Summary
Este protocolo describe un método robusto de injerto de plántulas que no requiere experiencia previa o capacitación y puede ejecutarse a un costo muy bajo utilizando materiales fácilmente accesibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular.
Abstract
El injerto de plántulas en etapa temprana se ha convertido en una herramienta popular en genética molecular para estudiar las relaciones raíz-brote dentro de las plantas. El injerto de plántulas en etapa temprana de la pequeña planta modelo, Arabidopsis thaliana, es técnicamente desafiante y requiere mucho tiempo debido al tamaño y la fragilidad de sus plántulas. Una creciente colección de métodos publicados describe esta técnica con diferentes tasas de éxito, dificultad y costos asociados. Este documento describe un procedimiento simple para hacer un dispositivo de injerto reutilizable interno utilizando mezcla de elastómero de silicona, y cómo usar este dispositivo para el injerto de plántulas. En el momento de esta publicación, cada dispositivo de injerto reutilizable cuesta solo $ 0.47 en materiales consumibles para producir. Usando este método, los principiantes pueden tener sus primeras plántulas injertadas con éxito en menos de 3 semanas de principio a fin. Este procedimiento altamente accesible permitirá a los laboratorios de genética molecular de plantas establecer el injerto de plántulas como una parte normal de su proceso experimental. Debido al control total que los usuarios tienen en la creación y diseño de estos dispositivos de injerto, esta técnica podría ajustarse fácilmente para su uso en plantas más grandes, como el tomate o el tabaco, si se desea.
Introduction
El injerto es una antigua técnica hortícola que se convirtió en una práctica agrícola establecida por 500 BCE1. El injerto de diferentes variedades de plantas de cultivo para mejorar los rendimientos fue el primer uso de esta técnica, y continúa siendo utilizado para este propósito hoy en día. En la última década, el injerto ha atraído una cantidad creciente de atención como una herramienta para que los biólogos moleculares estudien la señalización a larga distancia en plantas 2,3,4,5. Si bien injertar plantas adultas es relativamente fácil, injertar plantas poco después de la germinación es un desafío. A pesar de esto, a veces se requiere evaluar los efectos de la señalización a larga distancia en procesos como el desarrollo de las plantas, las respuestas ambientales y la floración 6,7,8.
Arabidopsis thaliana se ha establecido como el organismo modelo en biología vegetal por muchas razones, incluyendo su tamaño relativamente pequeño, lo que hace que sea fácil de cultivar dentro de un laboratorio. Sin embargo, el pequeño tamaño y la fragilidad de las plántulas de Arabidopsis hacen que el injerto de plántulas jóvenes sea muy difícil. En muchos casos, se requiere una amplia capacitación práctica para obtener con éxito los injertos de plántulas. Ha habido muchas mejoras metodológicas a lo largo de los años que han identificado condiciones ideales de crecimiento y nuevas técnicas para aumentar la tasa de éxito del injerto de plántulas 9,10,11. La herramienta más reciente introducida fue un chip de injerto de plántulas de Arabidopsis, que permite incluso a los usuarios inexpertos alcanzar niveles aceptables de éxito del injerto12. Si bien este avance ha reducido significativamente la barrera técnica del injerto de plántulas, el dispositivo de chip es costoso y la cantidad de injertos que se pueden realizar en paralelo rápidamente se vuelve prohibitiva.
Además, este dispositivo solo se puede usar para plántulas de Arabidopsis que tienen dimensiones de hipocótilo similares a las plántulas de tipo silvestre. Si bien Arabidopsis es la especie clave en el mundo de la genética molecular de plantas, se han realizado trabajos recientes en otras especies utilizando injertos de plántulas. Los ejemplos incluyen el injerto de soja y frijol común, tabaco a tomate y canola a Arabidopsis, y posteriormente muestreo de ambos tejidos para pequeños ARN13,14. Por lo tanto, un método de injerto que sea accesible para la mayoría de los laboratorios y que pueda adaptarse fácilmente a una amplia gama de especies de plantas sin ningún cambio importante en la técnica es altamente deseable.
Este protocolo detalla un método que emplea la producción interna de un dispositivo de injerto simple que permite la personalización completa del diámetro y la longitud del canal de injerto para acomodar cualquier morfología de plántula en la mayoría de las especies de plantas. La producción de estos dispositivos es muy asequible y altamente escalable, ya que los únicos componentes necesarios son elastómero de silicona, cableado o tubería del tamaño correcto, una cuchilla de alta precisión y un contenedor para servir como molde. Siguiendo el protocolo de injerto detallado aquí, los usuarios pueden lograr tasas de injerto exitosas del 45% (n = 105), comparables con los resultados de injerto informados anteriormente10,12.
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Protocol
1. Preparación del dispositivo
- Haga el dispositivo de injerto de silicona fundiendo una solución de elastómero de silicona en una placa de Petri cuadrada (100 mm x 100 mm). Prepare 15 ml de la solución de elastómero, siguiendo las instrucciones del fabricante.
NOTA: Los kits de elastómero de silicona generalmente incluyen un líquido a base de silicona y un agente de curado, que cuando se mezclan permiten que la silicona se solidifique. - Prepare la placa de Petri cuadrada colocando cuatro piezas rectas de alambre de 29 G en la placa de Petri cuadrada, equidistantes entre sí (Figura 1A). Asegúrese de que el cable quede al ras con la parte inferior del molde. Para enderezar completamente el alambre, enróllelo sobre una superficie dura y uniforme con un objeto pesado y plano (p. ej., una rejilla para tubos de metal).
NOTA: Las bridas giratorias a menudo contienen alambre de 29 G y se pueden usar después de quitar el recubrimiento exterior de papel con acetona. - Vierta la solución de elastómero de silicona mixta sobre los cables y cubra con la parte superior de la placa de Petri. Deje que la silicona se cure durante 24-48 h a temperatura ambiente.
- Retire la lámina de silicona de la placa de Petri con pinzas limpias y muévala a una superficie plana y limpia.
- Retire los cables de la lámina de silicona. Retire la capa delgada de silicona que queda en el exterior del canal con pinzas de punto fino, para permitir que el canal se abra por un lado (Figura 1A).
- Corte la lámina de silicona perpendicularmente a los canales en tiras de 3 mm con tijeras limpias. Mueva cada tira a un sobre de papel de aluminio y selle con cinta de autoclave.
- Esterilizar en autoclave las tiras a 121 °C durante al menos 30 min y conservar hasta que estén listas para su uso.
2. Preparación de plántulas
- Esterilizar y vernalizar las semillas.
- Suspender hasta 100 semillas de Arabidopsis en 1 ml de solución de lejía al 50% que contenga 0,1% de Tween 20 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e incubar durante 5-10 min. Retire la solución de lejía mediante pipeteo o aspiración en condiciones estériles. Enjuague las semillas con 1 ml de dH2O esterilizado. Asegúrese de invertir los tubos para enjuagar adecuadamente las semillas y eliminar cualquier solución de lejía que quede en la parte superior del tubo. Repita el enjuague 4x.
- Dejar aproximadamente 0,25 ml de agua en los tubos con las semillas y almacenar a 4 °C durante 3 días en la oscuridad.
- Coloque las semillas en preparación para el injerto.
- Prepare una placa MS de agar al 1% de la siguiente manera: para 1 L de MS (0.5% sacarosa) medio sólido, mezcle 4.4 g de sal MS, 5 g de sacarosa y 10 g de agar en 800 ml de agua, ajuste el pH a 5.7 con KOH y luego lleve el volumen total a 1 L con agua adicional. Autoclave durante al menos 20, min antes de verter ~ 25 ml en las placas de Petri cuadradas.
- En condiciones estériles, mueva el número apropiado de semillas preparadas al plato, utilizando una punta de pipeta de 20 μL para aspirar y transferir las semillas.
- Coloque una tira estéril en la superficie de la placa para guiar el posicionamiento de la semilla, de modo que las semillas estén alineadas con los canales de la tira. Retire la tira una vez que las semillas estén plateadas.
NOTA: Una placa cuadrada de 100 mm x 100 mm puede acomodar dos filas de plántulas (Figura 1B). - Una vez que las placas estén en pie, permita que el líquido se evapore del medio sólido y se acumule en el fondo de la placa. Después de colocar las semillas en el plato, coloque la tapa de la placa y selle un lado de la placa que esté paralelo a las dos filas de semillas (indicado por la región resaltada en azul en la Figura 1B) con parafilm. Envuelva cinta transpirable en la parte superior del parafilm y alrededor de todos los demás bordes de la placa.
- Levante con cuidado dos placas con el lado sellado con parafilm hacia abajo. Separe las dos placas en la parte inferior colocando un tubo centrífugo horizontal de 15 ml entre ellas y asegúrelas con una banda elástica. Asegúrese de que las superficies de la placa formen un ángulo de 100°-110° con la superficie de sobremesa (Figura 1C).
- Almacene las placas en esta orientación durante 72 h en total oscuridad a 21 °C, para permitir que los hipocótilos de las plántulas crezcan ~ 5 mm de longitud. Después de 72 h, retire las placas de la oscuridad y crezca bajo 16 h de luz (intensidad de 100 μE m-2 sec-1) y ciclos de oscuridad de 8 h durante 2-4 días más a la misma temperatura antes del injerto.
- Injertar las plántulas entre 5 y 7 días después de haber sido plateadas. Coloque una tira de injerto sobre las plántulas, encajando sus hipocótilos en los canales. Coloque suavemente la plántula de modo que la unión raíz-hipocótilo se coloque en la parte inferior de la tira de silicona para preparar la plántula para el corte (Figura 1D).
3. Procedimiento de injerto
- Prepare un ambiente de trabajo estéril desinfectando un endoscopio de disección con etanol al 70% y esterilizando en autoclave dos pares de pinzas de punta fina y un mango de bisturí. Realice todos los procedimientos de injerto en una campana estéril y con la ayuda de un endoscopio de disección según sea necesario. Realice la mayor parte del injerto con un aumento de 10.5x.
- Prepara los vástagos. Use una cuchilla de bisturí fresco para cortar el hipocótilo perpendicularmente para crear un corte limpio y recto. Empuje la cuchilla hacia adelante en lugar de presionar hacia abajo en la planta para evitar que la plántula sea empujada hacia el agar (Video 1).
- Retire el brote. Tenga cuidado de mantener hidratada la parte cortada del brote asegurando el contacto con la superficie del medio. Alternativamente, mueva el brote a un área de retención designada, como la parte superior de una placa de Petri llena de dH2O estéril, hasta que esté listo para su uso.
- Preparar los portainjertos. Tire suavemente de la raíz atrapando la raíz en el espacio que queda entre las pinzas cerradas y girándolas, dejando la sección cortada de los portainjertos en el medio de la tira (Video 2).
NOTA: La raíz frágil se dañará si se aplasta entre las pinzas cerradas directamente, lo que requiere encajar la raíz en el ángulo agudo de los extremos de la pinza para manipular el tejido. - Levante suavemente el brote deseado con las pinzas de punta fina e insértelo en la parte superior del canal.
NOTA: Es fundamental confirmar visualmente el contacto entre los vástagos y los portainjertos para obtener un injerto exitoso (Video 3). - Después de que se hayan hecho todos los injertos, envuelva las placas con parafilm y cinta transpirable y coloque las placas de la misma manera que antes, sin alterar las plántulas o las tiras de silicona. Mover con cuidado las placas a una cámara de crecimiento fijada a 26 °C con ciclos de luz/8 h de oscuridad.
- Evalúe las plántulas injertadas en condiciones estériles después de 7-10 días. Retire con cuidado la tira de silicona con pinzas pelando un lado, permitiendo que los canales liberen las plántulas. Retire cualquier raíz adventicia que crezca del vástago cortándolas del vástago con una hoja de bisturí fresco o aplastándolas con pinzas de punta fina. Evalúe visualmente si el portainjerto se ha unido firmemente al vástago para formar un injerto exitoso (Figura 2).
- Mueva los injertos exitosos al suelo de propagación de plántulas para que crezcan durante el tiempo que sea necesario. Cubra el suelo con plástico transparente durante unos días a medida que las plántulas se establezcan. Después de transferir las plantas al suelo, cultive bajo los ciclos de luz y oscuridad mencionados anteriormente a 21 ° C.
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Representative Results
Se probaron varios aspectos del diseño de la tira de injerto para identificar las condiciones óptimas de injerto que requerían la menor cantidad de habilidad técnica (Tabla 1). Todos los ensayos de injerto se completaron en medio MS de sacarosa al 0,5%, que se ha informado previamente como un medio de injerto ideal11,12.
El crecimiento óptimo de las plántulas no se puede lograr con la germinación en la tira
En la primera iteración de la tira de silicona, se hicieron canales cerrados dejando la capa delgada de silicona que permanece en la parte posterior de los canales de la tira después de que los cables se retiran de las láminas de silicona. En lugar de germinar las plántulas directamente en la placa y luego colocar la tira de injerto sobre los hipocótilos de las plántulas, las semillas germinaron directamente en la tira después de insertar las semillas en el canal lleno de una pequeña cantidad de medio MS. Usando esta técnica, la mitad de las plántulas se atascaron en los canales durante la germinación y no se alargaron. Incluyendo las plántulas no germinadas y las no alargadas, se lograron tasas de injerto exitosas del 25% (n = 16) (Tabla 1). Para abordar la falla de elongación observada, las semillas se orientaron de modo que los cotiledones y el radical del embrión apuntaran hacia abajo durante la germinación. Usando este método, el 75% de las semillas germinaron y se alargaron con éxito, lo que resultó en un ligero aumento en la eficiencia del injerto (33% de éxito, n = 12) (Tabla 1). Para aumentar el desarrollo exitoso de las plántulas, la capa delgada de silicona que cierra el canal se eliminó del lado medio de la tira de injerto para permitir el contacto entre la semilla y el medio de crecimiento (Figura 1A). Usando este método, el 85% de las plántulas germinaron y se alargaron con éxito, y el 31% (n = 16) fueron injertadas con éxito (Tabla 1). A pesar de aumentar significativamente la tasa de desarrollo adecuado de semillas en la tira, perder incluso un pequeño número de plántulas puede afectar significativamente el tamaño de la población experimental al realizar injertos recíprocos entre diferentes grupos experimentales. Por esta razón, se determinó que la germinación de plántulas directamente en la superficie media era ideal.
Mantener la tasa de supervivencia de las plántulas y minimizar el tiempo y los esfuerzos de procesamiento
Las plántulas se cultivaron primero para injertar en placas de MS (sacarosa al 1%), se transfirieron a una superficie sólida (como la tapa de una placa de Petri llena de agua) para cortar, luego se ensamblaron en una placa con la tira para injertar. Utilizando esta técnica, se observó una tasa de éxito del 50% (n = 8) (Tabla 1). Si bien este método obtuvo la mayor tasa de éxito, consumió mucho tiempo y esfuerzo, requiriendo 2,5 minutos para cada injerto, lo que limitaba el número de injertos que se podían ensamblar a la vez. Para reducir el tiempo y el esfuerzo requeridos, las plántulas se cultivaron verticalmente en la placa de injerto (0,5% de sacarosa) y luego se insertaron en la tira directamente antes del injerto, como se describe en este protocolo. Para probar aún más este método, se realizaron tres ensayos de diferentes tamaños. Los dos primeros ensayos tuvieron una tasa de éxito del 48% (n = 25 y 64) y el tercer ensayo tuvo una tasa de éxito del 25% (n = 16) (Tabla 1). En conjunto, estos ensayos indican una tasa de éxito del 45% (n = 105). Esta tasa de éxito es comparable al método que consume más tiempo y requiere aproximadamente 1 minuto por injerto para colocar la tira de injerto sobre las plántulas y completar el injerto (pasos del protocolo 3.2-3.5).
La tasa de éxito del injerto depende en gran medida de la calidad de la construcción de la tira de injerto. Mientras que los dos primeros ensayos tienen una tasa de éxito del 48%, el tercer ensayo tiene una tasa de éxito menor. La calidad hecha a mano de la tira de injerto resulta inherentemente en una ligera variabilidad entre los sitios de injerto. Si los cables utilizados para la construcción de tiras no son completamente rectos, entonces los canales en las tiras no estarán al ras con el fondo del molde y darán como resultado canales de profundidades ligeramente variables. En total, se realizan 25 tiras en cada fundición de tiras, lo que resulta en 100 sitios de injerto únicos (Tabla 2). Si bien el efecto de una ligera variación en los sitios de injerto se equilibra en los dos ensayos más grandes, en el ensayo más pequeño con tasas más bajas de éxito, parece que los sitios de injerto con más variación debido a los alambres ligeramente curvados pueden afectar negativamente la formación del injerto. Para minimizar este tipo de variación, se describe una técnica de enderezamiento de alambre en el paso 1.2 del protocolo.
Figura 1: Ilustración de los pasos de preparación del injerto . (A) Modelo del diseño del molde de tira de silicona. Este panel muestra el molde de placa cuadrada utilizado para fundir las tiras de silicona. Cuatro secciones de cables de 29 G de igual longitud se colocan en la parte inferior de la placa, y la mezcla de elastómero de silicona se vierte encima de ellos (arriba). Después de que la silicona se haya curado completamente, el cuadrado de silicona se retira de la placa y los cables se retiran para crear los canales de injerto. Una capa delgada de silicona permanece en la parte inferior de los canales después de retirar los cables (indicado por *). Esta capa debe eliminarse para dejar los canales abiertos en la parte inferior (abajo). El cuadrado se corta perpendicularmente a los canales de alambre en tiras de 3 mm, como se muestra en las líneas punteadas (arriba). (B) Posicionamiento de la semilla en la placa de injerto. Con la ayuda de una tira estéril, se colocan dos filas de semillas en la placa en línea con los canales de la tira. Después de colocar las semillas, esta tira debe retirarse para evitar cualquier obstáculo de germinación. Para preparar las placas MS para el crecimiento vertical, el parafilm debe envolverse a lo largo del borde inferior (lado de la raíz) de la placa, marcado aquí con resaltado azul. (C) Posición vertical de la placa para la germinación de semillas. Después del emplatado, las semillas se germinan verticalmente en placas en ángulo. Se coloca un tubo cónico de 15 ml en la base de dos placas para crear un ángulo ligeramente obtuso entre la superficie de la placa y la mesa de trabajo. El borde parafilmado (marcado con azul) de la placa está orientado hacia la superficie de la mesa de trabajo. Una banda elástica se envuelve alrededor de la parte superior de las dos placas para mantenerlas en su lugar. (D) Colocación de plántulas en la tira directamente antes del injerto. Se colocan tiras de injerto estériles en la parte superior de las plántulas con hipocótilos dentro de los canales de la tira. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen capturada en un endoscopio de disección que muestra un sitio de injerto curado. La flecha negra indica el sitio de unión del injerto, y las flechas rojas indican las raíces adventicias que se eliminaron durante el proceso de evaluación del injerto. Barra de escala = 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Demostración de injerto activo utilizando imágenes de plantas vivas. La colocación y el movimiento de la hoja de bisturí para crear un corte limpio. El hipocótilo de la plántula se corta directamente sobre la tira de injerto empujando la hoja de bisturí hacia adelante. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 2: Colocación del portainjerto cortado hipocótilo para injertar dentro de la tira. El portainjerto se tira suavemente usando pinzas para colocar el sitio de unión del injerto en el centro de la tira. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 3: Colocación del vástago y finalización del injerto. El vástago se reemplaza y se empuja dentro de la tira hasta que se conecta con el portainjerto. La alineación y el contacto adecuados se evalúan al ver que el hipocótilo responde cuando el vástago es empujado ligeramente. Haga clic aquí para descargar este video.
Tabla 1: Variables de ensayo de injerto y tasas de éxito. Esta tabla resume los resultados de los ensayos de injerto utilizados para determinar el protocolo de injerto óptimo para las tasas más altas de éxito. Las variables examinadas en estos ensayos incluyen las condiciones de germinación de las plántulas, la construcción de tiras de silicona y cuándo se insertaron las plántulas en los canales de la tira de silicona durante el injerto. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: El número de sitios de injerto que se pueden generar a partir de una botella de 250 ml de elastómero de silicona. El precio de cada unidad de producción también se muestra aquí (en el momento de la publicación), y se puede ajustar fácilmente a las fluctuaciones en el valor de mercado de los reactivos de elastómero de silicona. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Resumen y significado
La formación de una unión de injerto es crucial para el injerto exitoso, que requiere un contacto directo y sin interrupciones entre el portainjerto y el vástago. El tamaño en miniatura y la fragilidad de las plántulas de plantas pequeñas como Arabidopsis hacen que sea técnicamente difícil cumplir con este requisito. Una técnica desarrollada en los primeros métodos de injerto de plántulas de Arabidopsis fue insertar tanto el vástago como el portainjerto en un collar corto de tubos de silicona para soportar la unión del injerto10. Si bien este método es altamente efectivo para proteger las dos partes del injerto de la separación, no es una tarea fácil insertar el frágil vástago y el portainjerto en un tubo de diámetro estrecho. Además, el engrosamiento en la unión del crecimiento a menudo dificulta la eliminación de los tubos de silicona de diámetro estrecho sin dañar las plántulas injertadas. Otros métodos utilizaron técnicas alternativas para evitar el uso de un collar de injerto y evitar que las plántulas se muevan durante el crecimiento, incluida la eliminación de ambos cotiledones de los vástagos y el cultivo de plántulas injertadas en una superficie oblicua 9,11. Si bien estos métodos requieren pocos recursos para completarse, cuando se probaron, estos métodos dieron lugar a altos niveles de migración de vástagos lejos del portainjerto, lo que resultó en un éxito de injerto menor que el informado (80% en promedio para las condiciones recomendadas en ambos estudios) utilizando estas técnicas. Además, ambos requieren que el usuario alinee la interfaz entre las partes de las plántulas de injerto sin ninguna ayuda, una tarea que requiere un alto nivel de habilidad. Un chip de microinjerto diseñado específicamente para el injerto de plántulas de Arabidopsis ha sido reportado recientemente12. Cada chip contiene cuatro microcámaras para permitir que crezcan cuatro plántulas, con el diseño especial del espacio de la cámara que permite que el hipocótilo crezca dentro de un microcanal. Los portainjertos se generan in situ en el chip, y los vástagos se insertan en los microcanales. Esto elimina la necesidad de manejar tanto portainjertos como vástagos para el injerto, y el microcanal confina el injerto en su lugar sin sacrificar la facilidad de quitar las plántulas una vez que se forma la unión del injerto. Si bien este nuevo método reduce en gran medida la barrera técnica del injerto de plántulas, la fabricación del chip de microinjerto requiere sistemas microelectromecánicos (MEMS), una tecnología que no es fácilmente accesible para la mayoría de los laboratorios de biología. Las dimensiones de la microcámara en el chip de microinjerto se optimizaron para Arabidopsis Col-012. Esto evita el uso de los chips para otras especies o diferentes accesiones/mutantes de Arabidopsis que tienen hipocótilos que varían en altura o grosor15,16,17.
El método de bajo costo, flexible y fácil de seguir descrito aquí se inspiró en el trabajo previo de chips de microinjerto para facilitar el injerto de plántulas jóvenes. En este método, la manipulación de plántulas delicadas es mínima, lo que facilita el uso para nuevos usuarios. Los canales en las tiras ayudan a los nuevos usuarios a alinear las plántulas injertadas y mantienen la raíz y el brote en buen contacto durante la formación del sitio del injerto, al tiempo que garantizan una fácil extracción después de que se haya formado el injerto. Debido a la producción de alto rendimiento de las tiras de silicona y al costo relativamente bajo de los materiales de partida, se puede lograr el injerto de grandes cantidades de plántulas a una fracción del costo de los chips de microinjerto. Se estima que este dispositivo casero cuesta $ 0.12 por sitio de injerto, lo que lo convierte en una opción económica para los laboratorios que trabajan con una variedad de especies de plantas o fenotipos de plántulas (Tabla 2). Si bien el aspecto hecho a mano de las tiras de injerto disminuye los costos asociados con este método, también introduce la posibilidad de variabilidad entre diferentes tiras. Como se enfatizó anteriormente, la calidad de las tiras de injerto es clave para el éxito de este método. El aumento en el uso del injerto de plántulas en etapa temprana en genética molecular ha dado al campo de la genética vegetal una herramienta poderosa para estudiar la señalización a larga distancia en las plantas. Este método simple, de bajo costo y de fácil acceso proporcionará otra herramienta para ayudar a facilitar la adopción exitosa de la técnica de injerto de plántulas por parte de laboratorios con una capacitación y experiencia previas mínimas.
Consideraciones críticas
Procesos como iniciar una respuesta de reparación de heridas, establecer la comunicación de célula a célula entre el vástago y el portainjerto y, en última instancia, la formación de vasculatura, son necesarios para la formación de un injerto exitoso9. Durante el proceso de injerto, es importante mantener las plántulas hidratadas y sin daños más allá de la necesidad. Usando este método, los extremos cortados de las raíces y los vástagos deben estar limpios y perpendiculares para garantizar una conexión al ras entre el vástago y el portainjerto. Si el sitio del injerto se daña durante el corte, o las piezas del injerto no se cortan en el mismo ángulo, es poco probable que el injerto tenga éxito debido a la falta de contacto cercano entre las capas celulares a través de la unión del injerto. Si alguna de las partes del injerto de la planta se deja secar o se daña, los procesos mencionados anteriormente se inhibirán y el injerto no tendrá éxito. Las plántulas jóvenes son frágiles y fácilmente aplastadas por fórceps. Si los usuarios lo consideran necesario, los fórceps se pueden usar para sujetar uno de los dos cotiledones para maniobrar el vástago. En comparación con el método de chip de injerto previamente informado, aumenta la posibilidad de dañar el portainjerto mientras se tira del hipocótilo hacia abajo en la tira de silicona. Las técnicas de manipulación para minimizar este riesgo se describen en el paso 3.4 del protocolo.
Un total de cuatro sitios de injerto por tira es el número recomendado de posiciones para garantizar que las plántulas no se toquen entre sí durante la etapa de formación de la unión del injerto. Para ampliar el número total de injertos realizados a la vez, se recomienda que los usuarios aumenten el número de placas utilizadas, en lugar de disminuir la cantidad de espacio utilizado por injerto.
La modificación del protocolo es posible para acomodar el crecimiento de hipocótilo divergente o especies no Arabidopsis
Algunos mutantes etiolan a diferentes ritmos a las plantas de tipo salvaje. Las fitohormonas como las giberelinas, los brasinoesteroides, el etileno y la auxina desempeñan un papel importante en la regulación del crecimiento de las plántulas18,19,20. Las líneas mutantes defectuosas en estas vías hormonales pueden experimentar tasas de etiolaciónatípicas 16,17. El diseño controlado por el usuario de la tira de injerto permite acomodar estas diferencias fenotípicas, pero se requieren pruebas suficientes en estos casos. Si se utiliza una línea genética que experimenta etiolación a tasas significativamente diferentes de las del tipo salvaje, los usuarios deben determinar si el período de etiolación de 3 días descrito aquí es apropiado para sus líneas antes de comenzar. Las plántulas inadecuadamente etioladas resultarán en un injerto difícil debido a un hipocótilo acortado o excesivamente extendido (y más delgado). Los usuarios interesados en injertar plántulas de especies distintas de Arabidopsipueden adaptar este protocolo para satisfacer sus necesidades cambiando el diámetro del canal de injerto. Las plántulas de tomate y tabaco cultivadas hasta la edad adecuada de injerto parecen requerir canales de injerto de 0,8 y 0,4 mm de diámetro, respectivamente9.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Gracias a Javier Brumos por la formación inicial y la orientación en el injerto de plántulas de Arabidopsis .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
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