Summary
Este protocolo descreve um método robusto de enxertia de plântulas que não requer experiência ou treinamento prévio e pode ser executado a um custo muito baixo usando materiais de fácil acesso na maioria dos laboratórios de biologia molecular.
Abstract
A enxertia de plântulas em estágio inicial tornou-se uma ferramenta popular em genética molecular para estudar as relações raiz-parte aérea dentro das plantas. A enxertia de mudas em estágio inicial da pequena planta-modelo, Arabidopsis thaliana, é tecnicamente desafiadora e demorada devido ao tamanho e fragilidade de suas mudas. Uma coleção crescente de métodos publicados descreve essa técnica com diferentes taxas de sucesso, dificuldade e custos associados. Este trabalho descreve um procedimento simples para fazer um dispositivo de enxertia reutilizável in house usando mistura de elastômero de silicone, e como usar esse dispositivo para enxertia de plântulas. No momento desta publicação, cada dispositivo de enxertia reutilizável custa apenas US$ 0,47 em materiais consumíveis para produzir. Usando este método, os iniciantes podem ter suas primeiras mudas enxertadas com sucesso em menos de 3 semanas do início ao fim. Este procedimento altamente acessível permitirá que os laboratórios de genética molecular de plantas estabeleçam a enxertia de plântulas como parte normal de seu processo experimental. Devido ao total controle que os usuários têm na criação e design desses dispositivos de enxertia, essa técnica poderia ser facilmente ajustada para uso em plantas maiores, como tomate ou tabaco, se desejado.
Introduction
A enxertia é uma técnica hortícola antiga que se tornou uma prática agrícola estabelecida por volta de 500 a.C.1. A enxertia de diferentes variedades de plantas cultivadas para melhorar a produtividade foi o primeiro uso dessa técnica, e continua sendo utilizada para esse fim até hoje. Na última década, a enxertia tem atraído cada vez mais atenção como ferramenta para biólogos moleculares estudarem a sinalização de longa distância em plantas 2,3,4,5. Enquanto enxertar plantas adultas é relativamente fácil, enxertar plantas logo após a germinação é um desafio. Apesar disso, algumas vezes é necessário avaliar os efeitos da sinalização de longa distância em processos como o desenvolvimento das plantas, as respostas ambientais e o florescimento 6,7,8.
Arabidopsis thaliana foi estabelecido como o organismo modelo na biologia vegetal por muitas razões, incluindo seu tamanho relativamente pequeno, facilitando o crescimento dentro de um laboratório. No entanto, o pequeno tamanho e a fragilidade das mudas de Arabidopsis tornam a enxertia de mudas jovens muito desafiadora. Em muitos casos, é necessário treinamento prático extensivo para obter enxertos de plântulas com sucesso. Ao longo dos anos, houve muitos avanços metodológicos que identificaram condições ideais de cultivo e novas técnicas para aumentar a taxa de sucesso da enxertia de plântulas9,10,11. A ferramenta mais recente introduzida foi um chip de enxertia de plântulas de Arabidopsis, que permite que mesmo usuários inexperientes alcancem níveis aceitáveis de sucesso de enxertia12. Embora esse avanço tenha reduzido significativamente a barreira técnica da enxertia de plântulas, o dispositivo de chip é caro, e o número de enxertos que podem ser conduzidos em paralelo rapidamente se torna proibitivo.
Além disso, este dispositivo só pode ser usado para mudas de Arabidopsis que tenham dimensões de hipocótilo semelhantes às mudas selvagens. Embora Arabidopsis seja a espécie-chave no mundo da genética molecular de plantas, trabalhos recentes têm sido feitos em outras espécies usando enxertia de plântulas. Exemplos incluem a enxertia de soja e feijão, tabaco para tomate e canola para Arabidopsis e, posteriormente, amostragem de ambos os tecidos para pequenos RNAs13,14. Portanto, um método de enxertia acessível à maioria dos laboratórios e que possa ser facilmente adaptado a uma ampla gama de espécies vegetais sem grandes alterações técnicas é altamente desejável.
Este protocolo detalha um método que emprega a produção interna de um dispositivo de enxertia simples que permite a personalização completa do diâmetro e comprimento do canal de enxertia para acomodar qualquer morfologia de plântula na maioria das espécies vegetais. A produção desses dispositivos é muito acessível e altamente escalável, pois os únicos componentes necessários são elastômero de silicone, fiação ou tubulação do tamanho correto, uma lâmina de alta precisão e um recipiente para servir como molde. Seguindo o protocolo de enxertia aqui detalhado, os usuários podem obter taxas de enxertia bem-sucedidas de 45% (n = 105), comparáveis aos resultados de enxertia previamente relatados10,12.
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Protocol
1. Preparação do dispositivo
- Fazer o dispositivo de enxertia de silicone fundindo a solução de elastômero de silicone em uma placa de Petri quadrada (100 mm x 100 mm). Preparar 15 mL da solução de elastômero, seguindo as orientações do fabricante.
NOTA: Os kits de elastômero de silicone normalmente incluem um líquido à base de silicone e um agente de cura que, quando misturados, permitem que o silicone se solidifique. - Preparar a placa de Petri quadrada colocando quatro pedaços retos de fio 29 G na placa de Petri quadrada, equidistantes entre si (Figura 1A). Certifique-se de que o fio fique nivelado com o fundo do molde. Para endireitar totalmente o fio, enrole-o em uma superfície dura e uniforme com um objeto pesado e plano (por exemplo, um rack de tubo de metal).
NOTA: As gravatas de torção geralmente contêm fio de 29 G e podem ser usadas após a remoção do revestimento externo de papel com acetona. - Despeje a solução mista de elastômero de silicone por cima dos fios e cubra com a parte superior da placa de Petri. Deixe o silicone curar por 24-48 h à temperatura ambiente.
- Retire a folha de silicone da placa de Petri usando pinças limpas e passe para uma superfície plana limpa.
- Retire os fios da folha de silicone. Remova a fina camada de silicone remanescente na parte externa do canal com pinça de ponta fina, para permitir que o canal fique aberto de um lado (Figura 1A).
- Corte a folha de silicone perpendicularmente aos canais em tiras de 3 mm usando tesouras limpas. Mova cada tira para um envelope de papel alumínio e sele com fita autoclave.
- Autoclave as tiras a 121 °C por pelo menos 30 min e guarde até que esteja pronta para uso.
2. Preparo das mudas
- Esterilizar e vernalizar sementes.
- Suspender até 100 sementes de Arabidopsis em 1 mL de solução de água sanitária a 50% contendo Tween 20 a 0,1% em tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incubar por 5-10 min. Remover a solução de água sanitária por pipetagem ou aspiração em condições estéreis. Enxaguar as sementes com 1 mL de dH2O esterilizado. Certifique-se de inverter os tubos para enxaguar adequadamente as sementes e remover qualquer solução de água sanitária deixada na parte superior do tubo. Repita o enxágue 4x.
- Deixar aproximadamente 0,25 mL de água nos tubos com as sementes e armazenar a 4 °C por 3 dias no escuro.
- Plaquear as sementes em preparação para a enxertia.
- Prepare uma placa de MS de ágar 1% da seguinte forma: para 1 L de meio sólido MS (0,5% de sacarose), misture 4,4 g de sal MS, 5 g de sacarose e 10 g de ágar em 800 mL de água, ajuste o pH para 5,7 com KOH e, em seguida, leve o volume total para 1 L com água adicional. Autoclave por pelo menos 20, min antes de despejar ~25 mL nas placas de Petri quadradas.
- Em condições estéreis, mover o número adequado de sementes preparadas para a placa, usando uma ponta de pipeta de 20 μL para aspirar e transferir as sementes.
- Coloque uma tira estéril na superfície da placa para orientar o posicionamento da semente, para que as sementes fiquem alinhadas com os canais da tira. Retire a tira assim que as sementes estiverem chapeadas.
OBS: Uma placa quadrada de 100 mm x 100 mm pode acomodar duas fileiras de mudas (Figura 1B). - Quando as placas estiverem em pé, deixe o líquido evaporar do meio sólido e acumule no fundo da placa. Após a colocação das sementes na placa, colocar na tampa da placa e selar um dos lados da placa que esteja paralelo às duas fileiras de sementes (indicado pela região de destaque azul na Figura 1B) com parafilme. Embrulhe a fita respirável em cima do parafilme e ao redor de todas as outras bordas da placa.
- Levante cuidadosamente duas placas com o lado selado do parafilme virado para baixo. Separe as duas placas na parte inferior colocando um tubo de centrífuga horizontal de 15 mL entre elas e fixe com um elástico. Certifique-se de que as superfícies da placa formem um ângulo de 100°-110° com a superfície da bancada (Figura 1C).
- Armazenar as placas nesta orientação por 72 h no escuro total a 21 °C, para permitir que as plântulas de hipocótilo cresçam ~5 mm de comprimento. Após 72 h, remova as placas do escuro e cresça sob 16 h de luz (intensidade de 100 μE m-2 seg-1) e 8 h de ciclos escuros por mais 2-4 dias na mesma temperatura antes da enxertia.
- Enxertar as mudas entre 5 e 7 dias após serem plaqueadas. Coloque uma faixa de enxertia sobre as mudas, encaixando seus hipocótilos nos canais. Posicionar suavemente a plântula de modo que a junção raiz-hipocótilo seja posicionada no fundo da tira de silicone para preparar a plântula para o corte (Figura 1D).
3. Procedimento de enxertia
- Prepare um ambiente de trabalho estéril higienizando um escopo de dissecção com etanol 70% e autoclavando dois pares de pinças de ponta fina e um cabo de bisturi. Realizar todos os procedimentos de enxertia em capuz estéril e com o auxílio de um dossiê de dissecção, conforme necessário. Realizar a maior parte da enxertia com aumento de 10,5x.
- Prepare as scions. Use uma lâmina de bisturi fresca para cortar o hipocótilo perpendicularmente para criar um corte limpo reto. Empurre a lâmina para frente em vez de pressionar para baixo na planta para evitar que a muda seja empurrada para dentro do ágar (Vídeo 1).
- Remova o disparo. Tome cuidado para manter a parte cortada da parte aérea hidratada, garantindo o contato com a superfície do meio. Alternativamente, mova o rebento para uma área de retenção designada, como a parte superior de uma placa de Petri cheia de dH2O estéril, até que esteja pronta para uso.
- Prepare os porta-enxertos. Puxe suavemente a raiz pegando a raiz no espaço deixado entre as pinças fechadas e girando-as, deixando a seção de corte dos porta-enxertos no meio da tira (Figura 2).
NOTA: A raiz frágil será danificada se esmagada entre as pinças fechadas diretamente, necessitando encunhar a raiz no ângulo afiado das extremidades da pinça para manipular o tecido. - Pegue suavemente o rebento desejado usando a pinça de ponta fina e insira na parte superior do canal.
OBS: É fundamental confirmar visualmente o contato entre as mudas e os porta-enxertos para obter o sucesso do enxerto (Figura 3). - Após a confecção de todos os enxertos, envolva as placas com parafilme e fita adesiva respirável e monte as placas da mesma forma que antes, sem atrapalhar as mudas ou tiras de silicone. Mova cuidadosamente as placas para uma câmara de crescimento regulada a 26 °C com ciclos de 16 h claro/8 h escuro.
- Avaliar as plântulas enxertadas em condições estéreis após 7-10 dias. Retire cuidadosamente a tira de silicone usando pinças, descascando um dos lados, permitindo que os canais liberem as mudas. Remova quaisquer raízes adventícias que cresçam da copa, cortando-as da copa com uma lâmina de bisturi fresca ou esmagando-as usando pinças de ponta fina. Avaliar visualmente se o porta-enxerto ficou firmemente aderido à copa para formar um enxerto bem-sucedido (Figura 2).
- Mova enxertos bem-sucedidos para o solo de propagação de mudas para crescer pelo tempo necessário. Cubra o solo com plástico transparente por alguns dias à medida que as mudas forem se estabelecendo. Após a transferência das plantas para o solo, crescer sob os ciclos claro e escuro mencionados anteriormente a 21 °C.
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Representative Results
Vários aspectos do desenho da tira de enxertia foram testados para identificar as condições ideais de enxertia que exigiam menor habilidade técnica (Tabela 1). Todos os ensaios de enxertia foram concluídos em meio MS de sacarose a 0,5%, que foi previamente relatado como um meio de enxertia ideal11,12.
O crescimento ótimo das plântulas não pode ser alcançado com a germinação em faixa
Na primeira iteração da tira de silicone, foram feitos canais fechados deixando a fina camada de silicone que permanece na parte de trás dos canais da tira após a retirada dos fios das folhas de silicone. Ao invés de germinar as plântulas diretamente na placa e posteriormente colocar a faixa de enxertia sobre o hipocótilo das plântulas, as sementes foram germinadas diretamente na faixa após a inserção das sementes no canal preenchido com pequena quantidade de meio MS. Com essa técnica, metade das mudas ficou presa nos canais durante a germinação e não conseguiu se alongar. Incluindo as plântulas não germinadas e não alongadas, obtiveram-se taxas de sucesso de enxertia de 25% (n = 16) (Tabela 1). Para suprir a falha de alongamento observada, as sementes foram orientadas de modo que os cotilédones e o radical do embrião apontassem para baixo durante a germinação. Utilizando-se esse método, 75% das sementes germinaram e alongaram-se com sucesso, o que resultou em discreto aumento na eficiência de enxertia (33% de sucesso, n = 12) (Tabela 1). Para aumentar o sucesso no desenvolvimento das plântulas, a fina camada de silicone que fecha o canal foi removida da face média da tira de enxertia para permitir o contato entre a semente e o meio de cultura (Figura 1A). Por esse método, 85% das plântulas germinaram e alongaram com sucesso, e 31% (n = 16) foram enxertadas com sucesso (Tabela 1). Apesar de elevar significativamente a taxa de desenvolvimento adequado das sementes na faixa, a perda mesmo de um pequeno número de plântulas pode impactar significativamente o tamanho da população experimental ao realizar enxertos recíprocos entre diferentes grupos experimentais. Por esta razão, a germinação de plântulas diretamente na superfície do meio foi considerada ideal.
Manter a taxa de sobrevivência das plântulas e minimizar o tempo e os esforços de processamento
As mudas foram primeiramente cultivadas para enxertia em placas MS (1% de sacarose), transferidas para uma superfície sólida (como a tampa de uma placa de Petri preenchida com água) para o corte e, em seguida, montadas em uma placa com a tira para enxertia. Com essa técnica, observou-se taxa de sucesso de 50% (n = 8) (Tabela 1). Embora esse método tenha obtido a maior taxa de sucesso, foi demorado e trabalhoso, exigindo 2,5 min para cada enxerto, limitando o número de enxertos que podiam ser montados de uma só vez. Para diminuir o tempo e o esforço necessários, as mudas foram cultivadas verticalmente na placa de enxertia (0,5% de sacarose) e, em seguida, inseridas na tira diretamente antes da enxertia, conforme descrito neste protocolo. Para testar ainda mais esse método, foram realizados três ensaios clínicos de tamanhos variados. As duas primeiras tentativas tiveram uma taxa de sucesso de 48% (n = 25 e 64) e a terceira tentativa teve uma taxa de sucesso de 25% (n = 16) (Tabela 1). Juntos, esses estudos indicam uma taxa de sucesso de 45% (n = 105). Essa taxa de sucesso é comparável ao método mais demorado e requer aproximadamente 1 min por enxerto para colocar a tira de enxertia sobre as mudas e completar a enxertia (etapas do protocolo 3.2-3.5).
A taxa de sucesso da enxertia depende fortemente da qualidade da construção da tira de enxertia. Enquanto os dois primeiros ensaios têm uma taxa de sucesso de 48%, o terceiro ensaio tem uma taxa de sucesso menor. A qualidade artesanal da tira de enxertia resulta inerentemente em pequena variabilidade entre os locais de enxertia. Se os fios usados para a construção da tira não forem completamente retos, então os canais nas tiras não serão nivelados com o fundo do molde e resultarão em canais de profundidades ligeiramente variáveis. No total, são confeccionadas 25 tiras em cada fundição de tiras, resultando em 100 sítios únicos de enxertia (Tabela 2). Enquanto o efeito de pequena variação nos sítios de enxertia é equilibrado nos dois estudos maiores, no estudo menor, com menores taxas de sucesso, parece que os locais de enxertia com maior variação devido a fios ligeiramente curvados podem impactar negativamente a formação do enxerto. Para minimizar esse tipo de variação, uma técnica de endireitamento dos fios é descrita no passo 1.2 do protocolo.
Figura 1: Ilustração das etapas do preparo da enxertia . (A) Modelo do projeto do molde de tiras de silicone. Este painel demonstra o molde de placa quadrada usado para fundir as tiras de silicone. Quatro seções de fios de 29 G de comprimento igual são colocadas na parte inferior da placa, e a mistura de elastômero de silicone é derramada sobre eles (acima). Após a cura total do silicone, o quadrado de silicone é removido da placa e os fios são removidos para criar os canais de enxerto. Uma fina camada de silicone permanece no fundo dos canais após a retirada dos fios (indicado por *). Esta camada deve ser removida para deixar os canais abertos na parte inferior (abaixo). O quadrado é então cortado perpendicularmente aos canais de arame em tiras de 3 mm, como mostrado pelas linhas pontilhadas (acima). (B) Posicionamento das sementes na placa de enxertia. Com o auxílio de uma tira estéril, duas fileiras de sementes são posicionadas na placa em linha com os canais da tira. Após a colocação das sementes, esta faixa deve ser removida para evitar qualquer obstáculo à germinação. Para preparar as placas MS para o crescimento vertical, o parafilme deve ser envolvido ao longo da borda inferior (lado da raiz) da placa, marcada aqui com realce azul. (C) Posição vertical da placa para germinação das sementes. Após o plaqueamento, as sementes são germinadas verticalmente em placas anguladas. Um tubo cônico de 15 mL é colocado na base de duas placas para criar um ângulo ligeiramente obtuso entre a superfície da placa e a bancada. A borda parafilmada (marcada com azul) da placa é orientada para a superfície da bancada. Um elástico é enrolado ao redor da parte superior das duas placas para mantê-las no lugar. (D) Posicionamento das plântulas na faixa diretamente antes da enxertia. Tiras de enxertia estéreis são colocadas sobre as mudas com hipocótilos dentro dos canais da tira. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem capturada em um escopo de dissecção mostrando um local de enxertia cicatrizado. A seta preta indica o local da junção do enxerto e as setas vermelhas indicam raízes adventícias que foram removidas durante o processo de avaliação do enxerto. Barra de escala = 0,5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Demonstração de enxertia ativa usando imagens de plantas vivas. A colocação e o movimento da lâmina de bisturi para criar um corte limpo. O hipocótilo da plântula é cortado diretamente acima da tira de enxertia, empurrando a lâmina de bisturi para frente. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Posicionamento do porta-enxerto cortado hipocótilo para enxertia dentro da tira. O porta-enxerto é suavemente tracionado com pinça para posicionar o local da junção do enxerto no meio da tira. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 3: Colocação da tesoura e finalização do enxerto. O enxerto é substituído e empurrado para dentro da faixa até se conectar com o porta-enxerto. O alinhamento e o contato adequados são avaliados vendo o hipocótilo responder quando a tesoura é levemente empurrada. Clique aqui para baixar este vídeo.
Tabela 1: Variáveis do estudo de enxertia e taxas de sucesso. Esta tabela resume os resultados dos ensaios de enxertia utilizados para determinar o protocolo de enxertia ideal para as maiores taxas de sucesso. As variáveis examinadas nesses ensaios incluem as condições de germinação das plântulas, a construção da tira de silicone e a inserção das plântulas nos canais da tira de silicone durante a enxertia. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Número de sítios de enxertia que podem ser gerados a partir de um frasco de 250 mL de elastômero de silicone. O preço de cada unidade de produção também é mostrado aqui (no momento da publicação), e pode ser facilmente ajustado em caso de flutuações no valor de mercado dos reagentes de elastômero de silicone. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Resumo e significado
A formação de uma união do enxerto é crucial para o sucesso da enxertia, que requer contato direto e ininterrupto entre o porta-enxerto e a muda. O tamanho em miniatura e a fragilidade das mudas de pequenas plantas, como Arabidopsis, tornam tecnicamente desafiador atender a esse requisito. Uma técnica desenvolvida nos primeiros métodos de enxertia de plântulas de Arabidopsis foi inserir tanto a copa quanto o porta-enxerto em um colar curto de tubos de silicone para apoiar a junção do enxerto10. Embora este método seja altamente eficaz em proteger as duas partes do enxerto da separação, não é uma tarefa fácil inserir o frágil porta-enxerto em um tubo de furo estreito. Além disso, o espessamento na junção do crescimento muitas vezes dificulta a remoção dos tubos de silicone de furo estreito sem danificar as mudas enxertadas. Outros métodos utilizaram técnicas alternativas para evitar o uso de colar de enxertia e impedir que as plântulas se movimentassem durante o crescimento, incluindo a remoção de ambos os cotilédones das mudas e o crescimento de plântulas enxertadas em superfície oblíqua 9,11. Embora esses métodos necessitem de poucos recursos para serem concluídos, quando testados, esses métodos resultaram em altos níveis de migração da copa para longe do porta-enxerto, resultando em menor sucesso de enxertia do que o relatado (80% em média para as condições recomendadas em ambos os estudos) usando essas técnicas. Além disso, ambos exigem que o usuário alinhe a interface entre as partes da muda de enxertia sem nenhum auxílio, tarefa que exige um alto nível de habilidade. Um chip de microenxertia projetado especificamente para enxertia de plântulas de Arabidopsis foi recentemente relatado12. Cada cavaco contém quatro microcâmaras para permitir que quatro mudas cresçam, com o design especial do espaço da câmara permitindo que o hipocótilo cresça dentro de um microcanal. Os porta-enxertos são gerados no local no chip, e as mudas são inseridas nos microcanais. Isso elimina a necessidade de manusear porta-enxertos e mudas para enxertia, e o microcanal confina a enxertia no local sem sacrificar a facilidade de remoção de mudas uma vez que a união do enxerto é formada. Embora esse novo método reduza consideravelmente a barreira técnica da enxertia de mudas, a fabricação do chip de microenxertia requer Sistemas Micro-Eletromecânicos (MEMS), uma tecnologia não facilmente acessível à maioria dos laboratórios de biologia. As dimensões da microcâmara no chip de microenxertia foram otimizadas para Arabidopsis Col-012. Isso evita o uso dos chips para outras espécies ou diferentes acessos/mutantes de Arabidopsis que apresentam hipocótilos que variam em altura ou espessura15,16,17.
O método de baixo custo, flexível e fácil de seguir descrito aqui foi inspirado em trabalhos anteriores de microenxertia com chips para facilitar a enxertia de plântulas jovens. Nesse método, a manipulação de mudas delicadas é mínima, facilitando o uso para novos usuários. Os canais nas tiras auxiliam novos usuários no alinhamento das mudas enxertadas e mantêm a raiz e a parte aérea em bom contato durante a formação do local de enxertia, além de garantir fácil remoção após a formação do enxerto. Devido à produção de alto rendimento das tiras de silicone e ao custo relativamente baixo dos materiais de partida, a enxertia de um grande número de mudas pode ser obtida a uma fração do custo dos cavacos de microenxertia. Estima-se que esse dispositivo caseiro custe US$ 0,12 por local de enxertia, tornando-se uma opção econômica para laboratórios que trabalham com uma variedade de espécies de plantas ou fenótipos de plântulas (Tabela 2). Ao mesmo tempo em que o aspecto artesanal das tiras de enxertia diminui os custos associados a esse método, ele também introduz a chance de variabilidade entre as diferentes tiras. Como enfatizado anteriormente, a qualidade das tiras de enxertia é fundamental para o sucesso deste método. O aumento no uso de enxertia de plântulas em estágio inicial em genética molecular tem dado ao campo da genética vegetal uma ferramenta poderosa para o estudo da sinalização de longa distância em plantas. Este método simples, de baixo custo e de fácil acesso fornecerá outra ferramenta para ajudar a facilitar a adoção bem-sucedida da técnica de enxertia de mudas por laboratórios com mínimo treinamento prévio e experiência.
Considerações críticas
Processos como o início de uma resposta de reparo de feridas, o estabelecimento de comunicação célula-célula entre a copa e o porta-enxerto e, finalmente, a formação de vasculatura são necessários para a formação de um enxerto bem-sucedido9. Durante o processo de enxertia, é importante manter as mudas hidratadas e sem danos além da necessidade. Usando este método, as extremidades de corte das raízes e mudas devem ser limpas e perpendiculares para garantir uma conexão clara entre a copa e o porta-enxerto. Se o local de enxertia for danificado durante o corte, ou as peças de enxertia não forem cortadas no mesmo ângulo, o enxerto bem-sucedido é improvável devido à falta de contato próximo entre as camadas celulares através da junção do enxerto. Se alguma das partes de enxertia da planta for deixada secar ou estiver danificada, os processos mencionados anteriormente serão inibidos, e a enxertia não será bem-sucedida. As mudas jovens são frágeis e facilmente trituradas por pinças. Se os usuários acharem necessário, a pinça pode ser usada para segurar um dos dois cotilédones para manobrar a scion. Em comparação com o método de enxertia com chip relatado anteriormente, a chance de danificar o porta-enxerto ao puxar o hipocótilo para baixo na tira de silicone é aumentada. As técnicas de manuseio para minimizar esse risco estão descritas na etapa 3.4 do protocolo.
Um total de quatro pontos de enxertia por tira é o número recomendado de posições para garantir que as mudas não se toquem durante a fase de formação da junção do enxerto. Para aumentar o número total de enxertos realizados de uma só vez, recomenda-se que os usuários aumentem o número de placas utilizadas, em vez de diminuir a quantidade de espaço utilizado por enxerto.
A modificação do protocolo é possível para acomodar o crescimento divergente de hipocótilo ou espécies não-Arabidopsis
Alguns mutantes etiolaem em taxas diferentes das plantas selvagens. Fitohormônios como giberelinas, brassinosteróides, etileno e auxina desempenham um papel importante na regulação do crescimento de plântulas18,19,20. Linhagens mutantes defeituosas nessas vias hormonais podem apresentar taxas de etiolação atípicas16,17. O desenho controlado pelo usuário da tira de enxertia permite a acomodação dessas diferenças fenotípicas, mas testes suficientes nesses casos são necessários. Se for usada uma linhagem genética que experimente etiolação em taxas significativamente diferentes do tipo selvagem, os usuários devem determinar se o período de etiolação de 3 dias descrito aqui é apropriado para suas linhagens antes de começar. Mudas inadequadamente etioladas resultarão em difícil enxertia devido a um hipocótilo encurtado ou excessivamente estendido (e mais fino). Usuários interessados em enxertar mudas de outras espécies que não Arabidopsipodem adaptar este protocolo às suas necessidades através da alteração do diâmetro do canal de enxertia. Mudas de tomate e tabaco cultivadas até a idade de enxertia adequada parecem necessitar de canais de enxertia de 0,8 e 0,4 mm de diâmetro, respectivamente9.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Obrigado a Javier Brumos pelo treinamento inicial e orientação na enxertia de mudas de Arabidopsis .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
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