Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Virusforplantning og cellebasert kolorimetrisk kvantifisering

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64578
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

Den foreliggende protokollen beskriver forplantningen av Zika-virus (ZIKV) i Vero afrikanske grønne ape nyreceller og kvantifisering av ZIKV ved hjelp av cellebaserte kolorimetriske immunodeteksjonsmetoder i 24-brønn og 96-brønn (høy gjennomstrømning) formater.

Abstract

Zikavirus (ZIKV) er et myggbårent virus som tilhører slekten Flavivirus. ZIKV-infeksjon har vært assosiert med medfødte hjerneavvik og potensielt Guillain-Barré syndrom hos voksne. Forskning på ZIKV for å forstå sykdomsmekanismene er viktig for å legge til rette for vaksine- og behandlingsutvikling. Metoden for å kvantifisere virus er avgjørende og grunnleggende innen virologi. Fokusdannende analyse (FFA) er en viruskvantifiseringsanalyse som oppdager virusantigenet med antistoffer og identifiserer infeksjonsfokuset til celler ved hjelp av peroksidase-immunfargingsteknikken. Den nåværende studien beskriver virusutbredelsen og kvantifiseringsprotokollen ved bruk av både 24-brønn og 96-brønn (høy gjennomstrømning) formater. Sammenlignet med andre lignende studier har denne protokollen videre beskrevet optimalisering av foci-størrelse, som kan tjene som en veiledning for å utvide bruken av denne analysen for andre virus. For det første utføres ZIKV-forplantning i Vero-celler i 3 dager. Dyrkningssupernatanten som inneholder ZIKV høstes og kvantifiseres ved hjelp av FFA. Kort fortalt blir viruskulturen inokulert på Vero-celler og inkubert i 2-3 dager. Foci-dannelse bestemmes deretter etter optimaliserte fargeprosesser, inkludert cellefiksering, permeabilisering, blokkering, antistoffbinding og inkubasjon med peroksidasesubstrat. De fargede virusfociene visualiseres ved hjelp av et stereomikroskop (manuell telling i 24-brønnformat) eller programvareanalysator (automatisert telling i 96-brønnformat). FFA gir reproduserbare, relativt raske resultater (3-4 dager) og er egnet til bruk for forskjellige virus, inkludert ikke-plakkdannende virus. Deretter er denne protokollen nyttig for studiet av ZIKV-infeksjon og kan brukes til å oppdage andre klinisk viktige virus.

Introduction

Zikavirus (ZIKV) infeksjon er en fremvoksende myggbåren virussykdom. Den første isolasjonen av ZIKV var i Uganda i 1947 1,2; Den forble neglisjert fra 1947 til 2007, da de kliniske symptomene oftest er asymptomatiske og preget av selvbegrensende febersykdom. I 2007 begynte Zika-epidemien på Yap-øyene 3,4, etterfulgt av større epidemier i Stillehavsregionene (Fransk Polynesia, Påskeøya, Cookøyene og Ny-Caledonia) fra 2013 til 2014 5,6,7,8, hvor den alvorlige nevrologiske komplikasjonen Guillain-Barré syndrom (GBS) ble rapportert hos voksne for første gang9. I løpet av 2015 og 2016 feide den første utbredte ZIKV-epidemien over Amerika etter fremveksten av den asiatiske genotypen av ZIKV i Brasil allerede i 201310. Under dette utbruddet ble det rapportert 440 000 til 1,3 millioner tilfeller av mikrocefali og andre nevrologiske lidelser hos nyfødte barn11. Det er for tiden ingen spesifikk kur eller behandling for ZIKV-infeksjon; Derfor er det et presserende medisinsk behov for ZIKV-vaksiner som kan forhindre infeksjoner, spesielt under graviditet.

Viruskvantifisering er en prosess for å bestemme antall virus som er tilstede i en prøve. Det spiller en viktig rolle i forskning, og akademiske laboratorier involverer mange felt, for eksempel medisin og biovitenskap. Denne prosessen er også viktig i kommersielle sektorer, for eksempel produksjon av virale vaksiner, rekombinante proteiner, virale antigener eller antivirale midler. Mange metoder eller analyser kan brukes til viruskvantifisering12. Valg av metoder eller analyser avhenger normalt av virusets egenskaper, ønsket nøyaktighetsnivå og arten av eksperimentet eller forskningen. Generelt kan metoder for kvantifisering av virus deles inn i to kategorier: molekylære analyser som oppdager tilstedeværelsen av viral nukleinsyre (DNA eller RNA) og analyser som måler virussmittsomhet in vitro12. Kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR, for DNA) eller kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR, for RNA)13 og digital dråpe PCR14 er eksempler på vanlige molekylære teknikker som brukes til å kvantifisere virusnukleinsyren i en gitt prøve15. Imidlertid kan disse svært følsomme molekylære teknikkene ikke skille mellom levedyktige og ikke-levedyktige virus15. Derfor kan forskning som krever informasjon om biologiske egenskaper, som virussmittsomhet på celler, ikke fullføres ved hjelp av ovennevnte molekylære teknikker; Analyser som kan måle og bestemme tilstedeværelsen av levedyktige virus er nødvendig. Analyser som måler virussmittsomhet inkluderer plakkdannende analyse (PFA), 50% vevskultur infeksiøs dose (TCID50), fluorescerende fokusanalyse og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) 12.

PFA, utviklet av Renato Dulbecco i 1952, er en av de mest brukte metodene for virustitrering, inkludert for ZIKV16. Det brukes til direkte å bestemme virale konsentrasjoner for smittsomme lytiske virioner. Metoden er basert på et lytisk viruss evne til å produsere cytopatiske effekter (CPE, soner av celledød eller plakk, et infeksjonsområde omgitt av uinfiserte celler) i et inokulert cellemonolag etter virusinfeksjon. Det er imidlertid flere ulemper med analysen som påvirker verktøyet. Analysen er tidkrevende (tar omtrent 7-10 dager, avhengig av virus), CPE-avhengig og utsatt for feil. I denne studien rapporterer vi en immunokolorimetrisk teknikk, fokusdannende analyse (FFA), for å oppdage og kvantifisere ZIKV i 24-brønns plate- og 96-brønnplateformater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Virus forplantning

  1. Cell forberedelse
    1. Dyrk Vero-celler i en 75 cm2 cellekulturflaske inneholdende 12 ml Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) supplert med 10% føtal bovint serum (FBS) og 2 mM L-glutamin (se materialfortegnelse). Inkuber cellene i en cellekulturinkubator ved 37 °C med 5% CO2.
    2. Overvåke cellene under et mikroskop; når cellene når 70% -90% sammenløp, er de klare til bruk (figur 1A) .
      MERK: Vero-cellene dobler omtrent hver 24. time17. Fortynninger på 1:10 bør ta 3 til 4 dager for å nå 80% -90% sammenløp i en 75 cm2 kolbe. Overvåk cellene daglig eller annenhver dag.
  2. Infeksjon av cellemonolaget
    1. Fjern vekstmediet fra cellekulturkolben med en 10 ml serologisk pipette. Skyll kolben med 3 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (dPBS) 2x med en 5 ml serologisk pipette.
      MERK: Et beger med 10% natriumhypokloritt må være forberedt på å desinfisere kassert smittsomt flytende avfall fra kolber / plater.
    2. Tilsett 2 ml serumfritt DMEM (DMEM supplert med 2 mM L-glutamin uten FBS) og 20 μL ZIKV-inokulum i cellekulturkolben. Inkuber kolben med forsiktig gynging i 1 time ved romtemperatur for å tillate virusadsorpsjon.
      MERK: Titrering av den første ZIKV-beholdningen vil være nyttig for å bestemme volumet av ZIKV inokulumaddisjon (trinn 2).
      FORSIKTIG: ZIKV er klassifisert som et biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) patogen. Alle prosedyrer med materialer som inneholder ZIKV må utføres i et sertifisert biosikkerhetsskap og følge alle laboratoriestandard driftsprosedyrer (SOP) med passende personlig verneutstyr.
  3. Tilsetning av overleggsmediet
    1. Etter 1 time inkubasjon, fjern og kast det fortynnede virusinokulumet ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette. Skyll cellekulturkolben med 3 ml dPBS 2x.
    2. Tilsett 12 ml vedlikeholdsmedier (DMEM supplert med 2 % FBS, 2 mM L-glutamin og 100 U/ml penicillin-streptomycin) i cellekulturflasken for å opprettholde de infiserte cellene.
    3. Inkuber de infiserte Vero-cellene i 3 dager i en cellekulturinkubator ved 37 °C med 5% CO2.
      MERK: Overvåk daglig for CPE av infiserte Vero-celler under et mikroskop.
  4. Høsting av cellekultursupernatant som inneholder ZIKV
    1. Dag 3 etter infeksjon kan celleavrunding og løsrivelse (CPE) observeres (figur 1B-D). Høst cellekultursupernatanten som inneholder ZIKV inn i et 50 ml sentrifugerør ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette.
    2. Bruk et 0,22 μm polyetersulfon sprøytefilter (se Materialfortegnelse) for å filtrere cellekultursupernatanten. Aliquot 500 μL av den filtrerte cellekultursupernatanten i 2,0 ml skrukorkrør og oppbevares ved -80 °C inntil videre bruk.
      MERK: Høstet ZIKV kan lagres ved -80 °C for langtidslagring.
      FORSIKTIG: Ekstra forholdsregler må tas hvis en kanyle brukes, da nålen kan stikke huden gjennom. Laboratorie-SOP-er må etableres.

2. Virus kvantifisering

  1. Cell forberedelse
    1. Frø Vero-celler i utpekte plater (24-brønnplate: 0,5 ml / brønn, 7,5 x 104 celler / brønn; 96-brønnplate: 0,1 ml / brønn, 1,5 x 104 celler / brønn) og inkubere platen over natten i en cellekulturinkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
      MERK: Det er fem forskjellige tidspunkter som skal testes (24-brønnsplate: 48 timer, 60 timer, 72 timer, 84 timer og 96 timer etter infeksjon; 96-brønnsplate: 24 timer, 36 timer, 48 timer, 60 timer og 72 timer etter infeksjon); Forbered derfor en plate for hvert tidspunkt.
    2. Etter 24 timers inkubasjon og når cellene når 70% -90% sammenløp (figur 1E), er platen klar for infeksjon. Fortsett med å klargjøre den fortynnede virusstampen (trinn 2.2) før infeksjon av cellemonolaget.
  2. Virus fortynning
    1. For 24- og 96-brønnsplater, klargjør seks sterile 1,5 ml mikrosentrifugerør for hver plate for å utføre en ti ganger fortynning (10-1 opp til 10-5), inkludert en negativ kontroll. For eksperimentoppsettet for en 24-brønnsplate, tilsett 450 μL serumfri DMEM i alle seks mikrosentrifugerørene. For eksperimentoppsettet for en 96-brønnsplate, tilsett 135 μL serumfri DMEM i seks rør.
      MERK: Merk hver tube tydelig for å indikere fortynning av innholdet før du utfører den tidoble seriefortynningen.
    2. For å utføre seriell fortynning, for 24-brønns plateeksperimentoppsettet, tilsett 50 μL ZIKV-lager som ble høstet fra trinn 1 inn i 10-1-røret som inneholder 450 μL serumfri DMEM. For 96-brønns plateeksperimentoppsettet, tilsett 15 μL ZIKV-lager i 10-1-røret som inneholder 135 μL serumfri DMEM.
    3. Vortex hvert rør for å blande viruset og mediet. Dette er den første tifoldige fortynningen.
      MERK: Riktig blanding av virus og dyrkningsmedium i hvert fortynningsrør er nødvendig for å sikre nøyaktig seriefortynning.
    4. For 24-brønns plateeksperimentoppsettet, bruk en ny pipettespiss for å resuspendere 10-1-røret og overfør 50 μL fortynnet ZIKV til 10-2-røret som en andre ti ganger fortynning. For 96-brønns plateeksperimentoppsettet, bruk en ny pipettespiss for å resuspendere 10-1-røret og overfør 15 μL fortynnet ZIKV til 10-2-røret som en andre ti ganger fortynning.
    5. Gjenta trinn 2.2.4 fire ganger til det femte røret (utelukker negativ kontroll).
      MERK: Bruk en ny pipettespiss etter hvert pipetteringstrinn for å unngå krysskontaminering.
  3. Infeksjon av cellemonolaget
    1. Fjern og kast det kondisjonerte mediet fra hver brønn (24-brønnplate: 0,5 ml / brønn; 96-brønnplate: 0,1 ml / brønn).
    2. Skyll hver brønn med dPBS 2x (24-brønnsplate: 300 μL / brønn; 96-brønnplate: 60 μL / brønn).
    3. Arbeid fra høyeste til laveste fortynning, tilsett hvert seriefortynnet virusinokulum i brønnen (24-brønnsplate: 200 μL / brønn; 96-brønnplate: 40 μL / brønn).
      MERK: Infeksjonen av hver fortynning vil bli utført i dupliserte brønner. Oppretthold to uinfiserte brønner som negativ kontroll. Merk platen og brønnene tydelig for å unngå forvirring. Bytt pipettespissene etter hvert pipetteringstrinn for å forhindre krysskontaminering.
    4. Inkuber platen med forsiktig gynging i 1 time ved romtemperatur for å tillate virusadsorpsjon.
  4. Tilsetning av overleggscellekulturmediet
    1. Etter 1 time med inkubasjon, fjern og kast virussuspensjonen fra den laveste konsentrasjonen til den høyeste.
    2. Vask de infiserte cellene med dPBS 2x (24-brønnplate: 300 μL / brønn; 96-brønnplate: 60 μL / brønn).
    3. Overlegg brønnen med DMEM (supplert med 2% FBS, 2 mM L-glutamin og 100 U / ml penicillin-streptomycin) og 1,5% karboksymetylcellulose med lav viskositet (CMC; se materialfortegnelse) (24-brønnplate: 1 ml / brønn; 96-brønnplate: 0,2 ml / brønn).
    4. Inkuber platen i en cellekulturinkubator ved 37 °C med 5% CO2.
      MERK: Ikke forstyrr platen i denne inkubasjonsperioden.
    5. Ta platen ut fra cellekulturinkubatoren for farging på forskjellige tidspunkter (24-brønnplate: 48 timer, 60 timer, 72 timer, 84 timer og 96 timer etter infeksjon; 96-brønnsplate: 24 timer, 36 timer, 48 timer, 60 timer og 72 timer etter infeksjon).

3. Farging

  1. Cellefiksering
    1. Etter de spesifikke inkubasjonstimene (24-brønnsplate: 48 timer, 60 timer, 72 timer, 84 timer og 96 timer etter infeksjon, 96-brønnsplate: 24 timer, 36 timer, 48 timer, 60 timer og 72 timer etter infeksjon), fjern og kast overleggsmediet og vask cellene 3x med 1x PBS. For 96-brønnsplaten, fjern og kast overleggsmediet og vask cellene 3x med 60 μL / brønn på 1x PBS med en flerkanalspipette.
    2. Tilsett 4% paraformaldehyd for å fikse cellene (24-brønnplate: 300 μL / brønn; 96-brønnplate: 60 μL / brønn). Inkuber platen ved romtemperatur i 20 minutter.
      FORSIKTIG: Paraformaldehyd er et fast polymerisert formaldehyd. Det er et brannfarlig, fast, hvitt krystallinsk pulver som frigjør formaldehydgass når det blandes med vann eller oppvarmes. Alle prosedyrer som involverer bruk av paraformaldehyd må utføres i en sertifisert kjemisk avtrekkshette eller godkjente utmattede kapslinger etter laboratorie-som er spesifikke for formaldehydholdige kjemikalier.
    3. Etter 20 min, kast paraformaldehydet og vask cellene 3x med 1x PBS. Utfør permeabilisering, blokkering og antistoffinkubasjoner etter trinn 3.2-3.5.
      MERK: Når du kaster 4% paraformaldehyd, følg universitetets eller instituttets avfallshåndteringsprosedyre.
  2. Celle permeabilisering
    1. Tilsett 1% oktylfenoksypoly (etylenoksy)etanol (se materialfortegnelse) for å permeabilisere cellene (24-brønnsplate: 200 μL / brønn; 96-brønnplate: 40 μL / brønn). Inkuber platen ved romtemperatur i 15 minutter.
    2. Etter 15 min, kast oktylfenoksypoly (etylenoksy)etanol og vask cellene 3x med 1x PBS.
  3. Blokkerer
    1. Tilsett 3% skummet melk for å redusere den uspesifikke bindingen i prøven (24-brønnplate: 500 μL / brønn; 96-brønnplate: 100 μL / brønn). Inkuber platen ved romtemperatur i 2 timer.
    2. Etter 2 timer, kast 3% skummet melk og vask cellene 3x med 1x PBS.
      MERK: Dette er et stoppested. Etter tilsetning av 3 % skummet melk kan platene oppbevares ved 4 °C opptil 2 dager før innsetting av primært antistoff.
  4. Primær antistoffinkubasjon
    1. Legg til anti-flavivirus monoklonalt antistoff, 4G2 (klon D1-4G2-4-15; primært antistoff, se materialtabell) fortynnet i 1% skummet melk (1: 1,000-forhold) (24-brønnplate: 200 μL / brønn; 96-brønnplate: 40 μL / brønn). Inkuber platen ved 37 °C i 1 time.
    2. Etter 1 time, fjern løsningen som inneholder det monoklonale antistoffet og vask cellene 3x med 1x PBS.
  5. Sekundær antistoffinkubasjon
    1. Legg geit anti-mus IgG sekundært antistoff konjugert med pepperrotperoksidase (HRP) (se materialtabellen) fortynnet i 1% skummet melk (1: 1,000-forhold) (24-brønnplate: 200 μL / brønn; 96-brønnplate: 40 μL / brønn). Inkuber platene ved 37 °C i 1 time.
    2. Etter 1 time, fjern løsningen som inneholder det sekundære antistoffet og vask cellene 3x med 1x PBS.
  6. Inkubasjon av substrat
    1. Tilsett 3,3'diaminobenzidin (DAB) peroksidasesubstrat (se materialtabell) og inkuber platen i 30 minutter i mørket (24-brønnsplate: 200 μL / brønn; 96-brønnplate: 40 μL / brønn). Etter 30 min, stopp reaksjonen ved å vaske brønnene med vann.
    2. Lufttørk platene over natten og fortsett til foci-oppregning etter at platene er helt tørre.

4. Bestemmelse av virustiteren

  1. Manuell foci telleprosess (24-brønns format)
    1. Foci kan visualiseres under et stereomikroskop. Velg fortynning som produserer 50-200 foci.
    2. Telle foci for hver replikat av den valgte fortynningen. Beregn gjennomsnittlig antall foci for hver av de valgte fortynningene.
    3. Beregn focidannende enhet per ml (FFU / ml) for hver prøve med formelen nedenfor: FFU / ml = gjennomsnittlig antall foci telt / (fortynning x volum av fortynnet virus tilsatt).
  2. Automatisert foci telleprosess (96-brønnformat)
    1. Skann platen med 96 brønner på en kommersiell programvareanalysator.
      1. Dobbeltklikk på programvaren (se Materialfortegnelse) for å åpne.
      2. Klikk på Switch Suites og sørg for at suiten er byttet til en som er aktuell (tilleggsfigur 1A). Klikk OK.
      3. Start skanningen ved å klikke på Skann > Full plateskanning (tilleggsfigur 1B).
      4. Klikk på Dashboard for å sikre at fangstformatet er 96-brønnformatet (tilleggsfigur 2A).
      5. Velg sentreringsmodus som "Auto Prealignment User Verified" (tilleggsfigur 2B).
      6. Klikk på Løs ut for å legge i platen.
        MERK: Åpne lokket på platen og plasser det oppover med rad A øverst (tilleggsfigur 3A).
      7. Skriv inn platenavnet og klikk på OK. Klikk på Last for å legge platen.
      8. Klikk på Start for å starte skanningen. Deretter kalibrerer du posisjonene for A1, A12 og H1 ved hjelp av knappene "Opp, Ned, Venstre, Høyre" og klikker på Bekreft (tilleggsfigur 3B).
        MERK: Programvaren begynner å skanne hver brønn.
      9. Når skanningen er fullført, vises et oversiktsbilde. Klikk på Lukk.
      10. Avslutt skanningen ved å klikke på Tilbake til sentralbord.
    2. Tell platen med 96 brønner ved hjelp av programvaren.
      1. Klikk Count > Smart Count.
      2. På programvaren vil den vise "Trinn 1 av 5: Velg plater som skal telles". Klikk på Lastplate(r). Merk av for hele mappen og klikk på Velg for å importere den skannede platen (tilleggsfigur 4A).
      3. På programvaren vil den vise "Trinn 2 av 5: Definer telleparametere". Klikk på Juster parametere, og parametrene vises (diffus prosess; liten/normal/stor/størst/størst +1; punktseparasjon; telt område; bakgrunnsbalanse; fiberfjerning; gating).
        MERK: Start med en brønn, og sjekk frem og tilbake for å finne de beste innstillingene for alle brønnene.
      4. Når du er ferdig, klikker du på Neste (tilleggsfigur 4B).
      5. På programvaren vil den vise "Trinn 3 av 5: Velg / fjern valg av brønner". Når valget av brønnen som skal telles er fullført, klikker du på Neste for å fortsette.
        MERK: Brønnene som velges talt vil vises med en "C" øverst til høyre i hver brønn (tilleggsfigur 5A).
      6. På programvaren vil den vise "Trinn 4 av 5: Utgangsinnstillinger". Klikk på Vis / endre utgangsinnstillinger for å sjekke om innstillingene (for eksempel bildeformat) passer. Klikk på Lagre og avslutt > Neste (tilleggsfigur 5B).
      7. På programvaren vil den vise "Trinn 5 av 5: Start AutoCount". Klikk på Start AutoCount (tilleggsfigur 6A).
      8. Når du er ferdig, klikker du på Avslutt Autotelling.
  3. Utfør kvalitetskontroll (QC) i den kommersielle programvareanalysatoren.
    1. På sentralbordsiden klikker du på Kvalitetskontroll > Legg til plate(r). Merk av for hele mappen for å importere den opptelte platen, klikk på Velg > Start QC (tilleggsfigur 6B).
    2. Dobbeltklikk på hver brønn for å revidere flekkene. Klikk på Count for å fjerne eventuelle flekker. Programvaren begynner å telle.
      MERK: Forsikre deg om at "Spots: Remove" er krysset av. Fullføring av tellingen kan angis med det telte antall foci, for eksempel "30" (tilleggsfigur 7A).
    3. Når tellingen avsluttes (indikert med talt antall foci, for eksempel "30"), klikk "Ja" for å fjerne flekker (tilleggsfigur 7B). Trippel venstreklikk på stedet som skal fjernes. Høyreklikk for å fullføre, og klikk deretter på Ja.
    4. Klikk på Finish Plate og gå til Project Overview når QC er fullført.
  4. Utfør avbildning ved hjelp av programvareanalysatoren.
    1. Sjekk det skannede, opptelte bildet og QC-platebildet (figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ZIKV kan kvantifiseres ved hjelp av FFA, som skissert skjematisk i figur 3. For 24-brønnsplaten ble de infiserte Vero-cellene festet til 48 timer, 60 timer, 72 timer, 84 timer og 96 timer etter infeksjon. Resultatene viste at cellene forble intakte (ingen celleavløsning ble observert) etter 96 timer (4 dager) etter infeksjon (figur 4 og tilleggsfigur 8A-E). Forekomsten av virusfoci ble først observert 48 timer (2 dager) etter infeksjon (figur 4A-F). Imidlertid var foci-størrelsen for liten, noe som gjorde det vanskelig å telle foci nøyaktig. Den optimale focistørrelsen ble oppnådd 60 timer (2,5 dager) etter infeksjon (figur 4B). Ved sistnevnte tidspunkter (72 timer, 84 timer og 96 timer etter infeksjon) var foci større og hadde en tendens til å fusjonere eller overlappe. De sammenslåtte eller overlappede fociene økte over tid (figur 4C-E). Derfor ble foci dannet ved 60 timer (2,5 dager) etter infeksjonen valgt for å bestemme ZIKV-titeren i en 24-brønnplate (figur 4B).

For 96-brønnsplaten ble de infiserte Vero-cellene fiksert ved 24 timer, 36 timer, 48 timer, 60 timer og 72 timer etter infeksjon. Resultatene viste at cellene forble intakte etter 72 timer (3 dager) etter infeksjon (figur 5A-F og tilleggsfigur 9A-E). Forekomsten av virusfoci ble først observert 24 timer (1 dag) etter infeksjon (figur 5A). Imidlertid var foci-størrelsen for liten opptil 36 timer (1,5 dager) etter infeksjon, noe som gjorde det vanskelig å bestemme antall foci nøyaktig (figur 5A,B). Den optimale focistørrelsen ble oppnådd 48 timer (2 dager) etter infeksjon (figur 5C). Ved sistnevnte tidspunkt (60 timer og 72 timer etter infeksjon) ble overlappet eller sammenslått fokus observert, og antallet overlappede foci økte over tid (figur 5D,E). Derfor ble foci dannet ved 48 timer (2 dager) etter infeksjonen valgt for å bestemme virustiter av ZIKV-isolater (figur 5C). Foci-formasjonen kan visualiseres og oppregnes ved hjelp av kommersielle programvareanalysatorer som et alternativ.

Figure 1
Figur 1: Mikroskopisk bilde av Vero-celler. (A) Veroceller i 40x forstørrelse viste 70%-90% konfluens i en 75 cm2 cellekulturkolbe for virusutbredelse. (B) CPE på Vero-celler etter å ha blitt infisert med ZIKV på dag 1 etter infeksjon ved 100x forstørrelse. (C) CPE på Vero-celler etter å ha blitt infisert med ZIKV på dag 2 etter infeksjon ved 100x forstørrelse. (D) CPE på Vero-celler etter å ha blitt infisert med ZIKV på dag 3 etter infeksjon ved 100x forstørrelse. (E) Vero celler ved 40x forstørrelse viste 70% -90% sammenløp i en 24-brønns plate etter 24 timers inkubasjon for viruskvantifisering. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bilde av et skannet, telt og etterkvalitetskontrollskilt i 96-brønnformat ved hjelp av en kommersiell programvareanalysator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Arbeidsflyt for farging for foci-formingsanalysen. Fargeprosessene inkludert cellefiksering, permeabilisering, blokkering, antistoffbinding og inkubering med peroksidasesubstrat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Foci-dannende analyse for ZIKV P6-740 i 24-brønnsplater på forskjellige tidspunkter. (A) Foci er mindre tydelig på dag 2 (48 timer) etter infeksjon. (B) Optimal focistørrelse kan ses på dag 2,5 (60 timer) etter infeksjon. (VG Nett) Foci har slått seg sammen på dag 3 (72 timer), dag 3.5 (84 timer) og dag 4 (96 timer) etter infeksjon. (F) Negativ kontroll av platen. Skala bar: 1,000 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Foci-dannende analyse for ZIKV P6-740 i 96-brønnsplater på forskjellige tidspunkter. (A) Foci er mindre distinkte å regne med på den kommersielle programvareanalysatoren på dag 1 (24 timer) etter infeksjon. (B) Foci er mindre distinkte å regne med på den kommersielle programvareanalysatoren på dag 1,5 (36 timer) etter infeksjon. (C) Optimal focistørrelse kan ses på dag 2 (48 timer) etter infeksjon. (D,E) Foci har slått seg sammen dag 2.5 (60 timer) og dag 3 (72 timer) etter infeksjon. (F) Negativ kontroll av platen. Skala bar: 1,000 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Skjermbilder av oppstartssiden for den kommersielle programvareanalysatoren. (A) Bytt pakken til en hvilken som helst aktuell på den kommersielle programvareanalysatoren. Klikk "OK" når du er ferdig. (B) For å begynne å skanne på den kommersielle programvareanalysatoren, klikk "Skann" og klikk deretter "Full plateskanning". Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Skjermbilder for å vise "Capture format" og den valgte sentreringsmodusen som "Auto Prealignment User Verified" på den kommersielle programvareanalysatoren. (A) For å se fangstformatet, klikk "Dashboard" og velg 96-brønnformatet som fangstformat. (B) For sentreringsmodus, velg "Auto Prealignment User Verified". Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 3: 96-brønns plateplassering på plateleserbrettet for kommersiell programvareanalysator og et skjermbilde for å kalibrere posisjonene for brønnene A1, A12 og H1. (A) Plasser platen oppover med rad A øverst. (B) For å kalibrere posisjonene for brønnene A1, A12 og H1, bruk knappene "Opp, Ned, Venstre, Høyre". Når du er ferdig, klikker du på "Bekreft". Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 4: Skjermbilder for å velge mapper som inneholder skannede plater for telling på den kommersielle programvareanalysatoren og "Trinn 2 av 5: Definer telleparametere". (A) For å telle de skannede platene, klikk på "Legg plate(r)". Merk av for hele mappen og klikk "Velg" for å importere de skannede platene. (B) Juster telleparametrene. Klikk på "Neste" når parametrene er angitt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 5: Skjermbilder av den kommersielle programvareanalysatoren "Trinn 3 av 5: Velg/ikke velg brønner" og "Trinn 4 av 5: Utgangsinnstillinger". (A) Velg og fjern merket for brønnene som skal telles, og klikk "Neste" når du er ferdig. (B) For utgangsinnstillinger, klikk "Vis / endre utgangsinnstillinger" for å sjekke om innstillingene er passende (f.eks. Bildeformat). Klikk på "Lagre og avslutt" når du er ferdig, og klikk deretter "Neste". Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 6: Skjermbilder av den kommersielle programvareanalysatoren "Trinn 5 av 5: Start Autotelling" og kvalitetskontrollsiden. (A) Når du er klar for platetelling, klikker du på "Start Autotelling". (B) På kvalitetskontrollsiden merker du av for hele mappen for å importere den opptelte platen, klikker på "Velg", og klikker deretter "Start QC". Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 7: Skjermbilder av kvalitetskontrollsiden for kommersiell programvareanalyse. (A) Dobbeltklikk hver brønn for å revidere punkter. Klikk på "Count" for å fjerne et hvilket som helst sted. Merk av for "Spots: Remove". (B) Trippel venstreklikk for å fjerne flekker. Høyreklikk for å fullføre, og klikk deretter "Ja". Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 8: Foci-dannende analyse for ZIKV P6-740 i 24-brønnsplater på forskjellige tidspunkter. En tidoblet seriefortynning (10-1 til 10-5) ble utført på ZIKV P6-740 og infeksjon ble utført på Vero-celler i duplikat, inkludert en negativ kontroll. Et rådatabilde ble tatt med stereomikroskop, der skalalinjen indikerte 1000 μm. (A) Dag 2 (48 timer) etter infeksjon. (B) Dag 2.5 (60 timer) etter infeksjon. (C) Dag 3 (72 timer) etter infeksjon. (D) Dag 3.5 (84 timer) etter infeksjon. (E) Dag 4 (96 timer) etter infeksjon. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 9: Foci-dannende analyse for ZIKV P6-740 i 96-brønnplater på forskjellige tidspunkter. En tidoblet seriefortynning (10-1 til 10-5) ble utført på ZIKV P6-740 og infeksjon ble utført på Vero-celler i duplikat, inkludert en negativ kontroll. Et rådatabilde ble tatt med stereomikroskop, der skalalinjen indikerte 1000 μm. (A) Dag 1 (24 timer) etter infeksjon. (B) Dag 1.5 (36 timer) etter infeksjon. (C) Dag 2 (48 timer) etter infeksjon. (D) Dag 2.5 (60 timer) etter infeksjon. (E) Dag 3 (72 timer) etter infeksjon. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er flere analyser for å bestemme virustiter; PFA har en lignende viruskvantifiseringsprotokoll som FFA, der virusinokulumet fortynnes for å tillate individuelle plakk eller foci å skilles. Etter farging indikerer hver plakk eller foci en enkelt smittsom partikkel i inokulum19. PFA er farget med krystallfiolett for å visualisere plakkdannelse forårsaket av cellelyse eller død. Derfor er PFA mer tidkrevende, da det krever lengre tid for viruset å forårsake CPE, og det er bare begrenset til virusene som induserer cellelyse eller død. Mange laboratorier har med hell brukt FFAer for å bestemme smittsomme virustitere for flavivirus, inkludert ZIKV 19,20,21,22,23,24,25. FFA er en cellebasert kolorimetrisk immunodeteksjonsmetode som oppdager virusantigenet med antistoffer og derfor identifiserer fokusområdene til infiserte celler ved hjelp av immunfargingsteknikken, men ikke plakk12,26. FFA tilbyr noen fordeler for ZIKV over PFA. En klar fordel er at den er basert på antistoffgjenkjenning av virale komponenter uten merkbare CPEer. I tillegg er bruk av virusspesifikke antistoffer også nyttig for å identifisere forskjellige virus eller virale serotyper i blandede populasjoner27. Derfor er FFA mer spesifikk enn PFA, da den måler alle virusinfeksjonene og ikke er avhengig av virusene som forårsaker nok celledød til å danne en synlig plakk28. FFA har også en kortere inkubasjonstid enn PFA, noe som krever en åpenbar CPE som betyr cellelyse og død. Til slutt, ved å bruke en 96-brønnsplate, gir FFA-metoden fordelen av å bruke flere replikater og større fortynninger for å oppdage og titrere viruset27,29. I tillegg kan den rapporterte FFA-analysen enkelt tilpasses for virusnøytraliseringstester og metoder for å screene for antivirale forbindelser. Innlemming av kommersielle eller gratis automatiserte celletellingsinstrumenter eller programvare kan ytterligere forbedre brukervennligheten (konsistens, nøyaktighet, gjennomstrømning) av FFA og tilhørende metoder.

Når man sammenligner 24-brønnsplaten med 96-brønnplaten, er det viktig å merke seg at 24-brønnformatet krever et større antall celler som skal dyrkes i monolagskulturer, samt større mengder media og viruslager. Som et resultat kan det hende at 24-brønnsplateformatet ikke er egnet for bruk med prøver med begrensede volumer. Denne begrensningen kan overvinnes ved å bruke 96-brønnsformatet, som beskrevet i denne artikkelen. For det første krever 96-brønnformatet mindre materiale, noe som gjør det til et mer kostnadseffektivt alternativ. I tillegg tillater den automatiserte tellingen av fargede virusfoci i 96-brønnformatet høy gjennomstrømning og rask analyse, noe som ikke er mulig i 24-brønnformatet, noe som krever manuell telling. Denne automatiserte telleprosessen øker også reproduserbarheten og reduserer subjektiviteten sammenlignet med manuell telling, noe som fører til mer nøyaktige og pålitelige resultater fra FFA. Derfor er 96-brønnformatet med automatiserte bildebehandlingssystemer sterkt anbefalt for laboratorier som krever høy gjennomstrømning og pålitelig viruskvantifisering.

På den annen side bruker noen mennesker immunfluorescerende fokusanalyse for å oppdage ZIKV 25,27,28,30,31. Immunfluorescensfokusanalysen er parallell med FFA, bortsett fra at den utføres ved immunfarging av antigenene med fluorokromkonjugerte spesifikke antistoffer, etterfulgt av telling av infeksjonsfoci under et fluorescensmikroskop25. Denne analysen bruker mer kostbare reagenser og trenger fluorescensmikroskopi for å fullføre analysen. Derfor er immunfluorescensfokusanalysen begrenset til bedre utstyrte laboratorier, for eksempel henvisningslaboratorier. Det er ikke lett å bruke denne analysen i en ressursutfordrende setting.

Selv om FFA har mange fordeler, har den også noen begrensninger. Sammenlignet med andre analyser, for eksempel PFA, innebærer FFA flere trinn under fargeprosessene. Mens trinnene etter fiksering er fleksible og tillater over natten eller lengre pauser, tar fargingen av foci fortsatt lengre tid å fullføre. Videre krever FFA spesifikke eller kryssreagerende antistoffer i fargeprosessen, noe som begrenser anvendeligheten for å identifisere og kvantifisere nye eller nye virus. Videre er kostnaden for FFA høyere sammenlignet med PFA, som bare krever krystallfiolett for farging. I tillegg til det er det verdt å merke seg at den automatiserte telleprosessen (96-brønnformat) kun kan utføres i et laboratorium med riktig utstyr; Derfor vil det ikke være egnet for laboratorier uten nødvendig utstyr.

Avslutningsvis rapporterer vi detaljerte protokoller for utbredelse og kvantifisering av ZIKV ved bruk av cellebasert kolorimetrisk immunodeteksjonsanalyse eller FFA i 24-brønns plate- og 96-brønnsplateformater. Metoden gir en rekke praktiske fordeler i forhold til den klassiske PFA. Det er raskere og egnet for applikasjoner med høy gjennomstrømning når det brukes med et automatisert bildesystem for foci-telling. Standardiseringen av pålitelige protokoller for denne studien vil i stor grad bidra til Zika-forskning og kan også tilpasses bredt for å kvantifisere andre klinisk viktige virus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Denne forskningen mottok støtte fra departementet for høyere utdanning Malaysia under Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN fase 1: LRGS MRUN / F1/01/2018) og finansiering for Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) -programmet (MO002-2019). Figur 3 i denne studien som viser arbeidsflyten for farging for focidannende analyse er tilpasset fra "DAB Immunohistochemistry" av BioRender.com (2022). Hentet fra https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filter Sartorius S6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
10 mL sterile serological pipette Labserv 14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) Gibco 14190-136
2.0 mL Screw cap tube  Axygen SCT-200-SS-C-S
24-well plate Corning 3526
25 mL Sterile serological pipettes Labserv 14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate Thermo Scientific 34065
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
5 mL sterile serological pipette Labserv 14955155
50 mL centrifuge tube Falcon LAB352070
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
96-well plate Falcon 353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) MilliporeSigma MAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) N/A N/A 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) CTL-S6UNV12 Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-017
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) MilliporeSigma 12-349
Hemacytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
IGEPAL CA-630 detergent Sigma-Aldrich I8896 Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Laboratory rocker FINEPCR CR300
L-Glutamine Gibco 25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) Sigma-Aldrich C5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
Skim milk Sunlac Low Fat N/A Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium Hypochlorite Clorox N/A To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle Terumo SS10L21G
Vero African green monkey kidney cells  - ECACC 88020401 Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
  3. Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
  4. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
  5. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  6. Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
  7. Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
  8. Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
  10. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  11. Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control. , Stockholm. Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015).
  12. Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
  13. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  14. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  15. Bae, H. -G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
  18. Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
  19. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
  20. Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
  21. Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
  22. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  23. Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  24. Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  25. Kang, W., Shin, E. -C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
  26. Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
  27. Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
  28. Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
  29. Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
  30. Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
  31. Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 194 Zika-virus (ZIKV) flavivirus medfødte hjerneavvik Guillain-Barré syndrom virologi fokusdannende analyse (FFA) virviralt antigen peroksidase immunfargingsteknikk 24-brønnformat 96-brønnformat foci-størrelsesoptimalisering veroceller inkubasjon fargeprosesser cellefiksering permeabilisering blokkering antistoffbinding peroksidasesubstrat
Virusforplantning og cellebasert kolorimetrisk kvantifisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., … More

Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification. J. Vis. Exp. (194), e64578, doi:10.3791/64578 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter