Summary
Här presenteras ett protokoll för kartläggning av den tredimensionella genomorganisationen med nukleosomupplösning med hjälp av den genomomfattande kromosomkonformationsmetoden Micro-C-XL.
Abstract
Tredimensionell (3D) kromosomorganisation är en viktig faktor i genomreglering och celltypsspecifikation. Till exempel tros cis-reglerande element, kända som förstärkare, reglera aktiviteten hos distala promotorer via interaktion i 3D-rymden. Genomomfattande kromosomkonformationsfångst (3C)-teknologier, såsom Hi-C, har förändrat vår förståelse av hur genom är organiserade i celler. Den nuvarande förståelsen av 3D-genomets organisation begränsas av den upplösning med vilken den topologiska organisationen av kromosomer i 3D-rymden kan lösas. Micro-C-XL mäter kromosomveckning med upplösning på nukleosomnivå, den grundläggande enheten för kromatin, genom att använda mikrokocknukleas (MNase) för att fragmentera genom under kromosomkonformationsfångstprotokollet. Detta resulterar i ett förbättrat signal-brusförhållande i mätningarna, vilket underlättar bättre detektion av isoleringsställen och kromosomslingor jämfört med andra genomomfattande 3D-tekniker. Ett visuellt stödt, detaljerat, steg-för-steg-protokoll för beredning av högkvalitativa Micro-C-XL-prover från däggdjursceller presenteras i den här artikeln.
Introduction
Micro-C-XL är en genomomfattande teknik för att mäta 3D-genomkonformation med nukleosomupplösning. Micro-C-XL bygger på den allmänt använda närhetsligeringsbaserade Hi-C-tekniken, som har förändrat vår förståelse av hur 3D-genomär organiserade. Micro-C-XL och dess första iteration, Micro-C, utvecklades ursprungligen i Saccharomyces cerevisiae2,3 och anpassades senare till däggdjurscellsystem, för vilka protokollet har visat sin fulla potential för att detektera kortdistansegenskaper i 3D-genomet, såsom kromosomslingor och isoleringsställen. Denna version är baserad på de senaste publikationerna om däggdjurens Micro-C-XL 4,5. Eftersom Micro-C-XL ersätter Micro-C, kallas Micro-C-XL hädanefter för Micro-C i manuskriptet.
De största skillnaderna mellan Micro-C och Hi-C6 är följande: 1) genomfragmentering med mikrokocknukleas (MNase) jämfört med restriktionsenzymer och 2) ytterligare tvärbindare med större atomavstånd mellan de reaktiva grupperna jämfört med endast formaldehyd. Båda stegen bidrar avsevärt till det förbättrade signal-brusförhållandet för Micro-C jämfört med konventionell Hi-C. Fragmenteringsstorleken begränsar upplösningen till vilken 3D-genomorganisationen kan lösas upp under proximity-ligeringsprotokollet. MNas är ett nukleas som företrädesvis smälter tillgängligt DNA och lämnar nukleosomskyddat DNA intakt. Nukleosomfotavtryck med hjälp av MNase-sekvensering har visat att nukleosomer helt täcker de flesta eukaryota genom7. Eftersom nukleosomer är fördelade över hela genomet med ett genomsnittligt avstånd på 160-220 bp, beroende på art och celltyp, är MNas det idealiska enzymet för högupplöst kartläggning av genomarkitekturen.
Användningen av en extra tvärbindare i kombination med formaldehyd (FA) i Micro-C-metoden förbättrar dessutom signal-brusförhållandet 2,8. Aminspecifika tvärbindare med längre atomdistanser mellan de reaktiva grupperna underlättar protein-protein-tvärbindningar. Dessa är vanligtvis disuccinimidylglutarat (DSG) eller etylenglykolbisuccinimidylsuccinat (EGS) med 7,7 Å respektive 16,1 Å distanser. Minskningen av brus genom EGS eller DSG är särskilt tydlig i experiment med höga fragmenteringshastigheter, såsom Micro-C, och sker förmodligen på grund av en minskning av frekvensen av slumpmässiga ligeringshändelser8.
Ett nyligen utvecklat Hi-C 3.0-protokoll som använder ESG/DSG-tvärbindning och flera kombinationer av restriktionsenzymer minskar bruset i Hi-C-experiment och förbättrar avsevärt detektionen av kromosomslingor och isoleringsställen 8,9. En jämförelse av olika interaktionsdata visade dock att Micro-C hade överlägsen detektion av kortdistansegenskaper, såsom kromosomslingor och isoleringsställen, jämfört med både Hi-C 3.0 och konventionell Hi-C8. Hi-C 3.0 förbättrar dock detektionen av kortdistansegenskaper och bibehåller en stark detektion av genomkompartmentalisering jämfört med konventionell Hi-C. Sammanfattningsvis bör valet av en metod för att fånga kromosomkonformationer bestämmas av den objektiva och biologiska frågan.
Här tillhandahåller vi ett steg-för-steg-protokoll för framgångsrika Micro-C-experiment som kan reda ut 3D-genomets organisation.
Protocol
1. Cellodling och tvärbindning
- Odlingsceller enligt experimentet måste erhålla minst 1 x 107 celler. Här odlades cellerna vid 37 °C med 5 % CO2 i E14-medium (DMEM med pyruvat och L-glutamin, 15 % FBS, 1x LIF, 1 x NEAA, 1 % pen-strepto, 0,1 mM β-merkaptoetanol [se materialförteckning]) och passerade varannan dag.
OBS: Detta protokoll har framgångsrikt tillämpats på olika celltyper från flera arter, såsom Homo sapiens och Mus musculus. I det här exemplet användes embryonala stamceller från möss. - Skörda cellerna vid 70%-80% sammanflöde genom att aspirera mediet. Tvätta en gång med 5 ml DPBS och inkubera cellerna med 3 ml förvärmt 0,25 % trypsin per 10 cm skål i 2-3 minuter vid 37 °C.
- Släck trypsinet med 7 ml förvärmt E14-medium och överför de lossnade cellerna till ett 50 ml rör.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i mediet. Räkna cellerna med en cellräknare.
OBS Protokollet är robust mot viss variation i cellkoncentrationer, och olika cellräknare har använts för att kvantifiera cellantalet; Var dock medveten om det dynamiska omfånget för den cellräknare som används. Detta är vanligtvis mellan 1 x 105-1 x 107 celler/ml. Även om centrifugeringshastigheten och varaktigheten har testats för denna celltyp, kan olika, mindre celler kräva en högre centrifugeringshastighet eller längre centrifugeringstider, och centrifugeringen bör justeras därefter. - Samla upp cellerna genom centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid RT och återsuspendera cellerna i DPBS vid en slutlig koncentration av 1 x 106 celler/ml. Till exempelample, om utbytet är 1 x 107 celler, återsuspendera cellerna i 10 ml DPBS.
- För det första tvärbindningssteget, tillsätt 37 % formaldehyd (FA) till en slutlig koncentration på 1 % till cellsuspensionen och inkubera cellsuspensionen i 10 minuter vid RT med rotation (15-20 rpm); Som ett exempel, om utbytet är 1 x 107 celler, tillsätt 270 μL FA till 10 ml cellsuspensionen.
OBS: FA-lösningen är vanligtvis stabil vid RT i upp till 3 månader efter öppnandet. - Dämpa reaktionen genom att tillsätta 2,5 M glycin till en slutlig koncentration av 0,25 M och inkubera i 5 minuter vid RT med rotation (15-20 rpm). Till exempel, om utbytet är 1 x 107 celler, tillsätt 1,027 ml 2,5 M glycin till cellsuspensionen.
- Samla upp cellerna genom centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid RT. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 5 ml DPBS. Upprepa centrifugeringssteget en gång och återsuspendera de pelleterade cellerna i DPBS till 4 x 106 celler/ml. Till exempelample, om utbytet är 1 x 107 celler, återsuspendera cellerna i 2.5 ml DPBS.
- För det andra tvärbindningssteget, bereda en 0,3 M stamlösning av etylenglykolbisuccinimidylsuccinat (EGS) i DMSO (13,6 mg EGS i 100 μL DMSO). Tillsätt EGS vid en slutlig koncentration av 3 mM till cellsuspensionen och inkubera vid RT i 40 minuter med rotation (15-20 rpm). Till exempel, om utbytet är 1 x 107 celler, tillsätt 25 μL 0,3 M EGS-stamlösning till 2,5 ml av cellsuspensionen.
OBS: Jämvikt EGS med RT i minst 20 minuter före vägning för beredning av stamlösningen. - Dämpa reaktionen genom att tillsätta 2,5 M glycin till en slutlig koncentration av 0,4 M och inkubera i 5 minuter vid RT med rotation (15-20 rpm). Till exempel, om utbytet är 1 x 107 celler, tillsätt 400 μL 2,5 M glycin till cellsuspensionen.
- Samla upp cellerna genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 minuter vid RT och återsuspendera de pelleterade cellerna i DPBS till 5 x 106 celler/ml. Fördela 5 x 10 6 celler/rör för preparativa bibliotek och 1 x 106 celler/rör för titrering för MNase-uppslutning.
OBS: Det föreslås att titrera den optimala digestionsgraden för varje tvärbunden cellsats. Samla helst in två till tre alikvoter om 1 x 10 6 celler för MNase-titreringsexperiment (steg 2) och två till fyra alikvoter om 5 x 106 celler för preparativa experiment (steg 3). - Samla in cellerna genom centrifugering vid 1 000 x g i 5 minuter vid RT och avlägsna supernatanten. Snap-frys cellpelletsen i flytande kväve och förvara dem vid −80 °C.
OBS: Framgångsrika Micro-C-bibliotek kan framställas från samples lagrade i upp till 3 månader.
2. MNase-titrering
OBS: Det är nödvändigt att utföra en MNase-titrering för att bestämma den optimala koncentrationen av MNas innan de dubbeltvärbundna cellernas preparativa bibliotek bearbetas.
- För att utföra MNase-titreringen, tina en pellet med 1 x 106 celler på is i 10 minuter och återsuspendera cellerna i 500 μL DPBS (tillsätt 1x BSA om cellerna fastnar på väggen). Inkubera cellsuspensionen på is i 20 minuter.
- Samla upp cellerna genom centrifugering vid 10 000 x g i 5 minuter vid RT och ta bort supernatanten. Återsuspendera de pelleterade cellerna i 500 μL MB#1-buffert (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2,0,2 % NP-40, 1x proteashämmare [se materialtabell], pH 7,4).
- Samla upp cellerna genom centrifugering vid 10 000 x g i 5 minuter och ta bort supernatanten. Återsuspendera cellerna i 200 μL MB#1-buffert och dela upp provet i fyra rör.
- Tina en injektionsflaska med MNas (20 E/μL) och späd med 10 mM Tris, pH 7,4, i en serie om 1:2, 1:4, 1:4 och 1:4 för att uppnå koncentrationer på 10 E/μL, 2,5 E/μL, 0,625 E/μL respektive 0,1256 E/μL (en för varje matsmältningsbetingelse). Tillsätt med lämpliga tidsintervall (10–20 s) 1 μl MNase-lösning till ett av de fyra provexemplaren, virvla och inkubera på en termomixer vid 37 °C i 10 minuter (800 varv/min). Fortsätt med att tillsätta 1 μl från de återstående MNas-utspädningarna till de återstående cellalikvoterna.
- Avbryt Mnase-uppslutningen genom att tillsätta 200 μl nyberedd STOP-buffert (150 μl 10 mM Tris, pH 7,4, 25 μl 10 % SDS, 25 μl 20 mg/ml proteinas K, 2 μl 0,5 M EGTA) till varje rör i samma ordning och med samma tidsintervall som MNas tillsattes. Inkubera vid 65 °C i 2 timmar.
- Tillsätt 500 μl fenol-kloroform-isoamylalkohol (PCI) till varje prov och blanda noggrant genom virvling. Centrifugera vid 19 800 x g i 5 minuter vid RT för att separera faserna och överför vattenfasen till nya rör (cirka 200 μL/prov).
VARNING: PCI innehåller många giftiga komponenter och bör endast hanteras i en kemisk säkerhetshuva. Kontakta tillverkaren för mer information. - Rena DNA:t med hjälp av en kommersiell DNA-reningssats (se materialtabell) enligt tillverkarens anvisningar och eluera proverna i 12 μL elueringsbuffert.
OBS: SDS-koncentrationen från deproteiniseringssteget (steg 2.5) är hämmande för vissa DNA-reningssatser. DNA-reningssatsen som används här fungerar jämförbart med etanolutfällning. - Tillsätt 2-5 μL laddningsfärg och kör proverna på en 1,5% agarosgel vid 120 V i 30-50 minuter (tills de är ordentligt separerade; Figur 1A).
- Välj den bästa graden av nedbrytning för experimentet och fortsätt med den förberedande MNase-uppslutningen. En optimal nedbrytningsgrad uppvisar få eller inga subnukleosomala fragment och ett 70%-90% mono- till di-nukleosomförhållande.
OBS: I detta experiment bestämdes digestionsgraden för bana 4 i figur 1A till den optimala uppslutningen som erhölls med 0,625-1,25 U Mnase för 2,5 x 10 5 celler (= 2,5-5 U Mnase för 1 x 106 celler). En detaljerad diskussion finns i de representativa resultaten.
3. Preparativ MNase-nedbrytning
- För att fragmentera kromatin till mononukleosomerna via MNase-uppslutning, tina tidigare dubbeltvärbundna 5 x 10 6-cellsalikvoter och återsuspendera i 1 ml DPBS. Inkubera på is i 20 min (tillsätt 1x BSA om cellerna fastnar på rörväggen).
- Samla in cellerna genom centrifugering vid 10 000 x g i 5 minuter vid RT och kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 500 μL MB#1-buffert. Upprepa centrifugeringssteget en gång. Återsuspendera pelleten i 1 ml MB#1-buffert och gör 200 μL alikvoter (1 x 106 celler per alikvot).
- Baserat på MNas-titreringen (beskrivs i steg 2), digesta kromatinet genom att tillsätta lämplig mängd MNas (vanligtvis 2,5-10 E/μL per 1 x 106 celler) till varje alikvot. Blanda väl (virvla och centrifugera snabbt) och inkubera på en termomixer vid 37 °C i 10 minuter med 800 rpm skakning.
- Stoppa MNase-uppslutningen genom att tillsätta 1,6 μl 0,5 M EGTA (slutliga 4 mM) till varje alikvot och inkubera på en termomixer vid 65 °C i 10 minuter under 800 varv per minut.
- Samla upp provet genom centrifugering vid 10 000 x g i 5 minuter vid RT och kassera supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i 500 μL 1x NEBuffer 2.1.
- Poola prover motsvarande en inmatning på 5 × 106 celler eller mindre för vidare bearbetning.
OBS: Om mer än 5 x 10 6 celler ska bearbetas, bearbeta dessa prover parallellt, eftersom de enzymatiska förhållandena är optimerade för 5 x 106 celler. - Innan du går vidare till proximitetsligeringsstegen, överför 10 % av sample som en ingångskontroll för att kontrollera MNase-uppslutningsnivån. Tillsätt 150 μl 10 mM Tris, pH 7,4, 25 μl 10 % SDS och 25 μl 20 mg/ml proteinas K till detta prov och inkubera över natten vid 65 °C.
4. DNA-slutbearbetning och proximitetsligering
- Samla upp det återstående provet genom centrifugering vid 10 000 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 90 μl nyberedd Micro-C master mix 1 (tabell 1) och inkubera på en termomixer i 15 minuter vid 37 °C med 800 rpm skakning.
- Tillsätt 10 μL 5 U/μL Klenow Fragment och inkubera på en termomixer i 15 minuter vid 37 °C med 800 rpm skakning.
- Tillsätt 100 μl nyberedd Micro-C master mix 2 (tabell 2) och inkubera på en termomixer i 45 minuter vid 25 °C under 800 varv per minut. Efter inkubationen släcks den enzymatiska reaktionen genom att EDTA tillsätts till en slutlig koncentration av 30 mM. Inkubera på en termomixer i 20 minuter vid 65 °C med 800 rpm skakning.
- Samla upp provet genom centrifugering vid 10 000 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten. Återsuspendera provet i 500 μl nyberedd Micro-C master mix 3 (tabell 3) och inkubera i 2,5 timmar vid RT med rotation (15–20 rpm).
- Samla upp provet genom centrifugering vid 10 000 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten. Återsuspendera provet i 200 μl nyberedd Micro-C master mix 4 (tabell 4) och inkubera på en termomixer i 15 minuter vid 37 °C under 800 rpm skakning.
- För omvänd tvärbindning och deproteinering, tillsätt 25 μl 20 mg/ml proteinas K och 25 μl 10 % SDS till provet och inkubera vid 65 °C över natten med intermittent blandning.
5. Di-nukleosomal DNA-rening och storleksval
- Tillsätt 500 μl PCI till proverna och ingångskontrollen och blanda genom virvling. Separera faserna genom centrifugering vid 19 800 x g i 5 minuter och överför den övre vattenfasen till ett nytt rör.
- Koncentrera DNA:t antingen med hjälp av ett DNA-reningskit eller genom etanolutfällning. Eluera proverna i 30 μl (steg 5.3) och ingångskontrollerna (steg 3.11) i 15 μl och kör en 1,5 % agarosgel för att separera mononukleosomerna och di-nukleosomerna (figur 1B).
OBS: SDS-koncentrationen från deproteiniseringssteget är hämmande för vissa DNA-reningssatser. DNA-reningssatsen som används här (se Materialförteckning) fungerar jämförbart med etanolutfällning. Beroende på antalet celler som används kan ingången variera från 100 ng till 10 μg. Vanligtvis extraheras 1-5 μg DNA från 5 x 106 celler. - Punktbeskatta de DNA-fragment som har en di-nukleosomstorlek (cirka 300 bp). Använd ett kommersiellt tillgängligt DNA-gelelueringskit (se materialtabell) för att extrahera DNA från agarosgelen och eluera i 150 μL.
6. Beredning av streptavidinpärlorna
- Överför 10 μL streptavidinkulor (se materialtabell) per prov till ett reaktionsrör.
- Placera den i en lämplig magnet för 1.5 ml rör (se materialförteckning). När lösningen har klarnat (1-2 min), ta bort supernatanten och återsuspendera kulorna i 300 μl 1x TBW (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05 % Tween 20) per prov. Upprepa detta steg en gång.
- Återsuspendera kulorna i 150 μL 2x svartvit buffert (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) per prov som bearbetats i steg 7.
7. Förberedelse av Streptavidin-neddragning och pärlbibliotek
- Tillsätt 150 μl förberedda pärlor (steg 6.3) till 150 μL av provet (steg 5.3). Inkubera i 20 min vid RT med rotation (15-20 rpm).
- Placera rören i en lämplig magnet och vänta tills lösningen klarnar (1-2 min). Ta bort supernatanten och återsuspendera pärlorna i 300 μL 1x TBW. Upprepa detta steg.
- Placera rören i en lämplig magnet och vänta tills lösningen klarnar (1-2 min). Ta bort supernatanten och återsuspendera kulorna i 100 μL 0,1 x TE (1 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0).
- Placera rören i en lämplig magnet och vänta tills lösningen klarnar (1-2 min). Ta bort supernatanten, återsuspendera kulorna i 50 μL 0,1 x TE och överför dem till PCR-rör.
OBS: Volymen på 0.1x TE som används (50 μL) motsvarar ingångsvolymen för förberedelsesatsen för DNA-sekvenseringsbiblioteket (se materialtabell) som används i detta protokoll. Om ett annat kit eller en annan strategi används, justera volymen därefter. - Utför DNA-manipuleringsstegen i sekvenseringsbibliotekets förberedelsesats enligt tillverkarens protokoll. Dessa steg inkluderar vanligtvis DNA-avtrubbning, A-tailing, adapterligering och U-excision. Det sista steget (U-excision) är specifikt för det kit som används i denna studie. Om du använder det kitet, följ tillverkarens instruktioner från steg 1 till steg 2.6 i kitprotokollet med hjälp av icke-utspädda adaptrar, och överväg inte -20 °C förvaring efter steg 2.6.
OBS: De buffertförändringar som krävs av sekvenseringssatserna måste bytas ut genom bindning av pärlorna till en magnet och tvätt (steg 7.3 till 7.4), eftersom DNA fortfarande är bundet till streptavidinpärlorna. Dessutom, eftersom DNA:t är bundet till de magnetiska pärlorna, ignorera alla renings- och storleksvalssteg efter adapterligering från kitprotokollet. Fortsätt till steg 7.6 (det här protokollet). - När adapterligeringen är klar, tvätta sample enligt beskrivningen i steg 7.2. Kassera supernatanten och återsuspendera kulorna i 20 μL 0,1 x TE.
8. Uppskattning av de PCR-cykler som krävs
OBS: Att uppskatta de nödvändiga PCR-cyklerna för biblioteksförstärkning rekommenderas. Vanligtvis kräver ett Micro-C-bibliotek 8-15 cykler av PCR. Även om steget inte är nödvändigt, hjälper det till att undvika överförstärkning och minskar risken för PCR-dubbletter.
- För att definiera det minsta antalet PCR-cykler som krävs, utför PCR med 1 μl streptavidin-biotin-DNA-prov (steg 7.6). För att göra detta, tillsätt PCR-masterblandning (3,2 μlH2O, 0,4 μl i5-primer, 0,4 μL i7-primer och 5 μL Q5-DNA-polymeras med hög kvalitet) till provet. Utför PCR med 16 cykler enligt tillverkarens instruktioner för det DNA-biblioteksförberedelsekit som används.
OBS: Primers som används här köps i ett separat kit (se Materialförteckning) som måste vara kompatibelt med det biblioteksförberedelsekit som används. - Efter PCR, samla in kulorna med en lämplig magnet och mät DNA-koncentrationen på 1 μL av supernatanten med hjälp av ett högkänsligt DNA-kvantifieringsinstrument (se materialtabell). För att erhålla den totala DNA-koncentrationen, multiplicera detta värde med 10 (PCR-reaktionens totala volym). Uppskatta det antal PCR-cykler som krävs enligt beskrivningen i de representativa resultaten.
- Tillsätt 2 μl 6x belastningsbuffert till de återstående 9 μl PCR-blandningen. Lös upp det PCR-förstärkta biblioteket på en 1 % agarosgel för att fastställa framgångsrik adapterligering, vilket resulterar i en storlek på cirka 450 bp (figur 1C).
OBS: Gelen ska visa ett distinkt band på cirka 420 bp (Micro-C-bibliotek plus adaptrar). Band på 120 bp representerar adapterdimerer och är en indikation på bibliotek med låg komplexitet. Band med lägre molekylvikter kan förekomma (mindre än 100 bp), och dessa är oanvända primers från PCR-reaktionen.
9. Förstärkning av sekvenseringsbibliotek
- Tillsätt PCR-masterblandningen (65 μlH2O, 100 μl Q5-DNA-polymeras med hög kvalitet, 8 μl i5-primer, 8 μl i7-primer) till de återstående 19 μlen av streptavidin-biotin-DNA-provet. Dela upp reaktionsblandningen i 50-100 μL alikvoter.
OBS: Den optimala volymen för PCR beror på PCR-maskinen; vanligtvis erbjuder 50 μL den mest reproducerbara amplifieringen i vanliga PCR-maskiner. - Utför PCR enligt tillverkarens instruktioner för DNA-bibliotekets förberedelsesats med det antal cykler som bestämts i steg 8. Om steg 8 utelämnades rekommenderas 14 cykler för PCR.
- Rena DNA med paramagnetiska pärlor (se materialtabell) i förhållandet 1:0,9 enligt tillverkarens protokoll. Eluera i 20 μL 0,1 % TE.
OBS: Om adapterdimerer detekteras i steg 8.5, utför rening två gånger med samma förhållande. - Bestäm DNA-koncentrationen och kör proverna på ett kvalitetskontrollsystem (se materialförteckning). Säkerställ god kvalitet på Micro-C-biblioteket genom närvaron av ett enda exakt band (figur 1D).
OBS: Adapterdimerer är ovanliga i preparationer på pärlbiblioteket på grund av sample tvättar före PCR. Således indikerar utseendet på adapterdimerer låg bibliotekskomplexitet. Om adapterdimerer observeras, rekommenderas det starkt att kvalitetskontrollera sample med låg ingångssekvensering.
10. DNA-sekvensering och databehandling
- Sekvensera Micro-C-biblioteket med parad sekvensering enligt sekvenseringsleverantörens krav.
OBS: Helst sekvenseras exemplen på en plattform i parat slutläge med 50 bp per läsning. Äldre plattformar som erbjuder kortare läslängder, till exempel 2 x 35 bp, har också använts framgångsrikt. Det är viktigt att notera att om repetitiva genomiska regioner studeras kan det vara lämpligt att sekvensera med en längre läslängd. - Om du vill utvärdera kvaliteten på Micro-C-biblioteket utför du sekvensering med låg indata med 5 x 106 till 1 x 107 läsningar per exempel.
- Bearbeta sekvenseringsfilerna (fastq-filer) med Distiller10. Mappa avläsningarna mot lämpligt referensgenom, här mm10.
Sekvenseringsfilerna kan bearbetas med hjälp av olika pipelines på lokala datorer eller datorkluster. För exempel med låga sekvenseringsdjup kan större lagerplatsstorlekar, till exempel 10 000 bp, 50 000 bp, 100 000 bp och 500 000 bp, minska beräkningskraven och filstorlekarna. Distiller (som används i denna studie) genererar alla filtyper som krävs för att bedöma kvaliteten på Micro-C-biblioteket. Den genererade *.stats-filen innehåller information om karthastigheten, cis-trans-förhållanden och läsorientering stratifierade av avståndet mellan läsparen. Dessa parametrar visualiseras i figur 2, och bedömningen av Micro-C-bibliotekets kvalitet diskuteras i de representativa resultaten. Bearbetningsprogrammet genererar också mcool-filer som kan laddas direkt i HiGlass (https://docs.higlass.io/) för att generera interaktionsmatriser9.
Representative Results
Den framgångsrika förberedelsen av Micro-C-bibliotek kan utvärderas i flera steg i protokollet. Det viktigaste steget är valet av en korrekt MNase-nedbrytningsgrad. Därför måste MNas-koncentrationen titreras för att konsekvent ge 70%-90% mononukleosomer över di-nukleosomer för varje prov. Det är viktigt att notera att kromatinnedbrytningen är olika för eu- och heterokromatin, där MNas bryter ner heterokromatin mindre effektivt. Således beror den optimala nedbrytningsgraden på den kromatinregion som är av intresse och den studerade celltypen eftersom den relativa andelen eu- och heterokromatin är celltypsspecifik. Därför är det tillrådligt att noggrant titrera den MNase-koncentration som krävs och att först utvärdera Micro-C-experimentets framgång genom sekvensering med låg input.
Ett typiskt MNas-titreringsmönster för kromatin behandlat med minskande mängder MNas visas i figur 1A. Här bryts kromatin från 250 000 celler per reaktion med en fyrfaldig utspädning av MNas. Den högsta koncentrationen (10 U MNase, Lane 2) visar översmält kromatin som nästan uteslutande består av mononukleosomalt DNA (~150 bp). Noterbart är att mitten av det mononukleosomala bandet går lägre i agarosgelen jämfört med motsvarande band i proverna med reducerade MNas-koncentrationer, vilket indikerar en översmältning av nukleosomalt DNA. Översmälta nukleosomer ligeras ineffektivt i närhetsligeringsreaktionen; därför är provet i bana 2 suboptimalt för Micro-C-experiment. Bana 3 (2,5 U MNase) visar en nästan lämplig digestionsgrad för Micro-C-experiment. Här är det mononukleosomala bandet den dominerande arten, och det subnukleosomala utstryket, som tyder på översmälta nukleosomer, reduceras; Den finns dock fortfarande kvar. Rötningsgraden i bana 4 (0,635 U MNase) är ett idealiskt tillstånd för ett Micro-C-experiment i detta titreringsexempel. Ett tydligt mononukleosomalt band utan subnukleosomalt DNA är närvarande. Bandintensiteten för mono- och di-nukleosom-DNA är nästan lika, vilket indikerar ett mononukleosomutbyte på 66 % eller högre. Det är värt att notera att di-nukleosomalt DNA är ungefär dubbelt så stort som mononukleosomalt DNA (~320 bp vs. ~150 bp), så dess bandintensitet per mol DNA är dubbelt så hög jämfört med dess mononukleosomala motsvarighet. Nedbrytningsgraden i Lane 5 (0,156 U MNase) visar undersmält kromatin med nästan inget nukleosomalt DNA, och detta representerar därför ett suboptimalt prov.
Sammanfattningsvis, i detta exempel, erbjuder uppslutningen av 2,5 x 10 5 ES-celler från möss med 0,625 U MNas (motsvarande2,5 U MNas för 1 x 106 celler i 200 μL) den mest lovande utgångspunkten för preparativ nedbrytning i mikro-C-experiment. En mellanliggande MNas-koncentration mellan de betingelser som används för proverna i körfält 3 och körfält 4 (motsvarande 5 U MNas för 1 × 106 celler i 200 μl) bör dock också övervägas. Det är viktigt att kromatinnedbrytningen med MNase inte kan skalas linjärt, och det rekommenderas inte att skala upp den preparativa nedbrytningen mer än 4 gånger. För att framställa mikro-C-bibliotek från mer än 1 x 10 6 celler är det lämpligt att smälta kromatinet i alikvoter om 1 x 106 celler och slå samman dem efter MNase-inaktivering.
För att bedöma framgången för proximitetsligeringsprotokollet bör ingångskontrollen, som är MNase-digested och inte proximitetsligerad (steg 3.8), jämföras med det närhetligerade provet (steg 5.3) med 1,5 % agarosgelelektrofores (Figur 1B). Det närhetsligerade mononukleosombandet har en ungefärlig storlek på 300 bp, liknande di-nukleosomernas. Därför bör signalförhållandet mellan mono- och dinukleosomband skifta från övervägande mononukleosomer (Lane 1) till di-nukleosomer (Lane 3 och Lane 4). Eftersom agarosgelen i detta steg är di-nukleosomalt DNA som skärs ut och renas, är det lämpligt att dela upp proverna i flera banor för att undvika överbelastning.
Vi rekommenderar att du bedömer kvaliteten och kvantiteten på det förberedda sekvenseringsbiblioteket med minimal PCR. Här amplifieras DNA från 1 μL pärlor (1/20 av det totala provet) i 16 cykler i 10 μL PCR-reaktion. Den totala koncentrationen av det minimala PCR-biblioteket varierar vanligtvis från 50-500 ng efter 16 PCR-cykler. I teorin motsvarar detta ett 1-10 μg bibliotek från det återstående 19 μL-provet om det också amplifierades i 16 cykler. Det rekommenderas att använda det minsta antalet PCR-cykler som behövs för att generera ett bibliotek på cirka 100 ng från det totala DNA:t. Om man antar logaritmisk amplifiering i PCR kan den teoretiska koncentrationen av DNA som erhålls från 19 μL-ingången vid 16 cykler delas successivt med två för att beräkna antalet PCR-cykler som krävs för att generera ett 100 ng-bibliotek. Till exempel motsvarar ett utbyte på 100 ng från 1 μl efter 16 cykler ett utbyte på 1 900 ng förstärkt från 19 μL. I detta scenario bör 12 cykler helst generera ett sekvenseringsbibliotek på 118 ng från det totala DNA:t (1 900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). Det återstående 9 μL-provet från minimi-PCR kan sedan användas för att bedöma bibliotekets kvalitet genom agarosgelelektrofores (figur 1C). Visualiseringen bör visa ett distinkt band vid 420 bp och inga band för adapterdimerer (120 bp). Mindre fragment kan också förekomma, och dessa motsvarar oanvända PCR-primrar.
Därefter rekommenderas att analysera och bekräfta framgångsrik Micro-C-provberedning genom sekvensering med låg input innan du bestämmer dig för resurskrävande djupsekvensering. Vanligtvis sekvenseras bibliotek till ett läsdjup på 5 x 106 till 1 x 107 och utvärderas baserat på följande kriterier: sekvenseringsläsdupliceringshastigheten, cis- kontra transkromosominteraktionshastigheten och sekvenseringsläsorienteringsfrekvensen. Micro-C-biblioteken bearbetas med Distiller, en fullservicepipeline som bearbetar data från sekvensering av läsfiler (Fastq-format) till läsparfiler (Bedpe-format) och skalbara interaktionsmatriser (Cool- och Mcool-format) med hjälp av cooler, pairtools och cooltools10,11,12. Pipelinen genererar också en sammanfattningsfil som är idealisk för att utvärdera kvaliteten på Micro-C-biblioteken10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). PCR-dupliceringshastigheten ger information om sekvenseringsbibliotekets komplexitet och kan extraheras från den genererade *.stats-filen. Högkvalitativa Micro-C-bibliotek har mindre än 5%-10% PCR-dupliceringshastigheter när de genereras från 5 miljoner eller fler celler. Noterbart är att vissa sekvenseringsplattformar genererar PCR-dubbletter under klusterbildning oberoende av sekvenseringsbibliotekets komplexitet. Figur 2A visar den relativa dupliceringsfrekvensen för två experiment: ett som vi anser vara ett bra urval och ett dåligt urval. I det här exemplet visade båda exemplen acceptabla kartfrekvenser. Nästa kriterium för att bedöma kvaliteten på Micro-C-bibliotek är cis- kontra trans-förhållandet och läsorienteringsfrekvenserna. Inom kärnan bor kromosomer i enskilda kromosomterritorier och interagerar därför sällan med andra kromosomer. En hög frekvens av upptäckta transkromosomala interaktioner indikerar en hög frekvens av slumpmässiga ligeringar. Det bör noteras att på denna analysnivå uppvisade det dåliga provet en hög frekvens av transkromosomala interaktioner jämfört med det goda urvalet (figur 2B). För mikro-C är en cis-kromosominteraktionshastighet på 70 % eller högre önskvärd.
Ett Micro-C-bibliotek har en fragmentstorlek som liknar det di-nukleosomala DNA-bandet, som kan samrena med det proximity-ligerade provet och kontaminera experimentet. Dessa föroreningar är alltid cis-kromosomala interaktioner. Därför är det viktigt att även utvärdera läsorienteringsfrekvensen. Hastigheten för di-nukleosomal kontamination kan uppskattas genom sekvensering med låg input. Di-nukleosomalt DNA härstammar från två närliggande nukleosomer som inte har klyvts av MNas. Således kommer de resulterande sekvensläsningarna alltid att visa en läsorientering framåt-bakåt (F och R), och avståndet mellan läsparen kommer att vara cirka 320 bp. Närhetsligerade fragment kan i jämförelse ligeras i fyra riktningar, vilket ger läspar med F-R, R-R, R-F och F-F, helst med samma förekomst (Figur 2C). Dessutom visar de olika avstånd mellan de två läsparen. För att uppskatta mängden di-nukleosomala kontaminater kan frekvensen av läsorienteringar beräknas från *statsfilerna som genereras av destillatören (figur 2D). Noterbart är att i detta arbete var andelen F-R-läsningar (röda) högre i det dåliga urvalet jämfört med det goda urvalet, och detta blev mer uppenbart när läsorienteringarna stratifierades efter avstånd (Figur 2E). F-R-fraktionen domineras av di-nukleosomala fragment jämfört med Micro-C-bibliotek när läsparen stratifieras till läsningar med avstånd <562 bp eller ≥562 bp. Här domineras andelen läsningar med avstånd <562 bp av F-R-läsningar, medan fraktionen med avstånd ≥562 bp visar en jämn fördelning mellan de fyra möjliga orienteringarna, vilket indikerar att den globala överrepresentationen av F-R-läsningar härrör från di-nukleosomala föroreningar. Valet av 562 bp som tröskelvärde för delmängd definieras av grupperingen i den *stats-fil som genereras. Även om det inte är nödvändigt för denna kvalitetskontroll, kan en mer definierad delmängd uppnås genom att extrahera avstånden från *pairs-filen, som också genereras av destillatören. Det är viktigt att notera att di-nukleosomala avläsningar inte minskar kvaliteten på Micro-C-provet eftersom de kan identifieras och ignoreras under databehandlingen. De innehåller dock ingen värdefull information om 3D-interaktioner, och de späder ut de informativa läsningarna.
Således är noggrann MNase-titrering och noggrann kvalitetskontroll med sekvensering med låg input de bästa verktygen för att optimera kvaliteten på Micro-C-experiment.
Figur 1: Mellanliggande steg i Micro-C-protokollet . A) Agarosgelelektrofores av kromatin från 2,5 x 105 ES-celler från möss som spjälkats med varierande MNase-koncentrationer. De mono-, di- och trinukleosomala banden indikeras med pilar. M: DNA-stege (bana 1/6); 10 U MNas per 250 000 celler (körfält 2); 2,5 U MNas per 250 000 celler (körfält 3); 0,625 U MNas per 250 000 celler (körfält 4); 0,156 U MNas per 250 000 celler (körfält 2). (B) 1,0 % agarosgelelektrofores i de Micro-C-preparerade proverna (körfält 3 och körfält 4) och MNase-uppslamningskontrollen (körfält 1). Bana 1 och bana 2 (M: DNA-stegen) har förbättrats för att betona den relativa förändringen i intensiteten av mono- till di-nukleosomala fragment. De mono- och dinukleosomala banden indikeras med pilar. Di-nukleosombandet i det närhetsligerade provet kombinerar di-nukleosomalt och Micro-C-biblioteks-DNA. (C) 1,0 % agarosgelelektrofores i Micro-C-sekvenseringsbiblioteken amplifierad från 1 μL prov för att utvärdera kvaliteten. Bana 1 (M): DNA-stege. Bana 2 (S): Mirco-C-biblioteket. (D) Fragment Analyzer-spår av det slutliga Micro-C-biblioteket. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempelstatistik för sekvensering med låg inmatning av ett bra urval och ett dåligt urval . (A) Stapeldiagram över procentandelen mappade (gröna) och omappade (röda) avläsningar. (B) Normaliserad fraktion av läsningar som kartlägger cis- och transkromosominteraktioner. Datauppsättningarna normaliserades till cis-mappningsläsningen. Cis-mappningsavläsningarna stratifierades efter avståndet mellan den första och den andra läsningen av de parade sekvenserade proverna: ≤1 kbp (gul), >1 kbp och ≤10 kbp (orange) och >10 kbp (röd). C) Schematisk bild av de potentiella molekylarterna med dinukleosomstorlek. (D) Procentandelar av läsparorienteringar för alla läsningar av det bra urvalet och det dåliga urvalet. (E) Samma som panel (D) men stratifierad efter avstånd (vänster, <562 bp och höger, ≥562 bp). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Komponenter | 1x | 4,4 ggr |
| 10x NEBuffer 2.1, | 10 μL | 44 μL |
| 2 μL 100 mM ATP | 2 μL | 8,8 μL |
| 100 mM DTT | 5 μL | 22 μL |
| H2O | 68 μL | 299,2 μL |
| 10 U/μL T4 PNK | 5 μL | 22 μL |
| Total | 90 μL | 396 μL |
Tabell 1: Micro-C master mix 1. Sammansättning av masterblandningen för sluttuggningsreaktionen.
| Komponenter | 1x | 4,4 ggr |
| 1 mM biotin-dATP | 10 μL | 44 μL |
| 1 mM biotin-dCTP | 10 μL | 44 μL |
| 10 mM blandning av dTTP och dGTP | 1 μL | 4,4 μL |
| 10x T4 DNA-ligasbuffert | 5 μL | 22 μL |
| 200x BSA | 0,25 μL | 1,1 μL |
| H2O | 23,75 μL | 104,5 μL |
Tabell 2: Micro-C master mix 2. Sammansättning av masterblandningen för slutmärkningsreaktionen.
| Komponenter | 1x | 4,4 ggr |
| 10x NEB T4 Ligasreaktionsbuffert | 50 μL | 220 μL |
| H2O | 422,5 μL | 1859 μL |
| T4 DNA-ligas | 25 μL | 110μL |
Tabell 3: Micro-C master mix 3. Sammansättning av masterblandningen för proximitetsligeringsreaktionen.
| Komponenter | 1x | 4,4 ggr |
| 10x NEBuffer 1,1 | 20 μL | 88 μL |
| H2O | 180 μL | 792 μL |
| ExoIII-nukleas | 10 μL | 44 μL |
Tabell 4: Micro-C master mix 4. Sammansättning av masterblandningen för biotinborttagningsreaktionen.
Discussion
Framgången för ett Micro-C-experiment beror på några kritiska steg i protokollet som måste utföras noggrant. För det första kan tvärbindning med den extra tvärbindaren DSG eller EGS leda till aggregering av celler, beroende på celltyp. Att lägga till 0,1%-0,5% BSA till tvärbindningsreaktionen minskar aggregeringen avsevärt utan att påverka tvärbindningseffektiviteten. Ineffektiv tvärbindning kan resultera i ökade frekvenser av transkromosomala interaktioner som tyder på slumpmässiga ligationer. Det andra, men mest avgörande, steget i detta protokoll är nedbrytningen av kromatin med MNase. Suboptimal kromatinnedbrytning leder till ineffektiv proximitetsligering (översmältning) eller ökad förekomst av icke-närhetsligerade di-nukleosomer (undermatsmältning). Ligeringsreaktionens effektivitet kan utvärderas med agarosgelelektrofores (Figur 1B) och uppskattas dessutom bäst genom sekvensering med låg input. Om sekvenseringen med låg inmatning visar antingen en hög duplikationshastighet (ineffektiv ligering) eller ökade di-nukleosomhastigheter, bör MNase-nedbrytningsgraden omvärderas. I synnerhet kan förlusten av prov vid körning av protokollet leda till minskad bibliotekskomplexitet. Koncentrationen av ett prov utvärderas bäst efter DNA-rening (steg 5.3) eller med minimal PCR (steg 8). Det totala utbytet av DNA från 5 x 106 däggdjursceller efter DNA-rening är vanligtvis >2 μg. DNA-koncentrationen bör kontrolleras efter MNase-uppslutningen, ExoIII-uppslutningen och DNA-reningen. Endogena nukleaser, vars överflöd är celltypsspecifikt och artspecifikt, kan vara en källa till DNA-nedbrytning. Dessutom kan kolonnbaserad DNA-rening leda till provförlust på grund av inkompatibilitet med SDS från deproteineringsreaktioner. Etanolutfällning kan övervägas om DNA-koncentrationen är låg i detta steg.
Eftersom Micro-C kräver provspecifik MNase-titrering är det utmanande att tillämpa Micro-C på små cellpopulationer, såsom med små organ från olika modellorganismer, embryon och enskilda celler, organoider eller patientbiopsier. Här erbjuder Hi-C 3.0 ett väletablerat alternativ med hjälp av en slutpunktsreaktion med sekvensspecifika restriktionsendonukleaser 8,9.
Micro-C är en allmänt användbar högupplösande kromosomkonformationsteknik med ett högt dynamiskt omfång och ett lågt signal-brusförhållande, vilket gör den särskilt lämplig för att undersöka kromosomegenskaper 4,5,8 på kort avstånd, såsom kromosomslingor. Upplösningen av Micro-C gör det möjligt att fånga promotor-förstärkarslingor, som ligger utanför detektionsgränsen för Hi-C, vilket effektivt möjliggör en mer detaljerad analys av förhållandet mellan genomorganisation och reglering13,14,15. Dessutom har DNA-fångststrategier nyligen kombinerats med Micro-C för att öka den locus-specifika upplösningen av de riktade genomiska loci till oöverträffade nivåer, vilket avslöjar nya insikter om ultrastrukturen hos 3D-genomet16,17,18. Sammanfattningsvis föreställer vi oss att Micro-C och dess derivat kommer att vara en nyckelteknologi för att dissekera 3D-genomets roll i transkriptionsreglering och därmed celltypsdifferentiering och underhåll.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Christl Gaubitz och Kathleen Stewart-Morgan för deras kritiska läsning av manuskriptet. Vi tackar Anja Groth och Groth-labbet för deras stöd i etableringen av vårt labb. Vi tackar personalen på CPR/reNEW Genomics Platform för stöd: H. Wollmann, M. Michaut och A. Kalvisa. Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW) stöds av Novo Nordisk Foundations anslagsnummer NNF21CC0073729. Novo Nordisk Fondens centrum för proteinforskning (HLR) stöds av Novo Nordisk Fondens anslagsnummer NNF14CC0001. Vi tackar Brickmans labb vid Novo Nordisk Center for Stem Cell Medicine, reNEW Copenhagen, för ES-cellerna hos möss.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mM Biotin dATP | Jenna Bioscience | NU-835-Bio14-S | |
| 1 mM Biotin dCTP | Jenna Bioscience | NU-809-BioX-S | |
| 10 mM dGTP | NEB | N0442S | |
| 10 mM dTTP | NEB | N0443S | |
| 10 U/ml T4 PNK | NEB | M0201L | |
| 100 U/L Exonuclease III | NEB | M0206L | |
| 10x NEBuffer 1.1 | NEB | B7001S | |
| 10x NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | |
| 10x T4 DNA Ligase buffer | NEB | B0202A | |
| 1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ | ThermoFisher | 14190144 | |
| 1x LIF | |||
| 2_Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | 0.1 mM b-mercaptoethanol |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-500ML | Caution. See manufactures MSDS |
| 400 U/ml T4 DNA Ligase | NEB | M0202L | |
| 5 U/ml Klenow Fragment | NEB | M0210L | |
| Agarose | BIO-RAD | 1613102 | Caution. See manufactures MSDS |
| BSA 20mg/ml | NEB | B9000S | |
| CaCl2 | |||
| cell counter | |||
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D8418-100ML | Caution. See manufactures MSDS |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes |
| DynaMag-PCR Magnet | Invitrogen | 492025 | refered to as: magnet magnet for PCR tubes |
| EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | BioWorld | 40121266-1 | |
| Ethanol 96% | VWR Chemicals | 20824365 | quality control system |
| Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | |
| Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) | ThermoFisher | 21565 | |
| Fetl Bovin Serum | Sigma Aldrich | F7524 | 15% FBS |
| Gel Loading dye purple (6X) | NEB | B7024S | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067.0500 | |
| Halt Proteinase inhibitor (100x) | ThermoFisher | 78430 | Caution. See manufactures MSDS |
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | 18896-50ML | |
| MgCl 1 M | Invitrogen | AM9530G | |
| Micrococcal Nuclease (MNase) | Worthington | LS004798 | |
| mouse embryonic stem cells | |||
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) | NEB | E7600S | amplification primers for sequencing libraries |
| NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | NEB | E7645L | sequencing library preparation kit |
| NEBNext Ultra II Q5 Master mix | NEB | M0544S | Caution. See manufactures MSDS |
| Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | 1x NEAA |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | 1% Pen-Strep |
| Proteinase K (40 mg/ml) | GoldBio | P-480-1 | Caution. See manufactures MSDS |
| QIAquick Gel extraction kit | QIAgen | 28706 | refered to as: DNA gel elution kit |
| QIAquick PCR purification kit | QIAgen | 28106 | refered to as: commercial DNA purification kit |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA quantification instrument |
| Quick load purple 1kb plus DNA Ladder | NEB | N0550S | |
| SPRIselect size selection beads | Beckman Coulter | B23319 | paramagnetic beads |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | refered to as: thermomixer |
| Tris | Merck | 10708976001 | |
| Trypsin | |||
| Tween20 | Sigma Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrapure 10% SDS | Invitrogen | 15553-035 | |
| Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) | Invitrogen | 15593-031 | |
| Fragment Analyzer |
References
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. Micro-C XL: Assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome. Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).
- Hsieh, T. -H. S., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
- Krietenstein, N., et al. Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
- Hsieh, T. -H. S., et al. Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding. Molecular Cell. 78 (3), 539-553 (2020).
- Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation. Methods. 123, 56-65 (2017).
- van Holde, K. E. Chromatin. , Springer. New York, NY. (1989).
- Oksuz, B. A. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18, 1046-1055 (2021).
- Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. Hi-C 3.0: Improved protocol for genome-wide chromosome conformation capture. Current Protocols. 1 (7), 198 (2021).
- Goloborodko, A., Venev, S., Abdennur, N., Di Tommaso, P.
- Venev, S., et al.
- Abdennur, N., Mirny, L. A. Cooler: Scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays. Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2019).
- Zhang, S., Übelmesser, N., Barbieri, M., Papantonis, A. Enhancer-promoter contact formation requires RNAPII and antagonizes loop extrusion. BioRxiv. , (2022).
- Barshad, G., et al. RNA polymerase II and PARP1 shape enhancer-promoter contacts. BioRxiv. , (2022).
- Hansen, A. S., et al. Distinct classes of chromatin loops revealed by deletion of an RNA-binding region in CTCF. Molecular Cell. 76 (3), 395-411 (2019).
- Hua, P., et al. Defining genome architecture at base-pair resolution. Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).
- Downes, D. J. High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale. Nature Communications. 12, 531 (2021).
- Goel, V. Y., Huseyin, M. K., Hansen, A. S. Region capture Micro-C reveals coalescence of enhancers and promoters into nested microcompartments. BioRxiv. , (2022).
