Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

انتشار الفيروس والقياس اللوني القائم على الخلايا

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64578
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

يصف هذا البروتوكول انتشار فيروس زيكا (ZIKV) في خلايا الكلى القردة الخضراء فيرو الأفريقية والقياس الكمي لفيروس زيكا باستخدام طرق الكشف المناعي اللوني القائمة على الخلايا في شكل 24 بئرا و 96 بئرا (إنتاجية عالية).

Abstract

فيروس زيكا (ZIKV) هو فيروس ينقله البعوض ينتمي إلى جنس Flavivirus. ارتبطت عدوى فيروس زيكا بتشوهات خلقية في الدماغ وربما متلازمة غيلان باريه لدى البالغين. ومن المهم إجراء البحوث المتعلقة بفيروس زيكا لفهم آليات المرض لتيسير تطوير اللقاح والعلاج. طريقة قياس كمية الفيروسات حاسمة وأساسية في مجال علم الفيروسات. مقايسة تشكيل التركيز (FFA) هي مقايسة كمية للفيروس تكتشف المستضد الفيروسي بالأجسام المضادة وتحدد بؤر العدوى للخلايا باستخدام تقنية التلوين المناعي للبيروكسيداز. تصف الدراسة الحالية بروتوكول انتشار الفيروس والقياس الكمي باستخدام كل من تنسيقات 24 بئرا و 96 بئرا (إنتاجية عالية). بالمقارنة مع دراسات أخرى مماثلة ، وصف هذا البروتوكول كذلك تحسين حجم البؤر ، والذي يمكن أن يكون بمثابة دليل لتوسيع استخدام هذا الفحص للفيروسات الأخرى. أولا ، يتم إجراء انتشار ZIKV في خلايا Vero لمدة 3 أيام. يتم حصاد طافية الاستزراع التي تحتوي على ZIKV وقياسها باستخدام FFA. باختصار ، يتم تلقيح ثقافة الفيروس على خلايا Vero وتحضينها لمدة 2-3 أيام. ثم يتم تحديد تكوين البؤر بعد عمليات تلطيخ محسنة ، بما في ذلك تثبيت الخلايا ، والنفاذية ، والحجب ، وربط الأجسام المضادة ، والحضانة مع ركيزة البيروكسيديز. يتم تصور بؤر الفيروس الملطخة باستخدام مجهر ستيريو (العد اليدوي بتنسيق 24 بئرا) أو محلل البرامج (العد الآلي بتنسيق 96 بئرا). يوفر FFA نتائج قابلة للتكرار وسريعة نسبيا (3-4 أيام) وهو مناسب للاستخدام مع فيروسات مختلفة ، بما في ذلك الفيروسات غير المكونة للبلاك. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول مفيد لدراسة عدوى ZIKV ويمكن استخدامه للكشف عن الفيروسات الأخرى المهمة سريريا.

Introduction

عدوى فيروس زيكا (ZIKV) هي مرض فيروسي ناشئ ينقله البعوض. كانت أول عزلة ل ZIKV في أوغندا في عام 1947 1,2 ؛ ظل مهملا من عام 1947 إلى عام 2007 ، حيث أن الأعراض السريرية هي الأكثر شيوعا بدون أعراض وتتميز بمرض حموي ذاتي الحد. في عام 2007 ، بدأ وباء زيكا في جزر ياب 3,4 ، تلاه أوبئة أكبر في مناطق المحيط الهادئ (بولينيزيا الفرنسية وجزيرة إيستر وجزر كوك وكاليدونيا الجديدة) من 2013 إلى 2014 5،6،7،8 ، حيث تم الإبلاغ عن المضاعفات العصبية الشديدة متلازمة غيلان باريه (GBS) في البالغين لأول مرة9. خلال عامي 2015 و 2016 ، اجتاح أول وباء ZIKV واسع الانتشار الأمريكتين بعد ظهور النمط الجيني الآسيوي ل ZIKV في البرازيل في وقت مبكر من عام 201310. خلال هذه الفاشية ، تم الإبلاغ عن 440,000 إلى 1.3 مليون حالة من صغر الرأس ، واضطرابات عصبية أخرى ، في الأطفال حديثي الولادة11. لا يوجد حاليا علاج أو علاج محدد لعدوى فيروس زيكا. وبالتالي، هناك حاجة طبية ملحة للقاحات فيروس زيكا القادرة على الوقاية من العدوى، لا سيما أثناء الحمل.

القياس الكمي للفيروس هو عملية لتحديد عدد الفيروسات الموجودة في العينة. يلعب دورا مهما في البحث ، وتشمل المختبرات الأكاديمية العديد من المجالات ، مثل الطب وعلوم الحياة. هذه العملية مهمة أيضا في القطاعات التجارية ، مثل إنتاج اللقاحات الفيروسية أو البروتينات المؤتلفة أو المستضدات الفيروسية أو العوامل المضادة للفيروسات. يمكن استخدام العديد من الطرق أو المقايسات لقياس كمية الفيروس12. يعتمد اختيار الطرق أو المقايسات عادة على خصائص الفيروس ومستوى الدقة المطلوب وطبيعة التجربة أو البحث. بشكل عام ، يمكن تقسيم طرق قياس الفيروسات إلى فئتين: المقايسات الجزيئية التي تكشف عن وجود الحمض النووي الفيروسي (DNA أو RNA) والمقايسات التي تقيس عدوى الفيروس في المختبر12. يعد تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR ، للحمض النووي) أو تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR ، للحمض النووي الريبي)13 والقطيرات الرقمية PCR14 أمثلة على التقنيات الجزيئية الشائعة المستخدمة لتحديد كمية الحمض النووي الفيروسي في عينة معينة15. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه التقنيات الجزيئية شديدة الحساسية التمييز بين الفيروسات القابلة للحياة وغير القابلة للحياة15. لذلك ، لا يمكن إكمال البحث الذي يتطلب معلومات عن السمات البيولوجية ، مثل عدوى الفيروس على الخلايا ، باستخدام التقنيات الجزيئية المذكورة أعلاه ؛ هناك حاجة إلى فحوصات يمكنها قياس وتحديد وجود فيروسات قابلة للحياة. تشمل المقايسات التي تقيس عدوى الفيروس مقايسة تكوين البلاك (PFA) ، والجرعة المعدية لزراعة الأنسجة بنسبة 50٪ (TCID50) ، ومقايسة تركيز الفلورسنت ، والمجهر الإلكتروني الانتقالي (TEM) 12.

يعد PFA ، الذي طوره Renato Dulbecco في عام 1952 ، أحد أكثر الطرق شيوعا لمعايرة الفيروس ، بما في ذلك ZIKV16. يتم استخدامه لتحديد التركيزات الفيروسية مباشرة للفيروسات المعزولة المعدية. تعتمد الطريقة على قدرة الفيروس المحلل على إنتاج تأثيرات اعتلال خلوي (CPEs ؛ مناطق موت الخلايا أو اللويحات ، وهي منطقة عدوى محاطة بخلايا غير مصابة) في طبقة أحادية الخلية الملقحة بعد العدوى الفيروسية. ومع ذلك ، هناك العديد من العيوب للفحص التي تؤثر على فائدتها. تستغرق عملية الفحص وقتا طويلا (تستغرق حوالي 7-10 أيام ، اعتمادا على الفيروسات) ، وتعتمد على CPE ، وعرضة للأخطاء. في هذه الدراسة ، أبلغنا عن تقنية قياس الألوان المناعية ، مقايسة تشكيل التركيز (FFA) ، للكشف عن ZIKV وقياسه في تنسيقات صفيحة 24 بئرا و 96 بئرا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. انتشار الفيروس

  1. إعداد الخلية
    1. تنمو خلايا Vero في دورق زراعة خلايا 75 سم2 يحتوي على 12 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 2 مللي متر L-glutamine (انظر جدول المواد). احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    2. مراقبة الخلايا تحت المجهر. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -90٪ ، تصبح جاهزة للاستخدام (الشكل 1 أ).
      ملاحظة: تتضاعف خلايا Vero كل 24 ساعة17 تقريبا. يجب أن تستغرق التخفيفات من 1:10 من 3 إلى 4 أيام للوصول إلى التقاء 80٪ -90٪ في قارورة 75 سم2 . مراقبة الخلايا يوميا أو كل يوم.
  2. إصابة الخلية أحادية الطبقة
    1. قم بإزالة وسط النمو من دورق زراعة الخلايا باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. اشطف القارورة ب 3 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (dPBS) 2x باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل.
      ملاحظة: يجب تحضير دورق يحتوي على 10٪ هيبوكلوريت الصوديوم لتطهير أي نفايات سائلة معدية مهملة من القوارير / الألواح.
    2. أضف 2 مل من DMEM الخالي من المصل (DMEM مكمل ب 2 mM L-glutamine بدون FBS) و 20 ميكرولتر من لقاح ZIKV في دورق زراعة الخلايا. احتضان القارورة مع هزاز لطيف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح بامتصاص الفيروس.
      ملاحظة: ستكون معايرة مخزون ZIKV الأولي مفيدة لتحديد حجم إضافة لقاح ZIKV (الخطوة 2).
      تنبيه: يصنف فيروس زيكا على أنه أحد مسببات الأمراض من المستوى 2 للسلامة الأحيائية (BSL-2). ويجب أن تجرى جميع الإجراءات المتعلقة بالمواد المحتوية على فيروس زيكا في خزانة معتمدة للسلامة الأحيائية وأن تتبع جميع إجراءات التشغيل المعيارية المختبرية بمعدات الحماية الشخصية المناسبة.
  3. إضافة وسيط التراكب
    1. بعد الحضانة لمدة 1 ساعة ، قم بإزالة لقاح الفيروس المخفف والتخلص منه باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل. شطف قارورة ثقافة الخلية مع 3 مل من dPBS 2x.
    2. أضف 12 مل من وسائط الصيانة (DMEM مكمل ب 2٪ FBS و 2 mM L-glutamine و 100 U / mL من البنسلين والستربتومايسين) في دورق زراعة الخلايا للحفاظ على الخلايا المصابة.
    3. احتضان خلايا فيرو المصابة لمدة 3 أيام في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: راقب يوميا CPE لخلايا Vero المصابة تحت المجهر.
  4. حصاد طاف زراعة الخلايا المحتوي على ZIKV
    1. في اليوم 3 بعد الإصابة ، يمكن ملاحظة تقريب الخلايا وانفصالها (CPE) (الشكل 1B-D). حصاد طاف زراعة الخلايا الذي يحتوي على ZIKV في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل.
    2. استخدم مرشح حقنة بولي إيثر سلفون 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) لتصفية طاف زراعة الخلايا. القسمة 500 ميكرولتر من طاف زراعة الخلايا المفلترة في أنابيب غطاء لولبي 2.0 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
      ملاحظة: يمكن تخزين ZIKV المحصود في -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
      تنبيه: يجب اتخاذ احتياطات إضافية إذا تم استخدام إبرة حقنة ، لأن الإبرة يمكن أن تثقب الجلد. ويلزم وضع إجراءات تشغيلية موحدة للمختبرات.

2. القياس الكمي للفيروس

  1. إعداد الخلية
    1. خلايا فيرو البذور في لوحات مخصصة (صفيحة 24 بئر: 0.5 مل / بئر ، 7.5 × 104 خلايا / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 0.1 مل / بئر ، 1.5 × 104 خلايا / بئر) واحتضان اللوحة طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: هناك خمس نقاط زمنية مختلفة يجب اختبارها (صفيحة 24 بئرا: 48 ساعة ، 60 ساعة ، 72 ساعة ، 84 ساعة ، و 96 ساعة بعد الإصابة ؛ لوحة 96 بئرا: 24 ساعة ، 36 ساعة ، 48 ساعة ، 60 ساعة ، و 72 ساعة بعد الإصابة) ؛ لذلك ، قم بإعداد لوحة واحدة لكل نقطة زمنية.
    2. بعد حضانة 24 ساعة وبمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -90٪ (الشكل 1E) ، تكون اللوحة جاهزة للعدوى. تابع تحضير مخزون الفيروس المخفف (الخطوة 2.2) قبل إصابة الخلية أحادية الطبقة.
  2. تخفيف الفيروس
    1. بالنسبة لألواح 24 و 96 بئرا ، قم بإعداد ستة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 1.5 مل لكل لوحة لإجراء تخفيف عشرة أضعاف (10-1 حتى 10-5) ، بما في ذلك التحكم السلبي. لإعداد التجربة للوحة 24 بئرا ، أضف 450 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل إلى جميع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الستة. لإعداد التجربة للوحة 96 بئرا ، أضف 135 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل إلى ستة أنابيب.
      ملاحظة: قم بتسمية كل أنبوب بوضوح للإشارة إلى تخفيف محتوياته قبل إجراء التخفيف التسلسلي بعشرة أضعاف.
    2. لإجراء التخفيف التسلسلي ، لإعداد تجربة لوحة 24 بئرا ، أضف 50 ميكرولتر من مخزون ZIKV الذي تم حصاده من الخطوة 1 إلى الأنبوب 10-1 الذي يحتوي على 450 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل. لإعداد تجربة لوحة 96 بئرا ، أضف 15 ميكرولتر من مخزون ZIKV إلى الأنبوب 10-1 الذي يحتوي على 135 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل.
    3. دوامة كل أنبوب لخلط الفيروس والمتوسطة. هذا هو التخفيف الأول عشرة أضعاف.
      ملاحظة: يلزم الخلط الصحيح للفيروس ووسط الثقافة في كل أنبوب تخفيف لضمان التخفيف التسلسلي الدقيق.
    4. لإعداد تجربة لوحة 24 بئرا ، استخدم طرف ماصة جديد لإعادة تعليق الأنبوب 10-1 ونقل 50 ميكرولتر من ZIKV المخفف إلى أنبوب 10-2 كتخفيف ثان عشرة أضعاف. لإعداد تجربة لوحة 96 بئرا ، استخدم طرف ماصة جديد لإعادة تعليق الأنبوب 10-1 ونقل 15 ميكرولتر من ZIKV المخفف إلى الأنبوب 10-2 كتخفيف ثان عشرة أضعاف.
    5. كرر الخطوة 2.2.4 أربع مرات حتى الأنبوب الخامس (باستثناء التحكم السلبي).
      ملاحظة: استخدم طرف ماصة جديدا بعد كل خطوة سحب لتجنب التلوث المتبادل.
  3. إصابة الخلية أحادية الطبقة
    1. قم بإزالة الوسط المكيف والتخلص منه من كل بئر (لوحة 24 بئر: 0.5 مل / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 0.1 مل / بئر).
    2. اشطف كل بئر باستخدام dPBS 2x (لوحة 24 بئرا: 300 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 60 ميكرولتر / بئر).
    3. من خلال العمل من أعلى إلى أدنى تخفيف ، أضف كل لقاح فيروس مخفف بشكل متسلسل إلى البئر (لوحة 24 بئرا: 200 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 40 ميكرولتر / بئر).
      ملاحظة: سيتم إجراء إصابة كل تخفيف في الآبار المكررة. الحفاظ على بئرين غير مصابين كعنصر تحكم سلبي. قم بتسمية اللوحة والآبار بوضوح لتجنب الالتباس. قم بتغيير أطراف الماصة بعد كل خطوة سحب لمنع التلوث المتبادل.
    4. احتضن اللوحة بتأرجح لطيف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح بامتصاص الفيروس.
  4. إضافة وسط زراعة الخلايا المتراكبة
    1. بعد 1 ساعة من الحضانة ، قم بإزالة معلق الفيروس وتجاهله من أدنى تركيز إلى أعلى.
    2. اغسل الخلايا المصابة باستخدام dPBS 2x (لوحة 24 بئرا: 300 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 60 ميكرولتر / بئر).
    3. قم بتراكب البئر مع DMEM (مكمل ب 2٪ FBS ، 2 mM L-glutamine ، و 100 U / mL من البنسلين - الستربتومايسين) و 1.5٪ كربوكسي ميثيل السليلوز منخفض اللزوجة (CMC ؛ انظر جدول المواد) (لوحة 24 بئرا: 1 مل / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 0.2 مل / بئر).
    4. احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: لا تزعج اللوحة خلال فترة الحضانة هذه.
    5. أخرج الصفيحة من حاضنة زراعة الخلايا للتلطيخ في نقاط زمنية مختلفة (صفيحة 24 بئرا: 48 ساعة ، 60 ساعة ، 72 ساعة ، 84 ساعة ، و 96 ساعة بعد الإصابة ؛ لوحة 96 بئرا: 24 ساعة ، 36 ساعة ، 48 ساعة ، 60 ساعة ، و 72 ساعة بعد الإصابة).

3. تلطيخ

  1. تثبيت الخلية
    1. بعد ساعات الحضانة المحددة (صفيحة 24 بئرا: 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة و 84 ساعة و 96 ساعة بعد الإصابة ؛ لوحة 96 بئرا: 24 ساعة ، 36 ساعة ، 48 ساعة ، 60 ساعة ، و 72 ساعة بعد الإصابة) ، قم بإزالة وتجاهل وسط التراكب وغسل الخلايا 3x مع 1x PBS. بالنسبة للوحة 96 بئرا ، قم بإزالة وتجاهل وسيط التراكب واغسل الخلايا 3x ب 60 ميكرولتر / بئر من 1x PBS باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    2. أضف 4٪ بارافورمالدهايد لإصلاح الخلايا (لوحة 24 بئرا: 300 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 60 ميكرولتر / بئر). احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
      تنبيه: بارافورمالدهيد هو فورمالديهايد صلب مبلمر. إنه مسحوق بلوري أبيض صلب قابل للاشتعال يطلق غاز الفورمالديهايد عند مزجه بالماء أو تسخينه. يجب إجراء جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام بارافورمالدهايد في غطاء دخان كيميائي معتمد أو حاويات مستنفدة معتمدة وفقا لإجراءات التشغيل الموحدة المختبرية الخاصة بالمواد الكيميائية المحتوية على الفورمالديهايد.
    3. بعد 20 دقيقة ، تخلص من بارافورمالدهيد واغسل الخلايا 3x باستخدام 1x PBS. قم بإجراء عمليات النفاذية والحجب وحضانة الأجسام المضادة باتباع الخطوات 3.2-3.5.
      ملاحظة: عند التخلص من 4٪ بارافورمالدهيد ، اتبع إجراءات التخلص من النفايات في الجامعة أو المعهد.
  2. نفاذية الخلية
    1. أضف 1٪ أوكتيل فينوكسي بولي (إيثيلينوكسي) إيثانول (انظر جدول المواد) لنفاذية الخلايا (لوحة 24 بئرا: 200 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 40 ميكرولتر / بئر). احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. بعد 15 دقيقة ، تخلص من أوكتيل فينوكسي بولي (إيثيلينوكسي) إيثانول واغسل الخلايا 3x باستخدام 1x PBS.
  3. حظر
    1. أضف 3٪ حليب خالي الدسم لتقليل الارتباط غير النوعي في العينة (لوحة 24 بئرا: 500 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 100 ميكرولتر / بئر). احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    2. بعد 2 ساعة ، تخلص من الحليب الخالي من الدسم 3٪ واغسل الخلايا 3x باستخدام 1x PBS.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف. بعد إضافة 3٪ حليب خالي الدسم ، يمكن تخزين الألواح في 4 درجات مئوية حتى 2 أيام قبل إدخال الأجسام المضادة الأولية.
  4. حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. أضف جسما مضادا أحادي النسيلة مضادا للفيروس المصفر ، 4G2 (استنساخ D1-4G2-4-15 ؛ الجسم المضاد الأساسي ، انظر جدول المواد) المخفف في حليب خالي الدسم بنسبة 1٪ (نسبة 1: 1000) (صفيحة 24 بئرا: 200 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئرا: 40 ميكرولتر / بئر). احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. بعد 1 ساعة ، قم بإزالة المحلول الذي يحتوي على الجسم المضاد وحيد النسيلة وغسل الخلايا 3x مع 1x PBS.
  5. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
    1. أضف الجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للفأر للماعز المترافق مع بيروكسيديز الفجل (HRP) (انظر جدول المواد) المخفف في حليب خالي الدسم بنسبة 1٪ (نسبة 1: 1000) (لوحة 24 بئر: 200 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 40 ميكرولتر / بئر). احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. بعد 1 ساعة ، قم بإزالة المحلول الذي يحتوي على الجسم المضاد الثانوي واغسل الخلايا 3x باستخدام 1x PBS.
  6. حضانة الركيزة
    1. أضف 3،3'diaminobenzidine (DAB) ركيزة بيروكسيديز (انظر جدول المواد) واحتضن اللوحة لمدة 30 دقيقة في الظلام (لوحة 24 بئرا: 200 ميكرولتر / بئر ؛ لوحة 96 بئر: 40 ميكرولتر / بئر). بعد 30 دقيقة ، أوقف التفاعل عن طريق غسل الآبار بالماء.
    2. جفف الألواح في الهواء طوال الليل وانتقل إلى تعداد البؤر بعد أن تجف الألواح تماما.

4. تحديد عيار الفيروس

  1. عملية عد البؤر اليدوية (تنسيق 24 بئرا)
    1. يمكن تصور البؤر تحت مجهر ستيريو. حدد التخفيف الذي ينتج 50-200 بؤرة.
    2. عد البؤر لكل نسخة مكررة من التخفيف المحدد. احسب متوسط عدد البؤر لكل من التخفيفات المحددة.
    3. احسب وحدة تشكيل البؤر لكل مل (FFU / mL) لكل عينة بالصيغة أدناه: FFU / mL = متوسط عدد البؤر التي تم حسابها / (تمت إضافة التخفيف × حجم الفيروس المخفف).
  2. عملية عد البؤر الآلية (تنسيق 96 بئرا)
    1. امسح لوحة 96 بئرا ضوئيا على محلل برامج تجارية.
      1. انقر نقرا مزدوجا فوق البرنامج (انظر جدول المواد) لفتحه.
      2. انقر فوق تبديل الأجنحة وتأكد من تبديل الجناح إلى أي جناح قابل للتطبيق (الشكل التكميلي 1 أ). انقر فوق موافق.
      3. ابدأ الفحص بالنقر فوق مسح ضوئي > مسح كامل للوحة (الشكل التكميلي 1B).
      4. انقر فوق لوحة القيادة للتأكد من أن تنسيق الالتقاط هو تنسيق 96 بئرا (الشكل التكميلي 2 أ).
      5. حدد وضع التوسيط ك "تم التحقق من مستخدم المحاذاة المسبقة التلقائية" (الشكل التكميلي 2 ب).
      6. انقر فوق إخراج لتحميل اللوحة.
        ملاحظة: افتح غطاء اللوحة وضعه لأعلى مع وجود الصف A في الأعلى (الشكل التكميلي 3A).
      7. أدخل اسم اللوحة وانقر على موافق. انقر فوق تحميل لتحميل اللوحة.
      8. انقر فوق ابدأ لبدء الفحص. بعد ذلك ، قم بمعايرة مواضع A1 و A12 و H1 باستخدام الأزرار "أعلى ، أسفل ، يسار ، يمين" وانقر فوق تأكيد (الشكل التكميلي 3 ب).
        ملاحظة: سيبدأ البرنامج في مسح كل بئر.
      9. بمجرد اكتمال المسح ، ستظهر صورة نظرة عامة. انقر فوق إغلاق.
      10. اخرج من الفحص بالنقر فوق رجوع إلى لوحة التبديل.
    2. عد لوحة 96 بئرا باستخدام البرنامج.
      1. انقر على العد > العد الذكي.
      2. في البرنامج ، سيظهر "الخطوة 1 من 5: حدد اللوحات المراد حسابها". انقر فوق لوحة (لوحة) التحميل. ضع علامة في المجلد بأكمله وانقر فوق تحديد لاستيراد اللوحة الممسوحة ضوئيا (الشكل التكميلي 4 أ).
      3. في البرنامج ، سيظهر "الخطوة 2 من 5: تحديد معلمات العد". انقر فوق ضبط المعلمات ، وسيتم عرض المعلمات (عملية منتشرة ؛ صغير / عادي / كبير / أكبر / أكبر +1 ؛ فصل موضعي ؛ منطقة محسوبة ؛ توازن الخلفية ؛ إزالة الألياف ؛ بوابة).
        ملاحظة: ابدأ ببئر واحدة ، وتحقق ذهابا وإيابا للعثور على أفضل الإعدادات لجميع الآبار.
      4. بمجرد الانتهاء ، انقر فوق التالي (الشكل التكميلي 4 ب).
      5. في البرنامج ، سيظهر "الخطوة 3 من 5: تحديد / إلغاء تحديد الآبار". بمجرد اكتمال اختيار البئر المراد عدها ، انقر فوق التالي المضي قدما.
        ملاحظة: ستظهر الآبار المختارة المراد عدها بحرف "C" في الزاوية اليمنى العليا من كل بئر (الشكل التكميلي 5A).
      6. في البرنامج ، سيظهر "الخطوة 4 من 5: إعدادات الإخراج". انقر فوق عرض / تعديل إعدادات الإخراج للتحقق مما إذا كانت الإعدادات (مثل تنسيق الصورة) مناسبة. انقر فوق حفظ والخروج من > التالي (الشكل التكميلي 5B).
      7. في البرنامج ، سيظهر "الخطوة 5 من 5: بدء العد التلقائي". انقر فوق بدء العد التلقائي (الشكل التكميلي 6 أ).
      8. بمجرد الانتهاء ، انقر فوق الخروج من العد التلقائي.
  3. إجراء مراقبة الجودة (QC) في محلل البرامج التجارية.
    1. في صفحة لوحة التبديل ، انقر فوق مراقبة الجودة > إضافة لوحة (لوحة). حدد المجلد بأكمله لاستيراد اللوحة المحسوبة ، انقر فوق تحديد > بدء مراقبة الجودة (الشكل التكميلي 6 ب).
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق كل بئر لتدقيق المواقع. انقر فوق عد لإزالة أي نقاط. سيبدأ البرنامج في العد.
      ملاحظة: تأكد من تحديد "البقع: إزالة". يمكن الإشارة إلى إكمال العد من خلال عدد البؤر المحسوبة ، على سبيل المثال "30" (الشكل التكميلي 7 أ).
    3. بمجرد انتهاء العد (المشار إليه بعدد البؤر المحسوبة ، على سبيل المثال "30") ، انقر فوق "نعم" لإزالة البقع (الشكل التكميلي 7B). انقر بزر الماوس الأيسر ثلاث مرات على الفور المراد إزالته. انقر بزر الماوس الأيمن للإنهاء ، ثم انقر فوق نعم.
    4. انقر فوق لوحة الإنهاء وانتقل إلى نظرة عامة على المشروع بمجرد اكتمال مراقبة الجودة.
  4. قم بإجراء التصوير باستخدام محلل البرامج.
    1. تحقق من صورة اللوحة الممسوحة ضوئيا والمحسوبة ومراقبة الجودة (الشكل 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن قياس ZIKV كميا باستخدام FFA ، كما هو موضح بشكل تخطيطي في الشكل 3. بالنسبة للوحة 24 بئرا ، تم تثبيت خلايا Vero المصابة عند 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة و 84 ساعة و 96 ساعة بعد الإصابة. أظهرت النتائج أن الخلايا بقيت سليمة (لم يلاحظ أي انفصال خلوي) بعد 96 ساعة (4 أيام) بعد الإصابة (الشكل 4 والشكل التكميلي 8A-E). لوحظ ظهور بؤر الفيروس لأول مرة في 48 ساعة (2 أيام) بعد الإصابة (الشكل 4A-F). ومع ذلك ، كان حجم البؤر صغيرا جدا ، مما يجعل من الصعب حساب البؤر بدقة. تم تحقيق الحجم الأمثل للبؤر في 60 ساعة (2.5 يوم) بعد الإصابة (الشكل 4 ب). في النقاط الزمنية الأخيرة (72 ساعة و 84 ساعة و 96 ساعة بعد الإصابة) ، كانت البؤر أكبر وتميل إلى الاندماج أو التداخل. زادت البؤر المدمجة أو المتداخلة بمرور الوقت (الشكل 4C-E). لذلك ، تم اختيار البؤر التي تشكلت عند 60 ساعة (2.5 يوم) بعد الإصابة لتحديد عيار ZIKV في لوحة 24 بئرا (الشكل 4B).

بالنسبة للوحة 96 بئرا ، تم تثبيت خلايا Vero المصابة عند 24 ساعة و 36 ساعة و 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة بعد الإصابة. أظهرت النتائج أن الخلايا ظلت سليمة بعد 72 ساعة (3 أيام) بعد الإصابة (الشكل 5A-F والشكل التكميلي 9A-E). لوحظ ظهور بؤر الفيروس لأول مرة في 24 ساعة (1 يوم) بعد الإصابة (الشكل 5 أ). ومع ذلك ، كان حجم البؤر صغيرا جدا حتى 36 ساعة (1.5 يوما) بعد الإصابة ، مما يجعل من الصعب تحديد عدد البؤر بدقة (الشكل 5 أ ، ب). تم تحقيق حجم البؤر الأمثل في 48 ساعة (2 أيام) بعد الإصابة (الشكل 5C). في النقاط الزمنية الأخيرة (60 ساعة و 72 ساعة بعد الإصابة) ، لوحظت بؤر متداخلة أو مدمجة ، وزاد عدد البؤر المتداخلة بمرور الوقت (الشكل 5D ، E). لذلك ، تم اختيار البؤر التي تشكلت في 48 ساعة (2 أيام) بعد العدوى لتحديد عيار الفيروس من عزلات ZIKV (الشكل 5C). يمكن تصور تشكيل البؤر وتعدادها باستخدام محللات البرامج التجارية كبديل.

Figure 1
الشكل 1: صورة مجهرية لخلايا فيرو. (أ) أظهرت خلايا فيرو بتكبير 40x التقاء 70٪ -90٪ في دورق زراعة خلية 75 سم2 لانتشار الفيروس. (ب) CPE على خلايا Vero بعد إصابتها بفيروس ZIKV في اليوم 1 بعد الإصابة بتكبير 100x. (C) CPE على خلايا Vero بعد إصابتها بفيروس ZIKV في اليوم 2 بعد الإصابة بتكبير 100x. (د) CPE على خلايا Vero بعد إصابتها بفيروس ZIKV في اليوم 3 بعد الإصابة بتكبير 100x. (ه) أظهرت خلايا فيرو عند تكبير 40x التقاء 70٪ -90٪ في صفيحة 24 بئرا بعد 24 ساعة من الحضانة لتحديد كمية الفيروس. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: صورة للوحة تحكم بتنسيق 96 بئرا تم مسحها ضوئيا وعدها وما بعد الجودة باستخدام محلل برامج تجارية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: سير عمل تلطيخ مقايسة تشكيل البؤر. عمليات التلوين بما في ذلك تثبيت الخلايا ، النفاذية ، الحجب ، ربط الأجسام المضادة ، والحضانة مع ركيزة البيروكسيديز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مقايسة تشكيل البؤر ل ZIKV P6-740 في 24 لوحة بئر في نقاط زمنية مختلفة. (أ) تكون البؤر أقل وضوحا في اليوم 2 (48 ساعة) بعد الإصابة. (ب) يمكن رؤية الحجم الأمثل للبؤر في اليوم 2.5 (60 ساعة) بعد الإصابة. (جيم - ه) اندمجت البؤر في اليوم 3 (72 ساعة) واليوم 3.5 (84 ساعة) واليوم 4 (96 ساعة) بعد الإصابة. (و) السيطرة السلبية على اللوحة. شريط المقياس: 1000 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مقايسة تشكيل البؤر ل ZIKV P6-740 في 96 لوحة بئر في نقاط زمنية مختلفة. (أ) البؤر أقل تميزا ليتم احتسابها على محلل البرامج التجارية في اليوم 1 (24 ساعة) بعد الإصابة. (ب) البؤر أقل تميزا ليتم احتسابها على محلل البرامج التجارية في اليوم 1.5 (36 ساعة) بعد الإصابة. (ج) يمكن رؤية الحجم الأمثل للبؤر في اليوم 2 (48 ساعة) بعد الإصابة. (د، ه) اندمجت البؤر في اليوم 2.5 (60 ساعة) واليوم 3 (72 ساعة) بعد الإصابة. (و) السيطرة السلبية على اللوحة. شريط المقياس: 1000 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: لقطات شاشة لصفحة بدء التشغيل لمحلل البرامج التجارية. (أ) قم بتبديل المجموعة إلى أي مجموعة قابلة للتطبيق على محلل البرامج التجارية. انقر فوق "موافق" بمجرد الانتهاء. (ب) لبدء المسح الضوئي على محلل البرامج التجارية ، انقر فوق "مسح" ثم انقر فوق "مسح كامل للوحة". الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: لقطات شاشة لعرض "تنسيق الالتقاط" ووضع التوسيط المحدد ك "التحقق من مستخدم المحاذاة المسبقة التلقائية" على محلل البرامج التجارية. (أ) لعرض تنسيق الالتقاط ، انقر فوق "لوحة القيادة" وحدد تنسيق 96 بئرا كتنسيق الالتقاط. (ب) لوضع التوسيط، حدد "التحقق من مستخدم المحاذاة المسبقة التلقائية". الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: وضع لوحة 96 بئرا على درج قارئ لوحة محلل البرامج التجارية ولقطة شاشة لمعايرة مواضع الآبار A1 و A12 و H1. (أ) ضع اللوحة لأعلى مع وجود الصف A في الأعلى. (ب) لمعايرة مواضع الآبار A1 و A12 و H1 ، استخدم الأزرار "أعلى ، أسفل ، يسار ، يمين". بمجرد الانتهاء ، انقر فوق "تأكيد". الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: لقطات شاشة لتحديد المجلدات التي تحتوي على لوحات ممسوحة ضوئيا للعد على محلل البرامج التجارية و "الخطوة 2 من 5: تحديد معلمات العد". (أ) لحساب عدد اللوحات الممسوحة ضوئيا ، انقر فوق "لوحة (لوحات) التحميل". ضع علامة على المجلد بأكمله وانقر فوق "تحديد" لاستيراد اللوحات الممسوحة ضوئيا. (ب) ضبط بارامترات العد. انقر فوق "التالي" بمجرد تعيين المعلمات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: لقطات شاشة لمحلل البرامج التجارية "الخطوة 3 من 5: تحديد / إلغاء تحديد الآبار" و "الخطوة 4 من 5: إعدادات الإخراج". (أ) حدد وإلغاء تحديد الآبار المراد عدها وانقر فوق "التالي" بمجرد الانتهاء. (B) بالنسبة لإعدادات الإخراج ، انقر فوق "عرض / تعديل إعدادات الإخراج" للتحقق مما إذا كانت الإعدادات مناسبة (على سبيل المثال ، تنسيق الصورة). انقر فوق "حفظ وإنهاء" بمجرد الانتهاء ثم انقر فوق "التالي". الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 6: لقطات شاشة لمحلل البرامج التجارية "الخطوة 5 من 5: بدء العد التلقائي" وصفحة مراقبة الجودة. (أ) بمجرد الاستعداد لعد اللوحات ، انقر فوق "بدء العد التلقائي". (ب) في صفحة مراقبة الجودة ، حدد المجلد بأكمله لاستيراد اللوحة المحسوبة ، وانقر فوق "تحديد" ، ثم انقر فوق "بدء مراقبة الجودة". الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 7: لقطات شاشة لصفحة مراقبة جودة محلل البرامج التجارية. (أ) انقر نقرا مزدوجا فوق كل بئر لتدقيق المواقع. انقر فوق "عد" لإزالة أي بقعة. ضع علامة "البقع: إزالة". (B) انقر بزر الماوس الأيسر ثلاث مرات لإزالة البقع. انقر بزر الماوس الأيمن للإنهاء ، ثم انقر فوق "نعم". الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 8: مقايسة تشكيل البؤر ل ZIKV P6-740 في 24 لوحة بئر في نقاط زمنية مختلفة. تم إجراء تخفيف تسلسلي عشرة أضعاف (10-1 إلى 10-5) على ZIKV P6-740 وتم إجراء العدوى على خلايا Vero في نسختين ، بما في ذلك التحكم السلبي. تم التقاط صورة بيانات أولية باستخدام مجهر ستيريو ، مع شريط المقياس يشير إلى 1000 ميكرومتر. (أ) اليوم 2 (48 ساعة) بعد الإصابة. (ب) اليوم 2.5 (60 ساعة) بعد الإصابة. (ج) اليوم 3 (72 ساعة) بعد الإصابة. (د) اليوم 3.5 (84 ساعة) بعد الإصابة. (ه) اليوم 4 (96 ساعة) بعد الإصابة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 9: مقايسة تشكيل البؤر ل ZIKV P6-740 في 96 بئرا في نقاط زمنية مختلفة. تم إجراء تخفيف تسلسلي عشرة أضعاف (10-1 إلى 10-5) على ZIKV P6-740 وتم إجراء العدوى على خلايا Vero في نسختين ، بما في ذلك التحكم السلبي. تم التقاط صورة بيانات أولية باستخدام مجهر مجسم ، حيث يشير شريط المقياس إلى 1000 ميكرومتر. (أ) اليوم 1 (24 ساعة) بعد الإصابة. (ب) اليوم 1.5 (36 ساعة) بعد الإصابة. (ج) اليوم 2 (48 ساعة) بعد الإصابة. (د) اليوم 2.5 (60 ساعة) بعد الإصابة. (ه) اليوم 3 (72 ساعة) بعد الإصابة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك العديد من المقايسات لتحديد عيار الفيروس. لدى PFA بروتوكول كمي مشابه للفيروس مثل FFA ، حيث يتم تخفيف لقاح الفيروس للسماح بتمييز اللويحات أو البؤر الفردية. بعد تلطيخ ، تشير كل لوحة أو بؤر إلى جسيم معدي واحد في اللقاح19. PFA ملطخ باللون البنفسجي البلوري لتصور تكوين البلاك الناجم عن تحلل الخلايا أو الموت. وبالتالي ، فإن PFA يستغرق وقتا أطول ، لأنه يتطلب وقتا أطول للفيروس ليسبب CPEs ، ويقتصر فقط على الفيروسات التي تحفز تحلل الخلايا أو الموت. استخدمت العديد من المختبرات بنجاح FFAs لتحديد عيار الفيروسات المعدية للفيروسات المصفرة ، بما في ذلك ZIKV19،20،21،22،23،24،25. FFA هي طريقة للكشف المناعي اللوني القائمة على الخلايا والتي تكتشف المستضد الفيروسي بالأجسام المضادة ، وبالتالي تحدد مناطق بؤر الخلايا المصابة باستخدام تقنية التلوين المناعي ، ولكن ليس اللويحات12,26. يقدم FFA بعض المزايا ل ZIKV على PFA. إحدى المزايا الواضحة هي أنه يعتمد على التعرف على الأجسام المضادة للمكونات الفيروسية دون CPEs الواضحة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الأجسام المضادة الخاصة بالفيروسات مفيد أيضا في تحديد الفيروسات المختلفة أو الأنماط المصلية الفيروسية في المجموعات السكانيةالمختلطة 27. لذلك ، فإن FFA أكثر تحديدا من PFA لأنه يقيس جميع الإصابات بالفيروس ولا يعتمد على الفيروسات التي تسبب موت الخلايا الكافي لتشكيل لوحة مرئية28. لدى FFA أيضا فترة حضانة أقصر من PFA ، الأمر الذي يتطلب CPE واضحا يدل على تحلل الخلايا والموت. أخيرا ، باستخدام لوحة 96 بئرا ، توفر طريقة FFA ميزة استخدام المزيد من النسخ المتماثلة والتخفيفات الأكبر لاكتشاف الفيروسومعايرته 27,29. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف اختبار FFA المبلغ عنه بسهولة لاختبارات تحييد الفيروس وطرق فحص المركبات المضادة للفيروسات. يمكن أن يؤدي دمج أدوات أو برامج عد الخلايا الآلية التجارية أو المجانية إلى زيادة تحسين قابلية الاستخدام (الاتساق والدقة والإنتاجية) ل FFA والأساليب المرتبطة بها.

عند مقارنة الصفيحة المكونة من 24 بئرا بالصفيحة المكونة من 96 بئرا ، من المهم ملاحظة أن تنسيق 24 بئرا يتطلب عددا أكبر من الخلايا التي يجب زراعتها في مزارع أحادية الطبقة ، بالإضافة إلى كميات أكبر من مخزون الوسائط والفيروسات. نتيجة لذلك ، قد لا يكون تنسيق اللوحة المكونة من 24 بئرا مناسبا للاستخدام مع العينات ذات الأحجام المحدودة. يمكن التغلب على هذا القيد باستخدام تنسيق 96 بئرا ، كما هو موضح في هذه الورقة. أولا ، يتطلب تنسيق 96 بئرا مواد أقل ، مما يجعله خيارا أكثر فعالية من حيث التكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العد الآلي لبؤر الفيروسات الملطخة بتنسيق 96 بئرا يسمح بإنتاجية عالية وتحليل سريع ، وهو أمر غير ممكن في تنسيق 24 بئرا ، والذي يتطلب العد اليدوي. تزيد عملية العد الآلي هذه أيضا من قابلية التكرار وتقلل من الذاتية مقارنة بالعد اليدوي ، مما يؤدي إلى نتائج أكثر دقة وموثوقية ل FFA. لذلك ، يوصى بشدة بتنسيق 96 بئرا مع أنظمة التصوير الآلي للمختبرات التي تتطلب إنتاجية عالية وقياسا موثوقا للفيروسات.

من ناحية أخرى ، يستخدم بعض الأشخاص مقايسة التركيز المناعي للكشف عن ZIKV25،27،28،30،31. يوازي مقايسة تركيز التألق المناعي FFA ، باستثناء أنه يتم إجراؤه عن طريق تلطيخ المستضدات المناعية بأجسام مضادة محددة مترافقة بالفلوروكروم ، متبوعة بحساب بؤر العدوى تحت مجهر مضان25. يستخدم هذا الفحص كواشف أكثر تكلفة ويحتاج إلى فحص مجهري مضان لإكمال الفحص. لذلك ، يقتصر اختبار تركيز التألق المناعي على المختبرات المجهزة بشكل أفضل ، مثل مختبرات الإحالة. ليس من السهل استخدام هذا الفحص في بيئة صعبة الموارد.

على الرغم من أن FFA لها العديد من المزايا ، إلا أن لها أيضا بعض القيود. بالمقارنة مع المقايسات الأخرى ، مثل PFA ، يتضمن FFA المزيد من الخطوات أثناء عمليات التلطيخ. في حين أن الخطوات بعد التثبيت مرنة وتسمح بالتوقف طوال الليل أو لفترة أطول ، إلا أن تلطيخ البؤر لا يزال يستغرق وقتا أطول حتى يكتمل. علاوة على ذلك ، يتطلب FFA أجساما مضادة محددة أو متقاطعة التفاعل في عملية التلوين ، مما يحد من قابليته للتطبيق لتحديد وقياس الفيروسات الجديدة أو الجديدة. علاوة على ذلك ، فإن تكلفة FFA أعلى مقارنة ب PFA ، والتي تتطلب فقط البنفسج البلوري للتلطيخ. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن عملية العد الآلي (تنسيق 96 بئرا) لا يمكن إجراؤها إلا في مختبر مزود بالمعدات المناسبة ؛ وبالتالي ، لن تكون مناسبة للمختبرات بدون المعدات اللازمة.

في الختام ، نبلغ عن بروتوكولات مفصلة لانتشار وقياس ZIKV باستخدام مقايسة الكشف المناعي اللوني القائمة على الخلايا أو FFA في تنسيقات صفيحة 24 بئرا و 96 بئرا. تقدم الطريقة عددا من المزايا العملية على PFA الكلاسيكي. إنه أسرع وقابل للتطبيقات عالية الإنتاجية عند تطبيقه مع نظام تصوير آلي لحساب البؤر. وسيسهم توحيد البروتوكولات الموثوقة لهذه الدراسة إسهاما كبيرا في أبحاث زيكا، كما يمكن تكييفها على نطاق واسع لتحديد كمية الفيروسات الأخرى المهمة سريريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تلقى هذا البحث دعما من وزارة التعليم العالي الماليزية في إطار برنامج المنح البحثية طويلة الأجل (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN / F1 / 01/2018) وتمويل برنامج مركز التميز للمؤسسات العليا (HICoE) (MO002-2019). الشكل 3 في هذه الدراسة الذي يوضح سير عمل التلوين لمقايسة تشكيل البؤر مقتبس من "DAB Immunohistochemistry" بواسطة BioRender.com (2022). تم الاسترجاع من https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filter Sartorius S6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
10 mL sterile serological pipette Labserv 14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) Gibco 14190-136
2.0 mL Screw cap tube  Axygen SCT-200-SS-C-S
24-well plate Corning 3526
25 mL Sterile serological pipettes Labserv 14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate Thermo Scientific 34065
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
5 mL sterile serological pipette Labserv 14955155
50 mL centrifuge tube Falcon LAB352070
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
96-well plate Falcon 353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) MilliporeSigma MAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) N/A N/A 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) CTL-S6UNV12 Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-017
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) MilliporeSigma 12-349
Hemacytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
IGEPAL CA-630 detergent Sigma-Aldrich I8896 Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Laboratory rocker FINEPCR CR300
L-Glutamine Gibco 25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) Sigma-Aldrich C5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
Skim milk Sunlac Low Fat N/A Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium Hypochlorite Clorox N/A To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle Terumo SS10L21G
Vero African green monkey kidney cells  - ECACC 88020401 Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
  3. Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
  4. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
  5. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  6. Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
  7. Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
  8. Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
  10. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  11. Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control. , Stockholm. Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015).
  12. Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
  13. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  14. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  15. Bae, H. -G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
  18. Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
  19. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
  20. Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
  21. Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
  22. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  23. Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  24. Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  25. Kang, W., Shin, E. -C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
  26. Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
  27. Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
  28. Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
  29. Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
  30. Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
  31. Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 194 ، فيروس زيكا (ZIKV) ، الفيروس المصفر ، تشوهات الدماغ الخلقية ، متلازمة غيلان بارا© ، علم الفيروسات ، مقايسة تشكيل التركيز (FFA) ، المستضد الفيروسي ، تقنية التلوين المناعي للبيروكسيديز ، تنسيق 24 بئرا ، تنسيق 96 بئرا ، تحسين حجم البؤر ، خلايا فيرو ، الحضانة ، عمليات التلوين ، تثبيت الخلايا ، النفاذية ، الحجب ، ربط الأجسام المضادة ، ركيزة البيروكسيديز
انتشار الفيروس والقياس اللوني القائم على الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., … More

Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification. J. Vis. Exp. (194), e64578, doi:10.3791/64578 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter