Summary
Представлен протокол картирования трехмерной организации генома с нуклеосомным разрешением с использованием метода полногеномного захвата конформации хромосом Micro-C-XL.
Abstract
Трехмерная (3D) организация хромосом является основным фактором регуляции генома и спецификации типа клетки. Например, считается, что цис-регуляторные элементы, известные как энхансеры, регулируют активность дистальных промоторов посредством взаимодействия в трехмерном пространстве. Полногеномные технологии захвата конформации хромосом (3C), такие как Hi-C, изменили наше понимание того, как геномы организованы в клетках. Современное понимание трехмерной организации генома ограничено разрешением, с которым может быть решена топологическая организация хромосом в трехмерном пространстве. Micro-C-XL измеряет сворачивание хромосом с разрешением на уровне нуклеосомы, основной единицы хроматина, используя микрококковую нуклеазу (МНазу) для фрагментации геномов во время протокола захвата конформации хромосом. Это приводит к улучшению соотношения сигнал/шум в измерениях, что способствует лучшему обнаружению участков изоляции и хромосомных петель по сравнению с другими полногеномными 3D-технологиями. В данной статье представлен наглядно подтвержденный, подробный, пошаговый протокол подготовки высококачественных образцов Micro-C-XL из клеток млекопитающих.
Introduction
Micro-C-XL — это полногеномный метод измерения 3D-конформации генома с нуклеосомным разрешением. Micro-C-XL основан на широко используемой технологии Hi-C, основанной на бесконтактном лигировании, которая изменила нашепонимание того, как организованы 3D-геномы. Micro-C-XL и его первая итерация, Micro-C, были первоначально разработаны в Saccharomyces cerevisiae2,3, а затем адаптированы к клеточным системам млекопитающих, для которых протокол продемонстрировал весь свой потенциал в обнаружении ближних особенностей 3D-генома, таких как хромосомные петли и сайты изоляции. Эта версия основана на недавних публикациях Micro-C-XL у млекопитающих 4,5. Поскольку Micro-C-XL заменяет Micro-C, Micro-C-XL в дальнейшем упоминается в рукописи как Micro-C.
Основные различия между Micro-C и Hi-C6 заключаются в следующем: 1) фрагментация генома микрококковой нуклеазой (MNase) по сравнению с ферментами рестрикции и 2) дополнительные сшивающие агенты с большим расстоянием между атомами между реактивными группами по сравнению только с формальдегидом. Оба этапа вносят значительный вклад в улучшение соотношения сигнал/шум Micro-C по сравнению с обычным Hi-C. Размер фрагментации ограничивает разрешение, до которого может быть разрешена 3D-организация генома во время протокола бесконтактного лигирования. MNase — это нуклеозаза, которая преимущественно переваривает доступную ДНК и оставляет нуклеосомно-защищенную ДНК нетронутой. Нуклеосомный след с использованием MNase-секвенирования показал, что нуклеосомы полностью покрывают большинство эукариотических геномов7. Поскольку нуклеосомы распределены по всему геному со средним интервалом 160-220.н., в зависимости от вида и типа клеток, MNase является идеальным ферментом для картирования архитектуры генома с высоким разрешением.
Использование дополнительного сшивающего агента в сочетании с формальдегидом (ФА) в методе Micro-C дополнительно улучшает отношение сигнал/шум 2,8. Аминоспецифичные сшивающие агенты с более длинными атомными спейсерами между реакционноспособными группами облегчают белок-белковые сшивания. Обычно это дисукцинимидилглутарат (DSG) или бис-сукцинимидилсукцинат этиленгликоля (EGS) с разделками 7,7 Å и 16,1 Å соответственно. Снижение шума с помощью EGS или DSG особенно очевидно в экспериментах с высокой скоростью фрагментации, таких как Micro-C, и, по-видимому, происходит из-за снижения частоты случайных событий лигирования8.
Недавно разработанный протокол Hi-C 3.0, использующий кросслинкинг ESG/DSG и множественные комбинации ферментов рестрикции, снижает шум в экспериментах с Hi-C и значительно улучшает обнаружение хромосомных петель и участков изоляции 8,9. Тем не менее, пошаговое сравнение различных характеристик данных взаимодействия показало, что Micro-C обладает превосходным обнаружением ближних объектов, таких как хромосомные петли и сайты изоляции, по сравнению как с Hi-C 3.0, так и с обычным Hi-C8. Тем не менее, Hi-C 3.0 действительно улучшает обнаружение объектов на близком расстоянии и поддерживает сильное обнаружение компартментализации генома по сравнению с обычным Hi-C. Таким образом, выбор метода захвата конформации хромосом должен определяться объективным и биологическим вопросом.
Здесь мы приводим пошаговый протокол для успешных экспериментов на Micro-C, которые могут разгадать организацию 3D-генома.
Protocol
1. Клеточная культура и кросслинкинг
- Культура клеток в соответствии с экспериментальными потребностями должна получить минимум 1 х10 7 клеток. Здесь клетки выращивали при 37 °C с 5%СО2 в среде E14 (DMEM с пируватом и L-глутамином, 15% FBS, 1x LIF, 1x NEAA, 1% пен-стрептококк, 0,1 мМ β-меркаптоэтанола [см. таблицу материалов]) и пассажировали через день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был успешно применен к различным типам клеток различных видов, таких как Homo sapienss и Mus musculus. В данном примере использовались мышиные эмбриональные стволовые клетки (ЭС). - Собирайте клетки при слиянии 70%-80% путем аспирации среды. Промыть один раз 5 мл DPBS и инкубировать клетки с 3 мл предварительно подогретого 0,25% трипсина на 10-сантиметровую чашку в течение 2-3 мин при 37 °C.
- Погасите трипсин 7 мл предварительно подогретой среды Е14 и переложите отделенные клетки в пробирку объемом 50 мл.
- Гранулируют клетки центрифугированием при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Выбросьте надосадочную жидкость и повторно взвесьте клеточную гранулу в среде. Подсчитайте ячейки с помощью счетчика клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ Протокол устойчив к некоторым колебаниям концентраций клеток, и для количественной оценки количества клеток использовались различные счетчики клеток; Однако следует помнить о динамическом диапазоне используемого счетчика ячеек. Обычно это 1 x 105-1 x 107 клеток/мл. Несмотря на то, что скорость и продолжительность центрифугирования были протестированы для этого типа клеток, для других, меньших по размеру клеток может потребоваться более высокая скорость центрифугирования или более длительное время отжима, и центрифугирование должно быть соответствующим образом скорректировано. - Собирают клетки центрифугированием при 300 x g в течение 5 мин при RT и ресуспендируют клетки в DPBS при конечной концентрации 1 x 106 клеток/мл. Например, если выход составляет 1 x 107 клеток, повторно суспендируйте ячейки в 10 мл DPBS.
- Для первой стадии сшивания добавляют 37% формальдегида (ЖК) до конечной концентрации 1% к клеточной суспензии и инкубируют клеточную суспензию в течение 10 мин при RT с вращением (15-20 об/мин); Например, если выход составляет 1 x 107 клеток, добавьте 270 мкл ЖК к 10 мл клеточной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор FA обычно стабилен при RT в течение 3 месяцев после открытия. - Гасят реакцию, добавляя 2,5 М глицина до конечной концентрации 0,25 М и инкубируют в течение 5 мин при RT при вращении (15-20 об/мин). Например, если выход составляет 1 x 107 клеток, добавьте к клеточной суспензии 1,027 мл 2,5 М глицина.
- Собирают клетки центрифугированием при 300 x g в течение 5 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 5 мл DPBS. Повторите этап центрифугирования один раз и ресуспендируйте гранулированные клетки в DPBS до 4 x 106 клеток/мл. Например, если выход составляет 1 x 107 клеток, ресуспендируйте ячейки в 2,5 мл DPBS.
- Для второй стадии сшивания приготовьте 0,3 М исходный раствор бис-сукцинилсукцината этиленгликоля (ЭГС) в ДМСО (13,6 мг ЭГС в 100 мкл ДМСО). Добавляют EGS в конечной концентрации 3 мМ в клеточную суспензию и инкубируют при RT в течение 40 мин при вращении (15-20 об/мин). Например, если выход составляет 1 x 107 клеток, добавьте 25 мкл 0,3 М исходного раствора EGS к 2,5 мл клеточной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уравновешивайте EGS и RT в течение не менее 20 минут перед взвешиванием для приготовления исходного раствора. - Гасят реакцию, добавляя 2,5 М глицина до конечной концентрации 0,4 М, и инкубируют в течение 5 мин при РТ при вращении (15-20 об/мин). Например, если выход составляет 1 x 107 клеток, добавьте 400 мкл 2,5 М глицина к клеточной суспензии.
- Собирают клетки центрифугированием при 1000 x g в течение 5 мин при RT и ресуспендируют гранулированные клетки в DPBS до 5 x 106 клеток/мл. Распределите 5 x 10 6 клеток в пробирке для препаративных библиотек и 1 x 106 клеток в пробирке для титрования для расщепления MNase.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется титровать оптимальную степень разложения для каждой партии сшитых клеток. В идеале необходимо собрать две-три аликвоты 1 x 10 6 клеток для экспериментов по титрованию MNase (шаг 2) и две-четыре аликвоты 5 x 106 клеток для препаративных экспериментов (шаг 3). - Собирают клетки центрифугированием при 1000 x g в течение 5 мин при ЛТ и удаляют надосадочную жидкость. Мгновенно замораживайте гранулы клеток в жидком азоте и храните их при температуре −80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешные библиотеки Micro-C могут быть подготовлены из образцов, хранящихся до 3 месяцев.
2. Титрование MNазы
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение титрования MNase необходимо для определения оптимальной концентрации MNase перед обработкой препаративной библиотеки клеток с двойными сшитыми клетками.
- Чтобы выполнить титрование MNase, разморозьте одну гранулу 1 x 106 клеток на льду в течение 10 минут и повторно суспендируйте клетки в 500 мкл DPBS (добавьте 1x BSA, если клетки прилипают к стенке). Инкубируйте клеточную суспензию на льду в течение 20 мин.
- Собирают клетки центрифугированием при 10 000 x g в течение 5 мин при RT и удаляют надосадочную жидкость. Ресуспендировать гранулированные клетки в 500 мкл буфера MB#1 (50 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl, 5 мМ MgCl 2, 1 мМ CaCl 2,0,2% NP-40, 1x ингибитор протеазы [см. таблицу материалов], pH 7,4).
- Собирают клетки центрифугированием при 10 000 x g в течение 5 мин и удаляют надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 200 мкл буфера MB#1 и разделите образец на четыре пробирки.
- Разморозьте один флакон MNазы (20 Ед/мкл) и разбавьте 10 мМ Tris, pH 7,4, в сериях 1:2, 1:4, 1:4 и 1:4 до получения концентраций 10 U/мкл, 2,5 U/мкл, 0,625 U/мкл и 0,1256 U/мкл соответственно (по одному для каждого условия пищеварения). С соответствующими временными интервалами (10-20 с) добавляют 1 мкл раствора MNазы в один из четырех образцов, встряхивают и инкубируют на термомиксере при 37 °C в течение 10 мин (встряхивание 800 об/мин). Продолжайте добавлять 1 мкл из оставшихся разведений MNase к оставшимся клеточным аликвотам.
- Остановите разложение мназы, добавив 200 мкл свежеприготовленного буфера STOP (150 мкл 10 мМ Tris, pH 7,4, 25 мкл 10 % SDS, 25 мкл 20 мг/мл протеиназы K, 2 мкл 0,5 М EGTA) в каждую пробирку в том же порядке и с тем же интервалом времени, что и MNase. Инкубируют при 65 °C в течение 2 ч.
- Добавьте 500 мкл фенол-хлороформ-изоамилового спирта (PCI) в каждый образец и тщательно перемешайте методом вихря. Центрифугу при 19 800 x g в течение 5 мин при RT для разделения фаз и переноса водной фазы в новые пробирки (примерно 200 мкл/образец).
ВНИМАНИЕ: PCI содержит множество токсичных компонентов и должен обрабатываться только в химическом защитном колпаке. Для получения более подробной информации обратитесь к производителю. - Очистите ДНК с помощью коммерческого набора для очистки ДНК (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя и элюируйте образцы в 12 мкл элюирующего буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация SDS на этапе депротеинизации (шаг 2.5) является ингибирующей для некоторых наборов для очистки ДНК. Используемый здесь набор для очистки ДНК работает так же, как осаждение этанола. - Добавляют 2-5 мкл загрузочного красителя и запускают образцы на 1,5% агарозном геле при 120 В в течение 30-50 мин (до надлежащего разделения; Рисунок 1А).
- Выберите наилучшую степень расщепления для эксперимента и продолжайте препаративное разложение MNase. Оптимальная степень расщепления практически не характеризуется субнуклеосомными фрагментами и соотношением моно- и динуклеосом 70%-90%.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте степень разложения Lane 4 на рисунке 1A была определена как оптимальная степень разложения, полученная при 0,625-1,25 U Mnase для 2,5 x 10 5 клеток (= 2,5-5 U Mnase для 1 x 106 клеток). Подробное обсуждение см. в репрезентативных результатах.
3. Препаративное расщепление МНазы
- Чтобы фрагментировать хроматин до мононуклеосом путем расщепления MNase, предварительно разморозьте предварительно сшитые аликвоты 5 x 106 клеток и ресуспендируйте в 1 мл DPBS. Инкубируйте на льду в течение 20 минут (добавьте 1x BSA, если клетки прилипнут к стенке пробирки).
- Собирают клетки центрифугированием при 10 000 x g в течение 5 мин при RT и выбрасывают надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу в 500 мкл буфера MB#1. Повторите этап центрифугирования один раз. Ресуспендируйте гранулу в 1 мл буфера MB#1 и получите 200 мкл аликвот (1 x 106 клеток на аликвоту).
- Основываясь на титровании MNase (описанном на шаге 2), расщепляют хроматин, добавляя соответствующее количество MNase (обычно 2,5-10 U/мкл на 1 x 106 клеток) к каждой аликвоте. Хорошо перемешайте (быстро перемешайте и отжмите) и инкубируйте на термомиксере при температуре 37 °C в течение 10 минут при встряхивании 800 об/мин.
- Остановите разложение MNase, добавив 1,6 мкл 0,5 М EGTA (конечные 4 мМ) к каждой аликвоте, и инкубируйте на термомиксере при 65 °C в течение 10 мин при встряхивании 800 об/мин.
- Собирают образец центрифугированием при 10 000 x g в течение 5 мин при RT и выбрасывают надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл 1x NEBuffer 2.1.
- Пул образцов, эквивалентных входным значениям 5 x 10,6 ячеек или менее для дальнейшей обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо обработать более 5 x 10 6 клеток, обрабатывайте эти образцы параллельно, так как ферментативные условия оптимизированы для 5 x 106 клеток. - Прежде чем приступить к этапам бесконтактного лигирования, передайте 10% образца в качестве входного контроля для контроля уровня расщепления MNase. Добавьте в этот образец 150 мкл 10 мМ Tris, pH 7,4, 25 мкл 10% SDS и 25 мкл 20 мг/мл протеиназы K и инкубируйте в течение ночи при 65 °C.
4. Обработка концов ДНК и бесконтактное лигирование
- Оставшуюся пробу собирают центрифугированием при 10 000 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбрасывают надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в 90 мкл свежеприготовленной мастер-смеси Micro-C 1 (Таблица 1) и инкубируйте на термомиксере в течение 15 минут при 37 °C при встряхивании 800 об/мин.
- Добавьте 10 мкл 5 ед/мкл фрагмента Кленова и инкубируйте на термомиксере в течение 15 минут при 37 °C при встряхивании 800 об/мин.
- Добавьте 100 мкл свежеприготовленной мастер-смеси Micro-C 2 (Таблица 2) и инкубируйте на термомиксере в течение 45 минут при 25 °C при встряхивании 800 об/мин. После инкубации погасить ферментативную реакцию, добавив ЭДТА до конечной концентрации 30 мМ. Инкубировать на термомиксере в течение 20 мин при 65 °C при встряхивании 800 об/мин.
- Соберите образец центрифугированием при 10 000 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендировать образец в 500 мкл свежеприготовленной мастер-смеси Micro-C 3 (табл. 3) и инкубировать в течение 2,5 ч при RT с вращением (15-20 об/мин).
- Соберите образец центрифугированием при 10 000 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендировать образец в 200 мкл свежеприготовленной мастер-смеси Micro-C 4 (табл. 4) и инкубировать на термомиксере в течение 15 мин при 37 °C при встряхивании 800 об/мин.
- Для обратного сшивания и депротеинизации добавляют в образец 25 мкл 20 мг/мл протеиназы К и 25 мкл 10% SDS и инкубируют при 65 °C в течение ночи с прерывистым перемешиванием.
5. Очистка и выбор размера динуклеосомной ДНК
- Добавьте 500 мкл PCI к образцам и входному контролю, и перемешайте вихревым способом. Разделяют фазы центрифугированием при 19 800 x g в течение 5 мин и переносят верхнюю водную фазу в свежую пробирку.
- Концентрируйте ДНК либо с помощью набора для очистки ДНК, либо путем осаждения этанолом. Элюируют образцы в 30 мкл (шаг 5.3), а входные элементы управления (шаг 3.11) в 15 мкл и запускают 1,5 % агарозный гель для разделения мононуклеосом и динуклеосом (рис. 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация SDS на этапе депротеинизации является ингибирующей для некоторых наборов для очистки ДНК. Используемый здесь набор для очистки ДНК (см. таблицу материалов) работает так же, как осаждение этанола. В зависимости от количества используемых клеток входное значение может составлять от 100 нг до 10 мкг. Как правило, 1-5 мкг ДНК извлекают из клеток 5 х 106 . - Иссекают фрагменты ДНК, имеющие двунуклеосомный размер (примерно 300.н.). Используйте имеющийся в продаже набор для элюирования геля ДНК (см. таблицу материалов) для извлечения ДНК из агарозного геля и элюирования в 150 мкл.
6. Приготовление гранул стрептавидина
- Переложите 10 мкл гранул стрептавидина (см. таблицу материалов) на образец в реакционную пробирку.
- Поместите его в подходящий магнит для пробирок объемом 1,5 мл (см. Таблицу материалов). После того, как раствор очистится (1-2 мин), удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в 300 мкл 1x TBW (5 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, 0,05% Tween 20) на образец. Повторите этот шаг один раз.
- Ресуспендант гранул в 150 мкл 2-х черно-белого буфера (10 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 1 мМ ЭДТА, 2 М NaCl) на образец, обработанный на этапе 7.
7. Вытягивание стрептавидина и подготовка библиотеки на валике
- Добавьте 150 мкл предварительно подготовленных шариков (шаг 6.3) к 150 мкл образца (шаг 5.3). Инкубируют 20 мин при РТ при вращении (15-20 об/мин).
- Поместите пробирки в соответствующий магнит и подождите, пока раствор не вытечет (1-2 минуты). Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте шарики в 300 мкл 1x TBW. Повторите этот шаг.
- Поместите пробирки в соответствующий магнит и подождите, пока раствор не вытечет (1-2 минуты). Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте шарики в 100 мкл 0,1x TE (1 мМ Tris, 0,1 мМ ЭДТА, pH 8,0).
- Поместите пробирки в соответствующий магнит и подождите, пока раствор не вытечет (1-2 минуты). Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте шарики в 50 мкл 0,1х ТЭ и перенесите их в пробирки для ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый объем 0,1x TE (50 мкл) соответствует входному объему набора для подготовки библиотеки секвенирования ДНК (см. Таблицу материалов), используемого в этом протоколе. Если используется другой комплект или стратегия, отрегулируйте громкость соответствующим образом. - Выполните этапы манипуляций с ДНК набора для подготовки библиотеки секвенирования в соответствии с протоколом производителя. Эти этапы обычно включают притупление ДНК, А-хвост, адапторную лигацию и U-эксцизию. Последний этап (U-эксцизия) специфичен для набора, используемого в этом исследовании. При использовании этого комплекта следуйте инструкциям производителя от шага 1 до шага 2.6 в протоколе набора, используя неразбавленные адаптеры, и не рассматривайте возможность хранения при температуре −20 °C после шага 2.6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буферные изменения, требуемые наборами для секвенирования, должны быть заменены путем связывания шариков с магнитом и промывками (шаги 7.3 - 7.4), поскольку ДНК все еще связана с гранулами стрептавидина. Кроме того, поскольку ДНК связана с магнитными шариками, игнорируйте любые этапы очистки и выбора размера после лигирования адаптера из протокола набора. Перейдите к шагу 7.6 (этот протокол). - После завершения лигирования адаптера промойте образец, как описано в шаге 7.2. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте шарики в 20 мкл 0,1x TE.
8. Оценка необходимых циклов ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется оценить необходимое количество циклов ПЦР для библиотечной амплификации. Как правило, библиотека Micro-C требует 8-15 циклов ПЦР. Хотя этот шаг не является обязательным, он помогает избежать чрезмерного амплификации и снижает риск дубликатов ПЦР.
- Для определения минимального количества необходимых циклов ПЦР проводят ПЦР с 1 мкл образца ДНК стрептавидин-биотин-(шаг 7.6). Для этого в образец добавляют мастер-смесь ПЦР (3,2 мклH2O, 0,4 мкл праймера i5, 0,4 мкл праймера i7 и 5 мкл высокоточной ДНК-полимеразы Q5). Выполняйте ПЦР в 16 циклов в соответствии с инструкциями производителя для используемого набора для подготовки библиотеки ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые здесь буквари приобретаются в отдельном комплекте (см. Таблицу материалов), который должен быть совместим с используемым комплектом для подготовки библиотеки. - После ПЦР соберите шарики с помощью соответствующего магнита и измерьте концентрацию ДНК 1 мкл надосадочной жидкости с помощью высокочувствительного прибора для количественного определения ДНК (см. таблицу материалов). Чтобы получить общую концентрацию ДНК, умножьте это значение на 10 (общий объем реакции ПЦР). Оцените необходимое количество циклов ПЦР, как описано в репрезентативных результатах.
- Добавьте 2 мкл 6-кратного загрузочного буфера к оставшимся 9 мкл смеси ПЦР. Разрешите ПЦР-амплифицированную библиотеку на 1% агарозном геле, чтобы определить успешное лигирование адаптора, в результате чего размер приблизительно 450.о. (рис. 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Гель должен иметь отчетливую полосу примерно 420 п.н. (библиотека Micro-C плюс адаптеры). Полосы в 120.н. представляют собой димеры адаптеров и указывают на библиотеки низкой сложности. Могут появиться полосы с более низкой молекулярной массой (менее 100.н.), и это неиспользованные праймеры от реакции ПЦР.
9. Библиотечное усиление секвенирования
- Добавьте мастер-смесь для ПЦР (65 мклH2O, 100 мкл высокоточной ДНК-полимеразы Q5, 8 мкл праймера i5, 8 мкл праймера i7) к оставшимся 19 мкл образца стрептавидин-биотин-ДНК. Разделите реакционную смесь на аликвоты по 50-100 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный объем для ПЦР зависит от ПЦР-аппарата; Как правило, 50 мкл обеспечивает наиболее воспроизводимую амплификацию в обычных ПЦР-машинах. - Выполняйте ПЦР в соответствии с инструкциями производителя набора для подготовки библиотеки ДНК с количеством циклов, определенным на шаге 8. Если этап 8 был пропущен, рекомендуется 14 циклов для ПЦР.
- Очистите ДНК парамагнитными шариками (см. Таблицу материалов) в соотношении 1:0,9 согласно протоколу производителя. Элюируют в 20 мкл 0,1% TE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если на шаге 8.5 обнаружены димеры адаптера, выполните очистку дважды, используя одно и то же соотношение. - Определите концентрацию ДНК и запустите образцы в систему контроля качества (см. Таблицу материалов). Обеспечьте хорошее качество библиотеки Micro-C благодаря наличию одной точной полосы (рис. 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Адапторные димеры редко используются в библиотечных препаратах из-за промывки образцов перед ПЦР. Таким образом, появление адапторных димеров свидетельствует о низкой сложности библиотеки. Если наблюдаются адапторные димеры, настоятельно рекомендуется контролировать качество образца с низкой последовательностью входа.
10. Секвенирование ДНК и обработка данных
- Секвенирование библиотеки Micro-C с помощью секвенирования на парных концах в соответствии с требованиями поставщика секвенирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале образцы секвенируются на платформе в парном режиме с 50.н. на чтение. Более старые платформы, предлагающие меньшую длину чтения, такие как 2 x 35 бит, также успешно используются. Важно отметить, что если изучаются повторяющиеся участки генома, может быть целесообразно секвенирование с большей длиной чтения. - Чтобы оценить качество библиотеки Micro-C, выполните последовательность с низким уровнем входных данных: от 5 x 106 до 1 x 107 на выборку.
- Обработайте файлы секвенирования (файлы fastq) с помощью Distiller10. Сопоставьте показания с соответствующим референсным геномом, здесь mm10.
ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы последовательности могут обрабатываться с помощью различных конвейеров на локальных компьютерах или вычислительных кластерах. Для образцов с низкой глубиной секвенирования большие размеры ячеек, такие как 10 000.о., 50 000.о., 100 000.о. и 500 000.о., могут снизить требования к вычислительным ресурсам и размер файлов. Distiller (используется в данном исследовании) генерирует все необходимые типы файлов для оценки качества библиотеки Micro-C. Сгенерированный файл *.stats содержит информацию о скорости карты, цис-транс соотношениях и ориентации чтения, стратифицированную по расстоянию между считанными парами. Эти параметры визуализированы на рисунке 2, а оценка качества библиотеки Micro-C обсуждается в репрезентативных результатах. Программное обеспечение для обработки также генерирует файлы mcool, которые могут быть непосредственно загружены в HiGlass (https://docs.higlass.io/) для создания матриц взаимодействия9.
Representative Results
Успешная подготовка библиотек Micro-C может быть оценена в несколько этапов протокола. Наиболее важным этапом является выбор правильной степени расщепления MNase. Таким образом, концентрация MNазы должна быть титрована, чтобы последовательно давать 70%-90% мононуклеосом по сравнению с динуклеосомами для каждого образца. Важно отметить, что расщепление хроматина различается для эу- и гетеро-хроматина, при этом MNase переваривает гетерохроматин менее эффективно. Таким образом, оптимальная степень расщепления зависит от интересующей области хроматина и изучаемого типа клеток, поскольку относительное соотношение эу- и гетерохроматина зависит от типа клетки. Поэтому рекомендуется тщательно титровать требуемую концентрацию МНазы и сначала оценить успешность эксперимента Micro-C с помощью секвенирования с низким входом.
Типичная картина титрования MNазы хроматина, обработанного убывающими количествами MNase, показана на рисунке 1A. Здесь хроматин из 250 000 клеток за реакцию переваривается с четырехкратным разведением MNase. Самая высокая концентрация (10 U MNase, Lane 2) показывает переваренный хроматин, состоящий почти исключительно из мононуклеосомной ДНК (~150.н.). Примечательно, что центр мононуклеосомной полосы находится ниже в агарозном геле по сравнению с соответствующими полосами в образцах с пониженными концентрациями МНазы, что указывает на переваривание нуклеосомной ДНК. Переваренные нуклеосомы неэффективно лигируются в реакции бесконтактного лигирования; поэтому образец в Lane 2 является неоптимальным для экспериментов Micro-C. Дорожка 3 (2,5 U MNase) показывает почти соответствующую степень разложения для экспериментов с микро-С. Здесь мононуклеосомная полоса является доминирующим видом, а субнуклеосомный мазок, свидетельствующий о переваривании нуклеосом, редуцирован; Тем не менее, он все еще присутствует. Степень разложения в Lane 4 (0,635 U MNase) является идеальным условием для эксперимента Micro-C в этом примере титрования. Присутствует четкая мононуклеосомная полоса без субнуклеосомной ДНК. Интенсивность полос для моно- и динуклеосомной ДНК почти одинакова, что указывает на выход мононуклеосом 66% или выше. Стоит отметить, что динуклеосомная ДНК примерно в два раза больше мононуклеосомной ДНК (~320.н. против ~150.н.), поэтому ее полосная интенсивность на моль ДНК в два раза выше по сравнению с мононуклеосомным аналогом. Степень расщепления в Lane 5 (0,156 U MNase) показывает недоваренный хроматин почти без нуклеосомной ДНК, и это, следовательно, представляет собой субоптимальный образец.
В заключение, в этом примере расщепление 2,5 x 10 5 мышиных ЭС-клеток с 0,625 U MNазы (что соответствует2,5 U MNазы для 1 x 10,6 клеток в 200 мкл) предлагает наиболее многообещающую отправную точку для препаративного разложения в экспериментах Micro-C. Тем не менее, следует также учитывать промежуточную концентрацию MNase между условиями, используемыми для образцов в Lane 3 и Lane 4 (соответствующая 5 U MNase для 1 x 106 клеток в 200 мкл). Важно отметить, что расщепление хроматина с помощью МНазы не может быть линейно масштабировано, и не рекомендуется увеличивать препаративное расщепление более чем в 4 раза. Для получения библиотек Micro-C из более чем 1 x 10 6 клеток целесообразно переваривать хроматин в аликвотах 1 x 106 клеток и объединять их после инактивации MNase.
Для оценки успешности протокола бесконтактного лигирования входной контроль, который расщепляется MNase, а не бесконтактно лигирован (шаг 3.8), следует сравнить с ближайшим лигированным образцом (шаг 5.3) с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле (рис. 1B). Мононуклеосомная полоса, лигированная проксимацией, имеет приблизительный размер 300.н., как и у динуклеосом. Таким образом, отношение сигналов моно- и динуклеосомных полос должно смещаться от преимущественно мононуклеосом (дорожка 1) к динуклеосомам (дорожка 3 и полоса 4). Поскольку агарозный гель на этом этапе представляет собой динуклеосомную ДНК, которая иссекается и очищается, рекомендуется разделить образцы на несколько дорожек, чтобы избежать перегрузки.
Рекомендуется оценивать качество и количество подготовленной библиотеки секвенирования с помощью минимальной ПЦР. Здесь ДНК из 1 мкл шариков (1/20 от общего образца) амплифицируется в течение 16 циклов в 10 мкл реакции ПЦР. Общая концентрация минимальной библиотеки ПЦР обычно колеблется в пределах 50-500 нг после 16 циклов ПЦР. Теоретически это соответствует библиотеке 1-10 мкг из оставшегося образца объемом 19 мкл, если бы он также был усилен в течение 16 циклов. Рекомендуется использовать минимальное количество циклов ПЦР, необходимое для создания библиотеки примерно 100 нг из общей ДНК. Предполагая логарифмическую амплификацию в ПЦР, теоретическую концентрацию ДНК, полученную из 19 мкл на входе в 16 циклов, можно последовательно разделить на два, чтобы рассчитать количество циклов ПЦР, необходимых для создания библиотеки 100 нг. Например, выход 100 нг из 1 мкл после 16 циклов соответствует выходу 1 900 нг, усиленный из 19 мкл. В этом сценарии 12 циклов в идеале должны генерировать библиотеку секвенирования 118 нг из общей ДНК (1900 нг/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 нг). Оставшиеся 9 мкл образца из минимальной ПЦР затем могут быть использованы для оценки качества библиотеки с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 1C). Визуализация должна показать одну отдельную полосу на уровне 420.н. и отсутствие полос для димеров адаптера (120.н.). Также могут появиться более мелкие фрагменты, которые соответствуют неиспользованным праймерам для ПЦР.
Затем рекомендуется проанализировать и подтвердить успешную подготовку образцов Micro-C с помощью секвенирования с малыми затратами, прежде чем приступать к ресурсоемкому глубокому секвенированию. Как правило, библиотеки секвенируются на глубину чтения от 5 x 106 до 1 x 107 и оцениваются на основе следующих критериев: частота дублирования чтения при секвенировании, частота цис- и трансхромосомного взаимодействия и частота ориентации чтения секвенирования. Библиотеки Micro-C обрабатываются с помощью Distiller, полнофункционального конвейера, который обрабатывает данные от файлов последовательного чтения (формат Fastq) до файлов пар чтения (формат Bedpe) и масштабируемых матриц взаимодействия (форматы Cool и Mcool) с помощью cooler, pairtools и cooltools10,11,12. Конвейер также создает сводный файл, который идеально подходит для оценки качества библиотек Micro-C10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). Частота дублирования ПЦР предоставляет информацию о сложности библиотеки секвенирования и может быть извлечена из сгенерированного файла *.stats. Высококачественные библиотеки Micro-C имеют менее 5%-10% ПЦР-дублирования при генерации из 5 и более миллионов клеток. Примечательно, что некоторые платформы секвенирования генерируют ПЦР-дубликаты во время формирования кластера независимо от сложности библиотеки секвенирования. На рисунке 2А показана относительная скорость дублирования двух экспериментов: одного, который мы считаем хорошим, и другого, плохого. В этом примере в обеих выборках отображались приемлемые картографические коэффициенты. Следующим критерием оценки качества библиотек Micro-C является соотношение цис- и транс и частоты ориентации чтения. В ядре хромосомы населяют отдельные хромосомные территории и, таким образом, редко взаимодействуют с другими хромосомами. Высокая частота обнаруженных трансхромосомных взаимодействий свидетельствует о высокой частоте случайных лигирований. Следует отметить, что на данном уровне анализа плохой образец показал высокую частоту трансхромосомных взаимодействий по сравнению с хорошим образцом (рис. 2Б). Для Micro-C желателен уровень цис-хромосомного взаимодействия 70% или выше.
Библиотека Micro-C имеет размер фрагмента, аналогичный динуклеосомной полосе ДНК, которая может очищаться совместно с образцом с бесконтактной лигацией и загрязнять эксперимент. Эти контаминанты всегда являются цис-хромосомными взаимодействиями. Поэтому важно также оценить скорость ориентации чтения. Скорость динуклеосомной контаминации может быть оценена с помощью секвенирования с низким уровнем входа. Динуклеосомная ДНК происходит из двух соседних нуклеосом, которые не были расщеплены MNase. Таким образом, результирующие последовательные чтения всегда будут отображать прямо-обратную ориентацию чтения (F и R), а расстояние между парами считывания будет около 320.н. Для сравнения, фрагменты, лигированные в непосредственной близости, могут быть лигированы в четырех ориентациях, что дает считываемые пары с F-R, R-R, R-F и F-F, в идеале с равным количеством (рис. 2C). Кроме того, они отображают различные расстояния между двумя считываемыми парами. Чтобы оценить количество динуклеосомных загрязнений, частоту ориентаций считывания можно рассчитать по файлам *stats, сгенерированным дистиллятором (рис. 2D). Примечательно, что в этой работе доля прочтений F-R (красная) была выше в плохой выборке по сравнению с хорошей, и это стало более очевидным, когда ориентации чтения были стратифицированы по расстоянию (рис. 2E). Во фракции F-R преобладают динуклеосомные фрагменты по сравнению с библиотеками Micro-C, когда пары считывания стратифицированы на чтения с расстояниями <562.н. или ≥562.н. Здесь доля прочтений с расстоянием <562.н. доминирует в F-R чтениях, тогда как доля с расстояниями ≥562.н. демонстрирует равномерное распределение между четырьмя возможными ориентациями, что указывает на то, что глобальная избыточная представленность считываний F-R связана с динуклеосомными загрязнителями. Выбор 562.н. в качестве порогового значения для подмножества определяется биннингом в сгенерированном файле *stats. Хотя это и не является обязательным для такого контроля качества, более четкое подмножество может быть достигнуто путем извлечения расстояний из файла *pairs, который также генерируется дистиллятором. Важно отметить, что динуклеосомные считывания не снижают качество образца Micro-C, так как они могут быть идентифицированы и проигнорированы при обработке данных. Однако они не содержат ценной информации о 3D-взаимодействиях и разбавляют информативность чтения.
Таким образом, тщательное титрование MNase и тщательный контроль качества с малозатратным секвенированием являются лучшими инструментами для оптимизации качества экспериментов Micro-C.
Рисунок 1: Промежуточные этапы протокола Micro-C . (A) Электрофорез хроматина в агарозном геле из 2,5 x 105 клеток ЭС мыши, расщепленных с различными концентрациями МНазы. Одно-, ди- и тринуклеосомные полосы обозначены стрелками. M: лестница ДНК (полоса 1/6); 10 ЕД MNазы на 250 000 клеток (дорожка 2); 2,5 ЕД МНазы на 250 000 ячеек (дорожка 3); 0,625 ЕД МНазы на 250 000 клеток (дорожка 4); 0,156 ЕД МНазы на 250 000 клеток (дорожка 2). (Б) Электрофорез в 1,0% агарозном геле образцов, подготовленных Micro-C (дорожки 3 и дорожки 4) и входной контроль с ферментацией MNase (дорожка 1). Дорожки 1 и 2 (М: ДНК-лестница) усилены, чтобы подчеркнуть относительное изменение интенсивности моно- и динуклеосомных фрагментов. Моно- и динуклеосомные полосы обозначены стрелками. Динуклеосомная полоса в образце, лигированном проксимацией, сочетает в себе динуклеосомную ДНК и ДНК из библиотеки Micro-C. (C) Электрофорез в 1,0% агарозном геле библиотек секвенирования Micro-C, амплифицируемый из образца 1 мкл для оценки качества. Дорожка 1 (М): лестница ДНК; Переулок 2 (S): Библиотека Mirco-C. (D) Трассировка Fragment Analyzer окончательной библиотеки Micro-C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Выборочная статистика для секвенирования хороших и плохих образцов с низким уровнем входных данных . (A) Гистограмма процентного соотношения сопоставленных (зеленый) и несопоставленных (красный) показаний. (B) Нормализованная доля прочтений, картирующих цис- и трансхромосомные взаимодействия. Наборы данных были нормализованы для чтения cis-mapping. Показания цис-картирования были стратифицированы по расстоянию между первым и вторым чтением парных секвенированных образцов: ≤1 кбит/(желтый), >1 кбит/и ≤10 кбит/(оранжевый) и >10 кбит/(красный). (C) Схема потенциальных молекулярных частиц с динуклеосомными размерами. (D) Процентное соотношение ориентаций пар считывания всех чтений хорошего и плохого образца. (E) То же, что и на панели (D), но стратифицирована по расстояниям (слева, <562.н., и справа, ≥562.н.). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Компоненты | В 1 раз | В 4,4 раза |
| 10x NEBuffer 2.1, | 10 мкл | 44 мкл |
| 2 мкл 100 мМ АТФ | 2 мкл | 8,8 мкл |
| 100 мМ DTT | 5 мкл | 22 мкл |
| H2O | 68 мкл | 299,2 мкл |
| 10 ед/мкл T4 PNK | 5 мкл | 22 мкл |
| Итог | 90 мкл | 396 мкл |
Таблица 1: Мастер-микс Micro-C 1. Состав мастер-микса для конечной жевательной реакции.
| Компоненты | В 1 раз | В 4,4 раза |
| 1 мМ биотин-дАТФ | 10 мкл | 44 мкл |
| 1 мМ биотин-дХТФ | 10 мкл | 44 мкл |
| 10 мМ смесь dTTP и dGTP | 1 мкл | 4,4 мкл |
| 10-кратный буфер ДНК-лигазы T4 | 5 мкл | 22 мкл |
| 200x BSA | 0,25 мкл | 1,1 мкл |
| H2O | 23,75 мкл | 104,5 мкл |
Таблица 2: Мастер-микс Micro-C 2. Состав мастер-смеси для реакции конечной маркировки.
| Компоненты | В 1 раз | В 4,4 раза |
| 10x реакционный буфер NEB T4 Ligase | 50 мкл | 220 мкл |
| H2O | 422,5 мкл | 1859 мкл |
| ДНК-лигаза Т4 | 25 мкл | 110 мкл |
Таблица 3: Мастер-микс Micro-C 3. Состав мастер-смеси для реакции бесконтактного лигирования.
| Компоненты | В 1 раз | В 4,4 раза |
| 10x NEBuffer 1.1 | 20 мкл | 88 мкл |
| H2O | 180 мкл | 792 мкл |
| Нуклеаза ExoIII | 10 мкл | 44 мкл |
Таблица 4: Мастер-микс Micro-C 4. Состав мастер-смеси для реакции удаления биотина.
Discussion
Успех эксперимента на Micro-C зависит от нескольких критических шагов в протоколе, которые необходимо тщательно выполнить. Во-первых, сшивание с помощью дополнительного сшивающего агента DSG или EGS может привести к агрегации ячеек, в зависимости от типа ячейки. Добавление 0,1%-0,5% БСА в реакцию сшивания значительно снижает агрегацию, не влияя на эффективность сшивания. Неэффективное сшивание может привести к увеличению частоты трансхромосомных взаимодействий, которые указывают на случайные лигирования. Вторым, но самым важным этапом в этом протоколе является расщепление хроматина с помощью MNase. Неоптимальное расщепление хроматина приводит к неэффективному бесконтактному лигированию (избыточное переваривание) или увеличению скорости неблизко лигированных динуклеосом (недоваривание). Эффективность реакции лигирования может быть оценена с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 1B) и дополнительно лучше всего оценивается с помощью секвенирования с низким входом. Если секвенирование с низким входом обнаруживает либо высокую скорость дупликации (неэффективное лигирование), либо повышенную скорость динуклеосом, степень расщепления МНазы следует переоценить. Примечательно, что потеря выборки при выполнении протокола может привести к снижению сложности библиотеки. Концентрацию образца лучше всего оценивать после очистки ДНК (шаг 5.3) или с помощью минимальной ПЦР (шаг 8). Общий выход ДНК из клеток 5 x 106 млекопитающих после очистки ДНК обычно составляет >2 мкг. Концентрацию ДНК следует контролировать после расщепления MNase, расщепления ExoIII и очистки ДНК. Источником деградации ДНК могут быть эндогенные нуклеазы, обилие которых специфично для типа клетки и вида. Кроме того, колоночная очистка ДНК может привести к потере образца из-за несовместимости с SDS из реакций депротеинирования. Осаждение этанола можно рассматривать, если концентрация ДНК на этом этапе низкая.
Поскольку Micro-C требует титрования MNase для конкретного образца, применять Micro-C к небольшим клеточным популяциям, например, к небольшим органам различных модельных организмов, эмбрионов и отдельных клеток, органоидов или биоптатов пациентов, сложно. Здесь Hi-C 3.0 предлагает хорошо зарекомендовавшую себя альтернативу, использующую конечную реакцию последовательно-специфичными эндонуклеазами рестрикции 8,9.
Micro-C — это широко применяемая технология конформации хромосом высокого разрешения с широким динамическим диапазоном и низким отношением сигнал/шум, что делает ее особенно подходящей для исследования хромосомных особенностей малого радиуса действия 4,5,8, таких как хромосомные петли. Разрешение Micro-C позволяет захватывать петли промотор-энхансер, которые находятся за пределами предела обнаружения Hi-C, что позволяет проводить более детальный анализ взаимосвязи между организацией генома и регуляцией13,14,15. Кроме того, стратегии захвата ДНК недавно были объединены с Micro-C, чтобы увеличить локус-специфичное разрешение целевых геномных локусов до беспрецедентного уровня, что позволило по-новому взглянуть на ультраструктуру 3D-генома16,17,18. Таким образом, мы предполагаем, что Micro-C и его производные станут ключевой технологией для препарирования роли 3D-генома в транскрипционной регуляции и, следовательно, дифференцировке и поддержании типа клеток.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Кристл Гаубиц и Кэтлин Стюарт-Морган за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим Аню Грот и лабораторию Грота за их поддержку в создании нашей лаборатории. Благодарим за поддержку сотрудников платформы CPR/reNEW Genomics: Х. Волльманна, М. Мишо и А. Калвису. Центр медицины стволовых клеток Фонда «Ново Нордиск» (reNEW) поддерживается грантом No NNF21CC0073729 Фонда «Ново Нордиск». Центр исследований белка (CPR) Фонда «Ново Нордиск» поддерживается грантом No NNF14CC0001 Фонда «Ново Нордиск». Мы благодарим лабораторию Брикмана в Центре медицины стволовых клеток Novo Nordisk, reNEW Copenhagen, за ES клетки мышей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mM Biotin dATP | Jenna Bioscience | NU-835-Bio14-S | |
| 1 mM Biotin dCTP | Jenna Bioscience | NU-809-BioX-S | |
| 10 mM dGTP | NEB | N0442S | |
| 10 mM dTTP | NEB | N0443S | |
| 10 U/ml T4 PNK | NEB | M0201L | |
| 100 U/L Exonuclease III | NEB | M0206L | |
| 10x NEBuffer 1.1 | NEB | B7001S | |
| 10x NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | |
| 10x T4 DNA Ligase buffer | NEB | B0202A | |
| 1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ | ThermoFisher | 14190144 | |
| 1x LIF | |||
| 2_Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | 0.1 mM b-mercaptoethanol |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-500ML | Caution. See manufactures MSDS |
| 400 U/ml T4 DNA Ligase | NEB | M0202L | |
| 5 U/ml Klenow Fragment | NEB | M0210L | |
| Agarose | BIO-RAD | 1613102 | Caution. See manufactures MSDS |
| BSA 20mg/ml | NEB | B9000S | |
| CaCl2 | |||
| cell counter | |||
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D8418-100ML | Caution. See manufactures MSDS |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes |
| DynaMag-PCR Magnet | Invitrogen | 492025 | refered to as: magnet magnet for PCR tubes |
| EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | BioWorld | 40121266-1 | |
| Ethanol 96% | VWR Chemicals | 20824365 | quality control system |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | |
| Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) | ThermoFisher | 21565 | |
| Fetl Bovin Serum | Sigma Aldrich | F7524 | 15% FBS |
| Gel Loading dye purple (6X) | NEB | B7024S | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067.0500 | |
| Halt Proteinase inhibitor (100x) | ThermoFisher | 78430 | Caution. See manufactures MSDS |
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | 18896-50ML | |
| MgCl 1 M | Invitrogen | AM9530G | |
| Micrococcal Nuclease (MNase) | Worthington | LS004798 | |
| mouse embryonic stem cells | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) | NEB | E7600S | amplification primers for sequencing libraries |
| NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | NEB | E7645L | sequencing library preparation kit |
| NEBNext Ultra II Q5 Master mix | NEB | M0544S | Caution. See manufactures MSDS |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | 1x NEAA |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | 1% Pen-Strep |
| Proteinase K (40 mg/ml) | GoldBio | P-480-1 | Caution. See manufactures MSDS |
| QIAquick Gel extraction kit | QIAgen | 28706 | refered to as: DNA gel elution kit |
| QIAquick PCR purification kit | QIAgen | 28106 | refered to as: commercial DNA purification kit |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA quantification instrument |
| Quick load purple 1kb plus DNA Ladder | NEB | N0550S | |
| SPRIselect size selection beads | Beckman Coulter | B23319 | paramagnetic beads |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | refered to as: thermomixer |
| Tris | Merck | 10708976001 | |
| Trypsin | |||
| Tween20 | Sigma Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrapure 10% SDS | Invitrogen | 15553-035 | |
| Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) | Invitrogen | 15593-031 | |
| Fragment Analyzer |
References
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. Micro-C XL: Assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome. Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).
- Hsieh, T. -H. S., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
- Krietenstein, N., et al. Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
- Hsieh, T. -H. S., et al. Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding. Molecular Cell. 78 (3), 539-553 (2020).
- Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods. 123, 56-65 (2017).
- van Holde, K. E. Chromatin. , Springer. New York, NY. (1989).
- Oksuz, B. A. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18, 1046-1055 (2021).
- Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 3.0: Improved protocol for genome-wide chromosome conformation capture. Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).
- Goloborodko, A., Venev, S., Abdennur, N., Di Tommaso, P.
- Venev, S., et al.
- Abdennur, N., Mirny, L. A. Cooler: Scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays. Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2019).
- Zhang, S., Übelmesser, N., Barbieri, M., Papantonis, A. Enhancer-promoter contact formation requires RNAPII and antagonizes loop extrusion. BioRxiv. , (2022).
- Barshad, G., et al. RNA polymerase II and PARP1 shape enhancer-promoter contacts. BioRxiv. , (2022).
- Hansen, A. S., et al. Distinct classes of chromatin loops revealed by deletion of an RNA-binding region in CTCF. Molecular Cell. 76 (3), 395-411 (2019).
- Hua, P., et al. Defining genome architecture at base-pair resolution. Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).
- Downes, D. J. High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale. Nature Communications. 12, 531 (2021).
- Goel, V. Y., Huseyin, M. K., Hansen, A. S. Region capture Micro-C reveals coalescence of enhancers and promoters into nested microcompartments. BioRxiv. , (2022).
