Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kartlegging av pattedyrs 3D-genominteraksjoner med Micro-C-XL

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/64579
Automatic Translation
1, 1, 1
1Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, University of Copenhagen

Summary

En protokoll for kartlegging av den tredimensjonale genomorganisasjonen med nukleosomoppløsning ved bruk av den genombrede kromosomkonformasjonsfangstmetoden Micro-C-XL presenteres her.

Abstract

Tredimensjonal (3D) kromosomorganisasjon er en viktig faktor i genomregulering og celletypespesifikasjon. For eksempel antas cis-regulatoriske elementer, kjent som forsterkere, å regulere aktiviteten til distale promotorer via interaksjon i 3D-rom. Genom-wide chromosome conformation capture (3C)-teknologier, som Hi-C, har forvandlet vår forståelse av hvordan genomer er organisert i celler. Den nåværende forståelsen av 3D-genomorganisasjon er begrenset av oppløsningen som den topologiske organisasjonen av kromosomer i 3D-rom kan løses med. Micro-C-XL måler kromosomfolding med oppløsning på nivået av nukleosomet, den grunnleggende enheten av kromatin, ved å benytte mikrokokknuklease (MNase) for å fragmentere genomer under kromosomkonformasjonsfangstprotokollen. Dette resulterer i et forbedret signal-støy-forhold i målingene, og dermed muliggjør bedre deteksjon av isolasjonssteder og kromosomløkker sammenlignet med andre genombrede 3D-teknologier. En visuelt støttet, detaljert, trinnvis protokoll for fremstilling av høykvalitets Micro-C-XL-prøver fra pattedyrceller presenteres i denne artikkelen.

Introduction

Micro-C-XL er en genom-bred teknikk for å måle 3D-genomkonformasjon med nukleosomoppløsning. Micro-C-XL bygger på den mye brukte nærhetsligeringsbaserte Hi-C-teknologien, som har endret vår forståelse av hvordan 3D-genomer er organisert1. Micro-C-XL og dens første iterasjon, Micro-C, ble opprinnelig utviklet i Saccharomyces cerevisiae2,3 og senere tilpasset pattedyrcellesystemer, hvor protokollen har vist sitt fulle potensial for å oppdage kortdistanseegenskaper i 3D-genomet, for eksempel kromosomløkker og isolasjonssteder. Denne versjonen er basert på nyere pattedyrpublikasjoner 4,5. Ettersom Micro-C-XL erstatter Micro-C, blir Micro-C-XL heretter referert til som Micro-C i manuskriptet.

De største forskjellene mellom Micro-C og Hi-C6 er som følger: 1) genomfragmentering med mikrokokknuklease (MNase) sammenlignet med restriksjonsenzymer og 2) ytterligere kryssbindere med større atomavstand mellom de reaktive gruppene sammenlignet med bare formaldehyd. Begge trinnene bidrar betydelig til det forbedrede signal-støy-forholdet til Micro-C sammenlignet med konvensjonell Hi-C. Fragmenteringsstørrelsen begrenser oppløsningen som 3D-genomorganisasjonen kan løses til under nærhetsligeringsprotokollen. MNase er en nuklease som fortrinnsvis fordøyer tilgjengelig DNA og etterlater nukleosomalt beskyttet DNA intakt. Nukleosomfotavtrykk ved bruk av MNase-sekvensering har vist at nukleosomer fullt ut dekker de fleste eukaryote genomer7. Siden nukleosomer fordeles over hele genomet med en gjennomsnittlig avstand på 160-220 bp, avhengig av art og celletype, er MNase det ideelle enzymet for høyoppløselig kartlegging av genomarkitekturen.

Bruken av en ekstra tverrbinder i kombinasjon med formaldehyd (FA) i Micro-C-metoden forbedrer i tillegg signal-støy-forholdet 2,8. Aminspesifikke kryssbindere med lengre atomavstandsstykker mellom de reaktive gruppene letter protein-protein tverrbindinger. Disse er typisk disuccinimidylglutarat (DSG) eller etylenglykol bis-succinimidylsuccinat (EGS) med henholdsvis 7,7 Å og 16,1 Å avstandsstykker. Reduksjonen av støy gjennom EGS eller DSG er spesielt tydelig i eksperimenter med høye fragmenteringshastigheter, som Micro-C, og oppstår antagelig på grunn av en reduksjon i frekvensen av tilfeldige ligeringshendelser8.

En nylig utviklet Hi-C 3.0-protokoll som benytter ESG / DSG-tverrbinding og flere kombinasjoner av restriksjonsenzymer reduserer støy i Hi-C-eksperimenter og forbedrer deteksjonen av kromosomløkker og isolasjonssteder 8,9 betydelig. Likevel fant en sted-for-sted-sammenligning av ulike interaksjonsdatafunksjoner at Micro-C hadde overlegen deteksjon av kortdistansefunksjoner, for eksempel kromosomløkker og isolasjonssteder, sammenlignet med både Hi-C 3.0 og konvensjonell Hi-C8. Hi-C 3.0 forbedrer imidlertid deteksjonen av kortdistansefunksjoner og opprettholder sterk deteksjon av genomavdeling sammenlignet med konvensjonell Hi-C. Oppsummert bør valget av en kromosomkonformasjonsfangstmetode bestemmes av det objektive og biologiske spørsmålet.

Her gir vi en trinnvis protokoll for vellykkede Micro-C-eksperimenter som kan avdekke 3D-genomorganisasjon.

Protocol

1. Cellekultur og tverrbinding

  1. Kulturceller i henhold til eksperimentelle behov for å oppnå minimum 1 x 107 celler. Her ble cellene dyrket ved 37 °C med 5 % CO2 i E14 medium (DMEM med pyruvat og L-glutamin, 15 % FBS, 1x LIF, 1x NEAA, 1 % pen-streptokokker, 0,1 mM β-merkaptoetanol [se materialtabell]) og passert annenhver dag.
    MERK: Denne protokollen har blitt brukt på forskjellige celletyper fra flere arter, for eksempel Homo sapienss og Mus musculus. I dette eksemplet ble musembryonale stammeceller (ES) brukt.
  2. Høst cellene ved 70% -80% samløp ved å aspirere mediet. Vask en gang med 5 ml DPBS, og inkuber cellene med 3 ml forvarmet 0,25% trypsin per 10 cm tallerken i 2-3 min ved 37 ° C.
  3. Slukk trypsinet med 7 ml forvarmet E14-medium og overfør de frittliggende cellene til et 50 ml rør.
  4. Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i mediet. Telle cellene med en celleteller.
    MERK Protokollen er robust for noe variasjon i cellekonsentrasjoner, og forskjellige celletellere har blitt brukt til å kvantifisere celletallene; Vær imidlertid oppmerksom på det dynamiske området til celletelleren som brukes. Dette er vanligvis mellom 1 x 105-1 x 107 celler / ml. Mens sentrifugeringshastigheten og varigheten er testet for denne celletypen, kan forskjellige, mindre celler kreve høyere sentrifugeringshastighet eller lengre spinntider, og sentrifugeringen bør justeres tilsvarende.
  5. Samle cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved RT og resuspendere cellene i DPBS ved en endelig konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml. For eksempel, hvis utbyttet er 1 x 107 celler, resuspendere cellene i 10 ml DPBS.
  6. For det første kryssbindingstrinnet, tilsett 37% formaldehyd (FA) til en endelig konsentrasjon på 1% til cellesuspensjonen, og inkuber cellesuspensjonen i 10 minutter ved RT med rotasjon (15-20 rpm); som et eksempel, hvis utbyttet er 1 x 107 celler, tilsett 270 μL FA til 10 ml cellesuspensjonen.
    MERK: FA-løsningen er vanligvis stabil ved RT i opptil 3 måneder etter åpning.
  7. Slukk reaksjonen ved å tilsette 2,5 M glycin til en endelig konsentrasjon på 0,25 M og inkuber i 5 minutter ved RT med rotasjon (15-20 rpm). For eksempel, hvis utbyttet er 1 x 107 celler, tilsett 1,027 ml 2,5 M glycin til cellesuspensjonen.
  8. Samle cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved RT. Kast supernatanten og resuspender cellene i 5 ml DPBS. Gjenta sentrifugeringstrinnet én gang og resuspender de pelleterte cellene i DPBS til 4 x 106 celler/ml. For eksempel, hvis utbyttet er 1 x 107 celler, resuspendere cellene i 2,5 ml DPBS.
  9. For det andre kryssbindingstrinnet, lag en 0,3 M stamløsning av etylenglykol bis-succinimidylsuccinat (EGS) i DMSO (13,6 mg EGS i 100 μL DMSO). Legg til EGS ved en endelig konsentrasjon på 3 mM til cellesuspensjonen, og inkuber ved RT i 40 minutter med rotasjon (15-20 rpm). For eksempel, hvis utbyttet er 1 x 107 celler, tilsett 25 μL 0,3 M EGS-stamoppløsning til 2,5 ml av cellesuspensjonen.
    MERK: Balanser EGS til RT i minst 20 minutter før du veier for klargjøring av stamløsningen.
  10. Slukk reaksjonen ved å tilsette 2,5 M glycin til en endelig konsentrasjon på 0,4 M, og inkuber i 5 minutter ved RT med rotasjon (15-20 rpm). For eksempel, hvis utbyttet er 1 x 107 celler, tilsett 400 μL 2,5 M glycin til cellesuspensjonen.
  11. Samle cellene ved sentrifugering ved 1000 x g i 5 minutter ved RT, og resuspender de pelleterte cellene i DPBS til 5 x 106 celler / ml. Fordel 5 x 10 6 celler/rør for forberedende biblioteker og 1 x 106 celler/rør for titrering for fordøyelse av MNase.
    MERK: Det foreslås å titrere den optimale fordøyelsesgraden for hver tverrbundne cellebatch. Ideelt sett samles to til tre alikoter med 1 x 10 6 celler for MNase-titreringseksperimenter (trinn 2) og to til fire alikoter med 5 x 106 celler for forberedende eksperimenter (trinn 3).
  12. Samle cellene ved sentrifugering ved 1000 x g i 5 minutter ved RT og fjern supernatanten. Snap-frys cellepellets i flytende nitrogen, og oppbevar dem ved -80 °C.
    MERK: Vellykkede Micro-C-biblioteker kan fremstilles fra prøver lagret i opptil 3 måneder.

2. MNase-titrering

MERK: Å utføre en MNase-titrering er nødvendig for å bestemme den optimale konsentrasjonen av MNase før behandling av de dobbeltkryssbundne cellenes forberedende bibliotek.

  1. For å utføre MNase-titreringen, tine en pellet på 1 x 106 celler på is i 10 minutter og resuspendere cellene i 500 μL DPBS (legg til 1x BSA hvis cellene fester seg til veggen). Inkuber cellesuspensjonen på is i 20 minutter.
  2. Samle cellene ved sentrifugering ved 10.000 x g i 5 minutter ved RT, og fjern supernatanten. Resuspender de pelleterte cellene i 500 μL MB # 1 buffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2,0,2% NP-40, 1x proteasehemmer [se materialtabell], pH 7,4).
  3. Samle cellene ved sentrifugering ved 10 000 x g i 5 minutter, og fjern supernatanten. Resuspender cellene i 200 μL MB # 1 buffer, og del prøven i fire rør.
  4. Tine ett hetteglass med MNase (20 E/μL) og fortynn med 10 mM Tris, pH 7,4, i en serie på henholdsvis 1:2, 1:4, 1:4 og 1:4 for å oppnå konsentrasjoner på henholdsvis 10 U/μL, 2,5 E/μL, 0,625 U/μL og 0,1256 U/μL (ett for hver fordøyelsestilstand). Med passende tidsintervaller (10-20 s), tilsett 1 μL MNase-oppløsning til en av de fire prøvene, virvel, og inkuber på en termomixer ved 37 ° C i 10 minutter (800 rpm risting). Fortsett med å tilsette 1 μL fra de resterende MNasefortynningene til de gjenværende cellealikotene.
  5. Stopp Mnase-fordøyelsen ved å tilsette 200 μL nytilberedt STOP-buffer (150 μL på 10 mM Tris, pH 7,4, 25 μL med 10 % SDS, 25 μL 20 mg/ml proteinase K, 2 μL 0,5 M EGTA) til hvert rør i samme rekkefølge og med samme tidsintervall som MNase ble tilsatt. Inkuber ved 65 °C i 2 timer.
  6. Tilsett 500 μL fenol-kloroform-isoamylalkohol (PCI) til hver prøve, og bland grundig ved vortexing. Sentrifuge ved 19 800 x g i 5 min ved RT for å skille fasene, og overføre vannfasen til nye rør (ca. 200 μL/prøve).
    FORSIKTIG: PCI inneholder mange giftige komponenter og skal bare håndteres i en kjemisk sikkerhetshette. Ta kontakt med produsenten for mer informasjon.
  7. Rens DNA-et ved hjelp av et kommersielt DNA-rensesett (se materialtabellen) i henhold til produsentens instruksjoner og eluer prøvene i 12 μL elueringsbuffer.
    MERK: SDS-konsentrasjonen fra deproteiniseringstrinnet (trinn 2.5) er hemmende for noen DNA-rensingssett. DNA-rensesettet som brukes her fungerer sammenlignbart med etanolutfelling.
  8. Tilsett 2-5 μL lastfargestoff, og kjør prøvene på en 1,5% agarosegel ved 120 V i 30-50 minutter (til den er ordentlig separert; Figur 1A).
  9. Velg den beste graden av fordøyelse for forsøket, og fortsett med den forberedende MNase-fordøyelsen. En optimal fordøyelsesgrad viser lite eller ingen subnukleosomale fragmenter og et 70% -90% mono- til di-nukleosomforhold.
    MERK: I dette eksperimentet ble fordøyelsesgraden av Lane 4 i figur 1A bestemt til å være den optimale fordøyelsen oppnådd med 0,625-1,25 U Mnase for 2,5 x 10 5 celler (= 2,5-5 U Mnase for 1 x 106 celler). For en detaljert diskusjon, se de representative resultatene.

3. Forberedende MNase fordøyelse

  1. For å fragmentere kromatin til mononukleosomene via MNase-fordøyelse, tine tidligere dobbelt tverrbundet 5 x 10 6-cellealikoter og resuspendere i 1 ml DPBS. Inkuber på is i 20 min (tilsett 1x BSA hvis cellene fester seg til rørveggen).
  2. Samle cellene ved sentrifugering ved 10.000 x g i 5 minutter ved RT, og kast supernatanten. Resuspender pelleten i 500 μL MB # 1 buffer. Gjenta sentrifugeringstrinnet én gang. Resuspender pelleten i 1 ml MB # 1 buffer, og lag 200 μL alikoter (1 x 106 celler per alikot).
  3. Basert på MNase-titrering (beskrevet i trinn 2), fordøy kromatinet ved å tilsette riktig mengde MNase (vanligvis 2,5-10 E/μL per 1 x 106 celler) til hver alikot. Bland godt (virvel og sentrifugerer raskt), og rug på en thermomixer ved 37 °C i 10 minutter med risting på 800 o/min.
  4. Stopp MNase-fordøyelsen ved å tilsette 1,6 μL 0,5 M EGTA (siste 4 mM) til hver alikot, og inkuber på en thermomixer ved 65 °C i 10 minutter med 800 o / min risting.
  5. Samle prøven ved sentrifugering ved 10 000 x g i 5 minutter ved RT, og kast supernatanten. Resuspender cellepelleten i 500 μL 1x NEBuffer 2.1.
  6. Bassengprøver tilsvarende en inngang på 5 x 106 celler eller mindre for videre behandling.
    MERK: Hvis mer enn 5 x 10 6 celler skal behandles, behandle disse prøvene parallelt, da de enzymatiske forholdene er optimalisert for 5 x 106 celler.
  7. Før du går videre til nærhetsligeringstrinnene, overfør 10% av prøven som en inngangskontroll for å kontrollere MNase-fordøyelsesnivået. Tilsett 150 μL 10 mM Tris, pH 7,4, 25 μL 10% SDS og 25 μL 20 mg/ml proteinase K til denne prøven, og inkuber over natten ved 65 °C.

4. DNA-sluttbehandling og nærhetsligering

  1. Samle den gjenværende prøven ved sentrifugering ved 10 000 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kast supernatanten. Oppløs pelleten i 90 μL nylaget Micro-C master mix 1 (tabell 1), og inkuber på en thermomixer i 15 minutter ved 37 °C med risting ved 800 o/min.
  2. Tilsett 10 μL 5 U/μL Klenow Fragment, og inkuber på en thermomixer i 15 minutter ved 37 °C med risting ved 800 o/min.
  3. Tilsett 100 mikroliter nylaget Micro-C master mix 2 (tabell 2), og rug på en thermomixer i 45 minutter ved 25 °C med risting ved 800 o/min. Etter inkubering, slukk den enzymatiske reaksjonen ved å tilsette EDTA til en endelig konsentrasjon på 30 mM. Inkuber på en thermomixer i 20 minutter ved 65 °C med risting ved 800 o/min.
  4. Samle prøven ved sentrifugering ved 10 000 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kast supernatanten. Resuspender prøven i 500 μL nytilberedt Micro-C master mix 3 (tabell 3), og inkuber i 2,5 timer ved RT med rotasjon (15-20 rpm).
  5. Samle prøven ved sentrifugering ved 10 000 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kast supernatanten. Prøven resuspenderes i 200 mikrol nylaget Micro-C master mix 4 (tabell 4), og inkuber på en thermomixer i 15 minutter ved 37 °C med risting ved 800 o/min.
  6. For omvendt tverrbinding og deproteinering, tilsett 25 μL 20 mg/ml proteinase K og 25 μL 10 % SDS til prøven, og inkuber ved 65 °C over natten med intermitterende blanding.

5. Di-nukleosomal DNA-rensing og størrelsesvalg

  1. Tilsett 500 μL PCI til prøvene og inngangskontrollen, og bland ved vortexing. Separer fasene ved sentrifugering ved 19 800 x g i 5 minutter, og overfør den øvre vandige fasen til et nytt rør.
  2. Konsentrer DNA enten ved hjelp av et DNA-rensingssett eller ved etanolutfelling. Elluer prøvene i 30 μL (trinn 5.3) og inngangskontrollene (trinn 3.11) i 15 μL, og kjør en 1,5 % agarosegel for å skille mononukleosomene og di-nukleosomene (figur 1B).
    MERK: SDS-konsentrasjonen fra deproteiniseringstrinnet er hemmende for noen DNA-rensingssett. DNA-rensesettet som brukes her (se materialtabell) fungerer sammenlignbart med etanolutfelling. Avhengig av antall celler som brukes, kan inngangen variere fra 100 ng til 10 μg. Vanligvis ekstraheres 1-5 μg DNA fra 5 x 106 celler.
  3. Excise DNA-fragmentene som har en di-nukleosomal størrelse (ca. 300 bp). Bruk et kommersielt tilgjengelig DNA-gelelueringssett (se materialtabell) for å trekke ut DNA fra agarosegelen, og eluere i 150 μL.

6. Fremstilling av streptapavidinperlene

  1. Overfør 10 μL streptapavidinperler (se materialfortegnelse) per prøve til et reaksjonsrør.
  2. Plasser den i en passende magnet for 1,5 ml rør (se Materialfortegnelse). Etter at oppløsningen er klar (1-2 min), fjern supernatanten og resuspender kulene i 300 μL 1x TBW (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween 20) per prøve. Gjenta dette trinnet én gang.
  3. Resuspender kulene i 150 μL 2x B &W buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) per prøve behandlet i trinn 7.

7. Streptavidin nedtrekk og forberedelse av perlebibliotek

  1. Tilsett 150 μL ferdigpreparerte perler (trinn 6.3) til 150 μL av prøven (trinn 5.3). Inkuber i 20 min ved RT med rotasjon (15-20 o / min).
  2. Plasser rørene i en egnet magnet, og vent til oppløsningen klarner (1-2 min). Fjern supernatanten og resuspender perlene i 300 μL på 1x TBW. Gjenta dette trinnet.
  3. Plasser slangene i en egnet magnet og vent til oppløsningen er klar (1-2 min). Fjern supernatanten og resuspender kulene i 100 μL 0,1x TE (1 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0).
  4. Plasser slangene i en egnet magnet og vent til oppløsningen er klar (1-2 min). Fjern supernatanten, resuspender perlene i 50 μL 0,1x TE, og overfør dem til PCR-rør.
    MERK: Volumet på 0,1x TE som brukes (50 μL) tilsvarer inngangsvolumet til DNA-sekvenseringsbibliotekets forberedelsessett (se materialfortegnelse) som brukes i denne protokollen. Hvis et annet sett eller en annen strategi brukes, justerer du volumet tilsvarende.
  5. Utfør DNA-manipulasjonstrinnene i sekvenseringsbibliotekets forberedelsessett i henhold til produsentens protokoll. Disse trinnene inkluderer vanligvis DNA-stumping, A-tailing, adapterligering og U-excision. Det siste trinnet (U-eksisjon) er spesifikt for settet som ble brukt i denne studien. Hvis du bruker det settet, følg produsentens instruksjoner fra trinn 1 til trinn 2.6 i settprotokollen ved bruk av ikke-fortynnede adaptere, og ikke vurder -20 °C lagring etter trinn 2.6.
    MERK: Bufferendringene som kreves av sekvenseringssettene må byttes ut ved binding av perlene til en magnet og vasker (trinn 7.3 til 7.4), da DNA fortsatt er bundet til streptavidinperlene. I tillegg, fordi DNA er bundet til magnetkulene, ignorerer du eventuelle rense- og størrelsesvalgstrinn etter adapterligering fra settprotokollen. Gå videre til trinn 7.6 (denne protokollen).
  6. Etter at adapterligering er fullført, vask prøven som beskrevet i trinn 7.2. Kast supernatanten og heng opp kulene i 20 μL 0,1x TE.

8. Estimering av nødvendige PCR-sykluser

MERK: Det anbefales å estimere de nødvendige PCR-syklusene for bibliotekforsterkning. Vanligvis krever et Micro-C-bibliotek 8-15 sykluser med PCR. Selv om trinnet ikke er avgjørende, bidrar det til å unngå overforsterkning og reduserer risikoen for PCR-duplikater.

  1. For å definere minimum antall PCR-sykluser som kreves, utfør PCR med 1 μL streptapavidin-biotin-DNA-prøve (trinn 7.6). For å gjøre dette, legg til PCR-masterblanding (3,2 μLH2O, 0,4 μL i5-primer, 0,4 μL i7-primer og 5 μL Q5 høy-fidelity DNA-polymerase) til prøven. Utfør PCR med 16 sykluser i henhold til produsentens instruksjoner for DNA-bibliotekets forberedelsessett som brukes.
    MERK: Primerne som brukes her, kjøpes i et separat sett (se Materialfortegnelse) som må være kompatible med bibliotekforberedelsessettet som brukes.
  2. Etter PCR, samle perlene med en passende magnet, og måle DNA-konsentrasjonen på 1 μL av supernatanten ved hjelp av et høysensitivt DNA-kvantifiseringsinstrument (se materialtabell). For å oppnå den totale DNA-konsentrasjonen, multipliser denne verdien med 10 (totalt volum av PCR-reaksjonen). Beregn det nødvendige antall PCR-sykluser som diskutert i de representative resultatene.
  3. Tilsett 2 μL 6x lastbuffer til de resterende 9 μL PCR-blanding. Løs PCR-forsterket bibliotek på en 1% agarosegel for å bestemme vellykket adapterligering, noe som resulterer i ca. 450 bp-størrelse (figur 1C).
    MERK: Gelen skal vise et distinkt bånd på ca. 420 bp (Micro-C-bibliotek pluss adaptere). Bånd på 120 bp representerer adapterdimerer og er en indikasjon på biblioteker med lav kompleksitet. Bånd med lavere molekylvekt kan forekomme (mindre enn 100 bp), og disse er ubrukte primere fra PCR-reaksjonen.

9. Forsterkning av sekvensert bibliotek

  1. Legg til PCR-masterblanding (65 μLH2O, 100 μL Q5 høy-fidelity DNA-polymerase, 8 μL i5-primer, 8 μL i7-primer) til de resterende 19 μL av streptapavidin-biotin-DNA-prøven. Del reaksjonsblandingen i 50-100 μL alikoter.
    NOTAT: Det optimale volumet for PCR avhenger av PCR-maskinen; Vanligvis tilbyr 50 μL den mest reproduserbare forsterkningen i vanlige PCR-maskiner.
  2. Utfør PCR i henhold til produsentens instruksjoner for DNA-bibliotekets forberedelsessett med antall sykluser bestemt i trinn 8. Hvis trinn 8 ble utelatt, anbefales 14 sykluser for PCR.
  3. Rens DNA med paramagnetiske perler (se materialtabellen) i forholdet 1:0,9 i henhold til produsentens protokoll. Elute i 20 μL på 0,1% TE.
    MERK: Hvis adapterdimerer oppdages i trinn 8.5, må du utføre rensing to ganger med samme forhold.
  4. Bestem DNA-konsentrasjonen og kjør prøvene på et kvalitetskontrollsystem (se Materialfortegnelse). Sikre god kvalitet på Micro-C-biblioteket ved tilstedeværelsen av et enkelt presist bånd (figur 1D).
    MERK: Adapterdimerer er uvanlige i preparater på perlebibliotek på grunn av prøvevask før PCR. Dermed indikerer utseendet til adapterdimerer lav bibliotekskompleksitet. Hvis adapterdimerer observeres, anbefales det sterkt å kvalitetskontrollere prøven med lav inngangssekvensering.

10. DNA-sekvensering og databehandling

  1. Sekvenser Micro-C-biblioteket med paret sekvensering i henhold til sekvenseringsleverandørens krav.
    MERK: Ideelt sett sekvenseres prøvene på en plattform i paret sluttmodus med 50 bp per lest. Eldre plattformer som tilbyr kortere leselengder, for eksempel 2 x 35 bp, har også blitt brukt med hell. Det er viktig at hvis repeterende genomiske regioner studeres, kan det være tilrådelig å sekvensere med lengre leselengde.
  2. For å vurdere kvaliteten på Micro-C-biblioteket, utfør lav inngangssekvensering med 5 x 106 til 1 x 107 leser per prøve.
  3. Behandle sekvenseringsfilene (fastq-filer) med Distiller10. Kartlegg avlesningene mot det aktuelle referansegenomet, her mm10.
    MERK: Sekvenseringsfilene kan behandles ved hjelp av forskjellige rørledninger på lokale datamaskiner eller dataklynger. For prøver med lav sekvenseringsdybde kan større intervallstørrelser, for eksempel 10 000 bp, 50 000 bp, 100 000 bp og 500 000 bp, redusere databehandlingskrav og filstørrelser. Distiller (brukt i denne studien) genererer alle nødvendige filtyper for å vurdere kvaliteten på Micro-C-biblioteket. Den genererte *.stats-filen inneholder informasjonen om karthastigheten, cis-trans-forhold og leseretning stratifisert etter avstanden mellom leseparene. Disse parametrene er visualisert i figur 2, og vurderingen av Micro-C-bibliotekets kvalitet er diskutert i de representative resultatene. Behandlingsprogramvaren genererer også mcool-filer som kan lastes direkte inn i HiGlass (https://docs.higlass.io/) for å generere interaksjonsmatriser9.

Representative Results

Den vellykkede utarbeidelsen av Micro-C-biblioteker kan evalueres i flere trinn i protokollen. Det viktigste trinnet er valget av en riktig MNase fordøyelse grad. Derfor må MNase-konsentrasjonen titreres for konsekvent å gi 70% -90% mononukleosomer over di-nukleosomer for hver prøve. Det er viktig å merke seg at kromatinfordøyelsen er forskjellig for EU- og heterokromatin, med MNase som fordøyer heterokromatin mindre effektivt. Dermed avhenger den optimale fordøyelsesgraden av kromatinområdet av interesse og celletypen som studeres, siden den relative andelen av EU- og heterokromatin er celletypespesifikk. Derfor anbefales det å nøye titrere MNase-konsentrasjonen som kreves og først evaluere Micro-C-eksperimentets suksess ved lavinngangssekvensering.

Et typisk MNase-titreringsmønster av kromatin behandlet med avtagende mengder MNase er vist i figur 1A. Her fordøyes kromatin fra 250 000 celler per reaksjon med en fire ganger fortynning av MNase. Den høyeste konsentrasjonen (10 U MNase, Lane 2) viser overfordøyd kromatin som nesten utelukkende består av mononukleosomalt DNA (~150 bp). Spesielt går senteret av mono-nukleosomalt bånd lavere i agarosegelen sammenlignet med de tilsvarende båndene i prøvene med reduserte MNase-konsentrasjoner, noe som indikerer en overfordøyelse av nukleosomalt DNA. Overfordøyde nukleosomer er ineffektivt ligert i nærhetsligeringsreaksjonen; derfor er prøven i Lane 2 suboptimal for Micro-C-eksperimenter. Lane 3 (2.5 U av MNase) viser en nesten passende fordøyelsesgrad for Micro-C-eksperimenter. Her er mono-nukleosomalbåndet den dominerende arten, og det subnukleosomale smøret, som indikerer overfordøyde nukleosomer, reduseres; Den er imidlertid fortsatt til stede. Fordøyelsesgraden i Lane 4 (0,635 U MNase) er en ideell tilstand for et Micro-C-eksperiment i dette titreringseksemplet. Et klart mononukleosomalt bånd uten subnukleosomalt DNA er tilstede. Båndintensiteten for mono- og di-nukleosom-DNA er nesten lik, noe som indikerer et mononukleosomutbytte på 66% eller høyere. Det er verdt å merke seg at di-nukleosomalt DNA er omtrent dobbelt så stort som mono-nukleosomalt DNA (~ 320 bp vs ~ 150 bp), slik at båndintensiteten per mol DNA er dobbelt så høy sammenlignet med dens mono-nukleosomale motstykke. Fordøyelsesgraden i Lane 5 (0,156 U MNase) viser underfordøyd kromatin med nesten ingen nukleosomalt DNA, og dette representerer derfor en suboptimal prøve.

Avslutningsvis, i dette eksemplet, gir fordøyelsen av 2,5 x 10 5 mus ES-celler med 0,625 U MNase (tilsvarende2,5 U MNase for 1 x 106 celler i 200 μL) det mest lovende utgangspunktet for preparative fordøyelser i Micro-C-eksperimenter. Imidlertid bør en mellomliggende MNase-konsentrasjon mellom forholdene som brukes for prøvene i bane 3 og bane 4 (tilsvarende 5 U MNase for 1 x 106 celler i 200 μL) også vurderes. Det er viktig at kromatinfordøyelsen med MNase ikke kan skaleres lineært, og det anbefales ikke å oppskalere den forberedende fordøyelsen mer enn 4x. For å forberede Micro-C-biblioteker fra mer enn 1 x 10 6 celler, anbefales det å fordøye kromatinet i alikoter på 1 x 106 celler og basseng dem etter MNase-inaktivering.

For å vurdere suksessen til nærhetsligeringsprotokollen, bør inngangskontrollen, som er MNase-fordøyd og ikke nærhetsligert (trinn 3.8), sammenlignes med nærhetsligert prøve (trinn 5.3) med 1.5% agarosegelelektroforese (figur 1B). Det nærhetsligerte mononukleosombåndet har en omtrentlig størrelse på 300 bp, lik den for di-nukleosomer. Derfor bør signalforholdet mono- til di-nukleosombånd skifte fra overveiende mononukleosomer (Lane 1) mot di-nukleosomer (Lane 3 og Lane 4). Siden agarosegelen i dette trinnet er det di-nukleosomale DNA som blir skåret ut og renset, anbefales det å dele prøvene i flere baner for å unngå overbelastning.

Det anbefales å vurdere kvaliteten og kvantiteten til det forberedte sekvenseringsbiblioteket ved minimal PCR. Her amplifiseres DNA fra 1 μL perler (1/20 av den totale prøven) i 16 sykluser i 10 μL PCR-reaksjon. Den totale konsentrasjonen av det minimale PCR-biblioteket varierer vanligvis fra 50-500 ng etter 16 PCR-sykluser. I teorien tilsvarer dette et 1-10 μg bibliotek fra den resterende 19 μL-prøven hvis den også ble forsterket i 16 sykluser. Det anbefales å bruke det minste antall PCR-sykluser som trengs for å generere et bibliotek på ca. 100 ng fra det totale DNA. Forutsatt logaritmisk amplifisering i PCR, kan den teoretiske konsentrasjonen av DNA oppnådd fra 19 μL-inngangen ved 16 sykluser deles suksessivt med to for å beregne antall PCR-sykluser som kreves for å generere et 100 ng-bibliotek. For eksempel tilsvarer et utbytte på 100 ng fra 1 μL etter 16 sykluser et utbytte på 1,900 ng forsterket fra 19 μL. I dette scenariet bør 12 sykluser ideelt sett generere et 118 ng-sekvenseringsbibliotek fra det totale DNA (1,900 ng / [2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). Den resterende 9 μL-prøven fra minimal PCR kan da brukes til å vurdere kvaliteten på biblioteket ved agarosegelelektroforese (figur 1C). Visualisering skal vise ett distinkt bånd ved 420 bp og ingen bånd for adapterdimerer (120 bp). Mindre fragmenter kan også forekomme, og disse tilsvarer ubrukte PCR-primere.

Deretter anbefales det å analysere og bekrefte vellykket Micro-C-prøvepreparering ved lavinngangssekvensering før du forplikter deg til ressurskrevende dypsekvensering. Vanligvis sekvenseres biblioteker til en lesedybde på 5 x 106 til 1 x 107 og evalueres basert på følgende kriterier: sekvenseringslesedupliseringshastigheten, cis- versus transkromosomal interaksjonshastighet og sekvenseringsfrekvensen for leseorientering. Micro-C-bibliotekene behandles med Distiller, en fullservice-pipeline som behandler dataene fra sekvensering av lesefiler (Fastq-format) til leseparfiler (Bedpe-format) og skalerbare interaksjonsmatriser (Cool- og Mcool-formater) ved hjelp av kjøler, parverktøy og cooltools10,11,12. Rørledningen genererer også en sammendragsfil som er ideell for å vurdere kvaliteten på Micro-C-bibliotekene10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). PCR-dupliseringshastigheten gir informasjon om sekvenseringsbibliotekets kompleksitet og kan trekkes ut fra *.stats-filen som genereres. Mikro-C-biblioteker av høy kvalitet har mindre enn 5% -10% PCR-dupliseringsrater når de genereres fra 5 millioner eller flere celler. Spesielt genererer noen sekvenseringsplattformer PCR-duplikater under klyngedannelse uavhengig av sekvenseringsbibliotekets kompleksitet. Figur 2A viser de relative dupliseringsratene for to eksperimenter: en som vi anser som et godt utvalg og en dårlig prøve. I dette eksemplet viste begge eksemplene akseptable kartfrekvenser. De neste kriteriene for å vurdere kvaliteten på Micro-C-biblioteker er cis versus trans-forholdet og leseorienteringsfrekvenser. Innenfor kjernen bor kromosomer i individuelle kromosomområder og interagerer dermed sjelden med andre kromosomer. En høy grad av oppdagede transkromosomale interaksjoner indikerer en høy grad av tilfeldige ligeringer. Det skal bemerkes at på dette analysenivået viste den dårlige prøven en høy grad av transkromosomale interaksjoner sammenlignet med den gode prøven (figur 2B). For Micro-C er en 70% eller høyere cis-kromosomal interaksjonsrate ønskelig.

Et Micro-C-bibliotek har en fragmentstørrelse som ligner på di-nukleosomalt DNA-båndet, som kan rense sammen med nærhetsligert prøve og forurense eksperimentet. Disse forurensningene er alltid cis-kromosomale interaksjoner. Derfor er det viktig å også evaluere leseorienteringshastighetene. Graden av di-nukleosomal forurensning kan estimeres ved lavinngangssekvensering. Di-nukleosomalt DNA stammer fra to nærliggende nukleosomer som ikke har blitt spaltet av MNase. Dermed vil de resulterende sekvenseringsavlesningene alltid vise en fremover-omvendt leseretning (F og R), og avstanden mellom leseparene vil være rundt 320 bp. Nærhetsligerte fragmenter kan til sammenligning ligeres i fire retninger, noe som gir lesepar med F-R, R-R, R-F og F-F, ideelt sett med lik overflod (figur 2C). I tillegg viser de ulike avstander mellom de to leseparene. For å estimere mengden di-nukleosomale kontaminater, kan frekvensen av leseretninger beregnes fra *statistikkfilene generert av destillatør (figur 2D). Spesielt i dette arbeidet var brøkdelen av F-R-avlesninger (rød) høyere i det dårlige utvalget sammenlignet med det gode utvalget, og dette ble tydeligere når leseretningene ble stratifisert etter avstand (figur 2E). F-R-fraksjonen domineres av di-nukleosomale fragmenter sammenlignet med Micro-C-biblioteker når leseparene stratifiseres i avlesninger med avstander <562 bp eller ≥562 bp. Her domineres brøkdelen av avlesninger med avstand <562 bp av F-R-avlesninger, mens brøken med avstander ≥562 bp viser en jevn fordeling mellom de fire mulige retningene, noe som indikerer at den globale overrepresentasjonen av F-R-avlesninger stammer fra di-nukleosomale forurensninger. Valget av 562 bp som terskel for delinndeling er definert av binning i * stats fil generert. Selv om det ikke er nødvendig for denne kvalitetskontrollen, kan mer definert delinnstilling oppnås ved å trekke ut avstandene fra *par-filen, som også genereres av destillatør. Det er viktig å merke seg at di-nukleosomale avlesninger ikke reduserer kvaliteten på Micro-C-prøven, da de kan identifiseres og ignoreres under databehandling. Imidlertid inneholder de ikke verdifull informasjon om 3D-interaksjoner, og de fortynner de informative lesningene.

Dermed er nøye MNase-titrering og grundig kvalitetskontroll med lavinngangssekvensering de beste verktøyene for å optimalisere kvaliteten på Micro-C-eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: Mellomstadier av Micro-C-protokollen . (A) Agarosegelelektroforese av kromatin fra 2,5 x 105 mus ES-celler fordøyd med varierende MNase-konsentrasjoner. Mono-, di- og tri-nukleosomale bånd er indikert med piler. M: DNA-stige (Lane 1/6); 10 U MNase per 250 000 celler (Lane 2); 2,5 U MNase per 250 000 celler (Lane 3); 0,625 U MNase per 250 000 celler (Lane 4); 0,156 U MNase per 250 000 celler (Lane 2). (B) 1,0% agarosegelelektroforese av Micro-C-preparerte prøver (Lane 3 og Lane 4) og MNase fordøyd inngangskontroll (Lane 1). Lane 1 og Lane 2 (M: DNA-stige) er forbedret for å understreke den relative endringen i mono- til di-nukleosomal fragmentintensitet. De mono- og di-nukleosomale båndene er indikert med piler. Di-nukleosomalbåndet i nærhetsligert prøve kombinerer di-nukleosomalt og Micro-C-bibliotek-DNA. (C) 1,0% agarosegelelektroforese av Micro-C-sekvenseringsbibliotekene forsterket fra 1 μL-prøve for å evaluere kvaliteten. Lane 1 (M): DNA-stige; Lane 2 (S): Mirco-C bibliotek. (D) Fragmentanalysatorspor av det endelige Micro-C-biblioteket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksempelstatistikk for sekvensering med lav inngang av et godt utvalg og et dårlig utvalg . (A) Søylediagram over prosentandelen kartlagt (grønn) og ikke-kartlagt (rød) leser. (B) Normalisert brøkdel av lesninger som kartlegger cis og transkromosomale interaksjoner. Datasettene ble normalisert til cis-kartleggingen lest. CIS-kartleggingsavlesningene ble stratifisert etter avstanden mellom første og andre avlesning av de sammenkoblede sekvenserte prøvene: ≤1 kbp (gul), >1 kbp og ≤10 kbp (oransje) og >10 kbp (rød). (C) Skjematisk fremstilling av potensielle molekylære arter med di-nukleosomale størrelser. (D) Prosentandeler av leseparorienteringer av alle lesningene av det gode utvalget og det dårlige utvalget. (E) Samme som panel (D), men stratifisert etter avstander (venstre, <562 bp og høyre, ≥562 bp). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Komponenter 1x 4,4 ganger
10x NEBuffer 2.1, 10 μL 44 μL
2 μL 100 mM ATP 2 μL 8,8 μL
100 mM DTT 5 μL 22 μL
H2O 68 μL 299,2 μL
10 U/μL T4 PNK 5 μL 22 μL
Total 90 μL 396 μL

Tabell 1: Micro-C master mix 1. Sammensetning av masterblandingen for slutttyggereaksjonen.

Komponenter 1x 4,4 ganger
1 mM biotin-dATP 10 μL 44 μL
1 mM Biotin-dCTP 10 μL 44 μL
10 mM blanding av dTTP og dGTP 1 μL 4,4 μL
10x T4 DNA ligase buffer 5 μL 22 μL
200x BSA 0,25 μL 1,1 μL
H2O 23,75 μL 104,5 μL

Tabell 2: Micro-C master mix 2. Sammensetning av masterblandingen for sluttmerkingsreaksjonen.

Komponenter 1x 4,4 ganger
10x NEB T4 Ligase reaksjonsbuffer 50 μL 220 μL
H2O 422,5 μL 1859 μL
T4 DNA-ligase 25 μL 110μL

Tabell 3: Micro-C master mix 3. Sammensetning av masterblandingen for nærhetsligeringsreaksjonen.

Komponenter 1x 4,4 ganger
10x NEBuffer 1.1 20 μL 88 μL
H2O 180 μL 792 μL
ExoIII nuklease 10 μL 44 μL

Tabell 4: Micro-C master mix 4. Sammensetning av masterblandingen for biotinfjerningsreaksjonen.

Discussion

Suksessen til et Micro-C-eksperiment avhenger av noen kritiske trinn i protokollen som må utføres nøye. For det første kan kryssbinding med den ekstra kryssbinderen DSG eller EGS føre til aggregering av celler, avhengig av celletype. Tilsetning av 0,1% -0,5% BSA til tverrbindingsreaksjonen reduserer aggregeringen betydelig uten å påvirke tverrbindingseffektiviteten. Ineffektiv tverrbinding kan resultere i økte frekvenser av transkromosomale interaksjoner som indikerer tilfeldige ligeringer. Det andre, men mest avgjørende, trinnet i denne protokollen er fordøyelsen av kromatin med MNase. Suboptimal kromatinfordøyelse fører til ineffektiv nærhetsligering (overfordøyelse) eller økte frekvenser av ikke-nærhetsligerte di-nukleosomer (underfordøyelse). Effektiviteten av ligeringsreaksjonen kan evalueres ved agarosegelelektroforese (figur 1B) og estimeres i tillegg best ved lavinngangssekvensering. Hvis lavinngangssekvenseringen avslører enten en høy dupliseringshastighet (ineffektiv ligering) eller økte di-nukleosomhastigheter, bør MNase-fordøyelsesgraden evalueres på nytt. Spesielt kan tap av prøve ved kjøring av protokollen føre til redusert bibliotekkompleksitet. Konsentrasjonen av en prøve evalueres best etter DNA-rensing (trinn 5.3) eller ved minimal PCR (trinn 8). Det totale utbyttet av DNA fra 5 x 106 pattedyrceller etter DNA-rensing er typisk >2 μg. DNA-konsentrasjonen bør kontrolleres etter MNase-fordøyelsen, ExoIII-fordøyelsen og DNA-rensing. Endogene nukleaser, hvis overflod er celletypespesifikke og artsspesifikke, kan være en kilde til DNA-nedbrytning. I tillegg kan kolonnebasert DNA-rensing føre til prøvetap på grunn av inkompatibilitet med SDS fra deproteineringsreaksjoner. Etanolutfelling kan vurderes hvis DNA-konsentrasjonen er lav på dette trinnet.

Siden Micro-C krever prøvespesifikk MNase-titrering, er det utfordrende å anvende Micro-C på små cellepopulasjoner, for eksempel med små organer fra forskjellige modellorganismer, embryoer og enkeltceller, organoider eller pasientbiopsier. Her tilbyr Hi-C 3.0 et veletablert alternativ ved hjelp av en endepunktsreaksjon ved sekvensspesifikke restriksjonsendonukleaser 8,9.

Micro-C er en allment anvendelig kromosomkonformasjonsteknologi med høy oppløsning med høyt dynamisk område og lavt signal-støy-forhold, noe som gjør den spesielt egnet for å undersøke kortdistansekromosomfunksjoner 4,5,8, for eksempel kromosomløkker. Oppløsningen til Micro-C gjør det mulig å fange promotorforsterkersløyfer, som er utenfor deteksjonsgrensen for Hi-C, noe som effektivt muliggjør en mer detaljert analyse av forholdet mellom genomorganisasjon og regulering13,14,15. Videre har DNA-fangststrategier nylig blitt kombinert med Micro-C for å øke den locus-spesifikke oppløsningen av de målrettede genomiske stedene til enestående nivåer, og avslører ny innsikt i ultrastrukturen til 3D-genomet16,17,18. Oppsummert ser vi for oss at Micro-C og dets derivater vil være en nøkkelteknologi for å dissekere rollen til 3D-genomet i transkripsjonsregulering og følgelig celletypedifferensiering og vedlikehold.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Christl Gaubitz og Kathleen Stewart-Morgan for deres kritiske lesning av manuskriptet. Vi takker Anja Groth og Groth-laben for deres støtte i etableringen av laboratoriet vårt. Vi takker de ansatte ved CPR/reNEW Genomics Platform for støtte: H. Wollmann, M. Michaut og A. Kalvisa. Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW) støttes av Novo Nordisk Foundations stipendnummer NNF21CC0073729. Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research (CPR) støttes av Novo Nordisk Foundations stipendnummer NNF14CC0001. Vi takker Brickman-laboratoriet ved Novo Nordisk Center for Stem Cell Medicine, reNEW Copenhagen, for musens ES-celler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mM Biotin dATP Jenna Bioscience  NU-835-Bio14-S
1 mM Biotin dCTP Jenna Bioscience NU-809-BioX-S
10 mM dGTP NEB N0442S
10 mM dTTP  NEB N0443S
10 U/ml T4 PNK NEB M0201L
100 U/L Exonuclease III NEB M0206L
10x NEBuffer 1.1 NEB B7001S
10x NEBuffer 2.1 NEB B7202S
10x T4 DNA Ligase buffer  NEB B0202A
1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ ThermoFisher  14190144
1x LIF
2_Mercaptoethanol 50 mM  Gibco 31350010 0.1 mM b-mercaptoethanol 
37% Formaldehyde  Sigma Aldrich 252549-500ML Caution. See manufactures MSDS
400 U/ml T4 DNA Ligase  NEB M0202L
5 U/ml Klenow Fragment NEB M0210L
Agarose BIO-RAD 1613102 Caution. See manufactures MSDS
BSA 20mg/ml NEB B9000S
CaCl2
cell counter
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D8418-100ML Caution. See manufactures MSDS
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65001
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes
DynaMag-PCR Magnet Invitrogen 492025 refered to as: magnet magnet for PCR tubes
EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 Invitrogen 15575-038
EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 BioWorld 40121266-1
Ethanol 96%  VWR Chemicals 20824365 quality control system 
Ethidium Bromide  Invitrogen 15585-011
Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) ThermoFisher 21565
Fetl Bovin Serum Sigma Aldrich F7524 15% FBS
Gel Loading dye purple (6X) NEB B7024S
Glycine  PanReac AppliChem A1067.0500
Halt Proteinase inhibitor (100x) ThermoFisher 78430 Caution. See manufactures MSDS
IGEPAL CA-630 (NP-40) Sigma Aldrich 18896-50ML
MgCl 1 M Invitrogen AM9530G
Micrococcal Nuclease (MNase) Worthington LS004798
mouse embryonic stem cells 
NaCl Sigma Aldrich S9888-1KG
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) NEB E7600S amplification primers for sequencing libraries
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina NEB E7645L sequencing library preparation kit 
NEBNext Ultra II Q5 Master mix  NEB M0544S Caution. See manufactures MSDS
Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050 1x NEAA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 1% Pen-Strep
Proteinase K (40 mg/ml) GoldBio P-480-1 Caution. See manufactures MSDS
QIAquick Gel extraction kit QIAgen 28706 refered to as: DNA gel elution kit 
QIAquick PCR purification kit QIAgen 28106 refered to as: commercial DNA purification kit 
Qubit dsDNA HS Assay kit Invitrogen Q32854 high sensitivity DNA quantification instrument 
Quick load purple 1kb plus DNA Ladder NEB N0550S
SPRIselect size selection beads Beckman Coulter B23319 paramagnetic beads 
ThermoMixer C Eppendorf  5382000015 refered to as: thermomixer
Tris Merck 10708976001
Trypsin
Tween20 Sigma Aldrich P7949-100ML
Ultrapure 10% SDS Invitrogen 15553-035
Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) Invitrogen 15593-031
Fragment Analyzer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  2. Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. Micro-C XL: Assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome. Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).
  3. Hsieh, T. -H. S., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
  4. Krietenstein, N., et al. Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
  5. Hsieh, T. -H. S., et al. Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding. Molecular Cell. 78 (3), 539-553 (2020).
  6. Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods. 123, 56-65 (2017).
  7. van Holde, K. E. Chromatin. , Springer. New York, NY. (1989).
  8. Oksuz, B. A. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18, 1046-1055 (2021).
  9. Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 3.0: Improved protocol for genome-wide chromosome conformation capture. Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).
  10. Goloborodko, A., Venev, S., Abdennur, N., Di Tommaso, P. Mirnylab/distiller-nf; v033. Zenodo. , (2019).
  11. Venev, S., et al. Open2c/cooltools: v0.4.1. Zenodo. , (2021).
  12. Abdennur, N., Mirny, L. A. Cooler: Scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays. Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2019).
  13. Zhang, S., Übelmesser, N., Barbieri, M., Papantonis, A. Enhancer-promoter contact formation requires RNAPII and antagonizes loop extrusion. BioRxiv. , (2022).
  14. Barshad, G., et al. RNA polymerase II and PARP1 shape enhancer-promoter contacts. BioRxiv. , (2022).
  15. Hansen, A. S., et al. Distinct classes of chromatin loops revealed by deletion of an RNA-binding region in CTCF. Molecular Cell. 76 (3), 395-411 (2019).
  16. Hua, P., et al. Defining genome architecture at base-pair resolution. Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).
  17. Downes, D. J. High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale. Nature Communications. 12, 531 (2021).
  18. Goel, V. Y., Huseyin, M. K., Hansen, A. S. Region capture Micro-C reveals coalescence of enhancers and promoters into nested microcompartments. BioRxiv. , (2022).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 201 kromosomkonformasjonsfangst Micro-C-XL MNase nærhetsligering genomarkitektur compartmentalization TADs kromosomløkker cis-regulatoriske elementer
Kartlegging av pattedyrs 3D-genominteraksjoner med Micro-C-XL
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Metelova, M., Jensen, R. R.,… More

Metelova, M., Jensen, R. R., Krietenstein, N. Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL. J. Vis. Exp. (201), e64579, doi:10.3791/64579 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter