Summary
Bu protokol, önceden deneyim veya eğitim gerektirmeyen ve çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında kolayca erişilebilen malzemeler kullanılarak çok düşük bir maliyetle yürütülebilen sağlam bir fide aşılama yöntemini açıklamaktadır.
Abstract
Erken evre fide aşılama, bitkilerdeki kök-sürgün ilişkilerini incelemek için moleküler genetikte popüler bir araç haline gelmiştir. Küçük model bitki Arabidopsis thaliana'nın erken aşamadaki fidelerinin aşılanması, fidelerinin büyüklüğü ve kırılganlığı nedeniyle teknik olarak zor ve zaman alıcıdır. Yayınlanmış yöntemlerin giderek artan bir koleksiyonu, bu tekniği değişen başarı oranları, zorluk ve ilişkili maliyetlerle tanımlamaktadır. Bu makalede, silikon elastomer karışımı kullanılarak şirket içi yeniden kullanılabilir bir aşılama cihazı yapmak için basit bir prosedür ve bu cihazın fide aşılama için nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bu yayın sırasında, her bir yeniden kullanılabilir aşılama cihazı, üretilecek sarf malzemesinde sadece 0,47 $ 'a mal oluyor. Bu yöntemi kullanarak, yeni başlayanlar ilk başarılı aşılanmış fidelerini baştan sona 3 haftadan daha kısa bir sürede alabilirler. Bu son derece erişilebilir prosedür, bitki moleküler genetik laboratuvarlarının fide aşılamasını deneysel süreçlerinin normal bir parçası olarak kurmalarına izin verecektir. Kullanıcıların bu aşılama cihazlarının oluşturulmasında ve tasarımında sahip oldukları tam kontrol nedeniyle, bu teknik istenirse domates veya tütün gibi daha büyük bitkilerde kullanım için kolayca ayarlanabilir.
Introduction
Aşılama, MÖ 500 yılına kadar yerleşik bir tarım uygulaması haline gelen eski bir bahçecilik tekniğidir1. Verimi artırmak için farklı bitki çeşitlerini aşılamak, bu tekniğin ilk kullanımıydı ve bugün bu amaçla kullanılmaya devam ediyor. Son on yılda, aşılama, moleküler biyologların bitkilerde uzun mesafeli sinyalleşmeyi incelemeleri için bir araç olarak giderek artan miktarda dikkat çekmiştir 2,3,4,5. Yetişkin bitkileri aşılamak nispeten kolay olsa da, çimlenmeden hemen sonra bitkileri aşılamak zordur. Buna rağmen, bazen bitki gelişimi, çevresel tepkiler veçiçeklenme 6,7,8 gibi süreçlerde uzun mesafeli sinyalizasyonun etkilerini değerlendirmek gerekir.
Arabidopsis thaliana, nispeten küçük boyutu da dahil olmak üzere birçok nedenden dolayı bitki biyolojisinde model organizma olarak kurulmuştur ve bu da bir laboratuarda büyümesini kolaylaştırmaktadır. Bununla birlikte, Arabidopsis fidelerinin küçük boyutu ve kırılganlığı, genç fidelerin aşılanmasını çok zorlaştırır. Çoğu durumda, fide greftlerini başarılı bir şekilde elde etmek için kapsamlı uygulamalı eğitim gereklidir. Yıllar geçtikçe, fide aşılamanın başarı oranını artırmak için ideal yetiştirme koşullarını ve yeni teknikleri belirleyen birçok metodolojik gelişme olmuştur 9,10,11. Tanıtılan en son araç, deneyimsiz kullanıcıların bile kabul edilebilir aşılama başarısı seviyelerine ulaşmalarını sağlayan bir Arabidopsis fide aşılama çipiydi12. Bu ilerleme, fide aşılamasının teknik bariyerini önemli ölçüde azaltmış olsa da, çip cihazı pahalıdır ve paralel olarak yapılabilecek greft sayısı hızla maliyet engelleyici hale gelir.
Ek olarak, bu cihaz sadece yabani tip fidelere benzer hipokotil boyutlarına sahip Arabidopsis fideleri için kullanılabilir. Arabidopsis, bitki moleküler genetiği dünyasında kilit taşı türü olsa da, son zamanlarda fide aşılaması kullanılarak diğer türlerde de çalışmalar yapılmıştır. Örnekler arasında soya fasulyesi ve ortak fasulye, tütünden domatese ve kanoladan Arabidopsis'e aşılama ve daha sonra her iki dokunun da küçük RNA'lar için örneklenmesisayılabilir 13,14. Bu nedenle, çoğu laboratuvar tarafından erişilebilen ve herhangi bir büyük teknik değişiklik yapmadan çok çeşitli bitki türlerine kolayca uyarlanabilen bir aşılama yöntemi oldukça arzu edilir.
Bu protokol, çoğu bitki türünde herhangi bir fide morfolojisini barındırmak için aşılama kanalı çapının ve uzunluğunun tamamen özelleştirilmesine izin veren basit bir aşılama cihazının şirket içi üretimini kullanan bir yöntemi detaylandırır. Bu cihazların üretimi çok uygun fiyatlı ve oldukça ölçeklenebilirdir, çünkü ihtiyaç duyulan tek bileşenler silikon elastomer, doğru boyutta kablolama veya boru, yüksek hassasiyetli bir bıçak ve kalıp görevi görecek bir kaptır. Burada detaylandırılan aşılama protokolünü takiben, kullanıcılar daha önce bildirilen aşılama sonuçları 10,12 ile karşılaştırılabilir olan% 45'lik (n =105) başarılı aşılama oranları elde edebilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cihaz hazırlama
- Silikon elastomer çözeltisini kare bir Petri kabına (100 mm x 100 mm) dökerek silikon aşılama cihazını yapın. Üreticinin yönergelerini izleyerek 15 mL elastomer çözeltisi hazırlayın.
NOT: Silikon elastomer kitleri tipik olarak silikon bazlı bir sıvı ve birlikte karıştırıldığında silikonun katılaşmasına izin veren bir kürleme maddesi içerir. - Kare Petri kabını, birbirinden eşit uzaklıkta dört düz 29 G tel parçası yerleştirerek hazırlayın (Şekil 1A). Telin kalıbın tabanıyla aynı hizada durduğundan emin olun. Teli tamamen düzleştirmek için, ağır ve düz bir nesneyle (örneğin, metal bir boru rafı) sert ve düzgün bir yüzeye yuvarlayın.
NOT: Bükümlü bağlar genellikle 29 G tel içerir ve dış kağıt kaplamasını asetonla çıkardıktan sonra kullanılabilir. - Karışık silikon elastomer çözeltisini tellerin üzerine dökün ve Petri kabının üstü ile örtün. Silikonun oda sıcaklığında 24-48 saat kürlenmesine izin verin.
- Silikon tabakayı Petri kabından temiz forseps kullanarak çıkarın ve temiz düz bir yüzeye taşıyın.
- Telleri silikon tabakadan çıkarın. Kanalın bir tarafında açık olmasını sağlamak için kanalın dışında kalan ince silikon tabakasını ince nokta forsepsleri ile çıkarın (Şekil 1A).
- Silikon levhayı kanallara dik olarak temiz makas kullanarak 3 mm'lik şeritler halinde kesin. Her şeridi alüminyum bir folyo zarfa taşıyın ve otoklav bantla kapatın.
- Şeritleri 121 °C'de en az 30 dakika otoklavlayın ve kullanıma hazır olana kadar saklayın.
2. Fide hazırlama
- Tohumları sterilize edin ve ververalize edin.
- 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde% 0.1 Tween 20 içeren 1 mL% 50 ağartıcı çözeltisinde 100'e kadar Arabidopsis tohumunu askıya alın ve 5-10 dakika inkübe edin. Ağartıcı çözeltisini steril koşullar altında pipetleme veya aspirasyon yoluyla çıkarın. Tohumları 1 mL sterilize dH2O ile durulayın. tohumları yeterince durulamak ve tüpün üstünde kalan ağartıcı çözeltisini çıkarmak için tüpleri ters çevirdiğinizden emin olun. Durulamayı 4 kat tekrarlayın.
- Tohumlarla birlikte tüplerde yaklaşık 0.25 mL su bırakın ve karanlıkta 3 gün boyunca 4 ° C'de saklayın.
- Aşılamaya hazırlık olarak tohumları plakalayın.
- Aşağıdaki gibi% 1'lik bir agar MS plakası hazırlayın: 1 L MS (% 0.5 sakaroz) katı ortam için, 800 mL suda 4.4 g MS tuzu, 5 g sakkaroz ve 10 g agar karıştırın, pH'ı KOH ile 5.7'ye ayarlayın ve ardından toplam hacmi ilave su ile 1 L'ye getirin. Kare Petri kaplarına ~ 25 mL dökmeden önce en az 20 dakika otoklavlayın.
- Steril koşullar altında, tohumları aspire etmek ve aktarmak için 20 μL'lik bir pipet ucu kullanarak uygun sayıda hazırlanmış tohumu plakaya taşıyın.
- Tohum konumlandırmasını yönlendirmek için plaka yüzeyine steril bir şerit yerleştirin, böylece tohumlar şerit üzerindeki kanallarla hizalanır. Tohumlar kaplandıktan sonra şeridi çıkarın.
NOT: Bir adet 100 mm x 100 mm kare plaka iki sıra fide barındırabilir (Şekil 1B). - Plakalar ayağa kalktıktan sonra, sıvının katı ortamdan buharlaşmasına ve plakanın dibinde birikmesine izin verin. Tohumlar plakaya yerleştirildikten sonra, plaka kapağına koyun ve plakanın iki tohum sırasına paralel olan bir tarafını ( Şekil 1B'de mavi renkte vurgulanan bölge ile gösterilir) parafilm ile kapatın. Nefes alabilen bandı parafilmin üstüne ve plakanın diğer tüm kenarlarına sarın.
- Parafilm sızdırmaz tarafı aşağı bakacak şekilde iki plakayı dikkatlice ayağa kaldırın. İki plakayı, aralarına yatay 15 mL'lik bir santrifüj tüpü yerleştirerek alttan ayırın ve lastik bir bantla sabitleyin. Plaka yüzeylerinin tezgah üstü yüzeyle 100°-110° açı oluşturduğundan emin olun (Şekil 1C).
- Fide hipokotillerinin ~ 5 mm uzunluğunda büyümesine izin vermek için plakaları bu yönde 72 saat boyunca 21 ° C'de tamamen karanlıkta saklayın. 72 saat sonra, plakaları karanlıktan çıkarın ve aşılamadan önce aynı sıcaklıkta 2-4 gün daha 16 saat ışık (100 μE m-2 sn-1 yoğunluğu) ve 8 saat karanlık döngü altında büyüyün.
- Fideleri kaplandıktan sonra 5 ila 7 gün arasında aşılayın. Fidelerin üzerine, hipokotillerini kanallara yerleştirerek bir aşılama şeridi yerleştirin. Fideyi yavaşça konumlandırın, böylece kök-hipokotil bağlantısı, fideyi kesmeye hazırlamak için silikon şeridin altına yerleştirilir (Şekil 1D).
3. Aşılama prosedürü
- Bir diseksiyon kapsamını %70 etanol ile sterilize ederek ve iki çift ince uçlu forseps ve bir neşter sapını otoklavlayarak steril bir çalışma ortamı hazırlayın. Tüm aşılama prosedürlerini steril bir başlıkta ve gerektiğinde bir diseksiyon kapsamı yardımıyla gerçekleştirin. Aşılamanın çoğunu 10,5x büyütme kullanarak gerçekleştirin.
- Scion'ları hazırlayın. Düz ve temiz bir kesim oluşturmak için hipokotili dik olarak kesmek için taze bir neşter bıçağı kullanın. Fidenin agar içine itilmesini önlemek için bıçağı bitkiye bastırmak yerine ileri doğru itin (Video 1).
- Çekimi çıkarın. Medya yüzeyi ile teması sağlayarak sürgünün kesilmiş kısmını nemli tutmaya özen gösterin. Alternatif olarak, çekimi kullanıma hazır olana kadar steril dH2O ile doldurulmuş bir Petri kabının üstü gibi belirlenmiş bir tutma alanına taşıyın.
- Anaçları hazırlayın. Kökü kapalı forsepsler arasında kalan boşlukta yakalayıp çevirerek kökü yavaşça çekin ve anaçların kesilmiş kısmını şeridin ortasında bırakın (Video 2).
NOT: Kırılgan kök, kapalı forsepsler arasında doğrudan ezilirse zarar görür ve dokuyu manipüle etmek için kökün cımbız uçlarının keskin açısında kıvrılmasını gerektirir. - İnce uçlu forsepsleri kullanarak istediğiniz çekimi yavaşça alın ve kanalın üst kısmına yerleştirin.
NOT: Başarılı bir greft elde etmek için scionlar ve anaçlar arasındaki teması görsel olarak doğrulamak çok önemlidir (Video 3). - Tüm greftler yapıldıktan sonra, plakaları parafilm ve nefes alabilen bantla sarın ve fideleri veya silikon şeritleri rahatsız etmeden plakaları daha önce olduğu gibi ayarlayın. Plakaları dikkatlice 16 saat ışık/8 saat karanlık döngü ile 26 ° C'de ayarlanmış bir büyüme odasına taşıyın.
- Aşılı fideleri 7-10 gün sonra steril koşullarda değerlendirin. Silikon şeridi forseps kullanarak bir tarafını soyarak dikkatlice çıkarın ve kanalların fideleri serbest bırakmasına izin verin. Filizden büyüyen maceracı kökleri, taze bir neşter bıçağı ile filizden keserek veya ince uçlu forseps kullanarak ezerek çıkarın. Başarılı bir greft oluşturmak için anaçların filize sıkıca yapışıp bağlanmadığını görsel olarak değerlendirin (Şekil 2).
- Başarılı greftleri, gerektiği kadar büyümek için fide çoğaltma toprağına taşıyın. Fideler kuruldukça toprağı birkaç gün şeffaf plastikle örtün. Bitkileri toprağa aktardıktan sonra, daha önce bahsedilen açık ve karanlık döngüler altında 21 ° C'de büyüyün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aşılama şeridinin tasarımının çeşitli yönleri, en az miktarda teknik beceri gerektiren optimal aşılama koşullarını belirlemek için test edilmiştir (Tablo 1). Tüm greftleme çalışmaları, daha önce ideal bir aşılama ortamı olduğu bildirilen %0,5 sakkaroz MS besiyeri üzerinde tamamlandı11,12.
Şerit üzerinde çimlenme ile optimum fide büyümesi sağlanamaz
Silikon şeridin ilk yinelemesinde, teller silikon tabakalardan çıkarıldıktan sonra şerit kanallarının arkasında kalan ince silikon tabakası bırakılarak kapalı kanallar yapılmıştır. Fideleri doğrudan plaka üzerinde çimlendirmek ve daha sonra aşılama şeridini fide hipokotillerinin üzerine yerleştirmek yerine, tohumlar az miktarda MS ortamı ile doldurulmuş kanala yerleştirildikten sonra tohumlar doğrudan şerit üzerinde çimlenmiştir. Bu tekniği kullanarak, fidelerin yarısı çimlenme sırasında kanallara sıkışıyor ve uzamıyordu. Çimlenmemiş ve uzamamış fideler de dahil olmak üzere %25 (n=16) oranında başarılı aşılama oranları elde edilmiştir (Tablo 1). Gözlemlenen uzama başarısızlığını ele almak için, tohumlar yönlendirildi, böylece embriyonun kotiledonları ve radikalleri çimlenme sırasında aşağı doğru işaret ediyordu. Bu yöntem kullanılarak, tohumların %75'i başarılı bir şekilde çimlenmiş ve uzamış, bu da aşılama verimliliğinde hafif bir artışa neden olmuştur (%33 başarı, n=12) (Tablo 1). Başarılı fide gelişimini arttırmak için, kanalı kapatan ince silikon tabakası, tohum ile büyüme ortamı arasında temasa izin vermek için aşılama şeridinin orta tarafından çıkarıldı (Şekil 1A). Bu yöntem kullanılarak fidelerin %85'i başarıyla çimlenmiş ve uzamış, %31'i (n=16) başarıyla aşılanmıştır (Tablo 1). Şerit üzerinde uygun tohum gelişim oranını önemli ölçüde artırmasına rağmen, az sayıda fide kaybetmek bile, farklı deney grupları arasında karşılıklı greftler gerçekleştirirken deneysel popülasyon boyutunu önemli ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, fidelerin doğrudan orta yüzeyde çimlenmesinin ideal olduğu belirlenmiştir.
Fide hayatta kalma oranını korumak ve işleme süresini ve çabalarını en aza indirmek
Fideler ilk önce MS plakalarına (% 1 sakaroz) aşılama için yetiştirildi, kesmek için katı bir yüzeye (suyla dolu bir Petri kabının kapağı gibi) aktarıldı, daha sonra aşılama için şeritli bir plakaya monte edildi. Bu teknik kullanılarak %50 başarı oranı (n=8) gözlenmiştir (Tablo 1). Bu yöntem en yüksek başarı oranını elde ederken, zaman alıcı ve çaba yoğundu, her greft için 2.5 dakika gerektiriyordu ve bir kerede monte edilebilecek greft sayısını sınırlıyordu. Gerekli zaman ve çabayı azaltmak için, fideler aşılama plakasına dikey olarak ekildi (% 0.5 sakaroz) ve daha sonra bu protokolde açıklandığı gibi aşılamadan hemen önce şeride yerleştirildi. Bu yöntemi daha fazla test etmek için, farklı boyutlarda üç çalışma yapılmıştır. İlk iki çalışmanın her ikisinin de başarı oranı %48 (n=25 ve 64), üçüncü çalışmanın başarı oranı ise %25 (n=16) idi (Tablo 1). Birlikte, bu çalışmalar %45'lik bir başarı oranına işaret etmektedir (n=105). Bu başarı oranı, daha fazla zaman alan yöntemle karşılaştırılabilir ve aşılama şeridini fidelerin üzerine yerleştirmek ve aşılamayı tamamlamak için greft başına yaklaşık 1 dakika gerektirir (protokol adımları 3.2-3.5).
Aşılama başarısının oranı, aşılama şeridi yapısının kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. İlk iki çalışmanın başarı oranı %48 iken, üçüncü çalışmanın başarı oranı daha düşüktür. Aşılama şeridinin el yapımı kalitesi, doğal olarak aşılama bölgeleri arasında hafif değişkenliğe neden olur. Şerit yapımı için kullanılan teller tamamen düz değilse, şeritlerdeki kanallar kalıbın tabanı ile aynı hizada olmayacak ve hafif değişken derinliklerde kanallara neden olacaktır. Toplamda, her şerit dökümünde 25 şerit yapılır ve bu da 100 benzersiz aşılama bölgesi ile sonuçlanır (Tablo 2). Aşılama bölgelerindeki hafif varyasyonun etkisi iki büyük çalışmada dengelenirken, daha düşük başarı oranlarına sahip daha küçük çalışmalarda, hafif kıvrımlı teller nedeniyle daha fazla varyasyona sahip aşılama bölgelerinin greft oluşumunu olumsuz yönde etkileyebileceği görülmektedir. Bu tür bir varyasyonu en aza indirmek için, protokol adım 1.2'de bir tel düzleştirme tekniği açıklanmaktadır.
Şekil 1: Aşılama hazırlama adımlarının gösterimi . (A) Silikon şerit kalıp tasarımının modeli. Bu panel, silikon şeritlerin dökümü için kullanılan kare plaka kalıbını göstermektedir. Plakanın altına eşit uzunlukta 29 G telin dört bölümü serilir ve bunların üzerine silikon elastomer karışımı dökülür (yukarıda). Silikon tamamen kürlendikten sonra, silikon kare plakadan çıkarılır ve aşılama kanallarını oluşturmak için teller çıkarılır. Teller çıkarıldıktan sonra kanalların dibinde ince bir silikon tabakası kalır (* ile gösterilir). Kanalları altta (aşağıda) açık bırakmak için bu katman çıkarılmalıdır. Kare daha sonra noktalı çizgilerle (yukarıda) gösterildiği gibi tel kanallarına dik olarak 3 mm'lik şeritler halinde kesilir. (B) Aşılama plakası üzerinde tohum konumlandırma. Steril bir şerit yardımı kullanılarak, plaka üzerine şerit kanallarına uygun olarak iki sıra tohum yerleştirilir. Tohumları yerleştirdikten sonra, herhangi bir çimlenme engelini önlemek için bu şerit çıkarılmalıdır. MS plakalarını dikey büyümeye hazırlamak için, parafilm plakanın alt (kök tarafı) kenarı boyunca sarılmalı, burada mavi vurgulama ile işaretlenmelidir. (C) Tohum çimlenmesi için dikey plaka konumu. Kaplamadan sonra, tohumlar açılı plakalar üzerinde dikey olarak çimlenir. Plaka yüzeyi ile tezgah üstü arasında biraz geniş bir açı oluşturmak için iki plakanın tabanına 15 mL'lik bir konik tüp yerleştirilir. Plakanın parafilme alınmış kenarı (mavi ile işaretlenmiş) tezgah üstü yüzeye doğru yönlendirilir. Yerinde tutmak için iki plakanın üst kısmına bir lastik bant sarılır. (D) Fidenin aşılamadan hemen önce şerit içine konumlandırılması. Steril aşılama şeritleri, şerit kanallarının içinde hipokotiller bulunan fidelerin üzerine yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İyileşmiş bir aşılama bölgesini gösteren bir diseksiyon kapsamı üzerinde yakalanan görüntü. Siyah ok, greft birleşim bölgesini gösterir ve kırmızı oklar, greft değerlendirme işlemi sırasında çıkarılan maceracı kökleri gösterir. Ölçek çubuğu = 0,5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Canlı bitki görüntülemesi kullanılarak aktif aşılamanın gösterilmesi. Temiz bir kesim oluşturmak için neşter bıçağının yerleştirilmesi ve hareketi. Fide hipokotil, neşter bıçağını öne doğru iterek doğrudan aşılama şeridinin üzerinde kesilir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 2: Şerit içinde aşılama için kesilmiş anaç hipokotilin konumlandırılması. Anaç, greft bağlantı bölgesini şeridin ortasına yerleştirmek için forseps kullanılarak yavaşça çekilir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Video 3: Filizin yerleştirilmesi ve greftin tamamlanması. Filiz değiştirilir ve anaç ile bağlanana kadar şeridin içine itilir. Doğru hizalama ve temas, filiz hafifçe itildiğinde hipokotilin tepki verdiğini görerek değerlendirilir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Aşılama çalışması değişkenleri ve başarı oranları. Bu tabloda, en yüksek başarı oranları için optimal aşılama protokolünü belirlemek için kullanılan aşılama çalışmalarının sonuçları özetlenmektedir. Bu çalışmalarda incelenen değişkenler arasında fide çimlenme koşulları, silikon şerit yapımı ve fidelerin aşılama sırasında silikon şerit kanallarına ne zaman yerleştirildiği yer almaktadır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: 250 mL'lik bir şişe silikon elastomerden üretilebilecek aşılama bölgelerinin sayısı. Her üretim biriminin fiyatı da burada (yayın sırasında) gösterilmiştir ve silikon elastomer reaktiflerinin piyasa değerindeki dalgalanmalar üzerine kolayca ayarlanabilir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Özet ve önem
Greft birliğinin oluşması, anaç ve filiz arasında doğrudan ve kesintisiz temas gerektiren başarılı aşılama için çok önemlidir. Arabidopsis gibi küçük bitkilerin fidelerinin minyatür boyutu ve kırılganlığı, bu gereksinimi karşılamayı teknik olarak zorlaştırmaktadır. Erken Arabidopsis fide aşılama yöntemlerinde geliştirilen bir teknik, greft bileşkesi10'u desteklemek için hem filiz hem de anacı kısa bir silikon boru tasmasına yerleştirmekti. Bu yöntem, iki greft parçasını ayrılmaya karşı korumada oldukça etkili olsa da, kırılgan filizi ve anaacı dar delikli bir tüpe yerleştirmek kolay bir iş değildir. Dahası, birleşme noktasındaki büyümeden kaynaklanan kalınlaşma genellikle aşılanmış fidelere zarar vermeden dar delikli silikon tüplerin çıkarılmasını zorlaştırır. Diğer yöntemler, fidelerin büyüme sırasında hareket etmesini önlerken, her iki kotiledonun da scion'lardan çıkarılması ve eğik bir yüzeyde aşılanmış fidelerin yetiştirilmesi de dahil olmak üzere bir aşılama tasmasının kullanılmasını önlemek için alternatif teknikler kullanmıştır 9,11. Bu yöntemlerin tamamlanması için çok az kaynak gerekmesine rağmen, denendiğinde, bu yöntemler anaçtan uzakta yüksek düzeyde scion göçü ile sonuçlanmış ve bu teknikleri kullanarak rapor edilenden daha düşük aşılama başarısı (her iki çalışmada da önerilen koşullar için ortalama% 80) ile sonuçlanmıştır. Ek olarak, her ikisi de kullanıcının greft fidesi parçaları arasındaki arayüzü herhangi bir yardım olmadan hizalamasını gerektirir, bu da yüksek düzeyde beceri gerektiren bir görevdir. Arabidopsis fide aşılaması için özel olarak tasarlanmış bir mikrogreftleme çipi yakın zamanda bildirilmiştir12. Her çip, dört fidenin büyümesine izin vermek için dört mikro oda içerir ve oda boşluğunun özel tasarımı, hipokotilin bir mikro kanal içinde büyümesini sağlar. Anaçlar çip üzerinde yerinde üretilir ve scionlar mikro kanallara yerleştirilir. Bu, aşılama için hem anaçların hem de scionların işlenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır ve mikro kanal, greft birliği oluştuktan sonra fidelerin çıkarılmasının kolaylığından ödün vermeden aşılamayı yerinde sınırlar. Bu yeni yöntem, fide aşılamanın teknik engelini büyük ölçüde azaltırken, mikrogreftleme çipinin üretimi, çoğu biyoloji laboratuvarı tarafından kolayca erişilemeyen bir teknoloji olan Mikro-Elektro Mekanik Sistemler (MEMS) gerektirir. Mikrogreftleme çipi üzerindeki mikro odanın boyutları Arabidopsis Col-012 için optimize edilmiştir. Bu, çiplerin diğer türler veya yükseklik veya kalınlık15,16,17 değişen hipokotillere sahip farklı Arabidopsis katılımları / mutantları için kullanılmasını önler.
Burada açıklanan düşük maliyetli, esnek ve takip edilmesi kolay yöntem, genç fide aşılamayı kolaylaştırmak için önceki mikrogreftleme çipi çalışmalarından esinlenmiştir. Bu yöntemde, hassas fidelerin manipülasyonu minimumdur ve yeni kullanıcılar için kullanımı kolaylaştırır. Şeritlerdeki kanallar, yeni kullanıcıların aşılanmış fideleri hizalamalarına yardımcı olur ve greft bölgesi oluşumu sırasında kökü ve çekimi iyi temas halinde tutarken, greft oluştuktan sonra kolayca çıkarılmasını sağlar. Silikon şeritlerin yüksek verimli üretimi ve başlangıç malzemelerinin nispeten düşük maliyeti nedeniyle, mikrogreftleme yongalarının maliyetinin bir kısmında çok sayıda fide aşılama yapılabilir. Bu ev yapımı cihazın aşılama alanı başına 0,12 dolara mal olduğu tahmin edilmektedir, bu da bunu çeşitli bitki türleri veya fide fenotipleriyle çalışan laboratuvarlar için ekonomik bir seçenek haline getirmektedir (Tablo 2). Aşılama şeritlerinin el yapımı yönü bu yöntemle ilişkili maliyetleri azaltırken, aynı zamanda farklı şeritler arasında değişkenlik şansı da sunar. Daha önce de vurgulandığı gibi, aşılama şeritlerinin kalitesi bu yöntemin başarısı için anahtardır. Moleküler genetikte erken evre fide aşılamasının kullanımındaki artış, bitki genetiği alanına bitkilerde uzun mesafeli sinyalleşmeyi incelemek için güçlü bir araç vermiştir. Bu basit, düşük maliyetli ve kolay erişilebilir yöntem, fide aşılama tekniğinin minimum ön eğitim ve deneyime sahip laboratuvarlar tarafından başarılı bir şekilde benimsenmesini kolaylaştırmaya yardımcı olacak başka bir araç sağlayacaktır.
Dikkat edilmesi gereken kritik noktalar
Yara onarım yanıtının başlatılması, filiz ve anaç arasında hücreden hücreye iletişimin kurulması ve nihayetinde vaskülatür oluşumu gibi süreçler başarılı bir greft9'un oluşması için gereklidir. Aşılama işlemi sırasında, fidelerin nemlendirilmiş ve gereğinden fazla zarar görmemiş halde tutulması önemlidir. Bu yöntemi kullanarak, filiz ve anaç arasında düz bir bağlantı sağlamak için köklerin ve scionların kesilmiş uçları temiz ve dik olmalıdır. Kesim sırasında aşılama bölgesi hasar görürse veya aşılama parçaları aynı açıda kesilmezse, aşılama kavşağı boyunca hücre katmanları arasında yakın temas olmaması nedeniyle başarılı aşılama olasılığı düşüktür. Bitkinin aşılama parçalarından herhangi birinin kurumasına izin verilirse veya hasar görürse, daha önce bahsedilen işlemler engellenir ve aşılama başarılı olmaz. Genç fideler kırılgandır ve forseps tarafından kolayca ezilir. Kullanıcılar gerekli görürse, forseps, filizi manevra yapmak için iki kotiledondan birine tutunmak için kullanılabilir. Daha önce bildirilen aşılama çipi yöntemine kıyasla, hipokotili silikon şeridin içine çekerken anaç zarar verme şansı artar. Bu riski en aza indirmek için kullanılan teknikler protokol adımı 3.4'te açıklanmıştır.
Şerit başına toplam dört aşılama bölgesi, greft-bağlantı oluşum aşamasında fidelerin birbirine temas etmemesini sağlamak için önerilen pozisyon sayısıdır. Tek seferde gerçekleştirilen toplam greft sayısını artırmak için, kullanıcıların greft başına kullanılan alan miktarını azaltmak yerine, kullanılan plaka sayısını artırmaları önerilir.
Farklı hipokotil büyümesine veya Arabidopsis olmayan türlere uyum sağlamak için protokolün modifikasyonu mümkündür
Bazı mutantlar vahşi tip bitkilere farklı oranlarda etiyolasyon yapar. Gibberellinler, brassinosteroidler, etilen ve oksin gibi fitohormonlar fide büyüme düzenlemesinde geniş bir rol oynamaktadır18,19,20. Bu hormon yolaklarında defektif mutant çizgiler atipik etiolasyon oranları16,17 ile karşılaşabilir. Aşılama şeridinin kullanıcı kontrollü tasarımı, bu fenotipik farklılıkların yerleştirilmesine izin verir, ancak bu durumlarda yeterli test gereklidir. Yabani tipten önemli ölçüde farklı oranlarda etiolasyon yaşayan genetik bir çizgi kullanılıyorsa, kullanıcılar başlamadan önce burada açıklanan 3 günlük etiolasyon süresinin hatları için uygun olup olmadığını belirlemelidir. Yetersiz etiolasyonlu fideler, kısaltılmış veya aşırı genişlemiş (ve daha ince) bir hipokotil nedeniyle zor aşılamaya neden olacaktır. Arabidopsidışındaki türlerin fidelerini aşılamak isteyen kullanıcılar, aşılama kanalı çapını değiştirerek bu protokolü ihtiyaçlarına göre uyarlayabilirler. Uygun aşılama yaşına kadar yetiştirilen domates ve tütün fidelerinin sırasıyla 0,8 ve 0,4 mm çapında aşılama kanallarına ihtiyacı olduğu görülmektedir9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Arabidopsis fidelerinin aşılanmasında ilk eğitim ve rehberlik için Javier Brumos'a teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E.
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y.
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
