Summary
Этот протокол описывает надежный метод прививки рассады, который не требует предварительного опыта или обучения и может быть выполнен по очень низкой цене с использованием материалов, легко доступных в большинстве лабораторий молекулярной биологии.
Abstract
Ранняя стадия прививки саженцев стала популярным инструментом в молекулярной генетике для изучения взаимоотношений между корнями и побегами внутри растений. Прививка ранних саженцев небольшого модельного растения Arabidopsis thaliana является технически сложной и трудоемкой из-за размера и хрупкости его саженцев. Растущая коллекция опубликованных методов описывает эту технику с различными показателями успеха, сложностью и связанными с этим затратами. В этой статье описывается простая процедура изготовления собственного многоразового устройства для прививки с использованием смеси силиконовых эластомеров и способы использования этого устройства для прививки рассады. На момент этой публикации производство каждого многоразового прививочного устройства обходится всего в 0,47 доллара США в расходных материалах. Используя этот метод, новички могут получить свои первые успешно привитые саженцы менее чем за 3 недели от начала до конца. Эта высокодоступная процедура позволит лабораториям молекулярной генетики растений установить прививку рассады как нормальную часть своего экспериментального процесса. Благодаря полному контролю, который пользователи имеют при создании и проектировании этих устройств для прививки, этот метод может быть легко отрегулирован для использования на более крупных растениях, таких как помидоры или табак, если это необходимо.
Introduction
Прививка - это древняя садоводческая техника, которая стала устоявшейся сельскохозяйственной практикой к 500 г. до н.э.1. Прививка различных сортов сельскохозяйственных культур для повышения урожайности была первым применением этой техники и продолжает использоваться для этой цели сегодня. В последнее десятилетие прививка привлекает все большее внимание как инструмент молекулярных биологов для изучения передачи сигналов на большие расстояния у растений 2,3,4,5. В то время как прививка взрослых растений относительно проста, прививка растений вскоре после прорастания является сложной задачей. Несмотря на это, иногда требуется оценить влияние передачи сигналов на большие расстояния в таких процессах, как развитие растений, реакция окружающей среды и цветение 6,7,8.
Arabidopsis thaliana был признан модельным организмом в биологии растений по многим причинам, в том числе по относительно небольшому размеру, что позволяет легко выращивать его в лаборатории. Однако небольшой размер и хрупкость саженцев арабидопсиса делает прививку молодых саженцев очень сложной. Во многих случаях для успешного получения саженцевых трансплантатов требуется обширная практическая подготовка. За прошедшие годы было внесено много методологических усовершенствований, которые определили идеальные условия выращивания и новые методы для повышения успешности прививки саженцев 9,10,11. Самым последним представленным инструментом был чип для прививки рассады арабидопсиса, который позволяет даже неопытным пользователям достичь приемлемого уровня успеха прививки12. Несмотря на то, что этот прогресс значительно снизил технический барьер для прививки рассады, устройство чипа стоит дорого, а количество прививок, которые можно проводить параллельно, быстро становится непомерно дорогим.
Кроме того, это устройство можно использовать только для проростков арабидопсиса, которые имеют размеры гипокотиля, аналогичные саженцам дикорастущего типа. В то время как арабидопсис является краеугольным камнем в мире молекулярной генетики растений, недавняя работа была проделана и у других видов с использованием прививки рассады. Примеры включают прививку сои и фасоли обыкновенной, табака к томату и рапса к арабидопсису и последующий отбор проб обеих тканей для малых РНК13,14. Поэтому крайне желателен метод прививки, доступный для большинства лабораторий и легко адаптированный к широкому спектру видов растений без каких-либо серьезных изменений в технике.
В этом протоколе подробно описывается метод, в котором используется собственное производство простого устройства для прививки, которое позволяет полностью настроить диаметр и длину канала прививки для учета любой морфологии саженца у большинства видов растений. Производство этих устройств очень доступно по цене и легко масштабируется, так как единственными необходимыми компонентами являются силиконовый эластомер, проводка или трубка правильного размера, высокоточное лезвие и контейнер, служащий пресс-формой. Следуя протоколу прививки, подробно описанному здесь, пользователи могут достичь успешных показателей прививки 45% (n = 105), что сопоставимо с ранее сообщенными результатами прививки10,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка устройства
- Изготовьте силиконовое прививочное устройство, отлив раствор силиконового эластомера в квадратной чашке Петри (100 мм х 100 мм). Приготовьте 15 мл раствора эластомера, следуя рекомендациям производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наборы силиконовых эластомеров обычно включают жидкость на основе силикона и отвердитель, которые при смешивании позволяют силикону затвердевать. - Подготовьте квадратную чашку Петри, уложив четыре прямых куска проволоки 29 G в квадратную чашку Петри, равноудаленные друг от друга (рис. 1A). Убедитесь, что проволока лежит вровень с дном формы. Чтобы полностью выпрямить проволоку, прокатите ее по твердой однородной поверхности тяжелым и плоским предметом (например, металлической стойкой для труб).
ПРИМЕЧАНИЕ: Стяжки часто содержат провод 29G и могут использоваться после удаления внешнего бумажного покрытия ацетоном. - Налейте смешанный раствор силиконового эластомера поверх проводов и накройте сверху чашкой Петри. Дайте силикону затвердеть в течение 24-48 часов при комнатной температуре.
- Снимите силиконовый лист с чашки Петри с помощью чистых щипцов и переместите на чистую ровную поверхность.
- Снимите провода с силиконового листа. Удалите тонкий слой силикона, оставшийся снаружи канала, тонкими точечными щипцами, чтобы канал был открыт с одной стороны (рис. 1A).
- Разрежьте силиконовый лист перпендикулярно каналам на полоски по 3 мм с помощью чистых ножниц. Переместите каждую полоску в конверт из алюминиевой фольги и запечатайте автоклавной лентой.
- Автоклавируйте полоски при температуре 121 °C не менее 30 минут и храните до готовности к использованию.
2. Подготовка рассады
- Стерилизуют и яровизируют семена.
- Суспендировать до 100 семян арабидопсиса в 1 мл 50% раствора отбеливателя, содержащего 0,1% Tween 20, в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл и инкубировать в течение 5-10 минут. Удалите раствор отбеливателя с помощью пипетки или аспирации в стерильных условиях. Промойте семена 1 мл стерилизованного dH2O. Обязательно переверните пробирки, чтобы адекватно промыть семена, и удалите весь раствор отбеливателя, оставшийся в верхней части пробирки. Повторите полоскание 4 раза.
- Оставьте примерно 0,25 мл воды в пробирках с семенами и храните при температуре 4 ° C в течение 3 дней в темноте.
- Пластинчатые семена готовятся к прививке.
- Приготовьте 1%-ную тарелку МС с агаром следующим образом: на 1 л твердой среды МС (0,5% сахарозы) смешайте 4,4 г соли МС, 5 г сахарозы и 10 г агара в 800 мл воды, отрегулируйте рН до 5,7 с помощью КОН, а затем доведите общий объем до 1 л с дополнительной водой. Автоклав в течение не менее 20 мин, прежде чем налить ~25 мл в квадратные чашки Петри.
- В стерильных условиях переместите соответствующее количество подготовленных семян на тарелку, используя наконечник пипетки объемом 20 мкл для аспирации и переноса семян.
- Поместите стерильную полоску на поверхность пластины, чтобы направлять позиционирование семян, чтобы семена были выровнены с каналами на полоске. Удалите полоску, как только семена будут покрыты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна квадратная пластина размером 100 мм x 100 мм может вместить два ряда саженцев (рис. 1B). - Как только пластины встанут, дайте жидкости испариться из твердой среды и скапливайтесь на дне тарелки. После того, как семена будут помещены на тарелку, наденьте на тарелку крышку и запечатайте одну сторону тарелки, параллельную двум рядам семян (обозначенным выделенной синим цветом областью на рисунке 1B), парапленкой. Поверх парапленки и вокруг всех остальных краев пластины оберните дышащим скотчем.
- Осторожно встаньте на две пластины стороной, запечатанной парапленкой, вниз. Разделите две пластины внизу, поместив между ними горизонтальную центрифужную пробирку объемом 15 мл и закрепите резинкой. Убедитесь, что поверхности пластин образуют угол 100–110° с поверхностью столешницы (рис. 1C).
- Храните пластины в таком положении в течение 72 ч в полной темноте при температуре 21 °C, чтобы гипокотильи проростков выросли ~ 5 мм в длину. Через 72 ч выньте пластинки из темноты и выращивайте под 16 ч светлых (интенсивность 100 мкЭ м-2 сек-1) и 8 ч темных циклов еще 2-4 дня при той же температуре перед прививкой.
- Прививайте саженцы через 5-7 дней после обложки. Поместите прививочную полосу поверх саженцев, вставив их гипокотили в каналы. Аккуратно расположите саженец так, чтобы соединение корня и гипокотила было расположено в нижней части силиконовой полосы, чтобы подготовить саженец к срезке (рис. 1D).
3. Процедура прививки
- Подготовьте стерильную рабочую среду, продезинфицировав диссекционный прицел 70% этанолом и автоклавируя две пары щипцов с тонкими наконечниками и ручку скальпеля. Выполняйте все процедуры прививки в стерильном капюшоне и с помощью диссекционного эндоскопа по мере необходимости. Выполняют большую часть черенкования, используя увеличение в 10,5 раза.
- Подготовьте отпрыски. Используйте свежее лезвие скальпеля, чтобы разрезать гипокотиль перпендикулярно, чтобы создать прямой чистый срез. Толкайте лезвие вперед, а не вдавливайте в растение, чтобы саженец не вдавливался в агар (видео 1).
- Удалите побег. Следите за тем, чтобы срезанная часть побега была увлажненной, обеспечивая контакт с поверхностью среды. В качестве альтернативы переместите побег в специально отведенную зону хранения, например, в верхнюю часть чашки Петри, заполненную стерильным dH2O, до тех пор, пока он не будет готов к использованию.
- Подготовьте подвои. Аккуратно вытяните корень, зацепив корень за пространство, оставшееся между закрытыми щипцами, и повернув их, оставив срезанный участок подвоя посередине полосы (Видео 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хрупкий корень будет поврежден, если его раздавить непосредственно между закрытыми щипцами, что потребует расклинивания корня под острым углом концов пинцета для манипуляций с тканью. - Аккуратно возьмите нужный побег с помощью щипцов с тонкими наконечниками и вставьте в верхнюю часть канала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно визуально подтвердить контакт между привоями и подвоями, чтобы получить успешный привой (видео 3). - После того, как все прививки сделаны, оберните пластины парапленкой и дышащей лентой и установите пластины так же, как и раньше, не нарушая рассаду или силиконовые полоски. Осторожно переместите пластины в камеру для роста, установленную при температуре 26 °C, с циклами 16 часов света и 8 часов темноты.
- Оценивают привитые саженцы в стерильных условиях через 7-10 дней. Аккуратно удалите силиконовую полоску с помощью щипцов, отслаивая одну сторону, позволяя каналам освободить рассаду. Удалите все придаточные корни, растущие из привоя, отрезав их от привоя свежим лезвием скальпеля или раздавив щипцами с тонкими наконечниками. Визуально оцените, прочно ли прикрепился подвой к привою, чтобы сформировать удачный привой (рисунок 2).
- Переместите успешные прививки в почву для размножения рассады, чтобы они росли столько, сколько потребуется. Накройте почву прозрачным пластиком на несколько дней, пока рассада не укоренится. После переноса растений в почву растут при ранее упомянутых светлых и темных циклах при 21 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Были протестированы различные аспекты конструкции прививочной полосы для определения оптимальных условий прививки, требующих наименьшего количества технических навыков (табл. 1). Все испытания по прививке были завершены на 0,5% сахарозе MS, которая, как сообщалось ранее, является идеальной средой для прививки11,12.
Оптимальный рост рассады не может быть достигнут при проращивании на полосе
В первой итерации силиконовой полосы закрытые каналы были сделаны путем оставления тонкого слоя силикона, который остается на обратной стороне каналов полосы после удаления проводов с силиконовых листов. Вместо того, чтобы проращивать саженцы непосредственно на тарелке, а затем помещать прививочную полосу над гипокотилями рассады, семена проращивали непосредственно на полосе после введения семян в канал, заполненный небольшим количеством среды MS. Используя эту технику, половина сеянцев застревала в каналах во время прорастания и не успевала удлиняться. Включая непроросшие и неудлиненные сеянцы, были достигнуты успешные показатели прививки 25% (n = 16) (табл. 1). Чтобы устранить наблюдаемое нарушение удлинения, семена были ориентированы таким образом, чтобы семядоли и радикал эмбриона были направлены вниз во время прорастания. При использовании этого метода 75% семян успешно проросли и удлинились, что привело к незначительному повышению эффективности прививки (33% успеха, n = 12) (табл. 1). Чтобы увеличить успешное развитие проростков, тонкий слой силикона, закрывающий канал, был удален со средней стороны прививочной полосы, чтобы обеспечить контакт между семенем и питательной средой (рис. 1А). При использовании этого метода 85% сеянцев успешно проросли и вытянулись, а 31% (n = 16) были успешно привиты (табл. 1). Несмотря на значительное повышение скорости правильного развития семян на полосе, потеря даже небольшого количества проростков может существенно повлиять на размер опытной популяции при выполнении взаимных прививок между различными опытными группами. По этой причине проращивание рассады непосредственно на поверхности среды было определено идеальным.
Поддержание приживаемости рассады и минимизация времени и усилий на обработку
Сеянцы сначала культивировали для прививки на пластинах МС (1% сахарозы), переносили на твердую поверхность (например, крышку чашки Петри, наполненную водой) для срезки, затем собирали на тарелку с полоской для черенкования. При использовании этой методики наблюдался 50% успеха (n = 8) (табл. 1). Несмотря на то, что этот метод получил самый высокий уровень успеха, он был трудоемким и трудоемким, требуя 2,5 минуты для каждого трансплантата, что ограничивало количество трансплантатов, которые можно было собрать одновременно. Чтобы сократить время и усилия, саженцы культивировали вертикально на прививочной пластине (0,5% сахарозы), а затем вставляли в полосу непосредственно перед прививкой, как описано в этом протоколе. Для дальнейшего тестирования этого метода было проведено три испытания разного размера. В первых двух испытаниях вероятность успеха составила 48% (n = 25 и 64), а в третьем испытании - 25% (n = 16) (таблица 1). Вместе эти испытания показывают вероятность успеха 45% (n = 105). Этот показатель успеха сопоставим с более трудоемким методом и требует примерно 1 минуты на прививку, чтобы поместить полоску прививки на саженцы и завершить прививку (этапы протокола 3.2-3.5).
Скорость успеха прививки в значительной степени зависит от качества конструкции прививочной полосы. В то время как первые два испытания имеют вероятность успеха 48%, третье испытание имеет более низкий уровень успеха. Качество ручной работы прививочной полосы по своей сути приводит к небольшой вариабельности между местами прививки. Если провода, используемые для строительства полосы, не являются полностью прямыми, то каналы в полосах не будут находиться на одном уровне с нижней частью формы, что приведет к образованию каналов слегка переменной глубины. Всего в каждой полосовой отливке изготавливается 25 полос, в результате чего получается 100 уникальных участков прививки (табл. 2). В то время как эффект незначительных вариаций в местах прививки уравновешивается в двух более крупных испытаниях, в меньших испытаниях с более низкими показателями успеха представляется, что места прививки с большей вариативностью из-за слегка изогнутых проводов могут негативно повлиять на формирование трансплантата. Чтобы свести к минимуму этот тип вариаций, метод выпрямления проволоки описан в шаге протокола 1.2.
Рисунок 1: Иллюстрация этапов подготовки к прививке . (A) Модель конструкции силиконовой полосы. Эта панель демонстрирует квадратную пластинчатую форму, используемую для литья силиконовых полос. На дно плиты укладываются четыре отрезка проводов 29 Г равной длины, а поверх них (вверху) заливается смесь силиконового эластомера. После того, как силикон полностью отверждается, силиконовый квадрат удаляется с пластины, а провода удаляются для создания каналов для прививки. Тонкий слой силикона остается на дне каналов после снятия проводов (обозначается *). Этот слой следует удалить, чтобы оставить каналы открытыми внизу (внизу). Затем квадрат разрезается перпендикулярно проволочным каналам на полоски по 3 мм, как показано пунктирными линиями (выше). (B) Размещение семян на прививочной пластине. С помощью стерильной полоски два ряда семян располагаются на тарелке на одной линии с каналами полоски. После размещения семян эту полоску следует удалить, чтобы предотвратить прорастание. Чтобы подготовить пластины МС к вертикальному росту, парапленку следует обернуть по нижнему (корневым) краю пластины, отмеченной здесь синим выделением. (C) Вертикальное положение пластины для прорастания семян. После сервировки семена проращивают вертикально на угловых пластинах. Коническая трубка объемом 15 мл помещается у основания двух пластин для создания слегка тупого угла между поверхностью пластины и столешницей. Парапленированный край (отмечен синим цветом) пластины ориентирован на поверхность столешницы. Резинка оборачивается вокруг верхней части двух пластин, чтобы удерживать их на месте. (D) Размещение саженца в полосе непосредственно перед прививкой. Стерильные полоски для прививки укладывают поверх рассады с гипокотилями внутри полосовых каналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изображение, полученное на диссекционном прицеле, показывающее зажившее место прививки. Черная стрелка указывает на место соединения трансплантата, а красные стрелки указывают на придаточные корни, которые были удалены в процессе оценки трансплантата. Масштабная линейка = 0,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Демонстрация активной прививки с помощью визуализации живых растений. Размещение и движение лезвия скальпеля для создания чистого среза. Гипокотиль саженца срезают непосредственно над прививочной полосой, толкая вперед лезвие скальпеля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Позиционирование срезанного гипокотиля подвоя для прививки внутри полосы. Подвой аккуратно вытягивают с помощью щипцов, чтобы расположить место соединения прививки в середине полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 3: Размещение привоя и завершение прививки. Привой заменяют и проталкивают в полосу до тех пор, пока он не соединится с подвоем. Правильное выравнивание и контакт оцениваются по тому, как гипокотиль реагирует, когда привоя слегка толкают. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Таблица 1: Переменные испытаний прививки и показатели успеха. В этой таблице обобщены результаты испытаний трансплантации, используемых для определения оптимального протокола трансплантации для достижения наилучших показателей успеха. Переменные, изученные в этих испытаниях, включают условия прорастания рассады, конструкцию силиконовой полосы и то, когда саженцы были вставлены в каналы силиконовой полосы во время прививки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Количество участков прививки, которые могут быть получены из флакона силиконового эластомера объемом 250 мл. Цена за каждую единицу продукции также указана здесь (на момент публикации) и может быть легко скорректирована при колебаниях рыночной стоимости реагентов из силиконового эластомера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Резюме и значение
Формирование привоя имеет решающее значение для успешной прививки, которая требует прямого и беспрепятственного контакта между подвоем и привоем. Миниатюрный размер и хрупкость саженцев небольших растений, таких как арабидопсис, делает технически сложным выполнение этого требования. Один из методов, разработанных в ранних методах прививки саженцев Arabidopsis, заключался в том, чтобы вставить как привой, так и подвой в короткий воротник силиконовой трубки для поддержки соединениятрансплантата 10. Хотя этот метод очень эффективен для защиты двух частей привоя от разделения, вставить хрупкий привой и подвой в узкоствольную трубку - непростая задача. Более того, утолщение на стыке от роста часто затрудняет удаление узкопроходных силиконовых трубок, не повреждая привитые саженцы. В других методах использовались альтернативные методы, позволяющие избежать использования прививочного воротника при одновременном предотвращении движения саженцев во время роста, включая удаление обеих семядолей из привоев и выращивание привитых саженцев на косой поверхности 9,11. Хотя эти методы требуют мало ресурсов для завершения, при испытании эти методы привели к высокому уровню миграции привоя от подвоя, что привело к более низкому успеху прививки, чем сообщалось (в среднем 80% для рекомендуемых условий в обоих исследованиях) с использованием этих методов. Кроме того, они оба требуют, чтобы пользователь выровнял интерфейс между частями саженца трансплантата без каких-либо вспомогательных средств, что требует высокого уровня навыков. Недавно сообщалось о чипе для микропрививки, разработанном специально для прививки рассады Arabidopsis 12. Каждый чип содержит четыре микрокамеры, позволяющие расти четырем саженцам, со специальной конструкцией пространства камеры, позволяющей гипокотилю расти внутри микроканала. Подвои генерируются на месте на чипе, а отпрыски вставляются в микроканалы. Это избавляет от необходимости обрабатывать как подвои, так и отпрыски для прививки, а микроканал ограничивает прививку на месте, не жертвуя простотой удаления саженцев после формирования прививочного соединения. В то время как этот новый метод значительно снижает технический барьер прививки рассады, изготовление чипа для микропрививки требует микроэлектромеханических систем (MEMS), технологии, недоступной для большинства биологических лабораторий. Размеры микрокамеры на чипе микропрививки оптимизированы для Arabidopsis Col-012. Это предотвращает использование чипов для других видов или различных образцов/мутантов Arabidopsis, которые имеют гипокотили, различающиеся по высоте или толщине15,16,17.
Недорогой, гибкий и простой в использовании метод, описанный здесь, был вдохновлен предыдущей работой с чипами микропрививки для облегчения прививки молодых саженцев. В этом методе манипуляции с нежной рассадой минимальны, облегчая использование для новых пользователей. Каналы в полосках помогают новым пользователям выровнять привитые саженцы и поддерживают хороший контакт корня и побега во время формирования места прививки, а также обеспечивают легкое удаление после формирования прививки. Благодаря высокой производительности производства силиконовых полосок и относительно низкой стоимости исходных материалов, прививка большого количества саженцев может быть достигнута за небольшую часть стоимости микропрививочной стружки. Это самодельное устройство оценивается в 0,12 доллара США за место прививки, что делает его экономичным вариантом для лабораторий, работающих с различными видами растений или фенотипами саженцев (таблица 2). В то время как ручной аспект прививочных полосок снижает затраты, связанные с этим методом, он также дает возможность вариативности между различными полосками. Как подчеркивалось ранее, качество полосок для прививки является ключом к успеху этого метода. Рост использования ранней стадии прививки рассады в молекулярной генетике дал области генетики растений мощный инструмент для изучения передачи сигналов на большие расстояния в растениях. Этот простой, недорогой и легкодоступный метод станет еще одним инструментом, который поможет успешно внедрить технику прививки рассады лабораториями с минимальной предварительной подготовкой и опытом.
Критические соображения
Такие процессы, как инициация реакции заживления раны, установление межклеточной связи между привоем и корневым и, в конечном итоге, формирование сосудистой сети, необходимы для формирования успешного трансплантата9. В процессе прививки важно, чтобы саженцы были увлажненными и неповрежденными сверх необходимости. При использовании этого метода срезанные концы корней и привоев должны быть чистыми и перпендикулярными, чтобы обеспечить заподлицо соединение привоя и подвоя. Если место прививки повреждено во время черенкования, или прививочные части срезаны не под одинаковым углом, успешная прививка маловероятна из-за отсутствия тесного контакта между клеточными слоями через прививочный стык. Если какая-либо из прививочных частей растения подсохнет или будет повреждена, упомянутые ранее процессы будут угнетены, и прививка не будет успешной. Молодые саженцы хрупкие и легко раздавливаются щипцами. Если пользователи сочтут это необходимым, щипцы можно использовать, чтобы удерживать одну из двух семядолей, чтобы маневрировать привоем. По сравнению с ранее описанным методом прививки увеличивается вероятность повреждения подвоя при втягивании гипокотила в силиконовую полоску. Методы обработки для минимизации этого риска описаны в шаге 3.4 протокола.
Всего четыре места прививки на полосу - это рекомендуемое количество позиций, чтобы саженцы не соприкасались друг с другом на стадии формирования прививки-соединения. Чтобы увеличить общее количество трансплантатов, выполняемых за один раз, рекомендуется, чтобы пользователи увеличивали количество используемых пластин, а не уменьшали количество пространства, используемого для каждого трансплантата.
Модификация протокола возможна для учета дивергентного роста гипокотиля или видов, не относящихся к Arabidopsis
Некоторые мутанты этиолируют с разной скоростью к растениям дикого типа. Фитогормоны, такие как гиббереллины, брассиностероиды, этилен и ауксин, играют обширную роль в регуляции роста рассады18,19,20. Мутантные линии, дефектные в этих гормональных путях, могут испытывать атипичные показатели этиоляции16,17. Контролируемая пользователем конструкция полоски для прививки позволяет учитывать эти фенотипические различия, но в этих случаях требуется достаточное тестирование. Если используется генетическая линия, которая испытывает этиоляцию со значительно отличающейся частотой от дикого типа, пользователи должны определить, подходит ли 3-дневный период этиолирования, описанный здесь, для их линий, прежде чем начать. Недостаточно этиолированные саженцы приведут к затруднению черенкования из-за укороченного или чрезмерно вытянутого (и более тонкого) гипокотиля. Пользователи, заинтересованные в прививке саженцев видов, отличных от Arabidopsi, могут адаптировать этот протокол в соответствии со своими потребностями, изменив диаметр канала прививки. Рассада томатов и табака, выращенная до соответствующего возраста прививки, по-видимому, требует каналов для прививки диаметром 0,8 и 0,4 мм соответственно9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Спасибо Хавьеру Брумосу за начальное обучение и руководство по прививке саженцев арабидопсиса .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E.
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y.
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
