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Immunology and Infection

Propagação de vírus e quantificação colorimétrica baseada em células

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64578
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

O presente protocolo descreve a propagação do vírus Zika (ZIKV) em células Vero African green monkey kidney e a quantificação do ZIKV usando métodos de imunodetecção colorimétrica baseados em células nos formatos de 24 e 96 poços (alto rendimento).

Abstract

O vírus Zika (ZIKV) é um vírus transmitido por mosquitos pertencente ao gênero Flavivirus. A infecção pelo VZIK tem sido associada a anormalidades cerebrais congênitas e potencialmente à síndrome de Guillain-Barré em adultos. Pesquisas sobre o VZIK para entender os mecanismos da doença são importantes para facilitar o desenvolvimento de vacinas e tratamentos. O método de quantificação de vírus é crucial e fundamental no campo da virologia. O focus forming assay (FFA) é um ensaio de quantificação viral que detecta o antígeno viral com anticorpos e identifica os focos de infecção das células usando a técnica de imunomarcação da peroxidase. O presente estudo descreve o protocolo de propagação e quantificação do vírus usando os formatos de 24 e 96 poços (alto rendimento). Em comparação com outros estudos semelhantes, este protocolo descreveu melhor a otimização do tamanho dos focos, o que pode servir como um guia para expandir o uso deste ensaio para outros vírus. Primeiramente, a propagação do VZIK é realizada em células Vero por 3 dias. O sobrenadante da cultura contendo ZIKV é colhido e quantificado usando o FFA. Resumidamente, a cultura do vírus é inoculada em células Vero e incubada por 2-3 dias. A formação de focos é então determinada após processos de coloração otimizados, incluindo fixação celular, permeabilização, bloqueio, ligação de anticorpos e incubação com substrato peroxidase. Os focos virais corados são visualizados por estereomicroscópio (contagem manual em formato de 24 poços) ou analisador de software (contagem automatizada em formato de 96 poços). O FFA fornece resultados reprodutíveis, relativamente rápidos (3-4 dias) e é adequado para ser usado para diferentes vírus, incluindo vírus não formadores de placa. Posteriormente, este protocolo é útil para o estudo da infecção pelo VZIK e pode ser usado para detectar outros vírus clinicamente importantes.

Introduction

A infecção pelo vírus Zika (ZIKV) é uma doença viral emergente transmitida por mosquitos. O primeiro isolamento do VZIK foi em Uganda, em 1947 1,2; permaneceu negligenciada de 1947 a 2007, pois os sintomas clínicos são mais comumente assintomáticos e caracterizados por doença febril autolimitada. Em 2007, a epidemia de Zika teve início nas ilhas Yap 3,4, seguida por epidemias maiores nas regiões do Pacífico (Polinésia Francesa, Ilha de Páscoa, Ilhas Cook e Nova Caledônia) de 2013 a 2014 5,6,7,8, onde a complicação neurológica grave síndrome de Guillain-Barré (SGB) foi relatada em adultos pela primeira vez9. Durante os anos de 2015 e 2016, a primeira epidemia generalizada de VZIK varreu as Américas após o surgimento do genótipo asiático do VZIK no Brasil já em 201310. Durante esse surto, 440.000 a 1,3 milhão de casos de microcefalia e outros distúrbios neurológicos foram relatados em recém-nascidos11. Atualmente, não há cura ou tratamento específico para a infecção pelo VZIK; portanto, há uma necessidade médica urgente de vacinas contra o VZIK capazes de prevenir infecções, particularmente durante a gravidez.

A quantificação de vírus é um processo para determinar o número de vírus presentes em uma amostra. Desempenha um papel importante na pesquisa, e os laboratórios acadêmicos envolvem muitos campos, como medicina e ciências da vida. Esse processo também é importante em setores comerciais, como a produção de vacinas virais, proteínas recombinantes, antígenos virais ou agentes antivirais. Muitos métodos ou ensaios podem ser utilizados para a quantificação do vírus12. A escolha de métodos ou ensaios normalmente depende das características do vírus, do nível de precisão desejado e da natureza do experimento ou pesquisa. Em geral, os métodos de quantificação de vírus podem ser divididos em duas categorias: ensaios moleculares que detectam a presença de ácido nucleico viral (DNA ou RNA) e ensaios que medem a infectividade viral in vitro12. A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR, para DNA) ou a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR, para RNA)13 e a PCR digital em gotículas14 são exemplos de técnicas moleculares comuns usadas para quantificar o ácido nucleico viral em uma determinadaamostra15. No entanto, essas técnicas moleculares altamente sensíveis não conseguem diferenciar vírus viáveis de não viáveis15. Portanto, pesquisas que requerem informações sobre características biológicas, como a infectividade do vírus nas células, não podem ser concluídas usando as técnicas moleculares acima mencionadas; ensaios que possam medir e determinar a presença de vírus viáveis são necessários. Os ensaios que medem a infectividade do vírus incluem o ensaio de formação de placa (PFA), a dose infecciosa de cultura de tecido a 50% (TCID50), o ensaio de foco fluorescente e a microscopia eletrônica de transmissão (MET)12.

O PFA, desenvolvido por Renato Dulbecco em 1952, é um dos métodos mais utilizados para titulação de vírus, inclusive para o ZIKV16. É usado para determinar diretamente as concentrações virais para virions líticos infecciosos. O método é baseado na capacidade de um vírus lítico produzir efeitos citopáticos (CPEs; zonas de morte celular ou placas, uma área de infecção cercada por células não infectadas) em uma monocamada celular inoculada após a infecção viral. No entanto, existem várias desvantagens no ensaio que afetam sua utilidade. O ensaio é demorado (leva aproximadamente 7-10 dias, dependendo dos vírus), dependente do CPE e propenso a erros. No presente estudo, relatamos uma técnica imunocolorimétrica, o focus forming assay (FFA), para detecção e quantificação do VZIK nos formatos de placa de 24 e 96 poços.

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Protocol

1. Propagação do vírus

  1. Preparação celular
    1. Cultivar células Vero em um frasco de cultura de célulasde 75 cm 2 contendo 12 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 2 mM de L-glutamina (ver Tabela de Materiais). Incubar as células em estufa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2.
    2. Monitorar as células sob um microscópio; uma vez que as células atinjam 70%-90% de confluência, elas estão prontas para serem utilizadas (Figura 1A).
      NOTA: As células Vero dobram aproximadamente a cada 24 h17. Diluições de 1:10 devem levar de 3 a 4 dias para atingir 80%-90% de confluência em um frasco de 75 cm2 . Monitore as células diariamente ou em dias alternados.
  2. Infecção da monocamada celular
    1. Retirar o meio de cultura do frasco de cultura celular com pipeta sorológica de 10 mL. Enxaguar o balão com 3 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (dPBS) 2x usando uma pipeta sorológica de 5 mL.
      NOTA: Um copo com hipoclorito de sódio a 10% deve estar preparado para desinfetar quaisquer resíduos líquidos infecciosos descartados de frascos/placas.
    2. Adicionar 2 mL de DMEM sem soro (DMEM suplementado com 2 mM L-glutamina sem FBS) e 20 μL de inóculo ZIKV no balão de cultura celular. Incubar o balão com balanços suaves durante 1 h à temperatura ambiente para permitir a adsorção do vírus.
      NOTA: A titulação do estoque inicial de ZIKV será útil para determinar o volume de adição de inóculo ZIKV (etapa 2).
      CUIDADO: O ZIKV é classificado como um patógeno de nível de biossegurança 2 (BSL-2). Todos os procedimentos com materiais contendo ZIKV devem ser realizados em um gabinete de biossegurança certificado e seguir todos os procedimentos operacionais padrão (POPs) laboratoriais com equipamentos de proteção individual apropriados.
  3. Adição do meio de sobreposição
    1. Após 1 h de incubação, remover e descartar o inóculo viral diluído usando uma pipeta sorológica de 5 mL. Enxaguar o frasco de cultura celular com 3 mL de dPBS 2x.
    2. Adicionar 12 mL de meio de manutenção (DMEM suplementado com SFB a 2%, L-glutamina 2 mM e penicilina-estreptomicina 100 U/mL) ao frasco de cultura celular para manter as células infectadas.
    3. Incubar as células Vero infectadas por 3 dias em estufa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: Monitorar diariamente o CPE de células Vero infectadas sob um microscópio.
  4. Colheita de sobrenadante de cultura celular contendo ZIKV
    1. No 3º dia pós-infecção, pode-se observar arredondamento e descolamento celular (ECP) (Figura 1B-D). Colher o sobrenadante da cultura celular contendo o ZIKV em um tubo centrífugo de 50 mL usando uma pipeta sorológica de 10 mL.
    2. Use um filtro de seringa de polietersulfona de 0,22 μm (consulte Tabela de Materiais) para filtrar o sobrenadante da cultura celular. Alíquota 500 μL do sobrenadante da cultura celular filtrada em tubos de tampa de rosca de 2,0 mL e armazenar a -80 °C até nova utilização.
      NOTA: O ZIKV colhido pode ser armazenado a -80 °C para armazenamento a longo prazo.
      CUIDADO: Precauções extras devem ser tomadas se uma agulha de seringa for usada, pois a agulha pode perfurar a pele. Os POPs laboratoriais precisam ser estabelecidos.

2. Quantificação do vírus

  1. Preparação celular
    1. Semear células Vero em placas designadas (placa de 24 poços: 0,5 mL/poço, 7,5 x 104 células/poço; placa de 96 poços: 0,1 mL/poço, 1,5 x 104 células/poço) e incubar a placa durante a noite em uma incubadora de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: Existem cinco momentos diferentes a serem testados (placa de 24 poços: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h e 96 h pós-infecção; placa de 96 poços: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h e 72 h pós-infecção); Portanto, prepare uma placa para cada ponto de tempo.
    2. Após 24 h de incubação e uma vez que as células atinjam 70%-90% de confluência (Figura 1E), a placa está pronta para infecção. Proceder à preparação da reserva de vírus diluída (passo 2.2) antes da infeção da monocamada celular.
  2. Diluição do vírus
    1. Para placas de 24 e 96 poços, prepare seis tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mL para cada placa para realizar uma diluição de dez vezes (10-1 até 10-5), incluindo um controle negativo. Para a montagem do experimento para uma placa de 24 poços, adicione 450 μL de DMEM livre de soro em todos os seis tubos de microcentrífuga. Para a montagem do experimento para uma placa de 96 poços, adicione 135 μL de DMEM livre de soro em seis tubos.
      NOTA: Rotular claramente cada tubo para indicar a diluição do seu conteúdo antes de efectuar a diluição em série dez vezes.
    2. Para realizar a diluição seriada, para a montagem do experimento em placa de 24 poços, adicione 50 μL de estoque de ZIKV que foi colhido da etapa 1 no tubo 10-1 que contém 450 μL de DMEM livre de soro. Para a configuração do experimento da placa de 96 poços, adicione 15 μL de estoque de ZIKV no tubo 10-1 que contém 135 μL de DMEM livre de soro.
    3. Vórtice cada tubo para misturar o vírus e o meio. Esta é a primeira diluição de dez vezes.
      NOTA: É necessária uma mistura adequada de vírus e meio de cultura em cada tubo de diluição para garantir uma diluição em série precisa.
    4. Para a configuração do experimento da placa de 24 poços, use uma ponta de pipeta nova para ressuspender o tubo 10-1 e transferir 50 μL de ZIKV diluído para o tubo 10-2 como uma segunda diluição de dez vezes. Para a configuração do experimento da placa de 96 poços, use uma ponta de pipeta nova para ressuspender o tubo 10-1 e transferir 15 μL de ZIKV diluído para o tubo 10-2 como uma segunda diluição de dez vezes.
    5. Repetir o passo 2.2.4 quatro vezes até ao quinto tubo (excluir controlo negativo).
      NOTA: Use uma ponta de pipeta nova após cada etapa de pipetagem para evitar contaminação cruzada.
  3. Infecção da monocamada celular
    1. Retirar e descartar o meio condicionado de cada poço (placa de 24 poços: 0,5 mL/poço; placa de 96 poços: 0,1 mL/poço).
    2. Enxaguar cada poço com dPBS 2x (placa de 24 poços: 300 μL/poço; placa de 96 poços: 60 μL/poço).
    3. Trabalhando da diluição mais alta para a mais baixa, adicione cada inóculo viral diluído em série no poço (placa de 24 poços: 200 μL/poço; placa de 96 poços: 40 μL/poço).
      OBS: A infecção de cada diluição será realizada em poços duplicados. Manter dois poços não infectados como controle negativo. Rotule o prato e os poços claramente para evitar confusão. Troque as pontas da pipeta após cada etapa de pipetagem para evitar contaminação cruzada.
    4. Incubar a placa com balanço suave durante 1 h à temperatura ambiente para permitir a adsorção do vírus.
  4. Adição do meio de cultura celular de sobreposição
    1. Após 1 h de incubação, remova e descarte a suspensão do vírus da menor concentração para a mais alta.
    2. Lavar as células infectadas com dPBS 2x (placa de 24 poços: 300 μL/poço; placa de 96 poços: 60 μL/poço).
    3. Sobreponha o poço com DMEM (suplementado com 2% de FBS, 2 mM de L-glutamina e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina) e 1,5% de carboximetilcelulose de baixa viscosidade (CMC; ver Tabela de Materiais) (placa de 24 poços: 1 mL/poço; placa de 96 poços: 0,2 mL/poço).
    4. Incubar a placa em estufa de cultura celular a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: Não perturbe a placa durante este período de incubação.
    5. Retirar a placa da incubadora de cultura celular para coloração em diferentes momentos (placa de 24 poços: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h e 96 h pós-infecção; placa de 96 poços: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h e 72 h pós-infecção).

3. Coloração

  1. Fixação celular
    1. Após as horas específicas de incubação (placa de 24 poços: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h e 96 h pós-infecção; placa de 96 poços: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h e 72 h pós-infecção), remova e descarte o meio de sobreposição e lave as células 3x com 1x PBS. Para a placa de 96 poços, remova e descarte o meio de sobreposição e lave as células 3x com 60 μL/poço de 1x PBS com uma pipeta multicanal.
    2. Adicionar paraformaldeído a 4% para fixar as células (placa de 24 poços: 300 μL/poço; placa de 96 poços: 60 μL/poço). Incubar a placa à temperatura ambiente durante 20 min.
      CUIDADO: Paraformaldeído é um formaldeído sólido polimerizado. É um pó cristalino inflamável, sólido e branco que libera gás formaldeído quando misturado com água ou aquecido. Todos os procedimentos que envolvam a utilização de paraformaldeído devem ser realizados num exaustor químico certificado ou em compartimentos exaustivos aprovados, de acordo com POPs laboratoriais específicos para produtos químicos que contenham formaldeído.
    3. Após 20 min, descarte o paraformaldeído e lave as células 3x com 1x PBS. Realizar permeabilização, bloqueio e incubações de anticorpos seguindo as etapas 3.2-3.5.
      OBS: Ao descartar paraformaldeído a 4%, siga o procedimento de descarte de resíduos da universidade ou instituto.
  2. Permeabilização celular
    1. Adicionar 1% de octilfenoxi poli(etilenooxi)etanol (ver Tabela de Materiais) para permeabilizar as células (placa de 24 poços: 200 μL/poço; placa de 96 poços: 40 μL/poço). Incubar a placa à temperatura ambiente durante 15 min.
    2. Após 15 min, descarte o octilfenoxi poli(etilenooxi)etanol e lave as células 3x com 1x PBS.
  3. Bloqueio
    1. Adicionar 3% de leite desnatado para reduzir a ligação inespecífica na amostra (placa de 24 poços: 500 μL/poço; placa de 96 poços: 100 μL/poço). Incubar a placa à temperatura ambiente durante 2 h.
    2. Após 2 h, descarte o leite desnatado a 3% e lave as células 3x com 1x PBS.
      Observação : este é um ponto de parada. Após a adição de 3% de leite desnatado, as placas podem ser armazenadas a 4 °C até 2 dias antes da inserção do anticorpo primário.
  4. Incubação primária de anticorpos
    1. Adicionar anticorpo monoclonal anti-flavivírus, 4G2 (clone D1-4G2-4-15; anticorpo primário, ver Tabela de Materiais) diluído em leite desnatado a 1% (proporção 1:1.000) (placa de 24 poços: 200 μL/poço; placa de 96 poços: 40 μL/poço). Incubar a placa a 37 °C durante 1 h.
    2. Após 1 h, retirar a solução contendo o anticorpo monoclonal e lavar as células 3x com 1x PBS.
  5. Incubação secundária de anticorpos
    1. Adicionar anticorpo secundário IgG de cabra anti-rato conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (ver Tabela de Materiais) diluído em leite desnatado a 1% (proporção 1:1.000) (placa de 24 poços: 200 μL/poço; placa de 96 poços: 40 μL/poço). Incubar as placas a 37 °C durante 1 h.
    2. Após 1 h, remova a solução que contém o anticorpo secundário e lave as células 3x com 1x PBS.
  6. Incubação do substrato
    1. Adicionar substrato 3,3'diaminobenzidina (DAB) peroxidase (ver Tabela de Materiais) e incubar a placa durante 30 minutos no escuro (placa de 24 poços: 200 μL/poço; placa de 96 poços: 40 μL/poço). Após 30 min, pare a reação lavando os poços com água.
    2. Seque as placas ao ar durante a noite e proceda à enumeração de focos depois que as placas estiverem completamente secas.

4. Determinação do título de vírus

  1. Processo manual de contagem de focos (formato de 24 poços)
    1. Os focos podem ser visualizados ao microscópio estéreo. Selecione a diluição que produz 50-200 focos.
    2. Conte os focos para cada réplica da diluição selecionada. Calcular o número médio de focos para cada uma das diluições selecionadas.
    3. Calcular a unidade formadora de focos por mL (UFF/mL) para cada amostra com a fórmula abaixo: UFF/mL = número médio de focos contados/(diluição x volume de vírus diluído adicionado).
  2. Processo automatizado de contagem de focos (formato de 96 poços)
    1. Digitalize a placa de 96 poços em um analisador de software comercial.
      1. Clique duas vezes no software (consulte Tabela de Materiais) para abrir.
      2. Clique em Switch Suites e certifique-se de que o conjunto seja alternado para qualquer um que seja aplicável (Figura Suplementar 1A). Clique em OK.
      3. Inicie a varredura clicando em Scan > Full plate scan (Figura suplementar 1B).
      4. Clique em Dashboard para garantir que o formato de captura seja o formato de 96 poços (Figura 2A suplementar).
      5. Selecione o modo de centralização como "Auto Prealignment User Verified" (Figura 2B Suplementar).
      6. Clique em Ejetar para carregar a placa.
        NOTA: Abra a tampa da placa e coloque-a para cima com a linha A na parte superior (Figura 3A suplementar).
      7. Digite o nome da chapa e clique em OK. Clique em Carregar para carregar a placa.
      8. Clique em Iniciar para iniciar a varredura. Em seguida, calibre as posições para A1, A12 e H1 usando os botões "Up, Down, Left, Right" e clique em Confirm (Figura 3B Suplementar).
        NOTA: O software começará a digitalizar cada poço.
      9. Quando a digitalização estiver concluída, uma imagem de visão geral aparecerá. Clique em Fechar.
      10. Saia da varredura clicando em Voltar ao quadro de controle.
    2. Conte a placa de 96 poços usando o software.
      1. Clique em Contar > Contagem Inteligente.
      2. No software, ele mostrará "Passo 1 de 5: Selecione as placas para contar". Clique em Carregar placa(s). Marque toda a pasta e clique em Selecionar para importar a placa digitalizada (Figura Suplementar 4A).
      3. No software, ele mostrará "Passo 2 de 5: Definir parâmetros de contagem". Clique em Ajustar parâmetros, e os parâmetros serão exibidos (processo difuso; pequeno/normal/grande/maior/maior +1; separação de pontos; área contada; balanço de fundo; remoção de fibra; gating).
        NOTA: Comece com um poço e verifique para frente e para trás para encontrar as melhores configurações para todos os poços.
      4. Feito isso, clique em Next (Figura 4B Suplementar).
      5. No software, ele mostrará "Passo 3 de 5: Selecionar/desselecionar poços". Concluída a seleção do poço a ser contado, clique em Avançar para prosseguir.
        NOTA: Os poços selecionados para serem contados aparecerão com um "C" no canto superior direito de cada poço (Figura Suplementar 5A).
      6. No software, ele mostrará "Passo 4 de 5: Configurações de saída". Clique em Exibir/Modificar configurações de saída para verificar se as configurações (como o formato da imagem) são adequadas. Clique em Salvar e sair > Avançar (Figura Suplementar 5B).
      7. No software, ele mostrará "Passo 5 de 5: Iniciar AutoCount". Clique em Start AutoCount (Figura 6A Suplementar).
      8. Depois de concluído, clique em Sair da AutoContagem.
  3. Realizar controle de qualidade (CQ) no analisador de software comercial.
    1. Na página do quadro de distribuição, clique em Controle de qualidade > Adicionar placa(s). Marque toda a pasta para importar a chapa contada, clique em Select > Start QC (Figura 6B Suplementar).
    2. Clique duas vezes em cada poço para auditar os pontos. Clique em Contar para remover quaisquer pontos. O software começará a contar.
      NOTA: Certifique-se de que "Spots: Remove" está marcado. A conclusão da contagem pode ser indicada pelo número contado de focos, por exemplo "30" (Figura Suplementar 7A).
    3. Quando a contagem terminar (indicada pelo número contado de focos, por exemplo "30"), clique em "Sim" para remover manchas (Figura 7B Suplementar). Clique três vezes com o botão esquerdo do mouse no local a ser removido. Clique com o botão direito do mouse para concluir e clique em Sim.
    4. Clique em Placa de acabamento e vá para Visão geral do projeto quando o CQ estiver concluído.
  4. Execute imagens usando o analisador de software.
    1. Verifique a imagem digitalizada, contada e da placa QC (Figura 2).

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Representative Results

O VZIK pode ser quantificado usando os AGL, conforme esquematicamente descrito na Figura 3. Para a placa de 24 poços, as células Vero infectadas foram fixadas em 48 h, 60 h, 72 h, 84 h e 96 h pós-infecção. Os resultados mostraram que as células permaneceram intactas (não foi observado descolamento celular) após 96 h (4 dias) pós-infecção (Figura 4 e Figura Suplementar 8A-E). O aparecimento de focos virais foi observado pela primeira vez em 48 h (2 dias) pós-infecção (Figura 4A-F). No entanto, o tamanho dos focos era muito pequeno, dificultando a contagem precisa dos focos. O tamanho ótimo dos focos foi alcançado em 60 h (2,5 dias) pós-infecção (Figura 4B). Nos últimos momentos (72 h, 84 h e 96 h pós-infecção), os focos foram maiores e tenderam a se fundir ou se sobrepor. Os focos mesclados ou sobrepostos aumentaram ao longo do tempo (Figura 4C-E). Portanto, focos formados 60 h (2,5 dias) após a infecção foram escolhidos para determinar o título do VZIK em uma placa de 24 poços (Figura 4B).

Para a placa de 96 poços, as células Vero infectadas foram fixadas em 24 h, 36 h, 48 h, 60 h e 72 h pós-infecção. Os resultados mostraram que as células permaneceram intactas após 72 h (3 dias) pós-infecção (Figura 5A-F e Figura Suplementar 9A-E). O aparecimento de focos virais foi observado pela primeira vez em 24 h (1 dia) pós-infecção (Figura 5A). No entanto, o tamanho dos focos foi muito pequeno até 36 h (1,5 dias) pós-infecção, dificultando a determinação precisa do número de focos (Figura 5A,B). O tamanho ótimo dos focos foi alcançado em 48 h (2 dias) pós-infecção (Figura 5C). Nos últimos momentos (60 h e 72 h pós-infecção), focos sobrepostos ou mesclados foram observados, e o número de focos sobrepostos aumentou ao longo do tempo (Figura 5D,E). Portanto, focos formados 48 h (2 dias) após a infecção foram escolhidos para determinar o título viral dos isolados do ZIKV (Figura 5C). A formação dos focos pode ser visualizada e enumerada usando analisadores de software comerciais como alternativa.

Figure 1
Figura 1: Imagem microscópica das células Vero. (A) Células Vero em aumento de 40x apresentaram confluência de 70%-90% em frasco de cultura decélulas 75 cm2 para propagação do vírus. (B) ECP em células Vero após infecção pelo VZIK no 1º dia pós-infecção com aumento de 100x. (C) ECP em células Vero após infecção pelo VZIK no dia 2 pós-infecção com aumento de 100x. (D) ECP em células Vero após infecção pelo VZIK no 3º dia pós-infecção com aumento de 100x. (E) Células Vero em aumento de 40x mostraram confluência de 70%-90% em placa de 24 poços após 24 h de incubação para quantificação do vírus. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagem de uma placa de controle de qualidade digitalizada, contada e pós-qualidade em formato de 96 poços usando um analisador de software comercial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Fluxo de coloração para o ensaio de formação de focos. Os processos de coloração incluem fixação celular, permeabilização, bloqueio, ligação de anticorpos e incubação com substrato peroxidase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Ensaio de formação de focos para ZIKV P6-740 em placas de 24 poços em diferentes momentos. (A) Os focos são menos distintos no dia 2 (48 h) pós-infecção. (B) O tamanho ideal dos focos pode ser observado no dia 2,5 (60 h) pós-infecção. (C-E) Os focos se fundiram no dia 3 (72 h), no dia 3,5 (84 h) e no dia 4 (96 h) pós-infecção. (F) Controle negativo da chapa. Barra de escala: 1.000 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Ensaio de formação de focos para ZIKV P6-740 em placas de 96 poços em diferentes momentos. (A) Os focos são menos distintos para serem contados no analisador de software comercial no dia 1 (24 h) pós-infecção. (B) Os focos são menos distintos para serem contados no analisador de software comercial no dia 1,5 (36 h) pós-infecção. (C) O tamanho ideal dos focos pode ser observado no dia 2 (48 h) pós-infecção. (D,E) Os focos se fundiram no dia 2,5 (60 h) e no dia 3 (72 h) pós-infecção. (F) Controle negativo da chapa. Barra de escala: 1.000 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Capturas de tela da página de inicialização do analisador de software comercial. (A) Mude o conjunto para qualquer um aplicável no analisador de software comercial. Clique em "OK" uma vez feito. (B) Para iniciar a digitalização no analisador de software comercial, clique em "Scan" e, em seguida, clique em "Full plate scan". Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 suplementar: Capturas de tela para visualizar "Formato de captura" e o modo de centralização selecionado como "Auto Prealignment User Verified" no analisador de software comercial. (A) Para visualizar o formato de captura, clique em "Painel" e selecione o formato de 96 poços como o formato de captura. (B) Para o modo de centralização, selecione "Auto Prealignment User Verified". Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Colocação da placa de 96 poços na bandeja do leitor de placas do analisador de software comercial e uma captura de tela para calibrar as posições dos poços A1, A12 e H1. (A) Coloque a placa para cima com a linha A na parte superior. (B) Para calibrar as posições dos poços A1, A12 e H1, utilize os botões "Up, Down, Left, Right". Feito isso, clique em "Confirmar". Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 4 Suplementar: Capturas de tela para selecionar pastas contendo placas digitalizadas para contar com o analisador de software comercial e "Passo 2 de 5: Definir parâmetros de contagem". (A) Para contar as placas digitalizadas, clique em "Placas de carga". Marque toda a pasta e clique em "Selecionar" para importar as placas digitalizadas. (B) Ajuste os parâmetros de contagem. Clique em "Next" assim que os parâmetros estiverem definidos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 5: Capturas de tela do analisador de software comercial "Passo 3 de 5: Selecionar/desselecionar poços" e "Passo 4 de 5: Configurações de saída". (A) Selecione e desmarque os poços a serem contados e clique em "Avançar" uma vez feito. (B) Para configurações de saída, clique em "Exibir/modificar configurações de saída" para verificar se as configurações são adequadas (por exemplo, formato de imagem). Clique em "Salvar e sair" uma vez feito e, em seguida, clique em "Avançar". Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 6 suplementar: Capturas de tela do analisador de software comercial "Passo 5 de 5: Iniciar AutoCount" e página de controle de qualidade. (A) Quando estiver pronto para a contagem de placas, clique em "Iniciar AutoCount". (B) Na página de controle de qualidade, marque toda a pasta para importar a chapa contada, clique em "Selecionar" e, em seguida, clique em "Iniciar CQ". Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 7: Capturas de tela da página de controle de qualidade do analisador de software comercial. (A) Clique duas vezes em cada poço para auditar os pontos. Clique em "Contar" para remover qualquer ponto. Marque "Spots: Remover". (B) Clique três vezes com o botão esquerdo do mouse para remover pontos. Clique com o botão direito do mouse para concluir e, em seguida, clique em "Sim". Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 8: Ensaio de formação de focos para ZIKV P6-740 em placas de 24 poços em diferentes momentos. Uma diluição seriada de dez vezes (10-1 a 10-5) foi realizada no ZIKV P6-740 e a infecção foi realizada em células Vero em duplicata, incluindo um controle negativo. Uma imagem de dados brutos foi obtida usando um microscópio estéreo, com a barra de escala indicando 1.000 μm. (A) Dia 2 (48 h) pós-infecção. (B) Dia 2,5 (60 h) pós-infecção. (C) Dia 3 (72 h) pós-infecção. (D) Dia 3,5 (84 h) pós-infecção. (E) Dia 4 (96 h) pós-infecção. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 9: Ensaio de formação de focos para ZIKV P6-740 em placas de 96 poços em diferentes momentos. Uma diluição seriada de dez vezes (10-1 a 10-5) foi realizada no ZIKV P6-740 e a infecção foi realizada em células Vero em duplicata, incluindo um controle negativo. Uma imagem de dados brutos foi obtida usando um microscópio estéreo, com a barra de escala indicando 1.000 μm. (A) Dia 1 (24 h) pós-infecção. (B) Dia 1,5 (36 h) pós-infecção. (C) Dia 2 (48 h) pós-infecção. (D) Dia 2,5 (60 h) pós-infecção. (E) Dia 3 (72 h) pós-infecção. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Existem vários ensaios para determinar o título do vírus; o PFA tem um protocolo de quantificação viral semelhante ao FFA, no qual o inóculo do vírus é diluído para permitir a distinção de placas ou focos individuais. Após a coloração, cada placa ou foco indica uma única partícula infecciosa no inóculo19. O PFA é corado com cristal violeta para visualizar a formação de placa causada por lise ou morte celular. Assim, o PFA é mais demorado, pois requer um tempo maior para que o vírus cause CPEs, e é restrito apenas aos vírus que induzem lise ou morte celular. Muitos laboratórios têm utilizado com sucesso os AGL para determinar títulos de vírus infecciosos para flavivírus, incluindo o VZIK 19,20,21,22,23,24,25. O AGL é um método de imunodetecção colorimétrica baseado em células que detecta o antígeno viral com anticorpos e, portanto, identifica as áreas dos focos de células infectadas pela técnica de imunomarcação, mas não asplacas12,26. O FFA oferece algumas vantagens para o ZIKV em relação ao PFA. Uma vantagem clara é que ele é baseado no reconhecimento de anticorpos de componentes virais sem CPEs discerníveis. Além disso, o uso de anticorpos vírus-específicos também é útil na identificação de diferentes vírus ou sorotipos virais em populações mistas27. Portanto, os AGL são mais específicos que os AGF, pois medem todas as infecções virais e não são dependentes dos vírus que causam morte celular suficiente para formar uma placa visível28. O FFA também tem um período de incubação mais curto do que o PFA, o que requer um CPE óbvio que significa lise e morte celular. Finalmente, utilizando uma placa de 96 poços, o método FFA oferece a vantagem de usar mais réplicas e diluições maiores para detectar e titular o vírus27,29. Além disso, o ensaio de FFA relatado pode ser facilmente adaptado para testes de neutralização de vírus e métodos para rastrear compostos antivirais. A incorporação de instrumentos ou softwares de contagem de células automatizados comerciais ou gratuitos pode melhorar ainda mais a usabilidade (consistência, precisão, rendimento) do FFA e seus métodos associados.

Ao comparar a placa de 24 poços com a placa de 96 poços, é importante notar que o formato de 24 poços requer um maior número de células a serem cultivadas em culturas de monocamada, bem como maiores quantidades de meios e estoque de vírus. Como resultado, o formato de placa de 24 poços pode não ser adequado para uso com amostras com volumes limitados. Essa limitação pode ser superada com o uso do formato de 96 poços, conforme descrito neste artigo. Em primeiro lugar, o formato de 96 poços requer menos material, tornando-se uma opção mais econômica. Além disso, a contagem automatizada de focos de vírus corados no formato de 96 poços permite alto rendimento e análise rápida, o que não é possível no formato de 24 poços, que requer contagem manual. Esse processo automatizado de contagem também aumenta a reprodutibilidade e reduz a subjetividade em relação à contagem manual, levando a resultados mais precisos e confiáveis dos AGL. Portanto, o formato de 96 poços com sistemas de imagem automatizados é altamente recomendado para laboratórios que exigem alto rendimento e quantificação confiável de vírus.

Por outro lado, algumas pessoas utilizam o ensaio de foco de imunofluorescência para detectar o VZIK 25,27,28,30,31. O ensaio de foco de imunofluorescência é paralelo aos AGL, exceto que é realizado pela imunomarcação dos antígenos com anticorpos específicos conjugados ao fluorocromo, seguido da contagem dos focos de infecção em microscópio defluorescência25. Este ensaio usa reagentes mais caros e necessita de microscopia de fluorescência para completar o ensaio. Portanto, o ensaio de foco de imunofluorescência limita-se a laboratórios mais bem equipados, como os laboratórios de referência. Não é fácil usar este ensaio em um ambiente de recursos desafiadores.

Embora o FFA tenha muitas vantagens, ele também tem algumas limitações. Em comparação com outros ensaios, como o PFA, o FFA envolve mais etapas durante os processos de coloração. Embora os passos após a fixação sejam flexíveis e permitam pausas noturnas ou mais longas, a coloração dos focos ainda leva mais tempo para ser concluída. Além disso, os AGL requerem anticorpos específicos ou de reação cruzada no processo de coloração, o que limita sua aplicabilidade para identificar e quantificar vírus novos ou novos. Além disso, o custo do AGL é maior em relação ao PFA, que necessita apenas de cristal violeta para coloração. Além disso, vale ressaltar que o processo de contagem automatizada (formato de 96 poços) só pode ser realizado em laboratório com equipamentos adequados; portanto, não será adequado para laboratórios sem os equipamentos necessários.

Em conclusão, relatamos protocolos detalhados para a propagação e quantificação do VZIK usando o ensaio de imunodetecção colorimétrica baseado em células ou o FFA nos formatos de placa de 24 e 96 poços. O método oferece uma série de vantagens práticas em relação ao PFA clássico. É mais rápido e passível de aplicações de alto rendimento quando aplicado com um sistema de imagem automatizado para contagem de focos. A padronização de protocolos confiáveis para este estudo contribuirá grandemente para a pesquisa do Zika e também pode ser amplamente adaptada para quantificar outros vírus clinicamente importantes.

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Disclosures

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

Acknowledgments

Esta pesquisa recebeu apoio do Ministério do Ensino Superior da Malásia sob o Esquema de Bolsas de Pesquisa de Longo Prazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) e financiamento para o programa do Centro de Excelência da Instituição Superior (HICoE) (MO002-2019). A Figura 3 deste estudo que mostra o fluxo de coloração para o ensaio de formação de focos é adaptada de "DAB Immunohistochemistry" por BioRender.com (2022). Retirado de https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filter Sartorius S6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
10 mL sterile serological pipette Labserv 14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) Gibco 14190-136
2.0 mL Screw cap tube  Axygen SCT-200-SS-C-S
24-well plate Corning 3526
25 mL Sterile serological pipettes Labserv 14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate Thermo Scientific 34065
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
5 mL sterile serological pipette Labserv 14955155
50 mL centrifuge tube Falcon LAB352070
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
96-well plate Falcon 353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) MilliporeSigma MAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) N/A N/A 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) CTL-S6UNV12 Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-017
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) MilliporeSigma 12-349
Hemacytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
IGEPAL CA-630 detergent Sigma-Aldrich I8896 Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Laboratory rocker FINEPCR CR300
L-Glutamine Gibco 25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) Sigma-Aldrich C5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
Skim milk Sunlac Low Fat N/A Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium Hypochlorite Clorox N/A To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle Terumo SS10L21G
Vero African green monkey kidney cells  - ECACC 88020401 Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

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References

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