Summary
Человеческий грибковый патоген Cryptococcus neoformans продуцирует различные факторы вирулентности (например, пептидазы), способствующие его выживанию в организме хозяина. Экологические ниши представляют собой многообещающий источник новых природных ингибиторов пептидазы. В этом протоколе описывается приготовление экстрактов из моллюсков и оценка их влияния на выработку фактора вирулентности грибов.
Abstract
Cryptococcus neoformans - это инкапсулированный грибковый патоген человека с глобальным распространением, который в основном заражает людей с ослабленным иммунитетом. Широкое использование противогрибковых препаратов в клинических условиях, их использование в сельском хозяйстве и гибридизация штаммов привели к увеличению эволюции резистентности. Этот растущий уровень резистентности к противогрибковым препаратам вызывает растущую озабоченность среди клиницистов и ученых во всем мире, и существует повышенная необходимость в разработке новых противогрибковых методов лечения. Например, C. neoformans продуцирует несколько факторов вирулентности, включая внутри- и внеклеточные ферменты (например, пептидазы), играющие роль в деградации тканей, клеточной регуляции и усвоении питательных веществ. Нарушение такой пептидазной активности ингибиторами нарушает рост и пролиферацию грибов, предполагая, что это может быть важной стратегией борьбы с патогеном. Важно отметить, что беспозвоночные, такие как моллюски, продуцируют ингибиторы пептидазы с биомедицинским применением и антимикробной активностью, но они недостаточно изучены с точки зрения их использования против грибковых патогенов. В этом протоколе была проведена глобальная экстракция из моллюсков для выделения потенциальных ингибиторов пептидазы в сырых и осветленных экстрактах, и было оценено их влияние на классические факторы вирулентности криптококка. Этот метод поддерживает приоритет моллюсков с противогрибковыми свойствами и предоставляет возможности для открытия противовирулентных агентов за счет использования природных ингибиторов, обнаруженных в моллюсках.
Introduction
Cryptococcus neoformans — это грибковый патоген человека, который вызывает тяжелое заболевание у хозяев с ослабленным иммунитетом, таких как люди, живущие с ВИЧ/СПИДом1, и приводит примерно к 19% смертей, связанных соСПИДом2. Гриб чувствителен к нескольким классам противогрибковых препаратов, включая азолы, полиены и флуцитозин, которые проявляют фунгицидную и фунгистатическую активность с использованием различных механизмов 3,4. Однако широкое использование противогрибковых препаратов в клинических и сельскохозяйственных условиях в сочетании с гибридизацией штаммов усилило эволюцию резистентности у нескольких видов грибов, включая C. neoformans5.
Для преодоления проблем устойчивости к противогрибковым препаратам и снижения распространенности грибковых инфекций в глобальном масштабе перспективным подходом является использование факторов вирулентности Cryptococcus spp. (например, температурной адаптивности, полисахаридной капсулы, меланина и внеклеточных ферментов)в качестве потенциальных терапевтических мишеней 4,6 . Этот подход имеет ряд преимуществ, поскольку эти факторы вирулентности хорошо охарактеризованы в литературе, и нацеливание на эти факторы может потенциально снизить показатели устойчивости к противогрибковым препаратам, оказывая более слабое селективное давление за счет ухудшения вирулентности, а не нацеливания на рост клеток6. В этом контексте многочисленные исследования оценили возможность воздействия на внеклеточные ферменты (например, протеазы, пептидазы) для снижения или ингибирования вирулентности Cryptococcus spp.7,8,9.
Такие организмы, как беспозвоночные и растения, не обладают адаптивной иммунной системой, чтобы защитить себя от патогенов. Тем не менее, они полагаются на сильную врожденную иммунную систему с огромным количеством химических соединений для борьбы с микроорганизмами и хищниками10. Эти молекулы включают ингибиторы пептидаз, которые играют важную роль во многих биологических системах, включая клеточные процессы иммунитета беспозвоночных, такие как коагуляция гемолимфы, синтез цитокинов и антимикробных пептидов, а также защита хозяев путем прямой инактивации протеаз патогенов11. Таким образом, ингибиторы пептидазы беспозвоночных, таких как моллюски, обладают потенциальными биомедицинскими применениями, но многие из них остаются неохарактеризованными10,12,13. В этом контексте насчитывается около 34 видов наземных моллюсков в Онтарио и 180 пресноводных моллюсков в Канаде14. Однако их углубленное профилирование и характеристика по-прежнему ограничены15. Эти организмы предоставляют возможность для идентификации новых соединений с потенциальной противогрибковой активностью10.
В этом протоколе описаны методы выделения и осветления экстрактов беспозвоночных (например, моллюсков) (рис. 1) с последующим измерением предполагаемой ингибирующей активности пептидазы. Затем противогрибковые свойства этих экстрактов оценивают путем измерения их влияния на продукцию фактора вирулентности C. neoformans с использованием фенотипических анализов (рис. 2). Важно отметить, что различия в противогрибковых свойствах между сырыми и осветленными экстрактами могут указывать на микробные факторы (например, вторичные метаболиты или токсины, продуцируемые микробиомом хозяина) моллюска, которые могут влиять на экспериментальные наблюдения. Такие результаты подтверждают необходимость того, чтобы этот протокол независимо оценивал как сырые, так и осветленные экстракты, чтобы разгадать способы действия. Кроме того, процесс экстракции является объективным и может позволить обнаружить антимикробные свойства против множества грибковых и бактериальных патогенов. Таким образом, этот протокол обеспечивает отправную точку для определения приоритета видов моллюсков с противогрибковыми свойствами против C. neoformans и возможность оценить связи между ферментативной активностью и продукцией фактора вирулентности с помощью предполагаемых ингибирующих механизмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Извлечение белка из моллюсков
- Собирайте моллюсков в специально отведенной и утвержденной природной зоне (например, Спид-Ривер, Гвельф, Онтарио). Для этого исследования были выбраны как местные, так и инвазивные виды для оценки широкого спектра потенциальных противогрибковых эффектов.
- Аккуратно разбейте панцирь моллюсков (например, Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi и Cipangopaludina chinensis) с помощью пестика и ступки и удалите твердые кусочки пинцетом. Как правило, 10 моллюсков объединяются для использования по всему протоколу.
- Соберите и взвесьте органы. Оптимальным является примерно 15-20 г образца. С помощью ножниц разрежьте органы на мелкие кусочки размером примерно 0,5-1 см.
- Мгновенно замораживайте рассеченные и разрезанные образцы органов жидким азотом. Затем измельчите образцы органов в мелкий порошок с помощью пестика и ступки.
- Добавьте порошок образца органа (приблизительно 15 г) в 30 мл холодной дистиллированной воды (4 ° C) для достижения соотношения 1: 2 (мас. / об.).
- Налейте 2 мл образца в ударопрочные пробирки объемом 2 мл. Добавьте мерную ложку 3 мм шариков из нержавеющей стали (примерно 500 мкг) в каждую пробирку и гомогенизируйте с помощью блендера (см. Таблицу материалов) в течение 3 мин при 1 200 об/мин и 4 °C.
- Центрифуга при 12 000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Соберите все надосадочные жидкости пипеткой в свежую пробирку объемом 50 мл, выбросив гранулы.
- Фильтруйте надосадочную жидкость с помощью мембраны 0,22 мкм. Храните пробы на льду и, если применимо, приступайте к протоколу уточнения (раздел 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть заморожены в жидком азоте и храниться при температуре -20 °C для использования в качестве сырых экстрактов.
2. Осветление экстракта моллюска
- Поместите образец надосадочной жидкости из шага 1.8 в термальную ванну при температуре 60 °C на 30 минут. Затем быстро охладите образцы, переложив их в ведро со льдом на 20 минут.
- Центрифугируют образцы при 15 000 × г в течение 45 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку объемом 50 мл и выбросьте гранулы. Фильтруйте-стерилизуйте образцы с помощью мембранного фильтра 0,22 мкм, а затем храните их на льду.
- Определяют концентрацию белка в образцах из стадий 1.8 (т.е. сырой экстракт) и стадии 2.2 (т.е. осветленного экстракта) с использованием количественного анализа (например, анализа17 бицинхониновой кислоты). Оптимальный диапазон концентрации белка составляет 4-8 мг/мл.
- Храните образцы на льду до 1 часа или замораживайте их в жидком азоте и храните при температуре -20 °C до тех пор, пока они не понадобятся.
3. Анализ ингибирующей активности
- Измеряют ингибирующую активность сырых и осветленных экстрактов с помощью ферментативных анализов в техническом трипликате.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый ферментативный анализ состоит из фермента (например, субтилизина А, который участвует в вирулентности грибов 16,17,18; обычно около 1 x 10-9 моль/л для хромогенных анализов), буфера и субстрата. Реакция начинается, когда субстрат сталкивается с ферментом. Ферментативная активность пропорциональна скорости превращения субстрата в продукт. - Оценивают влияние концентрации фермента (ЭК) на ферментативную активность (ЭА) до тех пор, пока не будет получена линейная зависимость между обоими параметрами. Для следующих шагов используйте концентрацию фермента в пределах измеренного линейного диапазона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментативный анализ пептидазы субтилизина А подробно описан в следующих шагах. - Инкубируют сырые (стадия 1.11) или осветленные (стадия 2.5) экстракты белков моллюсков (например, 10 мкл, содержащий 4 мг/мл белка) с 10 мкл субтилизина А (концентрация определяется на этапе 3.2) и 220 мкл 100 мМ Tris-HCl при рН 8,6 (для контроля добавьте 230 мкл трис-буфера без добавления экстракта) в течение 10 мин при 25 °C в 96-луночной пластине с плоским дном.
- Добавьте 10 мкл N-сукцинил-ала-ала-Pro-Phe-p-нитроанилида, субстрата для субтилизина А, в конечной концентрации1 Км (постоянная Михаэлиса-Ментена; 0,2 мМ для этого субстрата с субтилизином А) для конечного объема реакции 250 мкл.
- Измеряйте ферментативную активность, отслеживая внешний вид продукта с течением времени, считывая оптическую плотность (OD) при 405 нм каждые 15 с в течение 3 минут.
- Определите остаточную ферментативную активность, вычислив отношение ферментативной активности в присутствии экстракта моллюска к таковой при отсутствии экстракта.
- Если наблюдается ингибирующая активность (т.е. остаточная активность ниже 1), измерьте значение ингибирующей концентрации 50 (IC50), используя диапазон концентраций экстрактов (например, двукратный ряд разведения от 200 мкг/мл до 1 мкг/мл) в соответствии со стандартными методами19.
4. Влияние экстрактов моллюсков на рост C. neoformans
- С помощью наконечника пипетки объемом 10 мкл ввести одну колонию C. neoformans var. grubii H99 дикого типа (WT) в 5 мл среды дрожжевого экстракта-пептид-декстрозы (YPD) (10 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л пептона и 20 г/л декстрозы, pH 6,5) и инкубировать в течение 16-18 ч при 30 °C и 200 об/мин. Проведите эксперимент в биологическом трипликации и техническом дубликате.
- Соберите 500 мкл культуры в кювету и измерьте рост, считывая OD на длине волны 600 нм. Разбавьте культуру дрожжевой азотно-щелочной средой (YNB) до конечного OD600 0,02.
- Совместное культивирование клеток C. neoformans с различными концентрациями (например, трехкратная серия разведения от 440 мкг/мл до 15 мкг/мл белка) экстрактов (т.е. сырых и осветленных). Для этого смешайте 10 мкл экстрактов со 190 мкл разбавленной культуры C. neoformans (этап 4.2) в 96-луночном планшете.
- Измерьте рост, считывая OD 600 с помощью планшетного считывателя каждые 15 минут до 1 ч в течение 72 ч при200 об/мин и 37 °C.
5. Влияние экстрактов моллюсков на выработку меланина C. neoformans
- Подготовьте пластины с L-3,4-дигидроксифенилаланином (L-ДОФА).
- Автоклав 230 мл 14 г/л агара и дайте ему остыть, пока он не достигнет 50-60 °C.
- Добавьте в жидкий агар 3,25 мл 1 М глицина, 7,35 мл 1 М KH 2 PO 4, 2,5 мл 1 М MgSO4,7H 2 O, 0,6 мл 40% глюкозы, 70 мкл 10 мМ тиамина и 2,5мл 100 мМ L-ДОФА (стерилизованного фильтром).
- Налейте 15 мл смеси в чашки Петри, дайте им высохнуть в течение примерно 1 часа в темноте и храните при температуре 2-4 ° C до 1 недели. Убедитесь, что крышки частично приподняты, чтобы агар правильно высох.
- Инокулируют 5 мл среды YNB 50 мкл культуры C. neoformans из шага 4.1. Инкубировать 16-18 ч при 30 °C и 200 об/мин.
- Отжимают клетки при 1000 × г в течение 5 мин при 4 ° C. Промойте клетки 2 раза стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) при pH 7,4.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Ресуспендируют клетки в 1 мл PBS до достижения конечной концентрации 106 клеток / мл.
- Приготовьте серию разбавления (например, двукратное) сырых и осветленных экстрактов моллюсков. Аналогичным образом готовят 10-кратную серию разведения клеток C. neoformans (этап 5.4) от 1 x 106 клеток/мл до 1 x 101 клеток/мл с использованием стерильного PBS в 96-луночных планшетах.
- Нанесите 200 мкл экстракта на пластины Петри, содержащие L-ДОФА-агар, с помощью тампона и дайте им высохнуть в течение 15 минут.
- Поместите по 5 мкл культуры из каждой лунки на пластину L-ДОФА, оставляя 1 см между каплями. Дайте высохнуть в темноте в течение 15 минут.
- Инкубируйте планшеты при 30 °C и 37 °C в статическом инкубаторе в течение 3-5 дней, делая снимки каждые 24 часа с помощью камеры или планшетного тепловизора (например, сканера).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используются два температурных условия для изучения влияния температуры на ингибирующие рост эффекты экстрактов моллюсков: 30 ° C представляет окружающую среду и 37 ° C представляет физиологическую температуру человека.
6. Влияние экстрактов моллюсков на продукцию полисахаридной капсулы C. neoformans
- Подготовьте среду с низким содержанием железа (LIM), как описано ниже.
- Растворите 5 г хелатирующей смолы (см. Таблицу материалов) в 60 мл сверхчистой воды и упакуйте в стеклянную колонку (диаметр 2 см х длина 25 см). Промойте колонку 100 мл воды и слейте собранную воду.
- Приготовьте воду с низким содержанием железа (LI-воду), пропустив 2 л стерильной сверхчистой воды через хелатирующую колонну. Храните литий-ионную воду при температуре 4 °C до 3 месяцев.
- Растворите 5 г глюкозы в 100 мл LI-воды. Растворите 5 г L-аспарагина в 200 мл LI-воды в отдельном стакане.
- Добавьте в 500 мл литий-ионной воды по порядку: 4,78 г HEPES, 0,4 г K 2 HPO 4, 0,08 г MgSO 4,7H 2 O, 1,85 г NaHCO 3 и 0,25 г CaCl 2,2H 2O.
- Объедините решения из шагов 6.1.3 и 6.1.4. Добавьте 1 мл 100 мМ натриевой соли батофенантролиндисульфоновой кислоты (BPS) до конечной концентрации 100 мкМ.
- Отрегулируйте рН до 7,2 с помощью 1 м литий-швабры. Добавьте литий-ионную воду до конечного объема 1 л и отфильтруйте и стерилизуйте среду, пропустив ее через мембрану 0,22 мкм. Добавьте в среду 100 мкл стерильного тиамина (4 мг/мл).
- Инокулируют 5 мл среды YNB 50 мкл культуры C. neoformans из шага 4.1. Инкубировать 16-18 ч при 30 °C и 200 об/мин. Используйте эту культуру для инокуляции 5 мл LIM до конечной концентрации 105 клеток / мл.
- Добавьте соответствующие объемы экстрактов моллюсков (например, двукратное разведение или объем, определенный из предыдущих анализов вирулентности) для достижения желаемых концентраций. Инкубировать в течение 72 ч при 37 °C и 200 об/мин с разрыхленными колпачками. После инкубации соберите 1 мл клеток и промыть 2 раза стерильным PBS, pH 7,4, при 1,500 × г в течение 2 мин при 4 °C.
- Осторожно ресуспендируйте клетки в 1 мл PBS. Смешайте клетки с India Ink в соотношении 1:1 (например, 4 мкл India Ink с 4 мкл клеточной суспензии) на предметном стекле микроскопа. Поместите покровное стекло поверх предметного стекла.
- Визуализируйте образцы с помощью дифференциально-интерференционно-контрастного микроскопа (DIC) с 63-кратным масляным объективом (см. Таблицу материалов). Установите автоматическую контрастность и сфокусируйтесь вручную с помощью диска микроскопа. Выберите все изображения и экспортируйте их в формате TIFF. Никаких фильтров применять не нужно.
- С помощью инструмента «Линейка» в ImageJ20 определите отношение общего размера клетки (включая капсулу) к размеру тела клетки.
7. Влияние экстрактов моллюсков на продукцию биопленки C. neoformans
- Инокулируют 5 мл среды YNB 50 мкл культуры C. neoformans из шага 4.1. Инкубировать 16-18 ч при 30 °C и 200 об/мин.
- Собирают клетки из культуры объемом 5 мл. Промыть клетки стерильным PBS, pH 7,4, при 1,500 × г в течение 2 мин при 4 ° C.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Ресуспендировать клетки в 3 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle Medium (DMEM) до конечной концентрации 107 клеток / мл.
- Перенесите 300 мкл клеточной суспензии в отдельные лунки стерильной полистирольной плоскодонной 24-луночной пластины. Используйте скважины со средой только в качестве контроля.
- Добавьте соответствующие объемы экстрактов моллюсков (например, двукратное разведение или объем, определенный из предыдущих анализов вирулентности), чтобы достичь конечной концентрации белка 10-20 мкг/мл. Убедитесь, что объем экстракта не превышает 10% от общего объема.
- Оберните пластины алюминиевой фольгой (чтобы избежать испарения среды) и инкубируйте в течение 48 часов в статическом инкубаторе при 30 ° C и 37 ° C.
- Используя бутылку или дозатор, промойте лунки 2 раза стерильной водой и дайте им высохнуть на воздухе в течение 10-15 минут при комнатной температуре. Затем добавляют 100 мкл 0,3% раствора кристаллического фиолетового цвета в каждую лунку (включая контрольные лунки только для среды) и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Тщательно промойте лунки 3 раза стерильной водой (биопленки не будут разрушены во время промывки). Добавьте 200 мкл 100% этанола и инкубируйте в течение 10 мин при RT.
- Перенесите 75 мкл на новую пластину с плоским дном с 96 лунками и считайте OD550. Количественно определите образование биопленки как (OD 550 нм образца - OD550 нм заготовки).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рабочий процесс, описанный в настоящем описании, позволяет выделять белки и пептиды из моллюсков с потенциальными антивирулентными свойствами в отношении C. neoformans. Аналогичным образом, оценка различных форм экстрактов (т.е. сырых и осветленных) позволяет проводить полуочистку потенциальных активных соединений и поддерживает последующую оценку (например, протеомику на основе масс-спектрометрии). Как правило, в процессе экстракции белка образуются гомогенизированные растворы с концентрацией белка 4-8 мг/мл. Здесь репрезентативные результаты демонстрируют оценку ферментативной активности и противогрибковых свойств экстрактов C. chinensis. Сырые и осветленные экстракты были способны ингибировать протеолитическую активность субтилизина А (связанную с вирулентностью у C. neoformans) (рис. 3) со значениями IC 50 5,3 мкг / мл и4,53 мкг / мл соответственно. Активность экстрактов C. chinensis была дополнительно протестирована против процессов, связанных с продукцией фактора вирулентности C. neoformans, включая рост грибов, выработку капсул и меланина, а также образование биопленок. Наблюдалось значительное снижение роста грибов при 37 ° C в присутствии сырых (рис. 4A) и осветленных (рис. 4B) экстрактов C. chinensis. Примечательно, что не было никаких изменений в производстве капсул или меланина в присутствии сырых или осветленных экстрактов C. chinensis (рис. 4C, D). Тем не менее, значительное снижение образования биопленки на 70-80% наблюдалось при высоких концентрациях сырых (рис. 4E) и осветленных (рис. 4F) экстрактов по сравнению с необработанным контролем.
Рисунок 1: Рабочий процесс для извлечения общего белка из моллюсков. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Общая стратегия, используемая для оценки влияния экстрактов моллюсков на протеолитическую активность, рост и продукцию фактора вирулентности у Cryptococcus neoformans. DIC = дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия. Измерение оптической плотности указывается с помощью длины волны в нанометрах (нм). Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты влияния белковых экстрактов моллюсков на протеолитическую активность субтилизина A. (A) Cipangopaludina chinensis сырые экстракты. (В) Осветленные экстракты C. chinensis. Каждая точка представляет собой среднее значение трех реплик. Столбцы показывают стандартное отклонение. IC50 = полумаксимальная ингибирующая концентрация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты влияния экстрактов C. chinensis на продукцию фактора вирулентности у C. neoformans. (А,Б) Рост C. neoformans при 37 °C в присутствии сырого и осветленного экстрактов C. chinensis соответственно. (C) ДВС-микроскопические изображения C. neoformans, показывающие образование капсулы в присутствии сырых (50 мкг/мл) и осветленных (40 мкг/мл) экстрактов. Масштабная линейка = 10 мкм. (D) Производство меланина C. neoformans в присутствии сырых (440 мкг/мл) и осветленных (410 мкг/мл) экстрактов при 30 °C и 37 °C. (E, F) Относительное образование биопленки C. neoformans в присутствии сырых и осветленных экстрактов соответственно. Для статистического анализа были выполнены односторонний тест ANOVA и тест множественного сравнения Даннетта. *p < 0,05; **p < 0,01; и ****p < 0,0001. Каждое значение соответствует в среднем как минимум пяти биологическим репликам и двум техническим репликам. Столбцы погрешности указывают на стандартное отклонение. Показанные изображения меланина являются репрезентативными для трех биологических реплик и двух технических реплик. Показанные изображения капсул репрезентативны для 40-50 клеток на условие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь протокол экстракции описывает выделение соединений из моллюсков, собранных в Онтарио, Канада, и демонстрирует новое исследование использования экстрактов моллюсков против грибкового патогена человека C. neoformans. Этот протокол дополняет растущий объем исследований, изучающих активность ингибиторов пептидазы у беспозвоночных13. Во время экстракции некоторые образцы экстракта было трудно фильтровать и стерилизовать, возможно, из-за присутствия растворимых полисахаридов и/или пигментов, которые блокировали фильтрующую мембрану. Чтобы преодолеть это ограничение, рекомендуется сначала фильтровать через мембрану 5 мкм, чтобы исключить крупные соединения (например, нарушенные клеточные мембраны, геномную ДНК), тем самым позволяя белкам проходить через фильтр, а затем снова фильтровать через мембрану 0,22 мкм. Эти шаги имеют решающее значение для протокола, поскольку они ограничивают присутствие микробов, которые могут загрязнять образцы и мешать последующим экспериментам.
В ходе этого исследования были обнаружены ингибиторы пептидазы против субтилизина А, модельного фермента для семейства субтилизина S8. Члены этого семейства ферментов широко распространены среди организмов и играют различные роли, например, в процессинге белка, питании и механизмах вирулентности21,22, которые поддерживают фенотипические эффекты, наблюдаемые в этом исследовании. Например, значительное снижение роста грибов наблюдалось в присутствии как сырых, так и осветленных экстрактов, а также в относительно высоких и низких концентрациях, что позволяет предположить, что ингибирующая активность была надежной в тестируемой модели. Примечательно, что при измерении OD с помощью планшетного считывателя присутствие экстрактов вызывало слипание грибковых клеток на дне лунки, мешая измерению роста. Это ограничение можно преодолеть, используя высокоскоростной встряхивающий инкубатор (например, 900 об/мин), который позволит избежать образования клеток.
Могут существовать и другие технические ограничения, которые могут повлиять на ожидаемые фенотипические наблюдения. Например, субтилизиноподобные пептидазы связаны с синтезом меланина и зондированием кворума у C. neoformans, но сырые или осветленные экстракты из любых моллюсков не оказывают существенного влияния на выработку меланина16,17,18. Возможно, это связано с естественным защитным действием меланина и капсулы против внешних агентов, которые могут предотвратить воздействие экстрактов моллюсков на внутриклеточные компоненты гриба. Важные факторы, которые следует учитывать при работе с органическими субстратами, включают необходимость растворения их в диметилсульфоксиде (ДМСО), который может представлять проблемы растворимости в агаровой пластине (как используется в анализах меланина). Чтобы преодолеть эту проблему, экстракты можно распределить по поверхности агаровой пластины и дать им высохнуть до того, как грибковые клетки попадут на пластину.
Предыдущая работа продемонстрировала восприимчивость биопленок C. neoformans к двум противогрибковым агентам in vitro, включая амфотерицин B и каспофунгин; Однако гриб был устойчив к флуконазолу и вориконазолу23. Учитывая важность грибковых биопленок в вирулентности и устойчивости к противомикробным препаратам, было бы полезно выявить новые стратегии вмешательства или нарушения образования биопленки. В текущем исследовании сырые и осветленные экстракты C. chinensis нарушали образование биопленок криптококковых клеток с очевидным поведением доза-реакция. Эти результаты подтверждают результативность и новизну подхода. Примечательно, что образование биопленки было ингибировано в большей степени при обработке сырой нефтью по сравнению с осветленным экстрактом, что может быть связано с потерей ингибирующих соединений в процессе осветления или снижением ингибирующей функции в тестируемых условиях. Возможно, что белки, ответственные за эти ингибирующие эффекты, имеют высокую молекулярную массу и были потеряны в процессе осветления или были подвержены деградации во время термической обработки. Эти результаты подчеркивают важность использования как сырых, так и осветленных экстрактов для обнаружения изменений в ингибирующих функциях, поскольку различия, связанные с источником ингибитора, могут влиять на результат.
В целом, этот протокол позволяет извлекать соединения из моллюсков и измерять предполагаемую ингибирующую активность в отношении выбранной пептидазы с продемонстрированной ролью в вирулентности грибов. В этом протоколе оценивали высокий выход и сильную пептидазную ингибирующую активность экстрактов и их влияние на рост C. neoformans и образование биопленки. Хотя необходимы дальнейшие эксперименты, эти результаты подчеркивают важность моллюсков как предполагаемых новых источников соединений против этого опасного грибкового патогена. Кроме того, в то время как этот протокол фокусируется на извлечении ингибиторов из моллюсков, методология адаптируется к другим беспозвоночным и может быть использована для оценки влияния ингибиторов, полученных из различных беспозвоночных, на продукцию фактора вирулентности в различных микроорганизмах, включая грибы и бактерии24,25,2 6 . В конечном счете, извлечение соединений из природных источников может увеличить репертуар предполагаемых новых противомикробных агентов и, таким образом, улучшить наши способности бороться с инфекционными заболеваниями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят членов лаборатории Геддеса-Макалистера за их ценную поддержку на протяжении всего исследования и отзывы о рукописях. Авторы выражают признательность за финансовую поддержку со стороны Ontario Graduate Scholarship and International Graduate Research Award - University of Guelph to D.G.-G, а также от Канадского фонда инноваций (JELF 38798) и Министерства колледжей и университетов Онтарио - Early Research Award для J.G.-M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. Werger, M. J. A. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2013).
- Collins, T. J.
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
