Summary
本文介绍了使用全基因组染色体构象捕获方法Micro-C-XL绘制具有核小体分辨率的三维基因组组织的方案。
Abstract
三维（3D）染色体组织是基因组调控和细胞类型规范的主要因素。例如，顺式调节元件，称为增强子，被认为通过在 3D 空间中的相互作用 来 调节远端启动子的活性。全基因组染色体构象捕获（3C）技术，如Hi-C，已经改变了我们对基因组在细胞中组织方式的理解。目前对3D基因组组织的理解受到分辨率的限制，该分辨率可以解析3D空间中染色体的拓扑组织。Micro-C-XL 通过在染色体构象捕获方案中利用微球菌核酸酶 （MNase） 片段化基因组，在核小体水平上以分辨率测量染色体折叠，核小体是染色质的基本单位。这导致测量中的信噪比得到改善，因此与其他全基因组 3D 技术相比，有助于更好地检测绝缘位点和染色体环。本文介绍了一种视觉支持的、详细的、分步的方案，用于从哺乳动物细胞制备高质量的Micro-C-XL样品。
Introduction
Micro-C-XL 是一种全基因组技术，用于测量具有核小体分辨率的 3D 基因组构象。Micro-C-XL 建立在广泛使用的基于邻位连接的 Hi-C 技术之上，该技术改变了我们对 3D 基因组组织方式的理解1。Micro-C-XL 及其第一次迭代 Micro-C 最初是在酿酒酵母 2,3 中开发的，后来适应了哺乳动物细胞系统，为此，该方案已证明其在检测 3D 基因组的短程特征（例如染色体环和绝缘位点）方面的全部潜力。该版本基于最近的哺乳动物 Micro-C-XL 出版物 4,5。由于 Micro-C-XL 取代了 Micro-C，因此 Micro-C-XL 在手稿中被称为 Micro-C。
Micro-C 和 Hi-C6 之间的主要区别如下：1） 与限制性内切酶相比，使用微球菌核酸酶 （MNase） 进行基因组片段化，以及 2） 与仅使用甲醛相比，反应性基团之间具有更大原子间距的额外交联剂。与传统的Hi-C相比，这两个步骤都大大提高了Micro-C的信噪比。片段大小限制了在邻位连接方案中可以解析 3D 基因组组织的分辨率。MNase 是一种核酸酶，可优先消化可接近的 DNA 并保持核粒细胞保护的 DNA 完整。使用 MNase 测序的核小体足迹表明，核小体完全覆盖了大多数真核生物基因组7。由于核小体分布在整个基因组中，平均间距为 160-220 bp，具体取决于物种和细胞类型，因此 MNase 是高分辨率基因组结构图谱的理想酶。
在 Micro-C 方法中使用额外的交联剂与甲醛 （FA） 结合使用，进一步提高了信噪比 2,8。胺特异联剂在反应性基团之间具有较长的原子间隔，可促进蛋白质-蛋白质交联。这些通常是二琥珀酰亚胺戊二酸酯 （DSG） 或乙二醇双琥珀酰亚胺基琥珀酸酯 （EGS），间隔分别为 7.7 Å 和 16.1 Å。通过EGS或DSG降低噪声在具有高碎裂率的实验中尤为明显，例如Micro-C，并且可能是由于随机连接事件速率的降低而发生的8。
最近开发的 Hi-C 3.0 方案利用 ESG/DSG 交联和限制性内切酶的多种组合，降低了 Hi-C 实验中的噪声，并显着改善了染色体环和绝缘位点的检测 8,9。尽管如此，对各种相互作用数据特征的逐点比较发现，与 Hi-C 3.0 和传统的 Hi-C8 相比，Micro-C 对染色体环和绝缘位点等短程特征的检测效果更好。然而，与传统的Hi-C相比，Hi-C 3.0确实改善了对短程特征的检测，并保持了对基因组区室化的强大检测。总之，染色体构象捕获方法的选择应由客观和生物学问题决定。
在这里，我们为成功的Micro-C实验提供了一个分步方案，可以解开3D基因组组织。
Protocol
1. 细胞培养和交联
- 根据实验需要培养细胞，获得至少1×10个7个 细胞。在这里，细胞在37°C下用5%CO2 在E14培养基（含丙酮酸和L-谷氨酰胺的DMEM，15%FBS，1x LIF，1x NEAA，1%pen-链球菌，0.1mM β-巯基乙醇[参见 材料表]）中生长，并每隔一天传代一次。
注：该协议已成功应用于来自多个物种的各种细胞类型，例如智人和Mus musculus。在本例中，使用小鼠胚胎干细胞（ES）细胞。 - 通过吸出培养基以 70%-80% 的汇合度收获细胞。用5mL DPBS洗涤一次，并在37°C下每10cm培养皿用3mL预热的0.25%胰蛋白酶孵育细胞2-3分钟。
- 用 7 mL 预热的 E14 培养基淬灭胰蛋白酶，并将分离的细胞转移到 50 mL 试管中。
- 通过在室温（RT）下以300× g 离心5分钟来沉淀细胞。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于培养基中。用细胞计数仪对细胞进行计数。
注意：该方案对细胞浓度的某些变化具有鲁棒性，并且已使用各种细胞计数器来量化细胞数量;但是，请注意所用细胞计数仪的动态范围。这通常在 1 x 105-1 x 107 个细胞/mL 之间。虽然已经针对这种细胞类型测试了离心速度和持续时间，但不同的、较小的细胞可能需要更高的离心速度或更长的离心时间，因此应相应地调整离心时间。 - 通过在室温下以 300 x g 离心 5 分钟来收集细胞，并将细胞重悬于 DPBS 中，终浓度为 1 x 106 个细胞/mL。例如，如果产量为 1 x 107 个细胞，则将细胞重悬于 10 mL DPBS 中。
- 对于第一个交联步骤，向细胞悬液中加入37%甲醛（FA）至终浓度为1%，并将细胞悬浮液在室温下旋转孵育10分钟（15-20rpm）;例如，如果产量为 1 x 107 个细胞，则向 10 mL 细胞悬液中加入 270 μL FA。
注意：FA 溶液通常在打开后在室温下稳定长达 3 个月。 - 通过加入2.5M甘氨酸至终浓度为0.25M来淬灭反应，并在室温下旋转（15-20rpm）孵育5分钟。例如，如果产量为 1 x 107 个细胞，则向细胞悬液中加入 1.027 mL 的 2.5 M 甘氨酸。
- 通过在室温下以300×g离心5分钟来收集细胞，弃去上清液并将细胞重悬于5mL DPBS中。重复离心步骤一次，并将沉淀的细胞重悬于DPBS中至4×10,6个细胞/ mL。例如，如果产量为 1 x 107 个细胞，则将细胞重悬于 2.5 mL DPBS 中。
- 对于第二个交联步骤，在DMSO中制备0.3M乙二醇双琥珀酰亚胺基琥珀酸酯（EGS）储备溶液（13.6mg EGS在100μL DMSO中）。将终浓度为3mM的EGS加入细胞悬液中，并在室温下旋转孵育40分钟（15-20rpm）。例如，如果产量为 1 x 107 个细胞，则向 2.5 mL 细胞悬液中加入 25 μL 0.3 M EGS 储备溶液。
注意：在称量以制备储备溶液之前，将EGS平衡至RT至少20分钟。 - 通过加入2.5M甘氨酸至终浓度为0.4M淬灭反应，并在室温下旋转（15-20rpm）孵育5分钟。例如，如果产量为 1 x 107 个细胞，则向细胞悬液中加入 400 μL 2.5 M 甘氨酸。
- 通过在室温下以1,000×g离心5分钟来收集细胞，并将沉淀的细胞重悬于DPBS中至5×106个细胞/ mL。分配 5 x 10 6 个细胞/管用于制备文库，1 x 106 个细胞/管用于滴定用于 MNase 消化。
注：建议滴定每个交联细胞批次的最佳消化度。理想情况下，收集 2 至 3 份 1 x 10 6 个细胞的等分试样用于 MNase 滴定实验（步骤 2），收集 2 至 4 份 5 x 106 个细胞的等分试样用于制备实验（步骤 3）。 - 通过在室温下以1,000× g 离心5分钟来收集细胞，并除去上清液。在液氮中快速冷冻细胞沉淀，并将其储存在-80°C。
注：成功的 Micro-C 文库可以从储存长达 3 个月的样品中制备。
2. MNase滴定
注：在处理双交联细胞的制备文库之前，必须进行MNase滴定以确定MNase的最佳浓度。
- 为了进行MNase滴定，在冰上解冻1 x 106 个细胞的沉淀10分钟，并将细胞重悬于500μL DPBS中（如果细胞粘附在壁上，则添加1x BSA）。将细胞悬浮液在冰上孵育20分钟。
- 通过在室温下以10,000×g离心5分钟来收集细胞，并除去上清液。将沉淀的细胞重悬于 500 μL MB#1 缓冲液（50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、5 mM MgCl 2、1 mM CaCl 2、0.2% NP-40、1x 蛋白酶抑制剂 [参见材料表]、pH 7.4）中。
- 通过以10,000× g 离心5分钟收集细胞，并除去上清液。将细胞重悬于 200 μL MB#1 缓冲液中，并将样品分成四个试管。
- 解冻一小瓶MNase（20U/μL），并用10mM Tris（pH 7.4）以1：2、1：4、1：4和1：4的顺序稀释，以达到浓度分别为10U/μL、2.5U/μL、0.625U/μL和0.1256U/μL（每种酶解条件一个）。以适当的时间间隔（10-20秒），向四个样品之一中加入1μLMNase溶液，涡旋，并在37°C的热混合器上孵育10分钟（800rpm振荡）。继续将剩余MNase稀释液中的1μL加入剩余的细胞等分试样中。
- 通过加入 200 μL 新鲜制备的 STOP 缓冲液（150 μL 10 mM Tris，pH 7.4,25 μL 10 % SDS，25 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K，2 μL 0.5 M EGTA）以与添加 MNase 相同的顺序和时间间隔向每个试管中加入 Mnase 消化。在65°C孵育2小时。
- 向每个样品中加入 500 μL 苯酚-氯仿-异戊醇 （PCI），并通过涡旋充分混合。在室温下以19,800× g 离心5分钟以分离相，并将水相转移到新管中（约200μL/样品）。
注意：PCI 含有许多有毒成分，只能在化学安全罩中处理。详情请咨询制造商。 - 根据制造商的说明，使用商业 DNA 纯化试剂盒（参见 材料表）纯化 DNA，并在 12 μL 洗脱缓冲液中洗脱样品。
注：脱蛋白步骤（步骤2.5）的SDS浓度对某些DNA纯化试剂盒具有抑制作用。这里使用的DNA纯化试剂盒的性能与乙醇沉淀相当。 - 加入 2-5 μL 上样染料，并将样品在 1.5% 琼脂糖凝胶上以 120 V 电泳 30-50 分钟（直至正确分离; 图1A）。
- 为实验选择最佳消化度，并继续制备型MNase消化。最佳消化度显示几乎没有亚核小体片段，单核小体与双核小体的比例为 70%-90%。
注：在本实验中，图1A中泳道4的消化程度被确定为2.5 x 10 5个细胞（= 1 x 106个细胞的2.5-5U Mnase）获得的最佳消化。有关详细讨论，请参阅代表性结果。
3. 制备型MNase酶解
- 要 通过 MNase 消化将染色质片段化为单核小体，解冻先前双交联的 5 x 106 细胞等分试样，并重悬于 1 mL DPBS 中。在冰上孵育20分钟（如果细胞粘在管壁上，则添加1x BSA）。
- 通过在室温下以10,000× g 离心5分钟来收集细胞，并弃去上清液。将沉淀重悬于 500 μL MB#1 缓冲液中。重复离心步骤一次。将沉淀重悬于 1 mL MB#1 缓冲液中，并制备 200 μL 等分试样（每个等分试样 1 x 10 个6 个 细胞）。
- 基于MNase滴定（如步骤2所述），通过向每个等分试样中加入适量的MNase（通常每1×106 个细胞2.5-10U / μL）来消化染色质。充分混合（快速涡旋和旋转），并在37°C的热混合器上孵育10分钟，振荡800rpm。
- 通过向每个等分试样中加入1.6μL的0.5M EGTA（最终4mM）来终止MNase消化，并在65°C的热混合器上以800rpm振荡孵育10分钟。
- 通过在室温下以10,000× g 离心5分钟收集样品，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 500 μL 的 1x NEBuffer 2.1 中。
- 将相当于 5 x 106 个细胞或更少输入的样本池合并，以便进一步处理。
注意：如果要处理超过 5 x 10 6 个细胞，请并行处理这些样品，因为酶条件针对 5 x 106 个细胞进行了优化。 - 在进行邻近连接步骤之前，转移 10% 的样品作为输入对照以控制 MNase 消化水平。向该样品中加入 150 μL 10 mM Tris、pH 7.4、25 μL 10% SDS 和 25 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K，并在 65 °C 下孵育过夜。
4. DNA末端处理和邻近连接
- 通过在4°C下以10,000× g 离心5分钟收集剩余的样品，并弃去上清液。将沉淀重悬于90μL新鲜制备的Micro-C预混液1（表1）中，并在37°C下以800rpm振荡在热混合器上孵育15分钟。
- 加入10μL的5U / μL Klenow片段，并在37°C下以800rpm振荡在热混合器上孵育15分钟。
- 加入100μL新鲜制备的Micro-C预混液2（表2），并在25°C下以800rpm振荡在热混合器上孵育45分钟。孵育后，通过加入EDTA至终浓度为30mM来淬灭酶促反应。在65°C下以800rpm振荡在热混合器上孵育20分钟。
- 通过在4°C下以10,000× g 离心5分钟收集样品，并弃去上清液。将样品重悬于500μL新鲜制备的Micro-C预混液3（表3）中，并在室温下旋转（15-20rpm）孵育2.5小时。
- 通过在4°C下以10,000× g 离心5分钟收集样品，并弃去上清液。将样品重悬于200μL新鲜制备的Micro-C预混液4（表4）中，并在37°C下以800rpm振荡在热混合器上孵育15分钟。
- 对于反向交联和脱蛋白，向样品中加入25μL的20mg / mL蛋白酶K和25μL的10%SDS，并在65°C下孵育过夜，间歇混合。
5. 二核小体DNA纯化和大小选择
- 向样品和输入对照中加入 500 μL PCI，并通过涡旋混合。通过以19,800× g 离心5分钟分离相，并将上层水相转移到新管中。
- 使用 DNA 纯化试剂盒或乙醇沉淀浓缩 DNA。在30μL（步骤5.3）中洗脱样品，在15μL中洗脱输入对照（步骤3.11），并运行1.5%琼脂糖凝胶以分离单核小体和二核小体（图1B）。
注：脱蛋白步骤的SDS浓度对某些DNA纯化试剂盒具有抑制作用。此处使用的DNA纯化试剂盒（参见 材料表）的性能与乙醇沉淀相当。根据所用细胞的数量，起始量范围为 100 ng 至 10 μg。通常，从 5 x 106 个细胞中提取 1-5 μg DNA。 - 切除具有双核小体大小（约300 bp）的DNA片段。使用市售的 DNA 凝胶洗脱试剂盒（参见 材料表）从琼脂糖凝胶中提取 DNA，并在 150 μL 中洗脱。
6.链霉亲和素微球的制备
- 将每个样品 10 μL 链霉亲和素珠（参见 材料表）转移到反应管中。
- 将其放入适合 1.5 mL 试管的磁铁中（参见 材料表）。溶液清除后（1-2分钟），除去上清液，并将珠子重悬于300μL的1x TBW（5mM Tris-HCl，pH 7.5,0.5mM EDTA，1M NaCl，0.05%吐温20）中。重复此步骤一次。
- 将珠子重悬于步骤7中处理的每个样品的150μL2x B&W缓冲液（10mM Tris-HCl，pH 7.5,1mM EDTA，2M NaCl）中。
7. 链霉亲和素下拉和珠上文库制备
- 将150μL预制备的珠子（步骤6.3）加入150μL样品（步骤5.3）中。在室温下旋转孵育20分钟（15-20rpm）。
- 将试管放入适当的磁铁中，等待溶液清除（1-2分钟）。除去上清液，将珠子重悬于300μL的1x TBW中。重复此步骤。
- 将试管放入适当的磁铁中，等待溶液清除（1-2分钟）。除去上清液，将珠子重悬于100μL的0.1x TE（1mM Tris，0.1mM EDTA，pH 8.0）中。
- 将试管放入适当的磁铁中，等待溶液清除（1-2分钟）。除去上清液，将珠子重悬于50μL的0.1x TE中，并将它们转移到PCR管中。
注：使用的0.1x TE体积（50μL）对应于本协议中使用的DNA测序文库制备试剂盒（参见 材料表）的起始体积。如果使用不同的试剂盒或策略，请相应地调整音量。 - 根据制造商的方案执行测序文库制备试剂盒的DNA操作步骤。这些步骤通常包括 DNA 钝化、A 拖尾、接头连接和 U 切除。最后一步（U 切除术）特定于本研究中使用的试剂盒。如果使用该试剂盒，请使用未稀释的适配器，按照试剂盒方案中步骤1至步骤2.6的制造商说明进行操作，并且在步骤2.6之后不要考虑-20°C储存。
注意：测序试剂盒所需的缓冲液变化必须通过将珠子与磁铁结合并洗涤（步骤7.3至7.4）来交换，因为DNA仍与链霉亲和素珠结合。此外，由于 DNA 与磁珠结合，因此请忽略试剂盒方案中衔接子连接后的任何纯化和大小选择步骤。继续执行步骤 7.6（此协议）。 - 接头连接完成后，按照步骤7.2中的说明洗涤样品。弃去上清液，将珠子重悬于20μL的0.1x TE中。
8. 所需PCR循环的估计
注：建议估计文库扩增所需的PCR循环。通常，Micro-C 文库需要 8-15 个循环的 PCR。虽然该步骤不是必需的，但它有助于避免过度扩增并降低PCR重复的风险。
- 要确定所需的最小PCR循环数，请使用1μL链霉亲和素 - 生物素 - DNA样品进行PCR（步骤7.6）。为此，向样品中加入PCR预混液（3.2μL的H2O，0.4μL的i5引物，0.4μL的i7引物和5μL的Q5高保真DNA聚合酶）。根据制造商对所用DNA文库制备试剂盒的说明进行16个循环的PCR。
注意：此处使用的引物以单独的试剂盒（参见 材料表）购买，该试剂盒需要与所使用的文库制备试剂盒兼容。 - PCR后，用适当的磁铁收集珠子，并使用高灵敏度DNA定量仪器测量1μL上清液的DNA浓度（参见 材料表）。要获得总DNA浓度，请将该值乘以10（PCR反应的总体积）。估计代表性结果中讨论的所需PCR循环数。
- 向剩余的 9 μL PCR 混合物中加入 2 μL 6x 上样缓冲液。在1%琼脂糖凝胶上解析PCR扩增文库以确定接头连接成功，产生约450 bp大小（图1C）。
注意：凝胶应显示大约 420 bp 的独特条带（Micro-C 文库加接头）。120 bp 的条带代表衔接子二聚体，表示低复杂度文库。可能会出现分子量较低的条带（小于 100 bp），这些是 PCR 反应中未使用的引物。
9. 测序文库扩增
- 将PCR预混液（65μL H2O、100 μL Q5 高保真 DNA 聚合酶、8 μL i5 引物、8 μL i7 引物）加入剩余的 19 μL 链霉亲和素-生物素-DNA 样品中。将反应混合物分成 50-100 μL 等分试样。
注意：PCR的最佳体积取决于PCR机器;通常，50 μL 在普通 PCR 仪中可提供最可重复的扩增。 - 根据制造商的DNA文库制备试剂盒的说明进行PCR，循环数在步骤8中确定。如果省略步骤8，建议进行PCR的14个循环。
- 根据制造商的方案，用顺磁珠（参见 材料表）以 1：0.9 的比例纯化 DNA。在 20 μL 的 0.1% TE 中洗脱。
注意：如果在步骤8.5中检测到接头二聚体，请使用相同的比例进行两次纯化。 - 确定DNA浓度并在质量控制系统上运行样品（参见 材料表）。通过存在单个精确频段来确保Micro-C库的良好质量（图1D）。
注：由于PCR前的样品洗涤，接头二聚体在微球文库制备中并不常见。因此，接头二聚体的出现表明文库复杂性较低。如果观察到接头二聚体，强烈建议使用低起始量测序对样品进行质量控制。
10. DNA测序和数据处理
- 根据测序提供商的要求，使用双端测序对 Micro-C 文库进行测序。
注：理想情况下，样品在平台上以双端模式进行测序，每次读取 50 bp。提供较短读取长度的旧平台（如 2 x 35 bp）也已成功使用。重要的是，如果研究重复的基因组区域，则建议使用更长的读取长度进行测序。 - 要评估 Micro-C 文库的质量，请执行低起始测序，每个样本的 5 x 106 至 1 x 107 个读长。
- 使用 Distiller10 处理测序文件（fastq 文件）。将读数与适当的参考基因组进行映射，此处为mm10。
注意：可以使用本地计算机或计算群集上的各种管道处理排序文件。对于测序深度较低的样本，较大的 bin 大小（如 10,000 bp、50,000 bp、100,000 bp 和 500,000 bp）可以减少计算需求和文件大小。Distiller（在本研究中使用）生成所有必需的文件类型来评估 Micro-C 库的质量。生成的 *.stats 文件包含有关映射速率、顺反率和读取方向的信息，这些信息按读取对之间的距离分层。这些参数如图 2所示，代表性结果中讨论了Micro-C库质量的评估。处理软件还生成mcool文件，可直接加载到HiGlass（https://docs.higlass.io/）中，生成交互矩阵9。
Representative Results
Micro-C文库的成功制备可以通过协议的几个步骤进行评估。最重要的一步是选择合适的MNase消化度。因此，必须滴定MNase浓度，以使每个样品的单核小体比双核小体一致地产生70%-90%。需要注意的是，真染色质和异染色质的染色质消化是不同的，MNase消化异染色质的效率较低。因此，最佳消化程度取决于感兴趣的染色质区域和所研究的细胞类型，因为真染色质和异染色质的相对比例是细胞类型特异性的。因此，建议仔细滴定所需的MNase浓度，并首先通过低起始测序评估Micro-C实验的成功。
用递减量的MNase处理的染色质的典型MNase滴定模式如图 1A所示。在这里，每个反应中来自250,000个细胞的染色质被MNase的四倍稀释液消化。最高浓度（10 U MNase，泳道 2）显示过度消化的染色质几乎完全由单核小体 DNA （~150 bp） 组成。值得注意的是，与MNase浓度降低的样品中的相应条带相比，琼脂糖凝胶中单核小体条带的中心较低，表明核小体DNA过度消化。过度消化的核小体在邻近连接反应中连接效率低下;因此，泳道 2 中的样品对于 Micro-C 实验来说是次优的。泳道 3（2.5 U MNase）显示出几乎适合 Micro-C 实验的酶解度。在这里，单核小体条带是优势物种，并且亚核小体涂片减少，表明核小体过度消化;但是，它仍然存在。泳道 4 中的消解度（0.635 U MNase）是本滴定示例中 Micro-C 实验的理想条件。存在一条清晰的单核小体条带，没有亚核小体 DNA。单核小体和双核小体DNA的条带强度几乎相等，表明单核小体产量为66%或更高。值得注意的是，双核小体 DNA 的大小大约是单核小体 DNA 的两倍（~320 bp vs. ~150 bp），因此其每摩尔 DNA 的条带强度是单核小体对应物的两倍。泳道 5 中的消化度（0.156 U MNase）显示染色质消化不足，几乎没有核小体 DNA，因此，这代表一个次优样品。
总之，在本例中，用 0.625 U MNase（相当于 200 μL 中 1 x 106 个细胞的 2.5 U MNase）消化 2.5 x 105 小鼠 ES 细胞，为 Micro-C 实验中的制备性消化提供了最有希望的起点。然而，还应考虑泳道 3 和泳道 4 中样品所用条件之间的中间 MNase 浓度（相当于 200 μL 中 1 x 106 个细胞的 5 U MNase）。重要的是，使用MNase的染色质酶切不能线性缩放，因此不建议将制备酶切放大超过4倍。为了从超过 1 x 10 6 个细胞制备 Micro-C 文库，建议以 1 x 106 个细胞的等分试样消化染色质，并在 MNase 失活后将它们混合在一起。
为了评估邻位连接方案的成功，应通过1.5%琼脂糖凝胶电泳将MNase消化且未邻位连接（步骤3.8）的输入对照与邻位连接的样品（步骤5.3）进行比较（图1B）。邻近连接的单核小体条带的大小约为 300 bp，与双核小体相似。因此，单核小体与双核小体的带信号比应从以单核小体为主的单核小体（泳道 1）转向双核小体（泳道 3 和泳道 4）。由于此步骤中的琼脂糖凝胶是被切除和纯化的双核小体DNA，因此建议将样品分成多个泳道以避免过载。
建议通过最少的PCR来评估制备的测序文库的质量和数量。在这里，来自1μL珠子（总样品的1/20）的DNA在10μLPCR反应中扩增16个循环。经过16个PCR循环后，最小PCR文库的总浓度通常在50-500 ng之间。从理论上讲，如果剩余的 19 μL 样品也被扩增 16 个循环，则相当于 1-10 μg 文库。建议使用从总 DNA 中生成约 100 ng 文库所需的最少 PCR 循环次数。假设在PCR中进行对数扩增，则从19 μL起始量获得的16个循环中获得的DNA的理论浓度可以连续除以2，以计算生成100 ng文库所需的PCR循环数。例如，16 次循环后 1 μL 的 100 ng 产量对应于 19 μL 扩增的 1,900 ng 产量。在这种情况下，理想情况下，12 个循环应从总 DNA 中生成 118 ng 测序文库 （1,900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng）。然后，来自最小PCR的剩余9μL样品可用于通过琼脂糖凝胶电泳评估文库的质量（图1C）。可视化应显示 420 bp 处的一个不同条带，并且没有接头二聚体 （120 bp） 的条带。也可能出现较小的片段，这些片段对应于未使用的PCR引物。
接下来，建议在进行资源密集型深度测序之前，通过低起始量测序分析和确认 Micro-C 样品制备是否成功。通常，文库的测序深度为 5 x 106 至 1 x 107，并根据以下标准进行评估：测序读取重复率、顺式与反染色体相互作用率以及测序读向频率。Micro-C 库使用 Distiller 进行处理，Distiller 是一个全方位服务管道，使用 cooler、pairtools 和 cooltools 处理从测序读取文件（Fastq 格式）到读取对文件（Bedpe 格式）和可扩展交互矩阵（Cool 和 Mcool 格式）的数据10、11、12。该管道还会生成一个摘要文件，该文件非常适合评估 Micro-C 库10 （https://github.com/open2c/distiller-nf） 的质量。PCR 重复率提供有关测序文库复杂性的信息，可以从生成的 *.stats 文件中提取。当从 500 万个或更多细胞生成时，高质量 Micro-C 文库的 PCR 重复率低于 5%-10%。值得注意的是，一些测序平台在簇形成过程中生成PCR重复，与测序文库的复杂性无关。图2A显示了两个实验的相对重复率：一个是我们认为是好样本，一个是坏样本。在此示例中，两个样本都显示了可接受的映射速率。评估 Micro-C 库质量的下一个标准是顺式与反式比以及读取取向频率。在细胞核内，染色体栖息在单个染色体区域，因此很少与其他染色体相互作用。检测到的反染色体相互作用率高表明随机连接率高。应该注意的是，在这种分析水平下，与良好样本相比，不良样本显示出较高的反染色体相互作用率（图2B）。对于 Micro-C，70% 或更高的顺染色体相互作用率是可取的。
Micro-C 文库的片段大小与双核小体 DNA 条带相似，可与邻近连接的样品共纯化并污染实验。这些污染物始终是顺染色体相互作用。因此，评估读取方向率也很重要。双核小体污染的速率可以通过低起始测序来估计。双核小体 DNA 源于两个未被 MNase 切割的相邻核小体。因此，得到的测序读长将始终显示正向-反向读向（F 和 R），并且读数对之间的距离约为 320 bp。相比之下，邻位连接片段可以在四个方向上连接，产生具有F-R、R-R、R-F和F-F的读长对，理想情况下丰度相等（图2C）。此外，它们还显示两个读取对之间的各种距离。为了估计二核小体污染物的数量，可以从蒸馏器生成的*stats文件中计算读取方向的频率（图2D）。值得注意的是，在这项工作中，与好样本相比，坏样本中 F-R reads 的比例（红色）更高，当读取方向按距离分层时，这一点变得更加明显（图 2E）。与 Micro-C 文库相比，当读长对分层为距离为 <562 bp 或 ≥562 bp 的读段时，F-R 部分以双核小体片段为主。在这里，距离为 <562 bp 的读段部分以 F-R 读长为主，而距离为 ≥562 bp 的读段部分在四个可能的方向之间显示出均匀分布，表明 F-R 读段的全局过度表示源于双核小体污染物。选择 562 bp 作为子集的阈值由生成的 *stats 文件中的分箱定义。虽然这种质量控制不是必需的，但可以通过从 *pairs 文件中提取距离来实现更明确的子集，该文件也是由 distiller 生成的。需要注意的是，双核小体读数不会降低Micro-C样品的质量，因为它们可以在数据处理过程中被识别和忽略。但是，它们不包含有关 3D 交互的宝贵信息，并且它们会稀释信息性读数。
因此，仔细的MNase滴定和低起始量测序的彻底质量控制是优化Micro-C实验质量的最佳工具。
图 1：Micro-C 协议的中间阶段 。 （A） 琼脂糖凝胶电泳对用不同 MNase 浓度消化的 2.5 x10 5 小鼠 ES 细胞的染色质进行电泳。单核小体、二核小体和三核小体条带用箭头表示。M：DNA 分子量标准（泳道 1/6）;每 250,000 个细胞 10 U MNase（泳道 2）;每 250,000 个细胞 2.5 U MNase（泳道 3）;每 250,000 个细胞 0.625 U MNase（泳道 4）;每 250,000 个细胞 0.156 U MNase（泳道 2）。（B） Micro-C 制备样品（泳道 3 和泳道 4）和 MNase 酶解起始对照（泳道 1）的 1.0% 琼脂糖凝胶电泳。泳道 1 和泳道 2（M：DNA 分子量标准）得到增强，以强调单核小体到双核小体片段强度的相对变化。单核小体和双核小体条带用箭头表示。邻位连接样品中的双核小体条带结合了双核小体和 Micro-C 文库 DNA。（C） 对从 1 μL 样品扩增的 Micro-C 测序文库进行 1.0% 琼脂糖凝胶电泳以评估质量。泳道 1 （M）：DNA 分子量标准;泳道 2 （S）：Mirco-C 库。（D） 最终 Micro-C 文库的片段分析器迹线。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：好样本和坏样本的低输入测序的样本统计量。 （A） 映射（绿色）和未映射（红色）读数百分比的条形图。（B） 绘制顺式和反染色体相互作用的归一化读段分数。数据集被归一化为顺式映射读取。顺式映射读长按双端测序样本的第一个和第二个读段之间的距离进行分层：≤1 kbp（黄色）、>1 kbp 和 ≤10 kbp（橙色）以及 >10 kbp（红色）。（C）具有双核小体大小的潜在分子种类的示意图。（D） 好样本和坏样本的所有读数的读数对方向的百分比。（E）与图（D）相同，但按距离分层（左<562 bp，右≥562 bp）。请点击这里查看此图的较大版本.
| 组件 | 1 倍 | 4.4 倍 |
| 10x NEBuffer 2.1， | 10微升 | 44微升 |
| 2μL 100 mM ATP | 2微升 | 8.8微升 |
| 100毫米DTT | 5微升 | 22微升 |
| H2O | 68微升 | 299.2微升 |
| 10 U/μL T4 PNK | 5微升 | 22微升 |
| 总 | 90微升 | 396微升 |
表 1：Micro-C 预混液 1. 用于末端咀嚼反应的预混液的组成。
| 组件 | 1 倍 | 4.4 倍 |
| 1毫米生物素-dATP | 10微升 | 44微升 |
| 1毫米生物素-dCTP | 10微升 | 44微升 |
| 10 mM dTTP 和 dGTP 混合物 | 1微升 | 4.4微升 |
| 10x T4 DNA连接酶缓冲液 | 5微升 | 22微升 |
| 200x 牛血清白蛋白 | 0.25微升 | 1.1微升 |
| H2O | 23.75微升 | 104.5微升 |
表 2：Micro-C 预混液 2. 用于末端标记反应的预混液的组成。
| 组件 | 1 倍 | 4.4 倍 |
| 10x NEB T4连接酶反应缓冲液 | 50微升 | 220微升 |
| H2O | 422.5微升 | 1859微升 |
| T4 DNA连接酶 | 25微升 | 110微升 |
表 3：Micro-C 预混液 3. 用于邻位连接反应的预混液的组成。
| 组件 | 1 倍 | 4.4 倍 |
| 10x NEBuffer 1.1 | 20微升 | 88微升 |
| H2O | 180微升 | 792微升 |
| ExoIII核酸酶 | 10微升 | 44微升 |
表 4：Micro-C 预混液 4. 用于生物素去除反应的预混液的组成。
Discussion
Micro-C实验的成功取决于协议中需要仔细执行的几个关键步骤。首先，与附加交联剂DSG或EGS的交联可导致细胞聚集，具体取决于细胞类型。在交联反应中加入0.1%-0.5%的BSA，在不影响交联效率的情况下，显著降低团聚。低效的交联会导致跨染色体相互作用的速率增加，这表明存在随机连接。该协议中的第二个也是最关键的步骤是用MNase消化染色质。染色质消化效果不佳会导致邻位连接效率低下（过度消化）或非邻位连接二核小体的速率增加（消化不足）。连接反应的效率可以通过琼脂糖凝胶电泳来评估（图1B），并且通过低起始量测序来估计连接反应的效率。如果低起始量测序显示重复率高（连接效率低下）或双核小体速率增加，则应重新评估 MNase 消化度。值得注意的是，执行协议时样本丢失会导致文库复杂性降低。样品的浓度最好在DNA纯化（步骤5.3）或通过最小的PCR（步骤8）进行评估。DNA 纯化后，5 x 106 个哺乳动物细胞的 DNA 总产量通常为 >2 μg。在MNase消化、ExoIII消化和DNA纯化后，应控制DNA浓度。内源性核酸酶的丰度是细胞类型特异性和物种特异性的，可以成为DNA降解的来源。此外，基于色谱柱的DNA纯化可能由于与脱蛋白反应的SDS不相容而导致样品损失。如果此时DNA浓度较低，则可以考虑乙醇沉淀。
由于 Micro-C 需要样品特异性 MNase 滴定，因此将 Micro-C 应用于小细胞群具有挑战性，例如来自各种模式生物、胚胎和单细胞的小器官、类器官或患者活检。在这里，Hi-C 3.0 提供了一种成熟的替代方案，使用序列特异性限制性核酸内切酶 8,9 的终点反应。
Micro-C是一种广泛应用的高分辨率染色体构象技术，具有高动态范围和低信噪比，特别适用于研究短程染色体特征4,5,8，如染色体环。Micro-C 的分辨率允许捕获超出 Hi-C 检测限的启动子-增强子环，从而能够更详细地分析基因组组织与调控13、14、15 之间的关系。此外，DNA 捕获策略最近与 Micro-C 相结合，将靶向基因组位点的位点特异性分辨率提高到前所未有的水平，揭示了对 3D 基因组超微结构的新见解16,17,18。总之，我们设想Micro-C及其衍生物将成为剖析3D基因组在转录调控中的作用的关键技术，从而在细胞类型分化和维持中的作用。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢克里斯特尔·高比茨（Christl Gaubitz）和凯瑟琳·斯图尔特-摩根（Kathleen Stewart-Morgan）对手稿的批判性阅读。我们感谢 Anja Groth 和 Groth 实验室对我们实验室的支持。我们感谢 CPR/reNEW 基因组学平台的工作人员的支持：H. Wollmann、M. Michaut 和 A. Kalvisa。诺和诺德基金会干细胞医学中心（reNEW）由诺和诺德基金会资助号NNF21CC0073729。诺和诺德基金会蛋白质研究中心（CPR）得到了诺和诺德基金会资助号NNF14CC0001的支持。我们感谢诺和诺德干细胞医学中心（reNEW Copenhagen）的Brickman实验室提供的小鼠ES细胞。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mM Biotin dATP | Jenna Bioscience | NU-835-Bio14-S | |
| 1 mM Biotin dCTP | Jenna Bioscience | NU-809-BioX-S | |
| 10 mM dGTP | NEB | N0442S | |
| 10 mM dTTP | NEB | N0443S | |
| 10 U/ml T4 PNK | NEB | M0201L | |
| 100 U/L Exonuclease III | NEB | M0206L | |
| 10x NEBuffer 1.1 | NEB | B7001S | |
| 10x NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | |
| 10x T4 DNA Ligase buffer | NEB | B0202A | |
| 1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ | ThermoFisher | 14190144 | |
| 1x LIF | |||
| 2_Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | 0.1 mM b-mercaptoethanol |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-500ML | Caution. See manufactures MSDS |
| 400 U/ml T4 DNA Ligase | NEB | M0202L | |
| 5 U/ml Klenow Fragment | NEB | M0210L | |
| Agarose | BIO-RAD | 1613102 | Caution. See manufactures MSDS |
| BSA 20mg/ml | NEB | B9000S | |
| CaCl2 | |||
| cell counter | |||
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D8418-100ML | Caution. See manufactures MSDS |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes |
| DynaMag-PCR Magnet | Invitrogen | 492025 | refered to as: magnet magnet for PCR tubes |
| EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | BioWorld | 40121266-1 | |
| Ethanol 96% | VWR Chemicals | 20824365 | quality control system |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | |
| Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) | ThermoFisher | 21565 | |
| Fetl Bovin Serum | Sigma Aldrich | F7524 | 15% FBS |
| Gel Loading dye purple (6X) | NEB | B7024S | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067.0500 | |
| Halt Proteinase inhibitor (100x) | ThermoFisher | 78430 | Caution. See manufactures MSDS |
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | 18896-50ML | |
| MgCl 1 M | Invitrogen | AM9530G | |
| Micrococcal Nuclease (MNase) | Worthington | LS004798 | |
| mouse embryonic stem cells | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) | NEB | E7600S | amplification primers for sequencing libraries |
| NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | NEB | E7645L | sequencing library preparation kit |
| NEBNext Ultra II Q5 Master mix | NEB | M0544S | Caution. See manufactures MSDS |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | 1x NEAA |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | 1% Pen-Strep |
| Proteinase K (40 mg/ml) | GoldBio | P-480-1 | Caution. See manufactures MSDS |
| QIAquick Gel extraction kit | QIAgen | 28706 | refered to as: DNA gel elution kit |
| QIAquick PCR purification kit | QIAgen | 28106 | refered to as: commercial DNA purification kit |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA quantification instrument |
| Quick load purple 1kb plus DNA Ladder | NEB | N0550S | |
| SPRIselect size selection beads | Beckman Coulter | B23319 | paramagnetic beads |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | refered to as: thermomixer |
| Tris | Merck | 10708976001 | |
| Trypsin | |||
| Tween20 | Sigma Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrapure 10% SDS | Invitrogen | 15553-035 | |
| Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) | Invitrogen | 15593-031 | |
| Fragment Analyzer |
References
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