Summary
Den metabolske statusen til humane retinale pigmentepitelceller (H-RPE) gjenspeiler deres helse og funksjon. Presentert her er en optimalisert protokoll for å undersøke sanntids metabolsk fluks av H-RPE ved hjelp av høyoppløselig respirometri.
Abstract
Metabolsk dysfunksjon av retinale pigmentepitelceller (RPE) er en nøkkelpatogen driver for retinale sykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og proliferativ vitreoretinopati (PVR). Siden RPE er svært metabolsk aktive celler, gjenspeiler endringer i deres metabolske status endringer i helse og funksjon. Respirometri med høy oppløsning muliggjør kinetisk analyse i sanntid av de to viktigste bioenergetiske banene, glykolyse og mitokondriell oksidativ fosforylering (OXPHOS), gjennom kvantifisering av henholdsvis ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR) og oksygenforbruk (OCR). Følgende er en optimalisert protokoll for å utføre høyoppløselig respirometri på primære humane retinale pigmentepitelceller (H-RPE). Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av trinnene som er involvert i å produsere bioenergetiske profiler av RPE for å definere deres basale og maksimale OXPHOS og glykolytiske kapasiteter. Eksponering av H-RPE for forskjellige legemiddelinjeksjoner rettet mot mitokondrie- og glykolytisk maskineri resulterer i definerte bioenergetiske profiler, hvorfra viktige metabolske parametere kan beregnes. Denne protokollen fremhever den forbedrede responsen til BAM15 som et frakoblingsmiddel sammenlignet med karbonylcyanid p-trifluormetoksyfenylhydrazon (FCCP) for å indusere maksimal respirasjonskapasitet i RPE. Denne protokollen kan brukes til å studere den bioenergetiske statusen til RPE under forskjellige sykdomsforhold og teste effekten av nye legemidler for å gjenopprette den basale metabolske statusen til RPE.
Introduction
Retinale pigmentepitelceller (RPE) eksisterer som et monolag av pigmenterte epitelceller strategisk plassert mellom fotoreceptorene og fenestrert endotel i choriocapillaris. RPE er svært metabolsk aktive med mange funksjoner, inkludert (1) fagocytose av skurfotoreseptorskiver, (2) resirkulering av visuelt pigment for å opprettholde synssyklusen, (3) transport av næringsstoffer, metabolitter, ioner og vann, (4) absorpsjon av lys, (5) beskyttelse mot fotooksidasjon, (6) sekresjon av essensielle faktorer for å støtte retinal integritet og (7) dannelse av den ytre blod-retinale barrieren1 . Degenerasjon av RPE er assosiert med metabolsk dysfunksjon og mitokondrielle defekter, noe som fører til blindende øyesykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og proliferativ vitreoretinopati (PVR)2.
To viktige bioenergetiske veier inkluderer glykolyse, som forekommer i cytoplasma, og oksidativ fosforylering (OXPHOS), som forekommer i mitokondrier. Under glykolyse omdannes ett molekyl glukose til to pyruvatmolekyler og en nettoproduksjon av to molekyler adenosintrifosfat (ATP). I motsetning til glykolyse produserer OXPHOS langt høyere nivåer av ATP (~ 32-38 molekyler ATP per glukosemolekyl). Spesielt forbruker OXPHOS oksygen og krever funksjonelle mitokondrier for å forekomme, mens glykolyse forekommer i cytoplasma og krever ikke oksygen.
Før introduksjonen av fluorescens- eller fosforescensbaserte teknikker for å undersøke mitokondriell respirasjon, ble oksygennivåer målt i permeabiliserte cellesuspensjoner i kamre utstyrt med en Clark-type oksygenelektrode3. Mens Clark-elektroden er mye billigere enn fluorescensbasert respirometri og fungerer i ikke-adherente celler, er den relativt lav gjennomstrømning, med hver respiratorisk kjøring som varer rundt 15-20 minutter og krever langt høyere mengder celler for hver prøve3. Dermed har fluorescensbasert respirometriteknikk i stor grad erstattet Clark-elektroden og har blitt en populær teknikk innen metabolisme og mitokondriell forskning.
Denne protokollen beskriver en høy gjennomstrømning, høyoppløselig, fluorescensbasert respirometriteknikk som kinetisk måler OXPHOS og glykolytiske bioenergetiske profiler av levende celler. Siden prosessen med OXPHOS forbruker oksygen, produseres den bioenergetiske profilen for OXPHOS ved å kartlegge endringer i oksygenforbrukshastigheten (OCR) over tid4. I denne teknikken er to fluoroforer innebygd i sensorpatronhylsen som er koblet til fiberoptiske bunter som avgir lys, spennende fluoroforene. Endringer i fluoroforutslipp måles av svært følsomme fluorescenssensorer og overføres gjennom den fiberoptiske bunten som skal konverteres til en OCR-avlesning5. Fluoroforen blir slukket av oksygen, og muliggjør dermed bestemmelse av ekstracellulære oksygennivåer i analysemediet, kjent som oksygenfluks eller OCR. Den andre fluoroforen er en pH-sensorsonde som er følsom for endringer i protonutstrømning, som omdannes til et mål på ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR). Under målinger senkes de fiberoptiske buntene med innebygde fluoroforer til 200 μm over cellemonolaget, og skaper et forbigående mikrokammer som muliggjør raske sanntidsavlesninger. Når en 10% endring i oksygen- eller protonnivåer oppdages, løftes sensorene oppover, slik at et større volum media blandes med det forbigående mikrokammermediet, og gjenoppretter OCR- og EAR-verdier tilbake til baseline. Hver sensorpatron er utstyrt med fire porter for å muliggjøre sekvensiell administrering av opptil fire forbindelser per brønn under analysen. Målinger kan samles før og etter injeksjon av forbindelsene i hver port, og avslører nøkkelinformasjon om cellens metabolske status.
Å undersøke disse to forskjellige metabolske veiene kan gi viktige funn angående metabolsk status for RPE etter eksponering for forskjellige patogene stimuli, og kan dermed brukes til å teste effekten av legemidler for å gjenopprette den metabolske integriteten til RPE 6,7,8. Fremkomsten av respirometri med høy gjennomstrømning og tilgjengeligheten av spesifikke mitokondriehemmere har stimulert mer forskning i å definere de bioenergetiske profilene til RPE og identifisere defekter i metabolisme og mitokondrier under sykdomstilstander 6,7,8,9,10,11,12,13 . Høyoppløselig respirometri har fremhevet nøkkelrollen som metabolsk omprogrammering av RPE i retinale patologier som AMD og PVR. To viktige cytokiner involvert i patogenesen av AMD og PVR transformerer vekstfaktor-beta 2 (TGFβ2) og tumornekrosefaktor-alfa (TNFα). Induksjonen av epitel-mesenkymal overgang (EMT) ved TGFβ2 ledsages av mitokondriell dysfunksjon, OXPHOS-undertrykkelse og en kompensatorisk økning i glykolytisk kapasitet i RPE6. Mer nylig har det proinflammatoriske cytokinet, TNFα, vist seg å indusere en signifikant oppregulering av basal OXPHOS og redusert glykolyse i H-RPE7. Administrering av dimetylfumarat undertrykte signifikant TNFa-indusert betennelse i H-RPE og gjenopprettet mitokondriell morfologi og basale bioenergetiske profiler7. De divergerende metabolske profilene indusert av disse to vekstfaktorene stimulerer spennende mekanistiske spørsmål angående involvering av metabolsk omprogrammering i retinale sykdommer. Følgende protokoll beskriver trinnene for å vurdere OXPHOS og glykolytiske bioenergetiske profiler i H-RPE ved bruk av høyoppløselig respirometri.
Protocol
1. Plettering H-RPE i cellekulturplaten
- Tine H-RPE i en T25-kolbe i humant RPE-medium supplert med RPE-vekstmediumtilskudd (4 mM L-glutamin, 25 ng / ml FGF-2, 2% FBS, 30 mg / ml gentamicin og 15 μg / ml amfotericin).
- Inkuber cellene ved 37 °C og 5 %CO2 i en fuktet inkubator. Oppdater mediet neste dag og vent til cellene når minst 80 % sammenløp før de passerer i forholdet 1:3 inn i en T75-kolbe.
- Når de er konfluerende, passerer cellene ved hjelp av subkulturreagenssettet som består av trypsin / EDTA 0,025% løsning, trypsinnøytraliserende løsning og HEPES bufret saltvann (pH 7,0-7,6).
- Skyll H-RPE forsiktig med 3 ml HEPES bufret saltvann. Tilsett deretter 3 ml trypsin/EDTA og inkuber (37 °C og 5 % CO2) i 5 minutter (eller til cellene har løftet seg fra kolben, som observert under mikroskopet). Nøytraliser trypsin / EDTA med 3 ml trypsinnøytraliserende løsning.
- Sentrifuger cellene ved 200 x g i 3,5 min for å danne cellepelleten. Aspirer forsiktig og kast supernatanten.
- Resuspendere cellene i humant RPE-medium til en endelig konsentrasjon på 20.000 celler per 100 μL per brønn.
- Pipett opp og ned flere ganger for å sikre at cellesuspensjonen er homogen, ved hjelp av en flerkanalspipett for enkel og konsistent pipettering i 96-brønns cellekulturmikroplate. Hvil pipettespissen rett under den sirkulære kanten på toppen av brønnen for et jevnt, homogent cellelag.
MERK: Ingen belegg er nødvendig da cellene fester seg godt til mikroplaten. - Pass på at de fire hjørnebrønnene er tomme for celler (kun 100 μL medier) for å fungere som bakgrunnskorreksjonsbrønner (figur 1A).
MERK: Mikroplaten er formatert i en typisk 96-brønns platedesign; Imidlertid er overflaten av hver brønn 0, 106 cm2, som er 40% mindre enn en standard 96-brønnplate. Ved denne celletettheten skal cellene være 100% sammenflytende neste dag. Det anbefales å utføre et eksperiment for optimalisering av celletetthet først før du tester behandlinger for å sikre at basale OCR- og ECAR-avlesninger er henholdsvis rundt 50-100 pmol/min og 10-20 mpH/min.
- Pipett opp og ned flere ganger for å sikre at cellesuspensjonen er homogen, ved hjelp av en flerkanalspipett for enkel og konsistent pipettering i 96-brønns cellekulturmikroplate. Hvil pipettespissen rett under den sirkulære kanten på toppen av brønnen for et jevnt, homogent cellelag.
- La cellekulturplaten stå i romtemperatur (RT) i 1 time før den settes tilbake i inkubatoren (5% CO2, 37 ° C, fuktet) for å minimere kanteffekter. Kanteffekter er endringer i medievolum i brønnene i de perifere grensene til 96-brønnsplaten på grunn av fordampning14.
MERK: Cellene vil feste seg over natten og danne et konfluent monolag neste dag. H-RPE modnes i platen i minst 1 måned ved å friske opp halvparten av vekstmediet hver 2-3 dag. - Undersøk cellene under mikroskopet før du bytter media for å sjekke morfologi og pigmenteringsnivå. Sørg for at cellene er sammenflytende med en karakteristisk brosteinslignende morfologi og får pigmentering over tid, som vist i morfologibildene i Shu et al.7.
2. Dagen før du kjører analysen
- Forsikre deg om at sensorpatronen er hydrert dagen før analysen ved å fylle hver brønn på verktøyplaten med 200 μL avionisert vann.
MERK: Lokket på verktøyplaten inneholder fluorescerende biosensorer for måling av oksygen- og pH-nivåer for hver brønn. Sensorene er koblet til fiberoptiske bølgeledere som leverer lys ved forskjellige eksitasjonsbølgelengder og overfører et fluorescerende signal gjennom optiske filtre til fotodetektorer. - Plasser sensorkassetten nedsenket i vann i verktøyplaten sammen med ~20 ml av kaliberet (for oppvarming til bruk neste dag) i en 37 °C fuktet ovn (uten CO2) over natten.
MERK: Kalibranten er en proprietær løsning designet for sensorpatronkalibrering og har sannsynligvis samme sammensetning som fosfatbufret saltvann (PBS). Minimumstiden for patronhydrering er 4 timer, men de beste resultatene oppnås med hydrering over natten. - Forsikre deg om at instrumentet er slått på, og start programvaren slik at instrumentet kan stabilisere seg til 37 °C over natten (figur 2). Generelt kan instrumentet stå på selv når det ikke er i bruk.
3. Mito-stresstest i sanntid ved bruk av ekstracellulær fluksanalysator
- På analysedagen må du bytte ut vannet i utstyrsplaten med et likt volum oppvarmet kalibrant minst 45 minutter før analysen kjøres.
- Gjør Mito Stress Test-analysemediet ved å bruke basemediet uten fenolrødt ved å tilsette kosttilskudd, som vist i tabell 1. Varm mediet til 37 °C, juster pH til 7,4 og vakuumfiltrer mediet ved hjelp av en filterenhet med tube top. For å kjøre en full plate, lag ~ 25 ml analysemedier.
- Fjern det menneskelige RPE-mediet og erstatt det med 180 mikrol nytilberedte analysemedier (trinn 3.2). Sett cellekulturplaten i en fuktig ovn på 37 °C (uten CO2) i 1 time før du starter analysen.
MERK: Dette er viktig for avgassing av celleplaten, noe som muliggjør CO2 -diffusjon. Siden cellene ikke lenger er i vekstmediet og ikke lenger er i en inkubator med CO2, vil deres levedyktighet forverres over tid, derfor bør det tas hensyn til å utføre analysen så effektivt som mulig. Det må også tas hensyn til at det ikke er bobler i cellekulturplaten; Hvis noen er til stede, pop dem med en pipette eller nål. - Hver sensorpatron har fire reagensleveringsporter per brønn for injeksjon av testforbindelser i brønnene på cellekulturplaten under analysen (figur 1C,D). Forbered ~3 ml av de 10x legemiddelløsningene ved å fortynne legemiddellagrene i de respektive analysemediene i henhold til tabell 2. For eksempel, last port A med 25 μM oligomycin oppløst i Mito Stress Test-analysemediet, slik at når legemiddelvolumet injiseres i brønnen av instrumentet, er den endelige konsentrasjonen som hver celle blir utsatt for, 2,5 μM. Pipette 20 μL av 10x legemiddellager i port A, 22 μL i port B, og 25 μL i port C, for å oppnå den spesifiserte endelige legemiddelkonsentrasjonen i hver brønn. For protokoller som krever alle fire legemiddelporter, pipett 28 μL inn i port D.
MERK: Se figur 1B når du pipetterer stoffene inn i narkotikaportene for riktig orientering av port A/B/C/D. Hakket på kanten av patronen skal være plassert i nedre venstre hjørne når du laster stoffportene. Ved å pipettere i vinkel inn i hver legemiddelport kan bobler minimeres. Hvis det er noen bobler tilstede, bør det tas hensyn til å poppe dem med en pipette eller nål. - Åpne fanen Maler i analyseprogramvaren, velg Mito stresstest, og fyll ut gruppedefinisjonene.
- Input detaljer om Injection Strategy (i dette tilfellet, er det pre-inputted som Mito Stress Test narkotika). Inntastingsdetaljer om de ulike eksperimentelle gruppene i analysen (f.eks. Kontroll eller behandling). Skriv inn detaljer om Assay Media (tillegg av forskjellige kosttilskudd og deres spesifikke konsentrasjoner til baseanalysemediet) og til slutt legge til celletypen.
- Klikk på neste fane, Plate Map, hvor de forskjellige gruppene som undersøkes vil bli tildelt deres spesifikke plassering på 96-brønns platekartet. Når dette er gjort, klikker du på kategorien Protokoll for å se gjennom instrumentprotokollen for standard Mito Stress Test-protokoll .
MERK: Standard Mito Stress Test-malen er klar til bruk, men kan endres på noen måte for å passe til det eksperimentelle designet. For eksempel er standard måletid 3 min, men dette kan endres til 5 min om ønskelig.
- Klikk på Kjør analysen og sett inn sensorkassetten som er nedsenket i kalibrantløsningen i verktøyplaten. Denne prosessen tar rundt 25 min. I dette trinnet kalibreres hver biosensor uavhengig basert på sensorutgangen målt i kalibrantløsningen med kjent pH og oksygenkonsentrasjon.
- Når dette er kalibrert, fjern verktøyplaten og sett inn cellekulturplaten.
MERK: Cellekulturplaten likevektes først, hvoretter instrumentet begynner å blande analysemediet og måle OCR- og ECAR-verdiene. Dette trinnet tar rundt 1,5 time og utføres inne i instrumentet uten innblanding fra brukeren. En baselineavlesning av OCR og ECAR etableres først ved å blande analysemediet i 3 minutter og deretter måle OCR og ECAR i 3 minutter. Instrumentet utfører tre sløyfer med blanding og måling. - Etter baselinemålingen injiserer instrumentet automatisk Port A-legemiddeloppløsningen i hver brønn. Dette etterfølges av tre sløyfer med blanding og måling (3 min hver). Det samme mønsteret oppstår etter hver påfølgende injeksjon av legemidlet (port B og C).
- Når dette er kalibrert, fjern verktøyplaten og sett inn cellekulturplaten.
- Når kjøringen er fullført, fjerner du cellekulturplaten og sensorkassetten. For kvalitetskontrollformål må du sørge for at alle legemiddelportene i sensorkassetten er injisert ved å undersøke portene for å kontrollere at det ikke er rester av legemiddelrester. Kast sensorkassetten og utstyrsplaten, da de er engangsartikler.
- Undersøk cellene i cellekulturens mikroplate under mikroskopet for å sikre at det fortsatt er et konfluent monolag av celler. Kast analysemediet og erstatt det med 60 μL 1x lysisbuffer i hver brønn.
MERK: Lysisbufferen er laget av 10x lysisbuffer fortynnet til 1x i avionisert vann med tilsetning av 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF). - Pakk kantene på platen i Parafilm for å forhindre fordampning og legg den i en -80 ° C fryser for å hjelpe til med cellelyse over natten, før kvantifisering av proteininnholdet ved hjelp av BCA-analysen.
- For dataanalyse, normaliser alle data ved å dele OCR- og EAR-verdiene med mikrogrammet protein i hver brønn. Eksporter Mito Stress Test-rapportgeneratoren, som bruker Excel-makroer til automatisk å beregne Mito Stress Test-parametrene ved hjelp av dataanalyseprogramvaren.
MERK: Dette kan brukes til å bestemme basal respirasjon, maksimal respirasjon, ekstra respiratorisk kapasitet, protonlekkasje, ATP-produksjon og ikke-mitokondriell respirasjon. Definisjoner av disse beregningene er gjengitt i tabell 3.
4. Glykolytisk stresstest i sanntid ved bruk av ekstracellulær fluksanalysator
- Utfør den glykolytiske stresstesten ved å følge de samme trinnene som Mito-stresstesten, bortsett fra å bruke de forskjellige analysemedietilskuddene og legemiddelinjeksjonene vist i tabell 1 og tabell 2.
- For dataanalyse eksporterer du den glykolytiske stresstestrapportgeneratoren, som bruker Excel-makroer til automatisk å beregne de glykolytiske stresstestparametrene fra dataanalyseprogramvaren.
MERK: Dette kan brukes til å bestemme ikke-glykolytisk forsuring, glykolyse, glykolytisk kapasitet og glykolytisk reserve. Definisjoner av disse beregningene er gjengitt i tabell 3.
5. BCA-proteinkvantifiseringsanalyse
MERK: Bicinchonic acid (BCA) proteinkvantifiseringsanalysen (også kjent som Smith assay15) er en kobberbasert kolorimetrisk analyse som brukes til å bestemme det totale proteininnholdet i en prøve. Normalisering av OCR- og EAR-data til mikrogrammet protein i hver brønn sikrer at forskjellige mengder celler / protein i hver brønn ikke forskyver avlesningene. Mekanismen til BCA-analysen er basert på to kjemiske reaksjoner. For det første reduserer peptidbindingene i proteiner cupricioner (Cu2+) til kobberioner (Cu+), som er en temperaturavhengig reaksjon assistert av høyere temperaturer (37 til 60 ° C). Hvis det er flere peptidbindinger, gjør mengden Cu2 + proporsjonal med proteininnholdet i løsningen16. Denne reaksjonen resulterer i en fargeendring fra grønn til en intens lilla løsning, med en topp absorbans ved 562 nm16. Jo høyere proteininnhold i prøven er, desto høyere absorbans ved denne bølgelengden. Arbeidsområdet til dette settet er 20-2,000 μg / ml.
- BCA-analysesettet inneholder 1 ml alikoter av bovint serumalbumin (BSA) ved 2 mg / ml, som fungerer som referansestandard for proteinkonsentrasjon. Forbered en seriell fortynning i en klar, flatbunnet 96-brønnsplate ved å starte fra den ufortynnede 2 mg/ml BSA og deretter halvere konsentrasjonen ved å fortynne i avionisert vann (f.eks. 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 mg/ml osv.). Ved å bruke en kjent konsentrasjon av protein kan man beregne en standardkurve, som brukes til å beregne proteininnholdet i eksperimentelle prøver. For å forbedre nøyaktigheten av de beregnede proteininnholdsmålingene, måles absorbansavlesninger av referansestandardene for proteinkonsentrasjon sammen med eksperimentelle prøver for hver analyse.
- Pipett 25 μL av hver BSA-seriell fortynning i duplikat til 96-brønnsplaten.
- Pipette 25 μL av 1x lysisbufferen i duplikat inn i 96-brønnplaten for å tjene som emne.
- Tine cellekulturplaten til romtemperatur og pipette 25 μL av hvert cellelysat i duplikat i 96-brønnplaten.
- Forbered arbeidsreagenset i et 50: 1-forhold mellom BCA-settreagenser A: B. Bland grundig ved vortexing for å fjerne turbiditet i arbeidsreagenset, slik at det er en homogen grønn løsning. Tilsett 200 μL av arbeidsreagenset til hver brønn.
- Beskytt platen mot lys ved å dekke platen i folie og ruge i en ovn på 37 °C i 20 minutter.
- Mål absorbansen ved 562 nm i en 96-brønns plateleser.
- For dataanalyse beregner du gjennomsnittet av alle de dupliserte verdiene. Trekk de blanke absorbansnivåene bestemt fra 1x lysisbufferbrønnene fra målingene av alle prøvene. Bestem standardkurven ved å plotte absorbansen til hver BSA-standard til den kjente konsentrasjonen i μg/ml. Bruk den lineære ligningen avledet fra standardkurven for å bestemme proteinkonsentrasjonen av eksperimentelle prøver.
Representative Results
Instrumentet måler samtidig både OCR og ECAR for hver kjøring. For Mito Stress Test er parameterberegninger basert på OCR-avlesninger (figur 3A), mens for glykolytisk stresstest er parameterberegninger basert på EAR-avlesninger (figur 3B). Figur 3 viser representative grafer for Mito Stress Test OCR-kurven over tid (figur 3C) og parameterberegninger i form av søylediagrammer for H-RPE (figur 3D). Glykolytisk stresstest er representert som en EAR-kurve over tid (figur 3E), og parameterberegninger vises i søylediagrammer for H-RPE (figur 3F).
Basal respirasjon gir en forståelse av cellens energetiske krav under basale forhold17. Den første legemiddelinjeksjonen, oligomycin (Oligo), er en ATP-syntasehemmer, og dermed er enhver reduksjon av OCR etter den første legemiddelinjeksjonen et mål på ATP-bundet respirasjon18. Eventuell gjenværende basal respirasjon etter påfølgende legemiddelinjeksjoner betraktes som en protonlekkasje siden den ikke er koblet til ATP-syntese. Økt protonlekkasje kan indikere økt mitokondriell frakobling, som reguleres av frakoblingsproteiner som er fysiologisk tilstede, men har også vært knyttet til patologier som fedme, kreft, type 2 diabetes og kardiovaskulær sykdom19. Den andre injeksjonen er av et frakoblingsmiddel, slik som BAM15 eller FCCP, for å bestemme det maksimale respirasjonspotensialet til mitokondriene. Frakoblingsmidler kollapser protongradienten og reduserer protonmotivkraften over mitokondriell indre membran. Resultatet er en uhemmet strøm av elektroner gjennom elektrontransportkjeden (ETC), som øker oksygenforbruket og forårsaker at mitokondriell respirasjon når sin maksimale kapasitet20. Ekstra respiratorisk kapasitet (SRC) er forskjellen mellom maksimal og basal respirasjon, noe som indikerer cellens kapasitet til å reagere på endringer i energiske krav når de utfordres, noe som indikerer cellekondisjon. Det er viktig at for Mito-stresstesten i H-RPE er BAM15 overlegen FCCP når det gjelder å øke mitokondriell respirasjonskapasitet (figur 4A, B), da maksimal respirasjon og ekstra respirasjonskapasitet er betydelig høyere med 10 μM BAM15 sammenlignet med 500 nM eller 1 μM FCCP. Ingen signifikante forskjeller ble observert mellom noen av FCCP-dosene. Den tredje og siste injeksjonen av rotenon og antimycin A (Rot/AA) hemmer henholdsvis mitokondriekompleksene I og III av ETC, som slår av mitokondriell respirasjon; eventuell gjenværende OCR skyldes ikke-mitokondrielle kilder21.
Under glykolyse omdannes ett molekyl glukose til to molekyler laktat i fravær av oksygen. Ekstruderingen av laktat fra cellen er ledsaget av utstrømningen av ett proton per laktatmolekyl, og forårsaker dermed forsuring av det ekstracellulære rommet. Strømmen av protonproduksjon i media måles ved endringer i ECAR. Basale glykolysenivåer etableres først, hvoretter glukose injiseres i analysemediet, som er blottet for glukose, for å indusere glykolyse og dermed øke EAR-nivåene22. Oligomycin injiseres for å indusere den "høyeste" ECAR da den stopper mitokondriell ATP-produksjon, og tvinger dermed cellen til å utlede sin ATP gjennom glykolyse. Til slutt stenges glykolyse ved å tilsette 2DG, som hemmer heksokinase, det første enzymet for glykolyse23. Eventuell gjenværende ECAR skyldes sannsynligvis andre kilder til forsuring, for eksempel CO2 -produksjon ved TCA-syklusen under OXPHOS, og betegnes som ikke-glykolytisk ECAR. Den glykolytiske reserven beregnes som forskjellen mellom den "høyeste" ECAR og ECAR i nærvær av glukose. Den glykolytiske kapasiteten er summen av glykolyse og glykolytisk reserve.
Figur 1: Komponenter i platen og sensorkassetten . (A) Instrumentet, dataanalyseprogramvaren og grensesnittet for protokolloppsett vises. I 96-brønns kulturplateoppsettet er cellene belagt i de blåfargede brønnene og de fire hjørnebrønnene er merket med svart, da de tjener som bakkorreksjonsbrønner som bare inneholder medier (og ingen celler). (B) Det er fire legemiddelporter for hver brønn i sensorpatronen der legemidler A, B, C og D kan lastes. Volumene som skal pipette i hver port er oppført basert på beregningene for 10x legemiddellagerpreparater. (C) Sensorkassetten består av sensorsonder som plasseres direkte i den kalibrantfylte verktøyplaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tidslinje for analysen. Cellene blir sådd i cellekulturplaten. Når den er klar, innebærer analysen en 2-dagers prosedyre etterfulgt av kvantifisering av proteininnholdet ved bruk av BCA-analysen og påfølgende dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative grafer av Mito stresstest og glykolytisk stresstest. Beregninger av (A) Mito stresstest og (B) glykolytisk stresstest parametere er avbildet i skjemaet. (C) Representativ oksygenforbrukskurve (OCR) og (D) Mito stresstestparametere for H-RPE er vist. (E) Representativ ekstracellulær forsuringsrate (ECAR) kurve og (F) Glykolytisk stresstestparametere for H-RPE er vist. Feilfelt er midler ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sammenligning av BAM15 versus FCCP som frakoblingsmiddel. Mito stresstest på H-RPE som sammenligner effekten av å indusere maksimal respirasjon ved bruk av 10 μM BAM15, 500 nM FCCP eller 1 μM FCCP, som viser (A) oksygenforbrukshastighetskurven (OCR) og (B) Mito stresstestparametere. Feilfelt er midler ± SEM. **** p ≤ 0,0001; ns, ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Prøve | Glukose (mM) | GlutaMax (mM) | Natriumpyruvat (mM) | HEPES (mM) |
| Mito stresstest | 25 | 2 | 1 | 1 |
| Glykolytisk stresstest | Ingen | 0.5 | Ingen | 1 |
Tabell 1: Konsentrasjon av tilskudd tilsatt analysemediet for Mito og glykolytiske stresstester.
| Prøve | Port A | Port B | Port C |
| Mito stresstest | Oligomycin 2,5 μM | FCCP 500 nM ELLER BAM15 10 μM | Rotenon 2 μM OG Antimycin A 2 μM |
| Glykolytisk stresstest | Glukose 10 mM | Oligomycin 2 μM | 2-deoksyglukose 50 mM |
Tabell 2: Konsentrasjoner av legemiddelportinjeksjoner for Mito- og glykolytiske stresstester. Det er viktig å merke seg at dette er de endelige konsentrasjonene som cellene utsettes for etter injeksjon av legemidlene i hver brønn. Legemidlene bør være forberedt 10 ganger sterkere når du laster narkotikaportene.
| Vilkår | Definisjon | |||
| Kaliber | Kaliberet er en løsning som brukes til kalibrering av sensorkassetten. Formuleringen er proprietær og har en lignende sammensetning som PBS. | |||
| Sensorkassett | Sensorpatronen inneholder to fluoroforer innebygd i sensorpatronhylsen som er koblet til fiberoptiske bunter som avgir lys, spennende fluoroforene. Den ene fluoroforen måler oksygenfluks og den andre måler protonfluks. Hver sensorpatron er også utstyrt med 4 porter for å muliggjøre sekvensiell administrering av opptil 4 forbindelser per brønn under analysen. | |||
| Bruksplate | Verktøyplaten (også kjent som kalibrantplaten) brukes til å kalibrere sensorene. Kalibrantløsningen plasseres i verktøyplaten. | |||
| Mito stresstest | Mito Stress Test er navnet på analysen som gir den bioenergetiske profilen for mitokondriell respirasjon ved å plotte endringer i OCR over tid. | |||
| Glykolytisk stresstest | Glykolytisk stresstest er navnet på analysen som gir den glykolytiske bioenergetiske profilen ved å plotte endringer i ECAR over tid. | |||
| Oksygenforbruk (OCR) | Oksygenforbruk er et mål på oksygenfluks (pmol/min) og indikerer mitokondriell metabolsk status. | |||
| Ekstracellulær forsuringsrate (ECAR) | Ekstracellulær forsuringshastighet er et mål på protonutstrømning (mpH/min) og indikerer glykolytisk metabolsk status. | |||
| Wave programvare | Wave-programvaren brukes til programmering av analysen og påfølgende dataanalyse | |||
| Ikke-mitokondrielt oksygenforbruk | Minimumshastighetsmåling etter Rotenone/antimycin A-injeksjon | |||
| Basal respirasjon | (Siste hastighetsmåling før første injeksjon) – (ikke-mitokondriell respirasjonsfrekvens) | |||
| Maksimal respirasjon | (Maksimal hastighetsmåling etter FCCP-injeksjon) – (ikke-mitokondriell respirasjon) | |||
| H+ (proton) lekkasje | (Minimumshastighetsmåling etter injeksjon av oligomycin) – (ikke-mitokondriell respirasjon | |||
| ATP-produksjon | (Siste hastighetsmåling før injeksjon av oligomycin) – (Minimumshastighetsmåling etter injeksjon av oligomycin) | |||
| Ledig respirasjonskapasitet | (maksimal respirasjon) – (basal respirasjon) | |||
| Ekstra respirasjonskapasitet i % | (maksimal respirasjon) / (basal respirasjon) × 100 | |||
| Kobling Effektivitet | ATP produksjonshastighet) / (basal respirasjonshastighet) × 100 | |||
| Glykolyse | (Maksimal hastighet måling før oligomycin injeksjon) – (Siste hastighet måling før glukoseinjeksjon) | |||
| Glykolytisk kapasitet | (Maksimal hastighet måling etter Oligomycin injeksjon) – (Siste hastighet måling før glukoseinjeksjon) | |||
| Glykolytisk reserve | (Glykolytisk kapasitet) – (Glykolyse) | |||
| Glykolytisk reserve i % | (Glykolytisk kapasitetsrate) /(Glykolyse) × 100 | |||
| Ikke-glykolytisk forsuring | Måling av siste hastighet før glukoseinjeksjon | |||
Tabell 3: Liste over definisjoner av nøkkelkomponenter i analysen.
Discussion
Denne optimaliserte protokollen for høyoppløselig respirometri av H-RPE innebærer bruk av BAM15 som frakobling i stedet for den vanlige FCCP. Mens tidligere studier på høyoppløselig respirometri av RPE benyttet FCCP 9,24, synes BAM15 å indusere en mer robust induksjon av maksimale respirasjonsnivåer i H-RPE sammenlignet med FCCP. Mens både FCCP og BAM15 er trygge å bruke i celler, er BAM15 rapportert å ha færre bivirkninger i normale celler sammenlignet med FCCP eller karbonylcyanid-3-klorfenylhydrazon (CCCP) 25. Kenwood et al. viste at BAM15 depolariserer mitokondrier uten å påvirke plasmamembranpotensialet, og induserer dermed en vedvarende maksimal mitokondriell respirasjonshastighet ved lav cytotoksisitet26. FCCP, derimot, depolariserer både mitokondrier og plasmamembranen og viser høyere cytotoksisitet26.
Det er flere kritiske trinn i protokollen, inkludert å sikre at cellene er riktig belagt i et konfluerende, jevnt og homogent monolag av RPE i alle eksperimentelle brønner på mikroplaten. Eldre RPE er svært avhengige av OXPHOS for energiproduksjon, og dermed bør cellene få lov til å modnes i minst 1 måned for å sikre at RPE genererer riktige basale og maksimale OCR-avlesninger under analysen. Avgassing av cellekulturplaten i 1 time ved 37 °C i en fuktet ovn (uten CO 2) før den plasseres i instrumentet, er avgjørende for nøyaktige EAR-avlesninger, da CO2 kan påvirke pH i analysemediet. Det er viktig å huske å hydrere sensorkassetten dagen før analysen for å sikre at den gir pålitelige OCR- og ECAR-avlesninger på analysedagen. Det må utvises forsiktighet for å rekonstituere legemidlene som skal injiseres på riktig måte, og lagre de rekonstituerte lagrene i mindre volumer for langtidsoppbevaring for å minimere fryse-/tinesykluser. Det er avgjørende å forberede 10x legemiddelløsninger som er fortynnet i de respektive analysemediene (f.eks. fortynnet i Mito Stress Test analysemedier for Mito Stress Test) for å faktor i fortynningen fra injeksjon av legemidlet i hver brønn fylt med analysemedier. Ved hver påfølgende legemiddelinjeksjon er det flere medier i hver brønn, og dermed øker volumene av legemiddel som lastes med hver injeksjon, og det bør utvises forsiktighet for å følge volumene som er spesifisert i protokollen. Det er viktig å utføre kvalitetskontroller når eksperimentet er fullført ved å undersøke sensorkassetten for å sikre at det ikke er noe gjenværende legemiddel og observere cellekulturplaten under et mikroskop for å sikre at det konfluente og homogene cellemonolaget forblir.
Endringer i denne protokollen inkluderer injeksjon av forskjellige stoffer i portene og bestemmelse av hvordan disse stoffene påvirker OCR- og ECAR-avlesninger. En populær modifikasjon er å injisere et eksperimentelt stoff av valget som port A før injisere de vanlige Mito eller glykolytisk stresstest narkotika. Denne typen protokoll gir innsikt i hvordan en akutt injeksjon av det valgte legemidlet påvirker de påfølgende OXPHOS- og glykolytiske parametrene. Andre modifikasjoner inkluderer å undersøke forskjellige celletyper; Dette krever innledende feilsøking av optimal såcelletetthet og optimalisering av analysemediet ved å sikre at basale avlesninger varierer fra 50-100 pmol/min for OCR og 10-20 mpH/min for ECAR. De optimale konsentrasjonene av de injiserte legemidlene må bestemmes for hver ny celletype som undersøkes ved å observere OCR- og EAR-responsene på en seriell fortynning av legemidlene.
En viktig begrensning i protokollen er at cellens levedyktighet reduseres over tid, da cellene ikke er i en CO2 -inkubator i deres normale vekstmedier, og dermed bør analysen fullføres innen 3-4 timer for å sikre maksimal celle levedyktighet. Videre kan eksponering for mitokondrielle toksiner injisert i hver brønn ytterligere redusere cellens levedyktighet over tid. Når analysen er fullført, må cellene lyseres for evaluering av proteininnholdet for å normalisere OCR- og EAR-avlesninger, og dermed kan de samme cellene ikke høstes for senere molekylærbiologiske analyser.
Alternativer til Seahorse for bioenergetisk profilering inkluderer Oroboros Oxygraph 2k (O2k) 27, BaroFuse28,29 og Resipher (Lucid Scientific)7. Oroboros O2k er et lukket tokammer respirometer som benytter S1 Clark-type polarografiske oksygenelektroder. Mens Oroboros O2k produserer svært følsomme målinger av sanntids metabolsk fluks, er enheten arbeidsintensiv da operatøren er pålagt å injisere hvert legemiddelmanuelt 30. BaroFuse er et nytt flerkanals mikrofluidisk perfusjonssystem som bruker gasstrykk for å muliggjøre flere parallelle perfusjonseksperimenter og er knyttet til et oksygendeteksjonssystem for å måle OCR. Fordelen med dette strømningskultursystemet er at vevsfunksjon og levedyktighet opprettholdes, i motsetning til Seahorse hvor cellenes levedyktighet reduseres over lengre analyser. Resipher bruker svært følsomme optiske oksygensensorer for å måle OCR mens cellene er i en 96-brønnsplate i inkubatoren, og muliggjør dermed kontinuerlige OCR-målinger over flere uker til måneder. Disse instrumentene måler ikke ECAR, og dermed har Seahorse fordelen av samtidig utforskning av både OXPHOS og glykolyse.
Å undersøke bioenergetiske profiler av OXPHOS og glykolyse i sanntid fremstår som en nøkkelfaktor for å karakterisere RPEs helse og funksjon. Høyoppløselig respirometri muliggjør et effektivt middel for å sammenligne metabolsk status for normal og syk RPE, og dermed åpne nye veier for screening av legemiddeleffekt for retinale sykdommer som AMD og PVR. Fremtidige retninger for høyoppløselig respirometri på RPE inkluderer optimalisering av en protokoll for å undersøke bioenergetiske profiler for høyt polariserte RPE-monolag dyrket på transbrønnfiltre. Calton et al. (2016) oppnådde dette ved å kutte en trekantet del av det polariserte RPE-monolaget dyrket på transbrønnfiltre31. Ytterligere utvidelse av metodikken inkluderer undersøkelse av bioenergetiske profiler av indusert pluripotent stamcelleavledet RPE (iPSC-RPE), isolert fra pasienter med forskjellige retinale degenerative tilstander32. Utforskning av hvordan patogene cytokiner involvert i AMD og PVR påvirker den dynamiske naturen til RPE-metabolisme, kan avsløre metabolske sårbarheter som kan informere identifiseringen av nye medisinerbare mål.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble delvis støttet av tilskudd fra: Fight for Sight Leonard & Robert Weintraub Postdoctoral Fellowship (DYS); BrightFocus Foundation postdoktorale stipendprogram i makuladegenerasjonsforskning (M2021010F, D.Y.S.); Forsvarsdepartementet, Spinal Vision Research Program under Award nr. VR180132 (MS-G. og LAKE); National Eye Institute of National Institutes of Health under Award nr. R01EY027739 (LAKE). Anerkjennelse gis til giverne av Macular Degeneration Research M2021010F, et program fra BrightFocus Foundation, for støtte til denne forskningen. Skjemaer ble opprettet med Biorender.com
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375-5G | Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection) |
| 96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile | VWR | 229597 | BCA Assay 96-well plate |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma | A8674-25MG | Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone) |
| BAM15 | Sigma | SML1760-5MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
| BCA Assay | ThermoFisher | 23225 | To determine total protein content in each well |
| Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge |
| Cell Lysis buffer 10x | Cell Signaling Technologies | 9803S | Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection) |
| DMSO, Cell culture grade | Sigma-aldrich | D4540-100ML | For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG |
| FCCP | Sigma | C2920-10MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
| HEPES solution | Sigma | H0887-100ML | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
| H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells | Lonza | 194987 | Primary human fetal RPE cells |
| Oligomycin - CAS 1404-19-9 - Calbiochem | Sigma | 495455-10MG | ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection) |
| Parafilm | Bemis | PM996 | To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor | Gold Biotechnology Inc | 50-153-2823 | Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution |
| ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL | Lonza | CC-5034 | Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline |
| Rotenone | Sigma | R8875-1G | Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A) |
| RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit - RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) | Lonza | 195409 | Media for primary human fetal RPE cells |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | High-Resolution Respirometry Instrument | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution |
| Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media |
| Synergy H1 Plate Reader | BioTek | Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay | |
| XF base medium without phenol red | Agilent | 103335-100 | Base media for running the Seahorse assay |
References
- He, Y., et al. Mitochondria impairment correlates with increased sensitivity of aging RPE cells to oxidative stress. Journal of Ocular Biology Diseases and Informatics. 3 (3), 92-108 (2010).
- Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. EMT and EndMT: Emerging roles in age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4271 (2020).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 2-16 (2014).
- Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protocol. 8 (10), 2850 (2018).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFbeta2-induced EMT of retinal pigment epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4701 (2021).
- Shu, D. Y., et al. Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium. Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 896786 (2022).
- Satish, S., Philipose, H., Rosales, M. A. B., Saint-Geniez, M. Pharmaceutical induction of PGC-1α promotes retinal pigment epithelial cell metabolism and protects against oxidative damage. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 9248640 (2018).
- Ferrington, D. A., et al. Altered bioenergetics and enhanced resistance to oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells from donors with age-related macular degeneration. Redox Biology. 13, 255-265 (2017).
- Cai, H., et al. High-throughput screening identifies compounds that protect RPE cells from physiological stressors present in AMD. Experimental Eye Research. 185, 107641 (2019).
- Kurihara, T., et al. Hypoxia-induced metabolic stress in retinal pigment epithelial cells is sufficient to induce photoreceptor degeneration. Elife. 5, 14319 (2016).
- Ishii, M., Beeson, G., Beeson, C., Rohrer, B. Mitochondrial C3a receptor activation in oxidatively stressed epithelial cells reduces mitochondrial respiration and metabolism. Frontiers in Immunology. 12, 628062 (2021).
- Rosales, M. A. B., Shu, D. Y., Iacovelli, J., Saint-Geniez, M. Loss of PGC-1α in RPE induces mesenchymal transition and promotes retinal degeneration. Life Science Alliance. 2 (3), 201800212 (2019).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Smith, P. K., et al.
- Huang, T., Long, M., Huo, B. Competitive binding to cuprous ions of protein and BCA in the bicinchoninic acid protein assay. Open Biomedical Engineering Journal. 4, 271-278 (2010).
- Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
- Symersky, J., Osowski, D., Walters, D. E., Mueller, D. M. Oligomycin frames a common drug-binding site in the ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13961-13965 (2012).
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26 (3), 192-205 (2011).
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
- Herst, P. M., Tan, A. S., Scarlett, D. J., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption by mitochondrial gene knockout cells. Biochimica Biophysica Acta. 1656 (2-3), 79-87 (2004).
- Pike Winer, L. S., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PLoS One. 9 (10), 109916 (2014).
- Laussel, C., Leon, S. Cellular toxicity of the metabolic inhibitor 2-deoxyglucose and associated resistance mechanisms. Biochemical Pharmacology. 182, 114213 (2020).
- Miyagishima, K. J., et al. AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration. Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).
- Gao, Z. X., et al. The new mitochondrial uncoupler BAM15 induces ROS production for treatment of acute myeloid leukemia. Biochemical Pharmacology. 198, 114948 (2022).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
- Ye, F., Hoppel, C. L. Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts. Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).
- Rountree, A., et al. Barofuse a novel pressure-driven, adjustable-throughput perfusion system for tissue maintenance and assessment. Heliyon. 2 (12), 00210 (2016).
- Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, 66716 (2021).
- Mas-Bargues, C., Garcia-Dominguez, E., Borras, C. Recent approaches to determine static and dynamic redox state-related parameters. Antioxidants. 11 (5), 864 (2022).
- Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
- Chichagova, V., et al. Human iPSC disease modelling reveals functional and structural defects in retinal pigment epithelial cells harbouring the m.3243A > G mitochondrial DNA mutation. Scientific Reports. 7 (1), 12320 (2017).
