Summary
这里介绍的是一种社会隔离（SI）诱导的焦虑小鼠模型，该模型利用野生型C56BL / 6J小鼠以最少的处理和无侵入性程序诱导压力和焦虑样行为。该模型反映了社会孤立的现代生活模式，是研究焦虑和相关疾病的理想选择。
Abstract
焦虑症是美国（US）残疾的主要原因之一。目前的治疗并不总是有效的，只有不到50%的患者达到完全缓解。开发新型抗焦虑药的关键步骤是开发和利用动物模型（例如小鼠）来研究病理变化并测试药物靶点、疗效和安全性。目前的方法包括基因操作，长期给予焦虑诱导分子或管理环境压力。然而，这些方法可能无法现实地反映日常生活中引起的焦虑。该协议描述了一种新的焦虑模型，该模型模仿了现代生活中有意或无意的社会孤立模式。社会孤立诱导的焦虑模型最大限度地减少了感知到的干扰和侵入性，并利用野生型C57BL / 6小鼠。在该协议中，将6至8周龄的小鼠（雄性和雌性）单独饲养在不透明的笼子中，以视觉上阻挡外部环境，例如邻近的小鼠4周。不提供环境富集（如玩具），垫料减少50%，任何药物处理均以琼脂形式施用，并且尽量减少小鼠的暴露/处理。使用该协议生成的社会孤立小鼠表现出更大的焦虑样行为，攻击性以及认知能力下降。
Introduction
焦虑症是美国精神疾病的最大类别和负担，相关年度成本超过420亿美元1，2，3。近年来，焦虑和压力使自杀和自杀意念的患病率提高了 16% 以上4。慢性病患者特别容易受到精神困扰或认知功能下降的意外继发性影响5.目前对焦虑症的治疗包括心理治疗、药物治疗或两者的组合6.然而，尽管存在这种危机，只有不到 50% 的患者达到完全缓解6，7。苯二氮卓类药物（BZs）和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）等抗焦虑药具有明显的缺点或几乎不产生立竿见影的效果8。此外，正在开发的新型抗焦虑药相对稀缺，受到昂贵且耗时的药物开发过程的挑战9，10。
药物开发过程中的一个关键步骤是建立和利用动物模型，例如小鼠，以研究病理变化并测试药物的安全性和有效性11。目前建立焦虑动物模型的方法包括1）基因操作，例如敲除血清素受体（5-HT1A）或γ-氨基丁酸A受体（GABAAR）α亚基12;2）长期给予焦虑诱导剂，如皮质酮或脂多糖（LPS）13，14;或 3） 施加环境压力，包括社会失败和母体分离15.然而，这些方法可能无法真实地反映日常生活中引起的焦虑，因此可能不适合研究潜在机制或测试新药。
像人类一样，老鼠和老鼠是高度社会化的生物16，17，18。社交接触和社交互动对于最佳的大脑健康至关重要，并且对于饲养期间的正常神经发育至关重要19。因此，在饲养期间，母体分离或社会孤立导致小鼠表现出更多的焦虑，抑郁和神经传递的变化20。此外，社交梳理或同种异体整理是生活在一起的小鼠和大鼠之间常见的结合或安慰行为形式21。因此，社会化是啮齿动物生活中不可或缺的一部分，隔离会对它们的健康产生负面影响。
在这种情况下，本协议描述了一种新的焦虑模型，以模仿现代生活中有意或无意的社会孤立模式。这种社会隔离（SI）模型最大限度地减少了感知的干扰和侵入性，并利用了成年野生型C57BL / 6小鼠和Sprague-Dawley（SD）大鼠。 这里介绍的方案侧重于基于我们发表的证据的焦虑小鼠模型，该模型显示由于社会孤立，焦虑样行为，攻击性，认知能力下降和神经炎症增加22，23，24。焦虑样行为通过升高加迷宫 （EPM） 和开放场地 （OF） 测试得到证实，而认知功能通过新型物体识别 （NOR） 和新型上下文识别 （NCR） 测试来测量。该模型可用于研究焦虑和相关疾病，但也可以调整或修改以研究轻度认知障碍的自然进展和发展以及压力引起的代谢变化。
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Protocol
所有动物实验均按照南加州大学（USC）机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议进行，所有方法均按照相关指南，法规和建议进行。
1. 动物
- 获得适当的动物护理委员会的批准以进行研究。
- 将动物园设置为暗光12小时循环，温度和湿度分别控制在24±2°C和50%-60%之间。
- 获得6-8周龄的雄性和/或雌性野生型C57BL / 6小鼠。按性别对动物进行分层后，将它们随机分配到以下组之一：1）经过车辆处理的组舍;2）接受药物治疗的集体住宅;3）通过车辆处理进行社会隔离;或4）药物治疗的社会隔离。目标是每组每性别至少四只小鼠（理想情况下每组六只小鼠）。
- 小鼠到达后，使它们适应动物园至少24小时。小鼠应单独饲养到达。
2. 笼子设置
- 对于社会隔离动物，使用标准鼠笼（2 楼空间 75 个），并添加一半的床上用品和 1 合2 的棉花（或等效物）筑巢。
- 用不透明的黑色塑料袋（或同等物品）包裹笼子的外壁，并用胶带固定。确保小鼠看不到外部环境或周围的动物。
- 保持笼子的顶部和底部未包裹，除非老鼠可以通过它们看到邻近的动物。
- 包装时，请确保袋子的任何部分都无法从笼子内部进入。这是为了防止动物将袋子撕开。
- 请勿包含任何形式的环境浓缩物，例如玩具或跑轮。
- 小心而轻柔地将小鼠放入准备好的笼子中。 随意提供食物和水。
- 在正常笼子条件下（即，在标准小鼠笼[75 在2楼空间]中，全量的床上用品，2合2 的棉花或等效的套料，以及不透明袋子的包裹），以两到三组为一组进行家控。
- 确保群体饲养的小鼠彼此兼容（即它们之间没有战斗/冲突）。如果发生冲突，请移除攻击者并从分析中排除。
- 将雄性和雌性小鼠分开饲养，并在雄性和雌性之间保持距离，以避免由于嗅觉能力而影响雌性小鼠内分泌水平变化的可能性。
3. 社会隔离期间的护理和治疗
- 在社交隔离期间尽可能少地打扰小鼠。在活动期间（即，在黑暗周期期间）和最小的噪音干扰下执行任何程序和活动，例如更换笼子和治疗管理。
- 在黑暗周期期间，每周只更换一次笼子。相同的塑料袋可以取出并重新包装到新的笼子中，除非存在重大损坏。
- 对于对照（群体饲养）小鼠，在黑暗周期中根据需要每周更换两次或更多笼子。
- 确保小鼠有足够的水和食物至少持续 1 周。
- 继续分离（或分组住房）小鼠至少4周，以获得最佳结果。
4. 琼脂药物/治疗制剂-一种非侵入性药物治疗
- 如果研究中涉及治疗（例如，正在研究的药物），理想情况下，利用琼脂形式以尽可能少的处理方式进行治疗。注射和口服强饲等途径会给小鼠带来额外的压力，这可能成为焦虑的混杂因素。
- 根据所用药物的性质调整治疗的时间和频率。
注意：在本研究中，使用2mg / kg二氢杨梅素（DHM，[（2R，3R）-3，5，7-三羟基-2-（3，4，5-三羟基苯基）-2，3-二氢苯并吡喃-4-酮]）作为治疗。在隔离（或集体住宅）期间的最后2周的黑暗阶段，每天以单剂量施用DHM。 - 为了准备处理，在去离子（DI）水中加入3%（w / v）琼脂并加热至~90°C以溶解。溶液会冒泡。防止溢出或沸腾。
注意：通过短时间的10秒微波 加热 玻璃烧瓶中的溶液。
注意：玻璃器皿会很热。处理溶液时，请穿戴适当的个人防护装备（PPE）。 - 旋转解决方案并目视确保解决方案均匀。
注意：溶液应该是半透明的，浅黄色至浅棕色。 - 当溶液仍然温暖时，加入5%（w / v）蔗糖和所需剂量的处理。仅添加蔗糖，不将感兴趣的处理添加到车辆对照中。
- 旋转解决方案并目视确保解决方案均匀。然后，将溶液倒入模具中，在室温下冷却以固化。如果治疗对光敏感，请确保保护它免受光照。
注意：溶液应略带粘性。 - 凝固后，将琼脂切成0.5cm x 0.5cm x 0.5cm的立方体，并储存在4°C直至给药。
- 要进行治疗，请将单个立方体放在一个小称重船上。在明暗循环的黑暗阶段，安静而小心地将琼脂称重船放入单独的笼子中，不要触摸鼠标。让鼠标消耗琼脂。
注意：小鼠通常需要15-45分钟才能完全消耗琼脂。 - 确认琼脂完全消耗，然后小心地将秤船从笼子中取出。根据需要重复此操作。
- 每周准备琼脂块以保持新鲜并避免任何污染。
5. 行为分析
- 在4周（或更长时间）隔离期的最后一天后24小时进行行为测试。在间接红光下的暗阶段进行测试，并用摄像机记录。
- 安排至少三人以双盲方式进行人工离线评分，以尽量减少偏差和错误。
- 高架加迷宫 （EPM）
- 准备 EPM 设备。本协议中使用的设备是商业获得的（见 材料表），由不透明塑料制成，具有两个张开臂和两个闭合臂（每个33厘米x 5厘米，垂直于闭合臂的张开臂），中心平台为5厘米x 5厘米。将设备抬高到离地板 50 厘米处。
- 将动物放在设备的中心，面向张开的手臂。让动物探索5分钟并使用摄像机记录其活动。
- 用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭所有表面，在每只动物之后清洁设备。确保擦去所有啮齿动物粪便。
- 使用秒表根据张开双臂、闭合双臂和中央平台所花费的时间对小鼠的行为进行离线评分。当鼠标将至少三只爪子放在相应的手臂或平台上时，启动秒表。
- 开放现场 （OF） 测试
- 准备 OF 设备。本协议中使用的设备（见 材料表）由不透明塑料制成，尺寸为50厘米x 50厘米x 38厘米（长x宽x高）。
- 在场地上绘制方形网格（每个 10 厘米 x 10 厘米），总共 25 个网格。
- 将动物放在田野的中心，让其探索10分钟。在摄像机上记录他们的活动。
- 在每只动物之后，用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭所有表面来清洁设备。确保擦去所有啮齿动物粪便。
- 根据在中心区域花费的时间、在角落花费的时间、行进的总距离和鼠标饲养的次数，对小鼠的行为进行离线评分。
- 使用秒表记录在中心或角落花费的时间。当鼠标在相应区域放置至少三个爪子时，启动秒表。
- 使用计数器记录行进的距离和饲养频率。计算鼠标进入的方块数（当鼠标在正方形中放置至少三个爪子时）。当老鼠清楚地用后爪站起来时，计数饲养。当鼠标站起来靠在墙上或站起来梳理毛发时，不要数数。
- 新型物体识别（NOR）测试
- 在 3 天内执行此测试。在第 1 天，准备一个 50 厘米 x 50 厘米 x 38 厘米（长 x 宽 x 高）的开放现场设备。将动物放在空地的中心，让其熟悉5分钟。然后将动物放回其家笼中。
- 用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭所有表面，在每只动物之后清洁设备。确保擦去所有啮齿动物粪便。
- 在第2天，准备相同的开放场地设备并放置两个相同的物体，例如一个小立方体。将它们对称放置，相距约 20 厘米。将动物放在设备的中心，并允许探索5分钟。然后将动物放回其家笼中。
- 用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭所有表面，在每只动物之后清洁设备。确保擦去所有啮齿动物粪便。
- 在第3天，准备相同的开放场地设备和来自第2天的一个物体（即小立方体），它将作为熟悉的物体。将另一个不同的新物体（例如木制金字塔）与熟悉的物体对称放置约20厘米。让动物探索 3 分钟并在摄像机上记录它们的活动。
- 用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭所有表面，在每只动物之后清洁设备。确保擦去所有啮齿动物粪便。
- 根据探索熟悉物体和新物体所花费的时间，对小鼠的行为进行离线评分。计算物体识别指数（ORI%），其中
tf 和tn 分别代表探索熟悉和新颖物体的时间。
- 在 3 天内执行此测试。在第 1 天，准备一个 50 厘米 x 50 厘米 x 38 厘米（长 x 宽 x 高）的开放现场设备。将动物放在空地的中心，让其熟悉5分钟。然后将动物放回其家笼中。
- 新型上下文识别 （NCR） 测试
- 在 2 天内执行此测试。准备两个形状明显的空地和两对形状明显的物体。OF设备可以用作上下文之一（开放领域）。另一个上下文应具有相似的大小但形状不同，例如圆形开放区域。
- 在第 1 天，将一对相同的对象（即两个立方体）放在正方形上下文中，将另一对相同的对象（即两个金字塔）放在圆形上下文中。物体应对称放置，相距15-20厘米。
- 将动物放在中心，并在一个环境中探索5分钟。在其他上下文中重复。然后，将动物放回其家庭笼子中。
- 用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭所有表面，在每只动物之后清洁设备。确保擦去所有啮齿动物粪便。
- 在第 2 天，将一个上下文中的一个对象与另一个上下文交换（即，在方形上下文中放置一个立方体和一个金字塔，在圆形上下文中放置一个立方体和一个金字塔）。
- 将动物放在中心，探索3分钟。在摄像机上记录他们的活动。动物不需要在两种情况下都记录下来。
- 用消毒剂（70%乙醇）彻底擦拭所有表面，在每只动物之后清洁设备。确保擦去所有啮齿动物粪便。
- 根据探索不同物体所花费的时间对小鼠的行为进行离线评分。计算识别指数 （RI%） 作为调查新颖的“脱离上下文”对象（即方形上下文中的金字塔）与熟悉的“上下文”对象（即方形上下文中的立方体）所花费的时间比例。
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tf 和tn 分别代表探索熟悉和新颖物体的时间。
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Representative Results
所有具有代表性的结果和数据均根据我们最近的出版物22，23进行了修改。为了评估社会隔离对焦虑和探索行为的影响，在4周的社会隔离期结束后24小时进行了EPM和OF测试。与对照组（2.3±1±0.27分钟）相比，社会孤立小鼠在开放臂上花费的时间（1.280.17分钟）显着减少，并且在闭合臂中的时间（3.31±0.27分钟）与对照组（2.24±0.31分钟）相比（图1）。同样，在OF测试中，社会孤立的小鼠旅行更少（2，176±146厘米与对照组[2，765±161厘米]），饲养较少（28.25±2.07与对照组[46.63±1.52]），在角落花费更多时间（73.00 ± 4.31 s与对照组[28.25 ± 2.07 s]），并且在中心区域花费的时间更少（7.63 ± 0.86 s vs. 对照组 [19.63 ± 0.71 s]）， 表明焦虑样行为增强（图2）。
此外，还评估了社会孤立对认知的影响，因为焦虑症通常也表现出认知障碍的症状，例如记忆力减退和注意力不集中25，26。如前所述，利用两种测试：新物体识别（NOR）和新情境识别（NCR），如前所述23，评估小鼠在相似情境（NOR）和具有相似物体的新情境（NCR）下识别新物体的能力。社会隔离小鼠显示出新物体识别减少（55.3±4.1%与对照组[66.3±4.7%]）（图3A）以及减少的新上下文识别（51.5±6.5%与对照组[68.6±2.8%]），表明认知障碍（图3B）。
图 1：通过升高加迷宫 （EPM） 测量的类似焦虑行为的变化。 在EPM设备的（A）张开臂和（B）闭合臂中花费的时间。数据表示为平均± SEM。 单因素方差分析，然后进行多重比较，Holm-Sidak方法。N = 每组 11 个。* p ≤ 0.05。该图已修改自Al Omran等人22 （根据知识共享署名4.0国际许可开放获取）。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：通过开放场地 （OF） 测试测量的焦虑样行为和运动活动的变化。 数据显示为（A）总行进距离，（B）小鼠饲养次数，（C）在角落里花费的总时间，以及（D）在OF装置中心花费的总时间。数据表示为平均± SEM。 单因素方差分析，然后进行多重比较，Holm-Sidak方法。N = 每组 11 个。* 第≤0.05页。该图已修改自Al Omran等人22 （根据知识共享署名4.0国际许可开放获取）。 请点击此处查看此图的大图。
图3：通过新型物体识别（NOR）和新型上下文识别（NCR）测试测量的认知变化。 （A） ORI = 物体识别指数。（B）RI =（新上下文）识别指数。数据表示为平均± SEM。 单因素方差分析，然后进行多重比较，Holm-Sidak方法。N = 每组 9 个。* p ≤ 0.05。该数字已修改自Watanabe等人23（根据知识共享署名4.0国际许可开放获取）。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
协议中的关键步骤包括正确设置社会隔离笼（即包裹不透明袋子并减少床上用品的数量），在整个隔离期间尽量减少对小鼠的处理和干扰， 并确保小鼠完全获得和食用琼脂。至关重要的是，将动物饲养场或饲养所的条件保持在恒定的温度和湿度，并尽量减少外部干扰。应付出巨大努力，尽可能减少这些混杂因素，包括但不限于噪音干扰（例如，交谈、设备噪音等）、过度处理和在暗光周期的光照阶段对动物的干扰。在隔离期间，更换笼子、补充食物和/或水、提供治疗和所有其他功能所需的时间也应尽量减少。虽然很少见，但我们过去曾观察到群体饲养的雄性小鼠之间的战斗。因此，对于群体饲养的小鼠（对照或类似），需要仔细观察以确保小鼠之间没有冲突，因为这会成为焦虑或压力的另一个混杂因素。如果确实发生战斗，应将涉嫌侵略者与另一群人交换，并继续观察。如果侵略者继续制造冲突，建议将侵略者以及遭受侵略者伤害的小鼠排除在研究之外。
所描述的方案建议隔离 4 周，但这个时间范围可能会增加。我们进行的最长的社会隔离期是8周，我们还进行了反复的社会隔离（隔离，集体住宿，重新隔离）作为累积焦虑/压力的模型。可以修改这些分离期的时间和长度以适应实验需求或目的。然而，不建议将分离期减少到少于4周，因为小鼠可能没有足够的时间表现出类似焦虑的行为或大脑病理变化。治疗的时间和频率也可以改变。
相对于建立焦虑动物模型的现有方法，该模型具有几个优点。首先，它不需要广泛的表型选择（选择性育种）或遗传操作，例如敲除或沉默大脑中的受体。虽然转基因小鼠可用于研究易感基因，但它们可能无法完全捕获焦虑发病机制12。此外，基因敲除可能是致命的，或者无法准确模仿在人类中观察到的焦虑27。基因操作需要时间和精力，需要胚胎干细胞提取，DNA注射，培养，植入子宫和抚养27。此外，这些遗传动物可能无法真正反映药物对药物开发的作用。这种社会隔离模式虽然需要至少 4 周的隔离，但在时间、精力和可靠性方面是有利的。其次，小鼠不必长期给予焦虑诱导剂，如皮质酮或脂多糖（LPS）13，14。调查人员不需要经历日常注射程序，社会隔离模型更准确地反映了人类的焦虑，因为大多数人不会每天接受注射来体验焦虑。最后，小鼠不需要被条件反射（例如在社会失败范式中），这需要时间并且可能不会产生可重复的焦虑水平（即小鼠之间的显着差异）15。
许多目前可用的社会隔离模型在早期发育中开始隔离期，介于新生儿期到青少年期和青少年时期之间。这种早期生活隔离模型诱发抑郁和焦虑样行为、社交回避行为和其他神经精神症状，这些症状反映了焦虑症、抑郁症、自闭症和相关的精神障碍28.虽然早期社会隔离方法已经确立并普遍使用，但它并不完全反映精神障碍的发展，因为并非所有人在青少年时期都经历过母体分离（社会隔离）29。此外，它们的影响因物种、菌株、性别和隔离的频率/持续时间而异28.例如，一些研究发现断奶后社会隔离会增加C57BL / 6J小鼠的攻击行为，而其他研究仅显示出很小或没有影响28。这种变化可能是由于隔离期的频率、持续时间或外壳设置略有不同。另一项针对成年或晚年阶段小鼠的研究发现，社会孤立会增加多动症，没有明显的抑郁或焦虑样行为30。这些小鼠无法看到邻近的小鼠，类似于我们的模型，但利用了雌性F1杂交C57BL / 6J x 129S6 / SvEvTac小鼠30，这表明品系和性别之间存在差异。本研究希望通过提出一种一致的方法来最小化这些变化。
这种技术的缺点是没有消除声音因素。由于笼子不隔音，动物仍然能够听到彼此的声音，因此可能不是绝对孤立的。将隔音笼纳入协议并研究听觉隔离对焦虑和认知的影响可能会很有趣。然而，就该模型而言，只有视觉感官和互动被阻止，因为该模型不是感官剥夺模型，而是禁止面对面社交互动的模型。该模型旨在模仿面对面的社交互动，因为听觉刺激通常存在于人类生活中。另一个缺点是该协议仅在C57BL / 6小鼠和Sprague Dawley大鼠中进行了测试。如前所述，社会隔离的影响可能因物种和菌株而异。尽管无法保证该协议在其他啮齿动物物种/品系中的可重复性，但可以确认该模型可以在这两种动物中始终如一地重建。
由于动物表现出认知和记忆力下降，该模型可以发展为轻度认知障碍模型。虽然需要进一步优化，但该模型可能有助于研究社会孤立引起的认知障碍的机制，可能是来自累积的压力和焦虑事件。该模型还可用于研究晚年社会孤立对社会行为、攻击或暴力的影响。
总体而言，社会孤立诱导的焦虑小鼠模型可以应用于以非侵入性、最低限度处理的方式研究焦虑和相关疾病，旨在准确模拟由社会孤立和孤独引起的焦虑。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作由美国国立卫生研究院拨款AA17991（致J.L.），无忧无虑生物技术基金会（致J.L.），南加州大学（USC），南加州大学研究生院旅行/研究奖（致SW）资助。沙特阿拉伯文化使命奖学金（致AAO）和陆军卫生专业奖学金计划（致ASS）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Plastic Bags | Office Depot | 791932 | 24" x 32" |
| Elevated Plus Maze | SD Instruments | NA | Black color |
| Open Field enclosure | SD Instruments | NA | White color |
| Select Agar | Invitrogen | 30391-023 | |
| Square cotton for nesting (nestlet) | Ancare Corporation | NC9365966 | Divide a 2" square piece into 4 pieces to create a 1" square piece for isolation group |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | |
| Weigh boat | SIgma | HS1420A | Small, square white polystyrene |
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