddet hydrert ved å sikre kontakt med medieoverflaten. Alternativt kan du flytte bildet til et angitt holdeområde, for eksempel toppen av en petriskål fylt med steril dH2O, til den er klar til bruk.
- Forbered grunnstammene. Trekk forsiktig roten ved å fange roten i rommet som er igjen mellom de lukkede tangene og snu dem, og la den kuttede delen av grunnstammene være midt på stripen (Video 2).
MERK: Den skjøre roten vil bli skadet hvis den knuses direkte mellom de lukkede tangene, noe som gjør det nødvendig å kile roten i den skarpe vinkelen på pinsettendene for å manipulere vevet. - Ta forsiktig opp ønsket skudd med den fine tangen og sett den inn i toppen av kanalen.
MERK: Det er viktig å visuelt bekrefte kontakten mellom scions og grunnstammer for å oppnå en vellykket graft (Video 3). - Etter at alle graftene er laget, pakk platene med parafilm og pustende tape og sett opp platene på samme måte som før, uten å forstyrre plantene eller silikonstrimlene. Flytt platene forsiktig til et vekstkammer satt til 26 °C med mørke sykluser på 16 t lys / 8 timer.
- Evaluer de podede plantene under sterile forhold etter 7-10 dager. Fjern silikonstrimmelen forsiktig med tang ved å skrelle opp den ene siden, slik at kanalene kan frigjøre plantene. Fjern utilsiktede røtter som vokser fra scionen ved å kutte dem fra scionen med et nytt skalpellblad eller knuse dem med fine tipped tang. Vurder visuelt om grunnstammen har blitt godt festet til scionen for å danne et vellykket transplantat (figur 2).
- Flytt vellykkede transplantater til frøplanteforplantningsjord for å vokse så lenge som nødvendig. Dekk jorden med gjennomsiktig plast i noen dager når plantene blir etablert. Etter overføring av plantene til jorden, vokse under de tidligere nevnte lyse og mørke syklusene ved 21 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ulike aspekter ved podestrimmelens design ble testet for å identifisere de optimale podeforholdene som krevde minst teknisk dyktighet (tabell 1). Alle podeforsøkene ble gjennomført på 0,5 % sukrose MS-medium, som tidligere er rapportert å være et ideelt podemedium11,12.
Optimal frøplantevekst kan ikke oppnås med spiring på stripen
I den første iterasjonen av silikonstripen ble lukkede kanaler laget ved å forlate det tynne laget av silikon som forblir på baksiden av stripkanalene etter at ledningene er fjernet fra silikonarkene. I stedet for å spire plantene direkte på platen og senere plassere podestrimmelen over frøplantehypokotylene, ble frøene spiret direkte på stripen etter å ha satt frøene inn i kanalen fylt med en liten mengde MS-medium. Ved hjelp av denne teknikken ble halvparten av plantene sittende fast i kanalene under spiring og klarte ikke å forlenge. Inkludert de ikke-spirede og de ikke-langstrakte plantene ble det oppnådd vellykkede transplantasjonsrater på 25 % (n = 16) (tabell 1). For å adressere den observerte forlengelsessvikten ble frøene orientert slik at embryoets cotyledoner og radikale pekte nedover under spiring. Ved hjelp av denne metoden spirte og forlenget 75 % av frøene vellykket, noe som resulterte i en liten økning i podeeffektiviteten (33 % suksess, n = 12) (tabell 1). For å øke vellykket frøplanteutvikling ble det tynne laget av silikon som lukket kanalen fjernet fra mellomsiden av podestrimmelen for å tillate kontakt mellom frøet og vekstmediet (figur 1A). Ved hjelp av denne metoden spirte 85% av plantene og forlenget vellykket, og 31% (n = 16) ble vellykket podet (tabell 1). Til tross for betydelig økning av hastigheten på riktig frøutvikling på stripen, kan tap av selv et lite antall frøplanter påvirke den eksperimentelle populasjonsstørrelsen betydelig når man utfører gjensidige transplantater mellom forskjellige eksperimentelle grupper. Av denne grunn ble spiring av frøplanter direkte på middels overflate bestemt på å være ideell.
Opprettholde overlevelsesrate for frøplanter og minimere behandlingstid og innsats
Frøplanter ble først dyrket for podning på MS-plater (1% sukrose), overført til en solid overflate (for eksempel lokket på en petriskål fylt med vann) for kutting, deretter montert på en tallerken med stripen for podning. Ved bruk av denne teknikken ble det observert en suksessrate på 50 % (n = 8) (tabell 1). Selv om denne metoden oppnådde den høyeste suksessraten, var den tidkrevende og arbeidskrevende, og krevde 2,5 minutter for hvert transplantat, noe som begrenset antall transplantater som kunne settes sammen samtidig. For å redusere tiden og innsatsen som kreves, ble plantene dyrket vertikalt på podeplaten (0,5% sukrose) og deretter satt inn i stripen rett før podning, som beskrevet i denne protokollen. For å teste denne metoden videre ble det gjennomført tre studier av varierende størrelse. De to første studiene hadde begge en suksessrate på 48 % (n = 25 og 64) og den tredje studien hadde en suksessrate på 25 % (n = 16) (tabell 1). Til sammen indikerer disse studiene en suksessrate på 45 % (n = 105). Denne suksessraten kan sammenlignes med den mer tidkrevende metoden og krever ca. 1 min per poding for å plassere podestrimmelen over plantene og for å fullføre podingen (protokolltrinn 3.2-3.5).
Graden av podesuksess er sterkt avhengig av kvaliteten på podestrimmelkonstruksjonen. Mens de to første studiene har en suksessrate på 48%, har den tredje studien en lavere suksessrate. Den håndlagde kvaliteten på podestripen resulterer iboende i liten variasjon mellom podesteder. Hvis ledningene som brukes til stripekonstruksjon ikke er helt rette, vil kanalene i stripene ikke være i flukt med bunnen av formen og vil resultere i kanaler med litt variable dybder. Totalt lages det 25 strimler i hver stripestøping, noe som resulterer i 100 unike podesteder (tabell 2). Mens effekten av liten variasjon i podestedene er balansert ut i de to større studiene, i den mindre studien med lavere suksessrater, ser det ut til at podesteder med mer variasjon på grunn av svakt buede ledninger kan påvirke graftdannelsen negativt. For å minimere denne typen variasjon er en trådrettingsteknikk beskrevet i protokolltrinn 1.2.
Figur 1: Illustrasjon av trinnene for podeforberedelse . (A) Modell av silikonstrimmelformdesignet. Dette panelet demonstrerer den firkantede plateformen som brukes til støping av silikonstrimlene. Fire seksjoner av 29 G ledninger med samme lengde legges på bunnen av platen, og silikonelastomerblandingen helles på toppen av dem (over). Etter at silikonet er fullstendig herdet, fjernes silikonfirkanten fra platen og ledningene fjernes for å lage podekanaler. Et tynt lag silikon forblir på bunnen av kanalene etter at ledningene er fjernet (indikert med *). Dette laget bør fjernes for å la kanalene være åpne på bunnen (under). Torget kuttes deretter vinkelrett på ledningskanalene i 3 mm strimler, som vist av de stiplede linjene (over). (B) Frøplassering på podeplaten. Ved hjelp av en steril stripe plasseres to rader frø på tallerkenen på linje med stripkanalene. Etter å ha plassert frøene, bør denne stripen fjernes for å forhindre spiringshindring. For å forberede MS-plater for vertikal vekst, bør parafilm vikles langs bunnen (rotsiden) kanten av platen, merket her med blå utheving. (C) Vertikal plateposisjon for frøspredning. Etter plating blir frøene spist vertikalt på vinklede plater. Et 15 ml konisk rør er plassert ved foten av to plater for å skape en litt stump vinkel mellom plateoverflaten og benkeplaten. Den parafilmede kanten (merket med blått) på platen er orientert mot benkeplaten. En gummistrikk er viklet rundt toppen av de to platene for å holde dem på plass. (D) Plassering av frøplanter i stripen rett før poding. Sterile podningsstrimler plasseres på toppen av plantene med hypokotyler inne i stripkanaler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bilde tatt på et disseksjonsomfang som viser et helbredet podested. Den svarte pilen indikerer transplantatkrysset, og de røde pilene indikerer utilsiktede røtter som ble fjernet under transplantatevalueringsprosessen. Skala bar = 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Demonstrasjon av aktiv poding ved hjelp av levende planteavbildning. Plassering og bevegelse av skalpellbladet for å skape et rent kutt. Frøplantehypokotylen kuttes rett over podestrimmelen ved å skyve skalpellbladet fremover. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Plassering av den kuttede grunnstammehypokotylen for poding i stripen. Grunnstammen trekkes forsiktig med tang for å plassere graftkryssstedet midt på stripen. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: Plassering av scion og fullføring av transplantatet. Scionen byttes ut og skyves inn i stripen til den kobles til grunnstammen. Riktig justering og kontakt evalueres ved å se hypocotyl reagere når scionen skyves lett. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tabell 1: Variabler for podeforsøk og suksessrater. Denne tabellen oppsummerer resultatene av podeforsøkene som ble brukt til å bestemme den optimale podeprotokollen for de høyeste suksessratene. Variablene som ble undersøkt i disse forsøkene inkluderer spiringsforhold for frøplanter, silikonstrimmelkonstruksjon og når frøplanter ble satt inn i silikonstrimmelkanalene under podning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Antall podesteder som kan genereres fra en 250 ml flaske silikonelastomer. Prisen for hver produksjonsenhet er også vist her (på publiseringstidspunktet), og kan enkelt justeres ved svingninger i markedsverdien av silikonelastomerreagensene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oppsummering og betydning
Dannelse av en graftforening er avgjørende for vellykket poding, noe som krever direkte og uforstyrret kontakt mellom grunnstammen og scion. Miniatyrstørrelsen og skjøtheten til frøplanter av små planter som Arabidopsis gjør det teknisk utfordrende å oppfylle dette kravet. En teknikk utviklet i tidlige Arabidopsis frøplantetransplantasjonsmetoder var å sette inn både scion og grunnstammen i en kort silikonrørkrage for å støtte graftkrysset10. Selv om denne metoden er svært effektiv for å beskytte de to graftdelene mot separasjon, er det ikke en lett oppgave å sette inn den skjøre scionen og grunnstammen i et smalboringsrør. Dessuten gjør fortykningen i krysset fra vekst det ofte vanskelig å fjerne silikonrørene med smalboring uten å skade de podede plantene. Andre metoder brukte alternative teknikker for å unngå bruk av en podekrage samtidig som plantene ikke beveget seg under vekst, inkludert fjerning av både cotyledoner fra scions og voksende podede frøplanter på en skrå overflate 9,11. Selv om disse metodene krever få ressurser å fullføre, resulterte disse metodene i høye nivåer av scionmigrasjon bort fra grunnstammen, noe som resulterte i lavere podesuksess enn rapportert (80% i gjennomsnitt for de anbefalte forholdene i begge studiene) ved bruk av disse teknikkene. I tillegg krever de begge at brukeren justerer grensesnittet mellom transplantatplantedelene uten hjelpemidler, en oppgave som krever et høyt ferdighetsnivå. En mikropodingsbrikke designet spesielt for Arabidopsis frøplantepoding har nylig blitt rapportert12. Hver brikke inneholder fire mikrokamre for å tillate fire frøplanter å vokse, med den spesielle utformingen av kammerrommet som gjør det mulig for hypocotyl å vokse inne i en mikrokanal. Grunnstammene genereres på plass på brikken, og scionene settes inn i mikrokanalene. Dette eliminerer behovet for å håndtere både grunnstammer og scions for poding, og mikrokanalen begrenser podingen på plass uten å ofre det enkle å fjerne frøplanter når graftforeningen er dannet. Selv om denne nye metoden i stor grad reduserer den tekniske barrieren for frøplantepoding, krever fabrikasjonen av mikrograftingbrikken Micro-Electro Mechanical Systems (MEMS), en teknologi som ikke er lett tilgjengelig for de fleste biologiske laboratorier. Dimensjonene til mikrokammeret på mikropodingsbrikken ble optimalisert for Arabidopsis Col-012. Dette forhindrer bruk av sjetongene for andre arter eller forskjellige Arabidopsis-tilsetninger/mutanter som har hypokotyler som varierer i høyde eller tykkelse15,16,17.
Den rimelige, fleksible og enkle å følge metoden beskrevet her ble inspirert av tidligere mikropodingsbrikkearbeid for å lette ung frøplantetransplantasjon. I denne metoden er manipuleringen av delikate frøplanter minimal, noe som letter bruken for nye brukere. Kanalene i strimlene hjelper nye brukere med å justere de podede plantene og holder roten og skuddet i god kontakt under dannelse av transplantatstedet, samtidig som de sikrer enkel fjerning etter at transplantatet er dannet. På grunn av den høye gjennomstrømningsproduksjonen av silikonstrimlene og relativt lave kostnader for utgangsmaterialene, kan podning av et stort antall frøplanter oppnås til en brøkdel av kostnaden for mikropodingsbrikkene. Denne hjemmelagde enheten anslås å koste $ 0.12 per podested, noe som gjør dette til et økonomisk alternativ for laboratorier som arbeider med en rekke plantearter eller frøplantefenotyper (tabell 2). Mens det håndlagde aspektet av podestrimlene reduserer kostnadene forbundet med denne metoden, introduserer det også sjansen for variasjon mellom forskjellige strimler. Som tidligere understreket, er kvaliteten på podestrimlene nøkkelen til suksessen til denne metoden. Økningen i bruk av tidlig stadium av frøplantepoding i molekylær genetikk har gitt plantegenetikk et kraftig verktøy for å studere langdistansesignalering i planter. Denne enkle, rimelige og lett tilgjengelige metoden vil gi et annet verktøy for å legge til rette for vellykket bruk av frøplantepodeteknikken av laboratorier med minimal tidligere opplæring og erfaring.
Kritiske overveielser
Prosesser som å initiere en sårreparasjonsrespons, etablere celle-til-celle-kommunikasjon mellom scion og grunnstamme, og til slutt vaskulaturdannelse, er nødvendige for dannelsen av et vellykket transplantat9. Under podningsprosessen er det viktig å holde plantene hydrert og uskadet utover nødvendighet. Ved hjelp av denne metoden må kuttendene av røttene og scions være rene og vinkelrette for å sikre en spyleforbindelse mellom scion og grunnstamme. Hvis podestedet er skadet under skjæring, eller podestykkene ikke er kuttet i samme vinkel, er vellykket poding usannsynlig på grunn av mangel på nær kontakt mellom cellelag over podekrysset. Hvis noen av podningsdelene av planten får tørke eller er skadet, vil de tidligere nevnte prosessene bli hemmet, og podning vil ikke lykkes. Unge frøplanter er skjøre og knuses lett av tang. Hvis brukerne finner det nødvendig, kan tangen brukes til å holde fast i en av de to cotyledonene for å manøvrere scionen. Sammenlignet med den tidligere rapporterte podechipmetoden, øker sjansen for å skade grunnstammen mens du trekker hypokotylen ned i silikonstripen. Håndteringsteknikker for å minimere denne risikoen er beskrevet i protokolltrinn 3.4.
Totalt fire podesteder per stripe er det anbefalte antall posisjoner for å sikre at plantene ikke berører hverandre under graft-junction-formasjonsstadiet. For å skalere opp det totale antallet transplantater som utføres på en gang, anbefales det at brukerne øker antall plater som brukes, i stedet for å redusere mengden plass som brukes per transplantat.
Modifikasjon av protokollen er mulig for å imøtekomme divergerende hypokotylvekst eller ikke-Arabidopsis-arter
Noen mutanter etiolate på forskjellige hastigheter til vill-type planter. Fytohormoner som gibberelliner, brassinosteroider, etylen og auxin spiller en omfattende rolle i frøplantevekstregulering18,19,20. Mutantlinjer defekte i disse hormonveiene kan oppleve atypiske etiolasjonshastigheter16,17. Den brukerstyrte utformingen av podestripen gjør det mulig å tilpasse disse fenotypiske forskjellene, men tilstrekkelig testing i disse tilfellene er nødvendig. Hvis det brukes en genetisk linje som opplever etiolering med betydelig forskjellige hastigheter fra den ville typen, bør brukerne avgjøre om 3-dagers etiolasjonsperioden beskrevet her passer for deres linjer før de begynner. Utilstrekkelig etiolerte frøplanter vil resultere i vanskelig poding på grunn av en forkortet eller overdreven utvidet (og tynnere) hypokotyl. Brukere som er interessert i poding av frøplanter av andre arter enn Arabidopsi, kan tilpasse denne protokollen til deres behov ved å endre podekanalens diameter. Tomat- og tobakksplanter dyrket til passende podealder ser ut til å kreve henholdsvis 0,8 og 0,4 mm diameter podekanaler,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Takk til Javier Brumos for innledende opplæring og veiledning i poding av Arabidopsis-frøplanter .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E.
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y.
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
