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Biology

उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री का उपयोग करके प्राथमिक मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं में बायोएनर्जेटिक का वास्तविक समय विश्लेषण

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/64572
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Schepens Eye Research Institute of Mass. Eye and Ear, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (एच-आरपीई) की चयापचय स्थिति उनके स्वास्थ्य और कार्य को दर्शाती है। यहां प्रस्तुत उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति का उपयोग करके एच-आरपीई के वास्तविक समय चयापचय प्रवाह की जांच के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है।

Abstract

रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (आरपीई) की चयापचय शिथिलता रेटिना रोगों जैसे उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) और प्रोलिफेरेटिव विट्रोरेटिनोपैथी (पीवीआर) का एक प्रमुख रोगजनक चालक है। चूंकि आरपीई अत्यधिक चयापचय-सक्रिय कोशिकाएं हैं, इसलिए उनकी चयापचय स्थिति में परिवर्तन उनके स्वास्थ्य और कार्य में परिवर्तन को दर्शाता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री क्रमशः बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) और ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के परिमाणीकरण के माध्यम से दो प्रमुख बायोएनर्जेटिक मार्गों, ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ओएक्सपीएचओएस) के वास्तविक समय गतिज विश्लेषण की अनुमति देती है। निम्नलिखित प्राथमिक मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (एच-आरपीई) पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति के संचालन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है। यह प्रोटोकॉल उनके बेसल और अधिकतम ओएक्सपीओएस और ग्लाइकोलाइटिक क्षमताओं को परिभाषित करने के लिए आरपीई के बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल के उत्पादन में शामिल चरणों का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लाइकोलाइटिक मशीनरी को लक्षित करने वाले विभिन्न दवा इंजेक्शन के लिए एच-आरपीई को उजागर करने से परिभाषित बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल होते हैं, जिससे प्रमुख चयापचय मापदंडों की गणना की जा सकती है। यह प्रोटोकॉल आरपीई में अधिकतम श्वसन क्षमता को प्रेरित करने के लिए कार्बोनिल साइनाइड पी-ट्राइफ्लोरोमेथोक्सीफेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) की तुलना में एक अनकपलिंग एजेंट के रूप में बीएएम 15 की बढ़ी हुई प्रतिक्रिया पर प्रकाश डालता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न रोग स्थितियों के तहत आरपीई की बायोएनर्जेटिक स्थिति का अध्ययन करने और आरपीई की बेसल चयापचय स्थिति को बहाल करने में नई दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाएं (आरपीई) कोरियोकेशिकाओं के फोटोरिसेप्टर और फेनेस्टेड एंडोथेलियम के बीच रणनीतिक रूप से स्थित पिगमेंटेड एपिथेलियल कोशिकाओं के मोनोलेयर के रूप में मौजूद हैं। आरपीई कई कार्यों के साथ अत्यधिक चयापचय रूप से सक्रिय हैं, जिनमें (1) शेड फोटोरिसेप्टर डिस्क का फागोसाइटोसिस, (2) दृश्य चक्र को बनाए रखने के लिए दृश्य वर्णक का पुनर्चक्रण, (3) पोषक तत्वों, मेटाबोलाइट्स, आयनों और पानी का परिवहन, (4) प्रकाश का अवशोषण, (5) फोटोऑक्सीडेशन के खिलाफ सुरक्षा, (6) रेटिना अखंडता का समर्थन करने के लिए आवश्यक कारकों का स्राव, और (7) बाहरी रक्त-रेटिना बाधाका गठन 1 . आरपीई का अध: पतन चयापचय शिथिलता और माइटोकॉन्ड्रियल दोषों से जुड़ा हुआ है, जिससे उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) और प्रोलिफेरेटिव विट्रोरेटिनोपैथी (पीवीआर) 2 जैसे आंखों के रोग हो सकते हैं।

दो प्रमुख बायोएनर्जेटिक मार्गों में ग्लाइकोलाइसिस शामिल है, जो साइटोप्लाज्म में होता है, और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ओएक्सपीएचओएस), जो माइटोकॉन्ड्रिया में होता है। ग्लाइकोलाइसिस के दौरान, ग्लूकोज का एक अणु पाइरूवेट के दो अणुओं और एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के दो अणुओं के शुद्ध उत्पादन में परिवर्तित हो जाता है। ग्लाइकोलाइसिस के विपरीत, OXPHOS एटीपी के उच्च स्तर (~ 32-38 अणु प्रति ग्लूकोज अणु) का उत्पादन करता है। विशेष रूप से, OXPHOS ऑक्सीजन का उपभोग करता है और कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया की आवश्यकता होती है, जबकि ग्लाइकोलाइसिस साइटोप्लाज्म में होता है और ऑक्सीजन की आवश्यकता नहीं होती है।

माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की जांच करने के लिए प्रतिदीप्ति- या फॉस्फोरेसेंस-आधारित तकनीकों की शुरूआत से पहले, क्लार्क-प्रकार ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड 3 से लैस कक्षों में परमेबिलाइज्ड सेल सस्पेंशन में ऑक्सीजन के स्तर को मापागया था। जबकि क्लार्क इलेक्ट्रोड फ्लोरेसेंस-आधारित श्वासमिति की तुलना में बहुत सस्ता है और गैर-अनुयायी कोशिकाओं में काम करता है, यह अपेक्षाकृत कम-थ्रूपुट है, जिसमें प्रत्येक श्वसन रन लगभग 15-20 मिनट तक चलता है और प्रत्येक नमूने3 के लिए कोशिकाओं की अधिक मात्रा की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, फ्लोरेसेंस-आधारित श्वासमिति तकनीक ने काफी हद तक क्लार्क इलेक्ट्रोड को बदल दिया है और चयापचय और माइटोकॉन्ड्रियल अनुसंधान के क्षेत्र में एक लोकप्रिय तकनीक बन गई है।

यह प्रोटोकॉल एक उच्च-थ्रूपुट, उच्च-रिज़ॉल्यूशन, फ्लोरेसेंस-आधारित श्वासमिति तकनीक का वर्णन करता है जो जीवित कोशिकाओं के ओएक्सपीओएस और ग्लाइकोलाइटिक बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल को गतिज रूप से मापता है। चूंकि OXPHOS की प्रक्रिया ऑक्सीजन की खपत करती है, इसलिए OXPHOS के लिए बायोएनर्जेटिकप्रोफ़ाइल समय के साथ ऑक्सीजन खपत दर (OCR) में परिवर्तन ों का मानचित्रण करके उत्पन्न होती है। इस तकनीक में, सेंसर कार्ट्रिज आस्तीन में दो फ्लोरोफोर एम्बेडेड होते हैं जो फाइबर ऑप्टिक बंडलों से जुड़े होते हैं जो प्रकाश उत्सर्जित करते हैं, फ्लोरोफोरे को उत्तेजित करते हैं। फ्लोरोफोरे उत्सर्जन में परिवर्तन को अत्यधिक संवेदनशील प्रतिदीप्ति सेंसर द्वारा मापा जाता है और फाइबर ऑप्टिक बंडल के माध्यम से ओसीआर रीडआउट 5 में परिवर्तित किया जाताहै। फ्लोरोफोरे ऑक्सीजन द्वारा बुझा दिया जाता है, इस प्रकार परख मीडिया में बाह्य ऑक्सीजन के स्तर के निर्धारण को सक्षम करता है, जिसे ऑक्सीजन फ्लक्स या ओसीआर के रूप में जाना जाता है। अन्य फ्लोरोफोरे एक पीएच सेंसर जांच है जो प्रोटॉन एफ्लक्स में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है, जिसे बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) के माप में परिवर्तित किया जाता है। माप के दौरान, एम्बेडेड फ्लोरोफोरे के साथ फाइबर ऑप्टिक बंडलों को सेल मोनोलेयर से 200 μm तक कम किया जाता है, जिससे एक क्षणिक माइक्रो-चैंबर बनता है जो तेजी से, वास्तविक समय रीडिंग को सक्षम बनाता है। एक बार ऑक्सीजन या प्रोटॉन के स्तर में 10% परिवर्तन का पता चलने के बाद, सेंसर को ऊपर की ओर उठाया जाता है, जिससे मीडिया की एक बड़ी मात्रा को क्षणिक माइक्रो-चैंबर मीडिया के साथ मिश्रण करने की अनुमति मिलती है, जिससे ओसीआर और ईसीएआर मूल्यों को बेसलाइन पर वापस बहाल किया जाता है। प्रत्येक सेंसर कारतूस परख के दौरान प्रति अच्छी तरह से चार यौगिकों के अनुक्रमिक प्रशासन की अनुमति देने के लिए चार बंदरगाहों से लैस है। प्रत्येक बंदरगाह में यौगिकों के इंजेक्शन से पहले और बाद में माप एकत्र किए जा सकते हैं, जिससे कोशिकाओं की चयापचय स्थिति के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी का पता चलता है।

इन दो अलग-अलग चयापचय मार्गों से पूछताछ करने से विभिन्न रोगजनक उत्तेजनाओं के संपर्क में आने के बाद आरपीई की चयापचय स्थिति के बारे में महत्वपूर्ण खोजें हो सकती हैं, और इस प्रकार आरपीई 6,7,8 की चयापचय अखंडता को बहाल करने में दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। उच्च-थ्रूपुट श्वसनमिति के आगमन और विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों की उपलब्धता ने आरपीई के बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल को परिभाषित करने और रोगअवस्थाओं के दौरान चयापचय और माइटोकॉन्ड्रिया में दोषों की पहचान करने में अधिक शोध को प्रेरित किया है 6,7,8,9,10,11,12,13 . उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री ने एएमडी और पीवीआर जैसे रेटिना पैथोलॉजी में आरपीई के चयापचय रीप्रोग्रामिंग की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला है। एएमडी और पीवीआर के रोगजनन में शामिल दो प्रमुख साइटोकिन्स विकास कारक-बीटा 2 (टीजीएफ2) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ) को बदल रहे हैं। टीजीएफ2 द्वारा उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) का प्रेरण माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, ओएक्सपीओएस दमन और आरपीई6 में ग्लाइकोलाइटिक क्षमता में प्रतिपूरक वृद्धि के साथ होता है। हाल ही में, प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन, टीएनएफ, को बेसल ओएक्सपीएचओएस के एक महत्वपूर्ण अपरेगुलेशन को प्रेरित करने और एच-आरपीई 7 में ग्लाइकोलाइसिस को कम करने के लिए दिखाया गयाहै। डाइमिथाइल फ्यूमरेट के प्रशासन ने एच-आरपीई में टीएनएफ-प्रेरित सूजन को काफी हद तक दबा दिया और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और बेसल बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल7 को बहाल किया। इन दो विकास कारकों से प्रेरित अलग-अलग चयापचय प्रोफाइल रेटिना रोगों में चयापचय रीप्रोग्रामिंग की भागीदारी के बारे में पेचीदा यांत्रिक प्रश्नों को उत्तेजित करते हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति का उपयोग करके एच-आरपीई में ओएक्सपीएचओएस और ग्लाइकोलाइटिक बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल का आकलन करने के चरणों का वर्णन करता है।

Protocol

1. सेल कल्चर प्लेट में एच-आरपीई चढ़ाना

  1. मानव आरपीई माध्यम में टी 25 फ्लास्क में पिघलना एच-आरपीई को आरपीई विकास माध्यम की खुराक (4 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 25 एनजी / एमएल एफजीएफ -2, 2% एफबीएस, 30 मिलीग्राम / एमएल जेंटामाइसिन, और 15 μg / mL एम्फोटेरिसिन) के साथ पूरक किया जाता है।
  2. एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन मीडिया को ताज़ा करें और टी 75 फ्लास्क में 1: 3 के अनुपात में पारित होने से पहले कोशिकाओं को कम से कम 80% संगम तक पहुंचने की प्रतीक्षा करें।
  3. एक बार कॉन्फ्लुएंट होने के बाद, ट्रिप्सिन / ईडीटीए 0.025% समाधान, ट्रिप्सिन न्यूट्रलाइजिंग समाधान और एचईपीईएस बफर्ड खारा (पीएच 7.0-7.6) से युक्त उपसंस्कृति अभिकर्मकों किट का उपयोग करके कोशिकाओं को पारित करें।
    1. एच-आरपीई को 3 एमएल एचईपीईएस बफर्ड सेलाइन के साथ धीरे से धोएं। फिर ट्रिप्सिन / ईडीटीए के 3 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) इनक्यूबेट करें (या जब तक कोशिकाएं फ्लास्क के आधार से नहीं हट जाती हैं, जैसा कि माइक्रोस्कोप के नीचे देखा गया है)। ट्रिप्सिन/ईडीटीए को 3 एमएल ट्रिप्सिन न्यूट्रलाइजिंग सॉल्यूशन के साथ बेअसर करें।
    2. सेल पेलेट बनाने के लिए 3.5 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सावधानी से तैरने वाले को चूसें और त्याग दें।
  4. मानव आरपीई माध्यम में कोशिकाओं को प्रति 100 μL प्रति कुएं में 20,000 कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता तक पुन: निलंबित कर दिया।
    1. 96-वेल सेल कल्चर माइक्रोप्लेट में पाइपिंग की आसानी और स्थिरता के लिए मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके यह सुनिश्चित करने के लिए कि सेल सस्पेंशन सजातीय है, कई बार ऊपर और नीचे करें। एक सम, सजातीय सेल परत के लिए कुएं के शीर्ष पर गोलाकार रिम के ठीक नीचे पिपेट टिप को आराम दें।
      नोट: कोई कोटिंग की आवश्यकता नहीं है क्योंकि कोशिकाएं माइक्रोप्लेट का अच्छी तरह से पालन करती हैं।
    2. पृष्ठभूमि सुधार कुओं (चित्रा 1 ए) के रूप में सेवा करने के लिए चार कोने के कुओं को कोशिकाओं (केवल मीडिया के 100 μL) से खाली छोड़ना सुनिश्चित करें।
      नोट: माइक्रोप्लेट को एक विशिष्ट 96-वेल प्लेट डिज़ाइन में स्वरूपित किया गया है; हालांकि, प्रत्येक कुएं का सतह क्षेत्र 0.106 सेमी2 है, जो मानक 96-वेल प्लेट से 40% छोटा है। इस सेल घनत्व पर, कोशिकाओं को अगले दिन 100% कॉन्फ्लुएंट होना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए उपचार का परीक्षण करने से पहले सेल घनत्व अनुकूलन प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है कि बेसल ओसीआर और ईसीएआर रीडिंग क्रमशः 50-100 pmol / min और 10-20 mph / min के आसपास हैं।
  5. सेल कल्चर प्लेट को इनक्यूबेटर (5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस, ह्यूमिडिफाइड) में वापस रखने से पहले 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर छोड़ दें ताकि किनारे के प्रभाव को कम करने में मदद मिल सके। एज प्रभाव वाष्पीकरण14 के कारण 96-वेल प्लेट की परिधीय सीमाओं के कुओं में मीडिया की मात्रा में परिवर्तन हैं।
    नोट: कोशिकाएं रात भर पालन करेंगी और अगले दिन एक कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर का निर्माण करेंगी। एच-आरपीई को हर 2-3 दिनों में आधे विकास मीडिया को ताज़ा करके कम से कम 1 महीने के लिए प्लेट में परिपक्व किया जाता है।
  6. उनकी आकृति विज्ञान और रंजकता स्तर की जांच करने के लिए मीडिया को बदलने से पहले माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं एक विशिष्ट कोबलस्टोन जैसी आकृति विज्ञान के साथ संयोजित हैं और समय के साथ रंजकता प्राप्त करती हैं, जैसा कि शू एट अल.7 में आकृति विज्ञान छवियों में देखा गया है।

2. परख चलाने से एक दिन पहले

  1. सुनिश्चित करें कि सेंसर कारतूस परख से एक दिन पहले उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक कुएं को 200 μL विआयनीकृत पानी से भरकर हाइड्रेटेड है।
    नोट: उपयोगिता प्लेट के ढक्कन में प्रत्येक कुएं के लिए ऑक्सीजन और पीएच स्तर को मापने के लिए फ्लोरोसेंट बायोसेंसर होते हैं। सेंसर फाइबर-ऑप्टिक वेवगाइड के साथ युग्मित होते हैं जो विभिन्न उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश प्रदान करते हैं और ऑप्टिकल फिल्टर के माध्यम से फोटोडिटेक्टरों को फ्लोरोसेंट सिग्नल प्रसारित करते हैं।
  2. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस ह्यूमिडिफाइड ओवन(सीओ 2 के बिना) में कैलिब्रेंट के ~ 20 एमएल (अगले दिन उपयोग के लिए गर्म करने के लिए) के साथ उपयोगिता प्लेट में पानी में डूबे सेंसर कारतूस रखें।
    नोट: कैलिब्रेंट सेंसर कारतूस अंशांकन के लिए डिज़ाइन किया गया एक मालिकाना समाधान है और फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) की संरचना में समान है। कारतूस जलयोजन के लिए न्यूनतम समय 4 घंटे है, लेकिन रात भर जलयोजन के साथ सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त किए जाते हैं।
  3. सुनिश्चित करें कि उपकरण चालू है और उपकरण को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस तक स्थिर करने की अनुमति देने के लिए सॉफ्टवेयर शुरू करें (चित्रा 2)। आम तौर पर, उपकरण को उपयोग में नहीं होने पर भी छोड़ा जा सकता है।

3. बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके वास्तविक समय माइटो तनाव परीक्षण

  1. परख के दिन, परख चलाने से कम से कम 45 मिनट पहले उपयोगिता प्लेट में पानी को गर्म कैलिब्रेंट की समान मात्रा के साथ बदलें।
  2. पूरक आहार जोड़कर फिनोल लाल के बिना आधार माध्यम का उपयोग करके माइटो स्ट्रेस टेस्ट परख मीडिया बनाएं, जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है। मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, पीएच को 7.4 में समायोजित करें, और ट्यूब टॉप फ़िल्टर यूनिट का उपयोग करके मीडिया को वैक्यूम फ़िल्टर करें। एक पूर्ण प्लेट चलाने के लिए, ~ 25 एमएल परख मीडिया बनाएं।
  3. मानव आरपीई मीडिया को हटा दें और इसे ताजा तैयार परख मीडिया (चरण 3.2) के 180 μL के साथ बदलें। परख शुरू करने से पहले सेल कल्चर प्लेट को 1 घंटे के लिए ह्यूमिडिफाइड 37 डिग्री सेल्सियस ओवन (सीओ2 के बिना) में रखें।
    नोट: यह सेल प्लेट को डी-गैसिंग के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे सीओ2 प्रसार की अनुमति मिलती है। चूंकि कोशिकाएं अब अपने विकास मीडिया में नहीं हैं और अब सीओ2 के साथ इनक्यूबेटर में नहीं हैं, इसलिए समय के साथ उनकी व्यवहार्यता बिगड़ जाएगी, इसलिए, परख को यथासंभव कुशलता से संचालित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए भी ध्यान रखा जाना चाहिए कि सेल कल्चर प्लेट में कोई बुलबुले न हों; यदि कोई मौजूद है, तो उन्हें पिपेट या सुई के साथ पॉप करें।
  4. प्रत्येक सेंसर कारतूस में परख के दौरान सेल कल्चर प्लेट के कुओं में परीक्षण यौगिकों के इंजेक्शन के लिए प्रति अच्छी तरह से चार अभिकर्मक वितरण पोर्ट होते हैं (चित्रा 1 सी, डी)। तालिका 2 के अनुसार संबंधित परख मीडिया में दवा स्टॉक को पतला करके 10x दवा समाधानों का ~ 3 एमएल तैयार करें। उदाहरण के लिए, पोर्ट ए को 25 μM ऑलिगोमाइसिन के साथ लोड करें, जैसे कि जब उपकरण द्वारा दवा की मात्रा को कुएं में इंजेक्ट किया जाता है, तो प्रत्येक सेल के संपर्क में आने वाली अंतिम एकाग्रता 2.5 μM होती है। और पोर्ट सी में 25 μL, प्रत्येक कुएं में निर्दिष्ट अंतिम दवा एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। सभी चार दवा बंदरगाहों की आवश्यकता वाले प्रोटोकॉल के लिए, पोर्ट डी में पिपेट 28 μL।
    नोट: पोर्ट्स ए /बी / सी / डी के उचित अभिविन्यास के लिए दवा बंदरगाहों में दवाओं को पाइप करते समय चित्रा 1 बी देखें। ड्रग पोर्ट्स लोड करते समय कारतूस के किनारे पर नॉच निचले बाएं कोने में स्थित होना चाहिए। प्रत्येक दवा बंदरगाह में एक कोण पर पाइपिंग करके, बुलबुले को कम किया जा सकता है। यदि कोई बुलबुले मौजूद हैं, तो उन्हें पिपेट या सुई के साथ पॉप करने का ध्यान रखा जाना चाहिए।
  5. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में टेम्प्लेट टैब खोलें, माइटो स्ट्रेस टेस्ट का चयन करें, और समूह परिभाषाएँ भरें।
    1. इंजेक्शन रणनीति पर इनपुट विवरण (इस मामले में, यह मिटो स्ट्रेस टेस्ट ड्रग्स के रूप में पूर्व-इनपुट है)। परख में विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों (जैसे, नियंत्रण या उपचार) के बारे में इनपुट विवरण। परख मीडिया पर इनपुट विवरण (आधार परख मीडिया में विभिन्न पूरक और उनकी विशिष्ट सांद्रता को जोड़ना) और अंत में सेल प्रकार जोड़ें।
    2. अगले टैब, प्लेट मैप पर क्लिक करें, जहां जांच किए जा रहे विभिन्न समूहों को 96-वेल प्लेट मानचित्र पर उनके विशिष्ट स्थान पर सौंपा जाएगा। एक बार ऐसा करने के बाद, डिफ़ॉल्ट माइटो स्ट्रेस टेस्ट प्रोटोकॉल के लिए उपकरण प्रोटोकॉल की समीक्षा करने के लिए प्रोटोकॉल टैब पर क्लिक करें।
      नोट: डिफ़ॉल्ट माइटो स्ट्रेस टेस्ट टेम्पलेट उपयोग करने के लिए तैयार है लेकिन प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुरूप किसी भी तरह से संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, डिफ़ॉल्ट मापने का समय 3 मिनट है, लेकिन यदि वांछित हो तो इसे 5 मिनट तक संशोधित किया जा सकता है।
  6. परख चलाएं पर क्लिक करें और सेंसर कारतूस डालें जो उपयोगिता प्लेट में कैलिब्रेंट समाधान में डूबा हुआ है। इस प्रक्रिया में लगभग 25 मिनट लगते हैं। इस चरण में, प्रत्येक बायोसेंसर को ज्ञात पीएच और ऑक्सीजन एकाग्रता के कैलिब्रेंट समाधान में मापा गया सेंसर आउटपुट के आधार पर स्वतंत्र रूप से कैलिब्रेट किया जाता है।
    1. एक बार जब यह कैलिब्रेट हो जाता है, तो उपयोगिता प्लेट को हटा दें और सेल कल्चर प्लेट डालें।
      नोट: सेल कल्चर प्लेट को पहले समतुल्य किया जाता है, जिसके बाद, उपकरण परख मीडिया को मिलाना और ओसीआर और ईसीएआर मूल्यों को मापना शुरू करता है। यह चरण लगभग 1.5 घंटे लेता है और उपयोगकर्ता के किसी भी हस्तक्षेप के बिना उपकरण के अंदर आयोजित किया जाता है। ओसीआर और ईसीएआर की बेसलाइन रीडिंग पहले 3 मिनट के लिए परख मीडिया को मिलाकर स्थापित की जाती है और फिर 3 मिनट के लिए ओसीआर और ईसीएआर को मापती है। उपकरण मिश्रण और माप के तीन छोर करता है।
    2. बेसलाइन माप के बाद, उपकरण स्वचालित रूप से पोर्ट ए दवा समाधान को प्रत्येक कुएं में इंजेक्ट करता है। इसके बाद मिश्रण और माप के तीन लूप (प्रत्येक 3 मिनट) होते हैं। प्रत्येक बाद की दवा इंजेक्शन (पोर्ट्स बी और सी) के बाद एक ही पैटर्न होता है।
  7. एक बार रन पूरा हो जाने के बाद, सेल कल्चर प्लेट और सेंसर कारतूस को हटा दें। गुणवत्ता नियंत्रण उद्देश्यों के लिए, सुनिश्चित करें कि सेंसर कारतूस में सभी दवा बंदरगाहों को बंदरगाहों की जांच करके इंजेक्ट किया गया है ताकि यह जांचा जा सके कि कोई अवशिष्ट दवा नहीं बची है। सेंसर कारतूस और उपयोगिता प्लेट को त्याग दें क्योंकि वे एकल-उपयोग आइटम हैं।
  8. माइक्रोस्कोप के तहत सेल कल्चर माइक्रोप्लेट में कोशिकाओं की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अभी भी कोशिकाओं का एक कंफ्लुएंट मोनोलेयर है। परख मीडिया को छोड़ दें और इसे प्रत्येक कुएं में 1x लाइसिस बफर के 60 μL के साथ बदलें।
    नोट: लाइसिस बफर 1 एमएम फिनाइलमेथिलसल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) के अतिरिक्त विआयनीकृत पानी में 1x तक पतला 10x लाइसिस बफर से बनाया गया है।
  9. वाष्पीकरण को रोकने के लिए पैराफिल्म में प्लेट के किनारों को लपेटें और बीसीए परख का उपयोग करके प्रोटीन सामग्री का परिमाणीकरण करने से पहले रात भर सेल लाइसिस में सहायता के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
  10. डेटा विश्लेषण के लिए, प्रत्येक कुएं में प्रोटीन के माइक्रोग्राम द्वारा ओसीआर और ईसीएआर मूल्यों को विभाजित करके सभी डेटा को सामान्य करें। माइटो स्ट्रेस टेस्ट रिपोर्ट जनरेटर निर्यात करें, जो डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मिटो स्ट्रेस टेस्ट पैरामीटर की स्वचालित रूप से गणना करने के लिए एक्सेल मैक्रोज़ का उपयोग करता है।
    नोट: इसका उपयोग बेसल श्वसन, अधिकतम श्वसन, अतिरिक्त श्वसन क्षमता, प्रोटॉन रिसाव, एटीपी उत्पादन और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इन गणनाओं की परिभाषाएँ तालिका 3 में सूचीबद्ध हैं।

4. बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग करके वास्तविक समय ग्लाइकोलाइटिक तनाव परीक्षण

  1. तालिका 1 और तालिका 2 में दिखाए गए विभिन्न परख मीडिया की खुराक और दवा इंजेक्शन का उपयोग करने के अलावा, माइटो स्ट्रेस टेस्ट के समान चरणों का पालन करके ग्लाइकोलाइटिक तनाव परीक्षण करें।
  2. डेटा विश्लेषण के लिए, ग्लाइकोलाइटिक स्ट्रेस टेस्ट रिपोर्ट जनरेटर निर्यात करें, जो डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर से ग्लाइकोलाइटिक स्ट्रेस टेस्ट पैरामीटर की स्वचालित रूप से गणना करने के लिए एक्सेल मैक्रोज़ का उपयोग करता है।
    नोट: इसका उपयोग गैर-ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण, ग्लाइकोलाइसिस, ग्लाइकोलाइटिक क्षमता और ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इन गणनाओं की परिभाषाएँ तालिका 3 में सूचीबद्ध हैं।

5. बीसीए प्रोटीन परिमाणीकरण परख

नोट: बिसिंकोनिक एसिड (बीसीए) प्रोटीन परिमाणीकरण परख (जिसे स्मिथ परख15 के रूप में भी जाना जाता है) एक तांबा-आधारित वर्णमिति परख है जिसका उपयोग नमूने में कुल प्रोटीन सामग्री निर्धारित करने के लिए किया जाता है। प्रत्येक कुएं में प्रोटीन के माइक्रोग्राम में ओसीआर और ईसीएआर डेटा को सामान्य करना यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं / प्रोटीन की अलग-अलग मात्रा रीडिंग को कम नहीं करती है। बीसीए परख का तंत्र दो रासायनिक प्रतिक्रियाओं पर आधारित है। सबसे पहले, प्रोटीन में पेप्टाइड बॉन्ड कपरिक आयनों (क्यू2 +) को कपस आयनों (क्यू +) में कम करते हैं, जो उच्च तापमान (37 से 60 डिग्री सेल्सियस) द्वारा सहायता प्राप्त तापमान-निर्भर प्रतिक्रिया है। यदि अधिक पेप्टाइड बांड हैं, तो समाधान में प्रोटीन सामग्री के लिए क्यू2 + की मात्रा आनुपातिक बनाताहै। इस प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप हरे से तीव्र बैंगनी समाधान में रंग परिवर्तन होता है, जिसमें 562 एनएम16 पर चरम अवशोषण होता है। नमूने में प्रोटीन की मात्रा जितनी अधिक होगी, इस तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण उतना ही अधिक होगा। इस किट की कार्य सीमा 20-2,000 μg / mL है।

  1. बीसीए परख किट में 2 मिलीग्राम / एमएल पर बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 1 एमएल एलिकोट होते हैं, जो प्रोटीन एकाग्रता संदर्भ मानक के रूप में कार्य करता है। 2 मिलीग्राम /एमएल बीएसए से शुरू करके एक स्पष्ट, सपाट तल वाली 96-वेल प्लेट में एक सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें और बाद में विआयनीकृत पानी (जैसे, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 मिलीग्राम / एमएल, आदि) में पतला करके एकाग्रता को आधा कर दें। प्रोटीन की एक ज्ञात एकाग्रता का उपयोग एक मानक वक्र की गणना के लिए अनुमति देता है, जिसका उपयोग प्रयोगात्मक नमूनों की प्रोटीन सामग्री की गणना करने के लिए किया जाता है। गणना किए गए प्रोटीन सामग्री माप की सटीकता में सुधार करने के लिए, प्रत्येक परख के लिए प्रयोगात्मक नमूनों के साथ प्रोटीन एकाग्रता संदर्भ मानकों के अवशोषण रीडिंग को मापें।
  2. 96-वेल प्लेट में डुप्लिकेट में प्रत्येक बीएसए सीरियल तनुकरण का 25 μL पिपेट।
  3. 1x लाइसिस बफर के पिपेट 25 μL को 96-वेल प्लेट में डुप्लिकेट में रिक्त स्थान के रूप में सेवा करने के लिए।
  4. सेल कल्चर प्लेट को कमरे के तापमान पर पिघलाएं और प्रत्येक सेल लाइसेट के 25 μL को डुप्लिकेट में 96-वेल प्लेट में मिलाएं।
  5. बीसीए किट अभिकर्मकों ए: बी के 50: 1 अनुपात में काम करने वाले अभिकर्मक तैयार करें। काम करने वाले अभिकर्मक में किसी भी टर्बिडिटी को दूर करने के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, ताकि यह एक समरूप हरा समाधान हो। प्रत्येक कुएं में काम करने वाले अभिकर्मक का 200 μL जोड़ें।
  6. प्लेट को पन्नी में कवर करके प्लेट को प्रकाश से बचाएं और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में इनक्यूबेट करें।
  7. 96-वेल प्लेट रीडर में 562 एनएम पर अवशोषण को मापें।
  8. डेटा विश्लेषण के लिए, सभी डुप्लिकेट मानों का औसत निकालें. सभी नमूनों के माप से 1x लाइसिस बफर कुओं से निर्धारित रिक्त अवशोषण स्तरों को घटाएं। प्रत्येक बीएसए मानक के अवशोषण को μg/mL में इसकी ज्ञात सांद्रता के लिए प्लॉट करके मानक वक्र निर्धारित करें। प्रयोगात्मक नमूनों की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए मानक वक्र से प्राप्त रैखिक समीकरण का उपयोग करें।

Representative Results

उपकरण एक साथ प्रत्येक रन के लिए ओसीआर और ईसीएआर दोनों को मापता है। माइटो स्ट्रेस टेस्ट के लिए, पैरामीटर गणना ओसीआर रीडिंग (चित्रा 3 ए) पर आधारित है, जबकि ग्लाइकोलाइटिक तनाव परीक्षण के लिए, पैरामीटर गणना ईसीएआर रीडिंग (चित्रा 3 बी) पर आधारित है। चित्रा 3 समय के साथ माइटो स्ट्रेस टेस्ट ओसीआर वक्र (चित्रा 3 सी) के लिए प्रतिनिधि ग्राफ और एच-आरपीई (चित्रा 3 डी) के लिए बार ग्राफ के रूप में पैरामीटर गणना दिखाता है। ग्लाइकोलाइटिक स्ट्रेस टेस्ट को समय के साथ ईसीएआर वक्र के रूप में दर्शाया जाता है (चित्रा 3 ई), और पैरामीटर गणना एच-आरपीई (चित्रा 3 एफ) के लिए बार ग्राफ में प्रदर्शित की जाती है।

बेसल श्वसन बेसल स्थितियों के तहत कोशिकाओं की ऊर्जावान मांगों की समझ प्रदान करताहै। पहला दवा इंजेक्शन, ऑलिगोमाइसिन (ओलिगो), एक एटीपी सिंथेस अवरोधक है, और इस प्रकार, पहले दवा इंजेक्शन के बाद ओसीआर की कोई भी कमी एटीपी-लिंक्ड श्वसन18 का एक उपाय है। बाद में दवा इंजेक्शन के बाद किसी भी शेष बेसल श्वसन को प्रोटॉन रिसाव के रूप में माना जाता है क्योंकि यह एटीपी संश्लेषण के साथ युग्मित नहीं है। बढ़े हुए प्रोटॉन रिसाव से माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग में वृद्धि हो सकती है, जो शारीरिक रूप से मौजूद प्रोटीन को अनकपलिंग द्वारा नियंत्रित किया जाता है, लेकिन मोटापे, कैंसर, टाइप 2 मधुमेह और हृदय रोग19 जैसी विकृतियों से भी जुड़ा हुआ है। दूसरा इंजेक्शन माइटोकॉन्ड्रिया की अधिकतम श्वसन क्षमता निर्धारित करने के लिए बीएएम 15 या एफसीसीपी जैसे एक अनकपलिंग एजेंट का है। अनकपलिंग एजेंट प्रोटॉन ढाल को ध्वस्त कर देते हैं और माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली में प्रोटॉन मोटिव बल को कम करते हैं। परिणाम इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) के माध्यम से इलेक्ट्रॉनों का एक निर्बाध प्रवाह है, जो ऑक्सीजन की खपत की दर को बढ़ाता है और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को अपनी अधिकतम क्षमता20 तक पहुंचने का कारण बनता है। स्पेयर श्वसन क्षमता (एसआरसी) अधिकतम और बेसल श्वसन के बीच का अंतर है, जो चुनौती दिए जाने पर ऊर्जावान मांगों में परिवर्तन का जवाब देने के लिए कोशिकाओं की क्षमता को दर्शाता है, जो सेल फिटनेस का संकेत देता है। महत्वपूर्ण रूप से, एच-आरपीई में माइटो स्ट्रेस टेस्ट के लिए, बीएएम 15 माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता (चित्रा 4 ए, बी) को बढ़ाने में एफसीसीपी से बेहतर है, क्योंकि अधिकतम श्वसन और अतिरिक्त श्वसन क्षमता 500 एनएम या 1 एसएम एफसीसीपी की तुलना में 10 μM BAM15 के साथ काफी अधिक है। एफसीसीपी खुराक के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया। रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए (रोट / एए) का तीसरा और अंतिम इंजेक्शन क्रमशः ईटीसी के माइटोकॉन्ड्रियल कॉम्प्लेक्स I और III को रोकता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को बंद कर देता है; कोई भी अवशिष्ट ओसीआर गैर-माइटोकॉन्ड्रियल स्रोतोंके कारण होता है।

ग्लाइकोलाइसिस के दौरान, ग्लूकोज का एक अणु ऑक्सीजन की अनुपस्थिति में लैक्टेट के दो अणुओं में परिवर्तित हो जाता है। कोशिका से लैक्टेट का एक्सट्रूज़न प्रति लैक्टेट अणु में एक प्रोटॉन के प्रवाह के साथ होता है, इसलिए बाह्य अंतरिक्ष का अम्लीकरण होता है। मीडिया में प्रोटॉन उत्पादन के प्रवाह को ईसीएआर में परिवर्तन द्वारा मापा जाता है। बेसल ग्लाइकोलाइसिस का स्तर पहले स्थापित किया जाता है, जिसके बाद ग्लूकोज को परख मीडिया में इंजेक्ट किया जाता है, जो ग्लाइकोलाइसिस को प्रेरित करने के लिए ग्लूकोज से रहित है और इस प्रकार ईसीएआर स्तर22 को बढ़ाता है। ओलिगोमाइसिन को "उच्चतम" ईसीएआर को प्रेरित करने के लिए इंजेक्ट किया जाता है क्योंकि यह माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी उत्पादन को रोकता है, इस प्रकार कोशिका को ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से अपना एटीपी प्राप्त करने के लिए मजबूर करता है। अंत में, ग्लाइकोलाइसिस को 2डीजी जोड़कर बंद कर दिया जाता है, जो ग्लाइकोलाइसिस23 के पहले एंजाइम हेक्सोकाइनेज को रोकता है। किसी भी शेष ईसीएआर की संभावना अम्लीकरण के अन्य स्रोतों के कारण होती है, जैसे कि ओएक्सपीएचओएस के दौरान टीसीए चक्र द्वारा सीओ2 उत्पादन, और इसे गैर-ग्लाइकोलाइटिक ईसीएआर के रूप में निरूपित किया जाता है। ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व की गणना ग्लूकोज की उपस्थिति में "उच्चतम" ईसीएआर और ईसीएआर के बीच अंतर के रूप में की जाती है। ग्लाइकोलाइटिक क्षमता ग्लाइकोलाइसिस और ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व का योग है।

Figure 1
चित्र 1: प्लेट और सेंसर कारतूस के घटक। (A) उपकरण, डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर और प्रोटोकॉल सेटअप इंटरफ़ेस दिखाया गया है। 96-वेल कल्चर प्लेट लेआउट में, कोशिकाओं को नीले रंग के कुओं में चढ़ाया जाता है और चार कोने के कुओं को काले रंग में चिह्नित किया जाता है, क्योंकि वे पीछे के सुधार कुओं के रूप में काम करते हैं जिनमें केवल मीडिया होता है (और कोई कोशिका नहीं)। (बी) सेंसर कारतूस के प्रत्येक कुएं के लिए चार दवा बंदरगाह हैं जहां ड्रग्स ए, बी, सी और डी लोड किए जा सकते हैं। प्रत्येक बंदरगाह में पिपेट करने के वॉल्यूम को 10x दवा स्टॉक तैयारी के लिए गणना के आधार पर सूचीबद्ध किया गया है। (सी) सेंसर कारतूस में सेंसर प्रोब होते हैं जिन्हें सीधे कैलिब्रेंट से भरी उपयोगिता प्लेट में रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: परख की समयरेखा। कोशिकाओं को सेल कल्चर प्लेट में बीज दिया जाता है। एक बार तैयार होने के बाद, परख में बीसीए परख और बाद के डेटा विश्लेषण का उपयोग करके प्रोटीन सामग्री का परिमाणीकरण करने के बाद 2 दिन की प्रक्रिया शामिल होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: माइटो स्ट्रेस टेस्ट और ग्लाइकोलाइटिक स्ट्रेस टेस्ट के प्रतिनिधि ग्राफ। (ए) माइटो स्ट्रेस टेस्ट और (बी) ग्लाइकोलाइटिक स्ट्रेस टेस्ट मापदंडों की गणना योजनाबद्ध में दर्शाई गई है। (सी) एच-आरपीई के लिए प्रतिनिधि ऑक्सीजन खपत (ओसीआर) वक्र और (डी) माइटो तनाव परीक्षण पैरामीटर दिखाए गए हैं। (ई) एच-आरपीई के लिए प्रतिनिधि बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) वक्र और (एफ) ग्लाइकोलाइटिक तनाव परीक्षण पैरामीटर दिखाए गए हैं। त्रुटि पट्टियाँ SEM ± साधन हैं. कृपया इस आरेख का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक अनकपलिंग एजेंट के रूप में बीएएम 15 बनाम एफसीसीपी की तुलना। एच-आरपीई पर माइटो स्ट्रेस टेस्ट 10 μM BAM15, 500 nM FCCP, या 1 μM FCCP का उपयोग करके अधिकतम श्वसन को प्रेरित करने की प्रभावकारिता की तुलना करता है, जो (A) ऑक्सीजन खपत दर (OCR) वक्र और (B) माइटो स्ट्रेस टेस्ट पैरामीटर दिखाता है। त्रुटि पट्टियाँ SEM ± साधन हैं। **** p ≤ 0.0001; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

परीक्षा ग्लूकोज (mM) ग्लूटामैक्स (mM) सोडियम पाइरूवेट (mM) HEPES (mM)
मिटो स्ट्रेस टेस्ट 25 2 1 1
ग्लाइकोलाइटिक तनाव परीक्षण कोई नहीं 0.5 कोई नहीं 1

तालिका 1: माइटो और ग्लाइकोलाइटिक तनाव परीक्षणों के लिए परख मीडिया में जोड़े गए पूरक की एकाग्रता।

 परीक्षा पोर्ट ए पोर्ट बी पोर्ट C
मिटो स्ट्रेस टेस्ट ओलिगोमाइसिन 2.5 μM FCCP 500 nM या BAM15 10 μM रोटेनोन 2 μM और Antimycin A 2 μM
ग्लाइकोलाइटिक तनाव परीक्षण ग्लूकोज 10 mM ओलिगोमाइसिन 2 μM 2-डीऑक्सीग्लूकोज 50 एमएम

तालिका 2: माइटो और ग्लाइकोलाइटिक तनाव परीक्षणों के लिए ड्रग पोर्ट इंजेक्शन की सांद्रता। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ये अंतिम सांद्रता हैं जो कोशिकाओं को प्रत्येक कुएं में दवाओं के इंजेक्शन के बाद उजागर किया जाता है। दवा बंदरगाहों को लोड करते समय दवाओं को 10 गुना मजबूत तैयार किया जाना चाहिए।

अवधि परिभाषा
कैलिब्रेंट कैलिब्रेंट एक समाधान है जिसका उपयोग सेंसर कारतूस को कैलिब्रेट करने के लिए किया जाता है। इसका सूत्रीकरण मालिकाना है और पीबीएस के समान संरचना है।
सेंसर कारतूस सेंसर कार्ट्रिज में सेंसर कार्ट्रिज आस्तीन में एम्बेडेड दो फ्लोरोफोर होते हैं जो फाइबर ऑप्टिक बंडलों से जुड़े होते हैं जो प्रकाश उत्सर्जित करते हैं, फ्लोरोफोरे को उत्तेजित करते हैं। एक फ्लोरोफोरे ऑक्सीजन फ्लक्स को मापता है और दूसरा प्रोटॉन फ्लक्स को मापता है। प्रत्येक सेंसर कारतूस भी परख के दौरान प्रति कुएं 4 यौगिकों के अनुक्रमिक प्रशासन की अनुमति देने के लिए 4 बंदरगाहों से लैस है।
उपयोगिता प्लेट उपयोगिता प्लेट (जिसे कैलिब्रेंट प्लेट के रूप में भी जाना जाता है) का उपयोग सेंसर को कैलिब्रेट करने के लिए किया जाता है। कैलिब्रेंट समाधान उपयोगिता प्लेट में रखा गया है।
मिटो स्ट्रेस टेस्ट माइटो स्ट्रेस टेस्ट परख का नाम है जो समय के साथ ओसीआर में परिवर्तन की साजिश करके माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल प्रदान करता है।
ग्लाइकोलाइटिक तनाव परीक्षण ग्लाइकोलाइटिक स्ट्रेस टेस्ट परख का नाम है जो समय के साथ ईसीएआर में परिवर्तन की योजना बनाकर ग्लाइकोलाइटिक बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल प्रदान करता है।
ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) ऑक्सीजन की खपत दर ऑक्सीजन फ्लक्स (pmol / min) का एक उपाय है और माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय स्थिति को इंगित करता है।
बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) एक्स्ट्रासेल्युलर अम्लीकरण दर प्रोटॉन एफ्लक्स (एमपीएच / मिनट) का एक उपाय है और ग्लाइकोलाइटिक चयापचय स्थिति को इंगित करता है।
वेव सॉफ्टवेयर वेव सॉफ्टवेयर का उपयोग परख और बाद के डेटा विश्लेषण की प्रोग्रामिंग के लिए किया जाता है
गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत एंटीमाइसिन ए इंजेक्शन के बाद न्यूनतम दर माप
बेसल श्वसन (पहले इंजेक्शन से पहले अंतिम दर माप) - (गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर)
अधिकतम श्वसन (एफसीसीपी इंजेक्शन के बाद अधिकतम दर माप) - (गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन)
एच + (प्रोटॉन) रिसाव (ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन के बाद न्यूनतम दर माप) - (गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन)
एटीपी उत्पादन (ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन से पहले अंतिम दर माप) - (ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन के बाद न्यूनतम दर माप)
अतिरिक्त श्वसन क्षमता (अधिकतम श्वसन) – (बेसल श्वसन)
अतिरिक्त श्वसन क्षमता एक % के रूप में (अधिकतम श्वसन) / (बेसल श्वसन) × 100
युग्मन दक्षता एटीपी उत्पादन दर) / (बेसल श्वसन दर) × 100
ग्लाइकोलाइसिस (ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन से पहले अधिकतम दर माप) - (ग्लूकोज इंजेक्शन से पहले अंतिम दर माप)
ग्लाइकोलाइटिक क्षमता (ओलिगोमाइसिन इंजेक्शन के बाद अधिकतम दर माप) - (ग्लूकोज इंजेक्शन से पहले अंतिम दर माप)
ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व (ग्लाइकोलाइटिक क्षमता) - (ग्लाइकोलाइसिस)
ग्लाइकोलाइटिक रिजर्व एक % के रूप में (ग्लाइकोलाइटिक क्षमता दर) / (ग्लाइकोलाइसिस) × 100
गैर-ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण ग्लूकोज इंजेक्शन से पहले अंतिम दर माप

तालिका 3: परख के प्रमुख घटकों की परिभाषाओं की सूची।

Discussion

एच-आरपीई के उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनोमेट्री के लिए इस अनुकूलित प्रोटोकॉल में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एफसीसीपी के बजाय अनकपलर के रूप में बीएएम 15 का उपयोग शामिल है। जबकि आरपीई के उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनोमेट्री पर पिछले अध्ययनों ने एफसीसीपी 9,24 का उपयोग किया था, बीएएम 15 एफसीसीपी की तुलना में एच-आरपीई में अधिकतम श्वसन स्तर के अधिक मजबूत प्रेरण को प्रेरित करता प्रतीत होता है। जबकि एफसीसीपी और बीएएम 15 दोनों कोशिकाओं में उपयोग करने के लिए सुरक्षित हैं, बीएएम 15 को एफसीसीपी या कार्बोनिलसाइनाइड -3-क्लोरोफेनिलहाइड्राज़ोन (सीसीसीपी) 25 की तुलना में सामान्य कोशिकाओं में कम दुष्प्रभाव होने की सूचना है। केनवुड एट अल ने दिखाया कि बीएएम 15 प्लाज्मा झिल्ली क्षमता को प्रभावित किए बिना माइटोकॉन्ड्रिया को विध्रुवित करता है, इस प्रकार कम साइटोटॉक्सिसिटी26 पर एक निरंतर अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर को प्रेरित करता है। दूसरी ओर, एफसीसीपी माइटोकॉन्ड्रिया और प्लाज्मा झिल्ली दोनों को विध्रुवित करता है और उच्च साइटोटॉक्सिसिटी26 प्रदर्शित करता है।

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, जिसमें यह सुनिश्चित करना शामिल है कि माइक्रोप्लेट के सभी प्रयोगात्मक कुओं में कोशिकाओं को आरपीई के एक कंफ्लुएंट, यहां तक कि और समरूप मोनोलेयर में ठीक से चढ़ाया जाता है। परिपक्व आरपीई ऊर्जा उत्पादन के लिए ओएक्सपीओएस पर अत्यधिक निर्भर हैं, और इस प्रकार कोशिकाओं को कम से कम 1 महीने के लिए परिपक्व होने की अनुमति दी जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि आरपीई परख के दौरान उचित बेसल और अधिकतम ओसीआर रीडिंग उत्पन्न करता है। उपकरण में रखने से पहले एक ह्यूमिडिफाइड ओवन (सीओ2 के बिना) में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर प्लेट को डी-गैसिंग करना सटीक ईसीएआर रीडिंग के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि सीओ2 परख मीडिया के पीएच को प्रभावित कर सकता है। परख से एक दिन पहले सेंसर कारतूस को हाइड्रेट करना याद रखना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह परख के दिन विश्वसनीय ओसीआर और ईसीएआर रीडिंग प्रदान करता है। इंजेक्शन की जाने वाली दवाओं को ठीक से पुनर्गठित करने और फ्रीज/पिघलने चक्रों को कम करने के लिए दीर्घकालिक भंडारण के लिए पुनर्गठित दवा स्टॉक को छोटी मात्रा में एलिकोट करने का ध्यान रखा जाना चाहिए। 10x दवा समाधान तैयार करना महत्वपूर्ण है जो संबंधित परख मीडिया (जैसे, माइटो स्ट्रेस टेस्ट के लिए मिटो स्ट्रेस टेस्ट परख मीडिया में पतला) में पतला है ताकि परख मीडिया से भरे प्रत्येक अच्छी तरह से दवा के इंजेक्शन से कमजोर पड़ने में कारक हो सके। प्रत्येक बाद की दवा इंजेक्शन के साथ प्रत्येक कुएं में अधिक मीडिया होता है, और इस प्रकार प्रत्येक इंजेक्शन के साथ लोड की जा रही दवा की मात्रा बढ़ जाती है, और प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट मात्रा का पालन करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। सेंसर कारतूस की जांच करके प्रयोग के पूरा होने पर गुणवत्ता की जांच करना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई अवशिष्ट दवा स्पष्ट नहीं है और माइक्रोस्कोप के तहत सेल कल्चर प्लेट का अवलोकन करना यह सुनिश्चित करने के लिए कि कंफ्लुएंट और सजातीय सेल मोनोलेयर बना रहे।

इस प्रोटोकॉल में संशोधनों में बंदरगाहों में विभिन्न दवाओं को इंजेक्ट करना और यह निर्धारित करना शामिल है कि ये दवाएं ओसीआर और ईसीएआर रीडिंग को कैसे प्रभावित करती हैं। एक लोकप्रिय संशोधन सामान्य माइटो या ग्लाइकोलाइटिक स्ट्रेस टेस्ट दवाओं को इंजेक्ट करने से पहले पोर्ट ए के रूप में पसंद की एक प्रयोगात्मक दवा इंजेक्ट करना है। इस प्रकार का प्रोटोकॉल अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कि पसंद की दवा का एक तीव्र इंजेक्शन बाद के ओएक्सपीएचओएस और ग्लाइकोलाइटिक मापदंडों को कैसे प्रभावित करता है। अन्य संशोधनों में विभिन्न सेल प्रकारों की जांच करना शामिल है; इसके लिए इष्टतम सीडिंग सेल घनत्व के प्रारंभिक समस्या निवारण और परख मीडिया के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, यह सुनिश्चित करके कि बेसल रीडिंग ओसीआर के लिए 50-100 pmol / min और ECAR के लिए 10-20 mph / min तक होती है। इंजेक्शन वाली दवाओं की इष्टतम सांद्रता को दवाओं के क्रमिक कमजोर पड़ने के लिए ओसीआर और ईसीएआर प्रतिक्रियाओं को देखकर जांच किए गए प्रत्येक नए सेल प्रकार के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है।

प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि सेल व्यवहार्यता समय के साथ कम हो जाती है, क्योंकि कोशिकाएं अपने सामान्य विकास मीडिया में सीओ2 इनक्यूबेटर में नहीं होती हैं, और इस प्रकार अधिकतम सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए परख को 3-4 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। इसके अलावा, प्रत्येक कुएं में इंजेक्ट किए गए माइटोकॉन्ड्रियल विषाक्त पदार्थों के संपर्क में आने से समय के साथ सेल व्यवहार्यता कम हो सकती है। एक बार परख पूरी हो जाने के बाद, कोशिकाओं को ओसीआर और ईसीएआर रीडिंग को सामान्य करने के लिए प्रोटीन सामग्री के मूल्यांकन के लिए लाइस किया जाना चाहिए, और इस प्रकार बाद के आणविक जीव विज्ञान परख के लिए एक ही कोशिकाओं को काटा नहीं जा सकता है।

बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग के लिए सीहॉर्स के विकल्पों में ओरोबोरोस ऑक्सीग्राफ 2 के (ओ 2 के) 27, बारोफ्यूज़28,29 और रेसिफर (ल्यूसिड साइंटिफिक) 7 शामिल हैं। ओरोबोरोस ओ 2 के एक बंद दो-कक्ष श्वासरोमीटर है जो एस 1 क्लार्क-प्रकार पोलारोग्राफिक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है। जबकि ओरोबोरोस ओ 2 के वास्तविक समय चयापचय प्रवाह के अत्यधिक संवेदनशील माप पैदा करता है, डिवाइस श्रम-गहन है क्योंकि ऑपरेटर को प्रत्येक दवा30 को मैन्युअल रूप से इंजेक्ट करने की आवश्यकता होती है। BaroFuse एक नया मल्टीचैनल माइक्रोफ्लुइडिक छिड़काव प्रणाली है जो कई समानांतर छिड़काव प्रयोगों को सक्षम करने के लिए गैस दबाव का उपयोग करता है और ओसीआर को मापने के लिए ऑक्सीजन डिटेक्शन सिस्टम से जुड़ा हुआ है। इस प्रवाह संस्कृति प्रणाली का लाभ यह है कि ऊतक समारोह और व्यवहार्यता बनाए रखी जाती है, जैसा कि सीहॉर्स के विपरीत है जहां सेल व्यवहार्यता लंबे समय तक कम हो जाती है। रेसिफर ओसीआर को मापने के लिए अत्यधिक संवेदनशील ऑप्टिकल ऑक्सीजन सेंसर का उपयोग करता है, जबकि कोशिकाएं इनक्यूबेटर में 96-वेल प्लेट में होती हैं, इसलिए कई हफ्तों से महीनों तक निरंतर ओसीआर माप को सक्षम करती हैं। विशेष रूप से, ये उपकरण ईसीएआर को नहीं मापते हैं, और इस प्रकार सीहॉर्स को ओएक्सपीएचओएस और ग्लाइकोलाइसिस दोनों के एक साथ अन्वेषण का लाभ है।

ओएक्सपीओएस और ग्लाइकोलाइसिस के वास्तविक समय बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल से पूछताछ करना आरपीई स्वास्थ्य और कार्य को चिह्नित करने में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में उभर रहा है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री सामान्य और रोगग्रस्त आरपीई की चयापचय स्थिति की तुलना करने का एक कुशल साधन सक्षम बनाता है, इस प्रकार एएमडी और पीवीआर जैसे रेटिना रोगों के लिए दवा प्रभावकारिता की जांच के नए रास्ते खोलता है। आरपीई पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासमिति के लिए भविष्य के निर्देशों में ट्रांसवेल फिल्टर पर उगाए गए अत्यधिक ध्रुवीकृत आरपीई मोनोलेयर के लिए बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल का अनुकूलन शामिल है। कैल्टन एट अल (2016) ने ट्रांसवेल फिल्टर31 पर उगाए गए ध्रुवीकृत आरपीई मोनोलेयर के त्रिकोणीय खंड को काटकर इसे सफलतापूर्वक हासिल किया। कार्यप्रणाली के आगे विस्तार में प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न आरपीई (आईपीएससी-आरपीई) के बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल की जांच करना शामिलहै, जो विभिन्न रेटिना अपक्षयी स्थितियों वाले रोगियों से अलग है। एएमडी और पीवीआर में शामिल रोगजनक साइटोकिन्स आरपीई चयापचय की गतिशील प्रकृति को कैसे प्रभावित करते हैं, इसकी खोज चयापचय कमजोरियों को प्रकट कर सकती है जो नए दवा योग्य लक्ष्यों की पहचान को सूचित कर सकती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: द फाइट फॉर साइट लियोनार्ड और रॉबर्ट वेनट्रॉब पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप (डी.वाई.एस.); मैकुलर अपघटन अनुसंधान में ब्राइटफोकस फाउंडेशन पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप प्रोग्राम (एम 2021010 एफ, डीवाईएस); रक्षा विभाग, स्पाइनल विजन रिसर्च प्रोग्राम पुरस्कार संख्या वीआर 180132 (एमएस-जी और एलएके) के तहत; राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय नेत्र संस्थान पुरस्कार संख्या R01EY027739 (L.A.K.) के तहत। इस शोध के समर्थन के लिए ब्राइटफोकस फाउंडेशन के एक कार्यक्रम मैकुलर अपघटन अनुसंधान एम 2021010 एफ के दाताओं को पावती दी जाती है। Biorender.com के साथ योजनाबद्ध बनाए गए थे

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose Sigma  D8375-5G Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection)
96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile VWR 229597 BCA Assay 96-well plate
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma A8674-25MG Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone)
BAM15 Sigma SML1760-5MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
BCA Assay ThermoFisher 23225 To determine total protein content in each well
Calibrant Solution Seahorse Bioscience  100840-000 Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge
Cell Lysis buffer 10x Cell Signaling Technologies 9803S Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use
D-(+)-Glucose solution Sigma G8644-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection)
DMSO, Cell culture grade Sigma-aldrich D4540-100ML For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG
FCCP Sigma C2920-10MG Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)
GlutaMAX Gibco 35050061 Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
HEPES solution Sigma H0887-100ML Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests
H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells Lonza 194987 Primary human fetal RPE cells
Oligomycin - CAS 1404-19-9 - Calbiochem Sigma 495455-10MG ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection)
Parafilm Bemis PM996 To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor Gold Biotechnology Inc 50-153-2823 Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution
ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL Lonza CC-5034 Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline
Rotenone Sigma R8875-1G Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A)
RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit - RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) Lonza 195409 Media for primary human fetal RPE cells
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent High-Resolution Respirometry Instrument
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution
Sodium pyruvate solution Sigma S8636-100ML Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size Millipore-Sigma SCGP00525  Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media
Synergy H1 Plate Reader BioTek Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay
XF base medium without phenol red  Agilent 103335-100 Base media for running the Seahorse assay

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References

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जीव विज्ञान अंक 192 चयापचय माइटोकॉन्ड्रिया रेटिना वर्णक उपकला ग्लाइकोलाइसिस ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन श्वसन बाह्य अम्लीकरण दर ऑक्सीजन की खपत दर उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति
उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री का उपयोग करके प्राथमिक मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं में बायोएनर्जेटिक का वास्तविक समय विश्लेषण
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